Thesis pH en bloedbijmenging

FACULTEIT GENEESKUNDE EN
GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2009 - 2010
PROSPECTIEVE ANALYSE VAN DE INVLOED VAN
PH EN BLOEDBIJMENGING OP EMBRYONALE
ONTWIKKELING IN VITRO NA
INTRACYTOPLASMATISCHE SPERMA-INJECTIE
Margot CLAUS
Ilse MEERSCHAUT
Promotor: Prof. Dr. Petra De Sutter
Co-promotor: Dr. Tom Coetsier
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteurs en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met
betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van
resultaten uit deze scriptie.”
23 april 2010
Prof. Dr. Petra De Sutter
Margot Claus
Ilse Meerschaut
VOORWOORD
Deze scriptie kadert binnen onze opleiding tot basisarts. Het was voor ons een eerste contact met
wetenschappelijk onderzoek dat in de hedendaagse geneeskunde een steeds belangrijkere rol inneemt.
Wij hebben geleerd om stapsgewijs een wetenschappelijke vraagstelling uit te werken. Dit naslagwerk
is het eindresultaat van ons leerproces.
De studie is tot stand gekomen dankzij de hulp en inbreng van verschillende mensen. Als eerste
zouden wij onze promotor, Prof. Dr. P. De Sutter, willen bedanken voor de goede opvolging, het
kritisch inzicht en de aanmoediging. Ook willen wij onze co-promotor, Dr. T. Coetsier, bedanken voor
de begeleiding bij de totstandkoming van deze scriptie. Verder zijn er de leden van het IVF-labo en de
Fertifoon zonder wie deze thesis onmogelijk verwezenlijkt kon worden. Wij willen hen dan ook
bedanken voor hun inzet en geduld. Graag willen wij ook nog onze ouders bedanken voor de steun en
de aanmoediging bij het maken van deze thesis en gedurende onze volledige opleiding. En natuurlijk
willen wij ook elkaar bedanken voor de vlotte samenwerking en de volharding om deze opdracht tot
een goed einde te brengen.
Met deze scriptie hopen wij een bijdrage te leveren aan de techniek van transport-ICSI. Aangezien er,
met uitzondering van de temperatuur, geen wettelijke bepalingen zijn omtrent de transportcondities,
willen wij met deze studie vooral een aanzet geven tot verder onderzoek hieromtrent.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
i
INHOUDSTAFEL
1. ABSTRACT ....................................................................................................... 1
2. INLEIDING ....................................................................................................... 2
2.1
Vruchtbaarheidsproblemen...................................................................................................... 2
2.2
De diagnostiek van vruchtbaarheidsproblemen....................................................................... 3
2.3
De behandeling van vruchtbaarheidsproblemen...................................................................... 4
2.4
IVF en ICSI als vorm van vruchtbaarheidsbehandeling .......................................................... 6
2.5
Standaardprocedure van IVF/ICSI-behandeling ..................................................................... 7
2.6
Transport-IVF ........................................................................................................................ 10
2.7
Rol van de pH van het follikelvocht ...................................................................................... 12
2.8
Rol van het bloed in het follikelvocht ................................................................................... 14
2.9
Kwaliteitsbeoordeling van de embryo’s ................................................................................ 16
2.10
Waarom dit onderzoek?......................................................................................................... 18
3. METHODOLOGIE ........................................................................................... 19
3.1
Patiënten ................................................................................................................................ 19
3.2
Studieprocedure ..................................................................................................................... 20
3.3
Uitkomstvariabelen ............................................................................................................... 22
3.4
Dataverwerking ..................................................................................................................... 24
4. RESULTATEN ................................................................................................. 27
4.1
Reproduceerbaarheid van de metingen ................................................................................. 29
4.2
Beschrijvende tabel ............................................................................................................... 29
4.3
Het verband tussen pH en bloedbijmenging .......................................................................... 30
4.4
Verband tussen pH, bloedbijmenging en de uitkomstvariabelen .......................................... 31
4.5
Samenvattende tabel resultaten ............................................................................................. 46
5. DISCUSSIE...................................................................................................... 47
6. CONCLUSIE ................................................................................................... 55
7. REFERENTIELIJST ......................................................................................... 56
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
ii
1. Abstract
1. ABSTRACT
Doel: In het kader van een transport-ICSI programma werd de graad van bloedbijmenging en de pH
van de follikelaspiraten bepaald en werd nagegaan of deze correleren met de bevruchtingsresultaten na
ICSI.
Design: Prospectieve observationele studie.
Setting: De patiënten namen allen deel aan een transport-ICSI behandeling waarbij de
stimulatieprocedure en de follikelpunctie plaatsvond in het AZ Sint-Lucas (Gent) en waarna de
aspiraten getransporteerd werden naar het IVF labo van het UZ Gent.
Patiënten: Van midden juni 2009 tot midden december 2009 werden 18 puncties uitgevoerd bij
18 verschillende patiënten. In totaal werden 234 eicellen verkregen. De resultaten van één punctie
werden niet in het onderzoek opgenomen wegens het gebruik van een andere procedure. Dit bracht het
totale aantal eicellen op 221. Daarvan werd voor 195 eicellen een behandeling met ICSI gepland en
voor 26 eicellen een behandeling met IVF. Uiteindelijk werden enkel de 195 eicellen die in
aanmerking kwamen voor een behandeling met ICSI verwerkt in de statistische analyse.
Metingen: Na aankomst in het IVF labo werd de pH van de follikelvochten geregisteerd en de graad
van bloedbijmenging bepaald met behulp van een kleurenkaart.
Bestudeerde primaire en secundaire uitkomstvariabelen: Eicelmaturiteit, fertilisatie, aantal cellen op
dag twee, meerkernigheid op dag twee, fragmentatie op dag twee, embryoscore op dag twee, aantal
cellen op dag drie, meerkernigheid op dag drie, fragmentatie op dag drie, embryotransfer,
cryopreservatie, zwangerschap en evolutieve zwangerschap.
Resultaten: Er werd een significant verband gevonden tussen pH en bloedbijmenging. Aspiraten met
bloedbijmenging bleken een hogere pH te hebben. Er waren significant meer embryo’s abnormaal
bevrucht bij aanwezigheid van bloedbijmenging. Een gestegen pH had een negatieve invloed op de
beslissing tot cryopreservatie. Wat betreft de andere parameters is dit onderzoek niet conclusief.
Conclusie: De pH was hoger bij aspiraten met bloedbijmenging. Dit had echter geen significante
impact op de graad van fragmentatie. Ook de meerderheid van de secundaire uitkomstvariabelen
waren niet significant verschillend volgens de graad van bloedcontaminatie of de pH. Er werden
significant meer abnormaal bevruchte eicellen bekomen in de aspiraten met bloedbijmenging, en er
konden significant minder embryo’s gecryopreserveerd worden bij hogere pH in het aspiraat.
Verder onderzoek is aangewezen om de klinische relevantie van de gevonden significante resultaten te
bepalen en om uit te maken of het belangrijk zou zijn voor de uitkomst van de
vruchtbaarheidsbehandeling om meer aandacht te schenken aan de stijging van de pH en de
aanwezigheid van bloed in het follikelvocht bij transport.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
1
2. Inleiding
2. INLEIDING
2.1 Vruchtbaarheidsproblemen
‘Subfertiliteit’ of ‘verminderde vruchtbaarheid’ kan gedefinieerd worden als het falen om zwanger te
worden na één jaar regelmatige coïtus zonder gebruik van anticonceptie. (De Sutter, 2008-2009)
Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) treft het probleem van subfertiliteit/infertiliteit
gemiddeld acht à tien procent van de wereldbevolking. In absolute cijfers gaat het naar schatting om
vijftig à tachtig miljoen mensen, met ongeveer twee miljoen nieuwe probleemparen per jaar.
(www.brusselsivf.be)
Oorzaken van onvruchtbaarheid kunnen worden ingedeeld in vrouwelijke factoren, mannelijke
factoren, gemengde factoren en onverklaarde factoren (De Sutter, 2008-2009). Een wereldwijd
WHO-onderzoek bij 5.700 paren toonde aan dat in 41% van de gevallen enkel bij de vrouw een
belastende factor te vinden is, in 27% enkel bij de man en in 32% bij beide partners
(www.brusselsivf.be).
Binnen het kader van ‘normale’ menselijke vruchtbaarheid zijn vijf voorwaarden essentieel:
de productie van gameten (oögenese en spermatogenese), de extrusie van gameten (ovulatie en
ejaculatie), het transport en de samenkomst van de gameten, de penetratie van de zaadcel in de eicel en
de migratie en implantatie van de bevruchte eicel. Stoornissen in één of meerdere van deze stappen
liggen aan de basis van ‘verminderde vruchtbaarheid’. (De Sutter, 2008-2009)
Tabel 1: Oorzaken van verminderde vruchtbaarheid (De Sutter, 2008-2009)
Productie van gameten:
Stoornissen in de oögenese
Turner syndroom
Stoornissen in de spermatogenese
Stoornissen van de extrusie van mature gameten:
Ejaculatiestoornissen
Psychogeen, diabetes, neurologisch
Ovulatiestoornissen
Polycystisch Ovarium Syndroom (PCO)
Stoornissen in de migratie van de gameten:
Stoornissen in de migratie van de zaadcel
Obstructie van de mannelijke afvoerwegen
Onmogelijkheid van het sperma om in het
cervixslijm op te zwemmen
Ondoorgankelijkheid van de eileiders
Stoornissen in de migratie van de eicel
Pick-up stoornis door tubaire stoornis,
endometriose
Tubaire obstructie of beschadiging door
infectie
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
2
2. Inleiding
Stoornissen in de penetratie van de zaadcel in de eicel:
Stoornissen van de zaadcel
Stoornissen van de eicel
Bv. receptorstoornissen
Stoornissen van de migratie en implantatie van de bevruchte eicel:
Tubaire afwijkingen
Stoornissen in
endometrium
de
ontwikkeling
van
het
Verscheidene studies die over de jaren heen bij de westerse populatie zijn gevoerd naar de problemen
die aan de basis van onvruchtbaarheid liggen, leverden de volgende cijfers op:
Tabel 2: Vruchtbaarheidsproblemen in de Westerse populatie (www.brusselsivf.be)
Ovulatiestoornis
30%
Abnormaal semen
22%
Eileiderproblematiek (o.a. verklevingen)
17%
Endometriose
5%
Onverklaarde onvruchtbaarheid
14%
Andere (immunologisch, genetisch,…)
12%
Bij deze cijfers moet steeds in gedachten gehouden worden dat de vruchtbaarheid van een paar afhangt
van beide partners. Zo kan een verminderd vruchtbare man bij een normaal vruchtbare partner
probleemloos een kind hebben verwekt, terwijl het bij een tweede partner niet lukt, omdat ook zij een
verminderde vruchtbaarheid heeft. Verminderde vruchtbaarheid is dus steeds gelinkt aan het koppel en
niet uitsluitend aan één van de partners. (www.brusselsivf.be)
2.2 De diagnostiek van vruchtbaarheidsproblemen
Accurate
diagnostiek
van
onderliggende
reproductieve
abnormaliteiten
leidt
tot
een
geïndividualiseerde aanpak van het vruchtbaarheidsprobleem en verhoogt de uitkomsten van de
medisch begeleide voortplanting (MBV) (Devroey et al., 2009). Het diagnostische arsenaal bestaat
zoals steeds uit anamnese en klinisch onderzoek, aangevuld met specifieke testen zoals
sperma-analyse, opsporen van de ovulatie, post coïtum test, uteriene en tubaire evaluatie en evaluatie
van de ovariële reserve (Balasch, 2000; De Sutter, 2006). De post coïtum test wordt echter niet meer
uitgevoerd.
Bij de sperma-analyse worden de concentratie, de morfologie en de beweeglijkheid van de zaadcellen
beoordeeld. (Devroey et al, 2009)
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
3
2. Inleiding
Het opsporen van de ovulatie gebeurt door evaluatie van de regelmaat van de cyclus door uitvoering
van een mid-cyclische echo en bepaling van het mid-luteaal progesteron. Toestanden van oligo- of
amenorroe worden geëvalueerd door middel van bepaling van het thyroïdstimulerend hormoon (TSH),
prolactine, oestradiol, progesteron,… (De Sutter, 2006)
De evaluatie van de uterus en de tubae uterinae kan gebeuren aan de hand van hysteroscopie,
hysterosalpingografie (HSG), transvaginale ultrasonografie (TVS), saline infusion sonografie (SIS),
magnetic resonance imaging (MRI) of laparoscopie. Hierbij wordt de doorgankelijkheid van de tubae
beoordeeld en worden eventuele abnormaliteiten van de uterus opgespoord. (Devroey et al, 2009;
De Sutter, 2006)
Evaluatie van de kwaliteit en kwantiteit van de reserve aan follikels in de ovaria kan eveneens worden
uitgevoerd door middel van verschillende technieken: telling van het aantal rijpende follikels tijdens
stimulatie met follikelstimulerend hormoon (FSH), bepaling van het serum FSH gehalte, telling van
het aantal antrale follikels bij TVS en bepaling van het serum anti-müllerian hormoon (AMH).
(Broekmans et al., 2006; Devroey et al., 2009; Nelson et al., 2007)
2.3 De behandeling van vruchtbaarheidsproblemen
De behandeling van vruchtbaarheidsproblemen kan globaal worden ingedeeld in etiologische
behandelingen en behandelingen die de kans op spontane conceptie bevorderen. In het eerste geval
gaat het bijvoorbeeld om de re-anastomose van de tuba uterina of het vas deferens na sterilisatie, de
inductie van ovulatie bij anovulatoire vrouwen en mogelijks ook de behandeling van mannelijke
onvruchtbaarheid. In het tweede geval worden technieken zoals intra-uteriene inseminatie (IUI),
in-vitrofertilisatie (IVF) en intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) bedoeld. (De Sutter, 2006)
In 1978 werd in Groot-Brittannië Louise Brown, de eerste IVF-baby ter wereld geboren
(www.brusselsivf.be). In België volgde de eerste IVF-baby in 1983. Vanaf het begin van de
ontwikkeling van medisch begeleide voortplanting (MBV) hebben Belgische centra door middel van
fundamenteel en klinisch onderzoek bijgedragen aan de vooruitgang ervan. Van 1989 tot 2001 nam
het aantal MBV-behandelingen geleidelijk aan toe. De introductie van ICSI in 1992 zorgde voor een
belangrijke toename. Sindsdien kunnen ook bijna alle vormen van mannelijke onvruchtbaarheid
verholpen worden. Dit zorgde ook voor een daling van de vraag naar donorsperma. Deze vraag daalde
nog meer in 1996 door de invoering van de Testicular Sperm Extraction techniek (TESE) die kan
worden toegepast in de meeste gevallen van azoöspermie. Hierbij wordt sperma uit de teelbal gehaald
en gebruikt om eicellen te bevruchten via de ICSI-techniek. Bij Microchirurgical Epididymal Sperm
Aspiration (MESA) worden zaadcellen uit de bijbal gehaald. (De Sutter et al., 2004)
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
4
2. Inleiding
Daartegenover staat dat de vraag naar eicel- en embryodonatie in de loop der jaren is gestegen,
alhoewel deze laatste maar zelden wordt toegepast. (De Sutter et al., 2004)
Een andere belangrijke vooruitgang was de ontwikkeling van de cryopreservatie van overtollige
embryo’s. Deze techniek werd geïntroduceerd vanaf 1989 en is geleidelijk aan uitgegroeid tot een
volwaardig complement van de IVF-behandeling. (De Sutter et al., 2004)
Doorheen de jaren vond ook een belangrijke verschuiving plaats in het aantal teruggeplaatste embryo’s.
Heel wat centra kozen ervoor om het aantal embryo’s dat wordt teruggeplaatst in de baarmoeder aan te
passen
aan
de
individuele
kenmerken
van
de
patiënte.
Zo
wilden
zij
het
aantal
meerlingzwangerschappen en alle negatieve gevolgen ervan (maternale en neonatale complicaties,
foetale
morbiditeit
en
kosten)
inperken.
Daarom
wordt
volgens
de
terugbetalingswet
(Koninklijk Besluit van 4 juni 2003) in België bij patiënten jonger dan 36 jaar, bij de eerste of de
tweede poging slechts één embryo teruggeplaatst. De volledige wettelijke bepaling van het toegelaten
aantal teruggeplaatste embryo’s wordt weergegeven in onderstaande tabel. (De Sutter et al., 2004;
Devroey et al., 2009)
Tabel 3: Terugbetalingswetgeving in België (Koninklijk Besluit van 4 juni 2003)
Leeftijd vrouw < 35 jaar
> 36 & < 40 jaar
> 40 & < 42 jaar
Cyclus
1e cyclus
Max. 1 embryo
Max. 2 embryo’s
2e cyclus
Max. 1 embryo (*)
Max. 2 embryo’s
3e tot 6e cyclus
Max. 2 embryo’s
Max. 3 embryo’s
Niet bij wet gelimiteerd
(*) Uitzonderlijk laat de wet terugplaatsing van twee embryo’s toe indien geen embryo van topkwaliteit
beschikbaar is.
Ondanks deze inspanningen zijn wereldwijd nog altijd minstens 20 tot 30% van de zwangerschappen
na IVF meerlingzwangerschappen (Reddy et al., 2007; Andersen et al., 2008). Volgens de Evian
Annual Reproduction (EVAR) Workshop Group (Devroey et al., 2009) zou men moeten streven naar
10%. Volgens de Belgian Register for Assisted Procreation (BELRAP, 2007) ligt het aantal in België
momenteel rond 10%. In sommige gevallen wordt de transfer van meerdere embryo’s echter
‘gerechtvaardigd’ door factoren die de kans op bevruchting reduceren zoals hoge leeftijd van de
moeder of slechte kwaliteit van de eicellen (ESHRE Campus Course Report, 2001; van Montfoort et
al., 2006; Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine, 2008).
In de toekomst zal nog meer gestreefd worden naar Single Embryo Transfer (SET), zullen technieken
zoals cryopreservatie en vitrificatie meer op punt gesteld worden, zal de kwaliteitsbeoordeling van
embryo’s en eicellen gestandaardiseerd worden, enz. (Devroey et al., 2009)
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
5
2. Inleiding
2.4 IVF en ICSI als vorm van vruchtbaarheidsbehandeling
Bij in-vitrofertilisatie (IVF) treedt de bevruchting op buiten het lichaam. Hierbij worden de eicellen
met 10.000 voorbereide zaadcellen geïncubeerd, waarna ‘spontane’ bevruchting van de eicellen kan
optreden. (De Sutter, 2008-2009)
Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) is een bijzondere vorm van IVF, waarbij één zaadcel
rechtstreeks in de eicel wordt geïnjecteerd. (De Sutter, 2008-2009)
Volgens data van BELRAP werden tussen 1989 en 2001 in België 78.419 verse IVF-cycli,
19.016 cryotransfers, 2.146 eiceldonatie-cyclussen en 278 embryodonatie-cyclussen geregistreerd.
Vanaf 1992 werden naast IVF cycli ook ICSI cycli geregistreerd. Het aantal cycli nam met verloop
van de jaren geleidelijk aan toe, gaande van 3.750 geregistreerde verse cycli in 1989 tot 9.460
geregistreerde verse cycli in 2001. (De Sutter et al., 2004). Actueel vinden meer dan 20.000 IVF en
ICSI cycli per jaar plaats in België.
De European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) verzamelt data met
betrekking tot medisch geassisteerde voortplanting van dertig landen in Europa. Volgens deze
gegevens werden in deze dertig landen in 2005 in totaal 418.111 cycli geregistreerd. Van de
321.403 verse cycli waren 118.074 IVF cycli en 203.329 ICSI cycli. In België werden in 2005 in
totaal 22.012 cycli geregistreerd, waarvan 15.185 verse cycli (3.796 IVF cycli en 11.389 ICSI cycli).
(Nyboe et al., 2009). Vergeleken met de cijfers van BELRAP uit 2001, wijst dit op een duidelijke
stijging.
De EVAR Workshop Group 2008 stelt dat bij de selectie van de behandelingsstrategie in eerste
instantie onderscheid moet gemaakt worden tussen een afwachtende en een actieve therapie. Keuze
tussen deze beide strategieën gebeurt op basis van de kans op het optreden van spontane zwangerschap.
Deze kans wordt bepaald met behulp van prognostische modellen. (Devroey et al., 2009)
Verder stellen zij dat in het geval van vrouwelijke onvruchtbaarheid, IVF een effectieve behandeling is.
In geval van mannelijke onvruchtbaarheid door sterk afwijkende spermakwaliteit wordt best geopteerd
voor ICSI. Bij twijfel over de kans op spontane fertilisatie kan in een eerste cyclus voorrang worden
gegeven aan een behandeling waarbij de helft van de eicellen worden behandeld met IVF en de andere
helft door middel van ICSI worden bevrucht. (Devroey et al., 2009)
Volgens De Sutter (2006) spelen bij de opstelling van het therapeutisch plan naast de diagnose ook de
leeftijd van de vrouw, de duur van de onvruchtbaarheid, de voorkeur van de patiënte,
de kosten-effectiviteit,… een rol.
Verder wordt gesteld dat best eerst een etiologische behandeling wordt geprobeerd. Dit is het geval
voor de behandeling van anovulatie door middel van ovulatie-inductie, bij herstel van de tuba of het
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
6
2. Inleiding
vas deferens na sterilisatie, alsook voor de behandeling van onvruchtbaarheid te wijten aan
endometriose. Slechts in tweede instantie wordt overgegaan tot behandelingen zoals IUI, IVF en ICSI.
Zo wordt voor gevallen van onverklaarde onvruchtbaarheid de behandeling aangevat met IUI met of
zonder ovariële stimulatie. Indien met deze behandeling na vier tot zes cycli geen zwangerschap
optreedt, kan worden overgeschakeld op een behandeling met IVF of ICSI.
IVF wordt beschouwd als een zinvolle behandeling voor onverklaarde onvruchtbaarheid, omdat het
verschillende essentiële stappen in het fertilisatieproces omzeilt. Heel wat mogelijke oorzaken van
onvruchtbaarheid worden op deze manier uitgeschakeld, zoals ovariële dysfunctie, cervicale factoren,
stoornissen in sperma- en eiceltransport, problemen met sperma-eicel interactie,… Daarnaast heeft
IVF ook een diagnostische rol bij het opsporen van problemen met sperma-eicel interactie. (Pandian et
al., 2003)
Hoewel IVF een aanvaarde behandeling voor onverklaarde onvruchtbaarheid is, blijft het de vraag of
IVF beter is dan afwachten, stimulatie met clomifeen citraat of IUI (met of zonder stimulatie). Volgens
een Cochrane studie (Pandian et al., 2003) zijn de resultaten na behandeling van onverklaarde
onvruchtbaarheid door middel van IVF niet significant verschillend dan na afwachting of behandeling
met IUI.
2.5 Standaardprocedure van IVF/ICSI-behandeling
(cfr. laboratoriumprotocols)
2.5.1
Stimulatie van de eierstokken
Door middel van hormonale stimulatie met gonadotrofines worden ter hoogte van de ovaria meerdere
follikels tot rijping gebracht. De stimulatie gebeurt met natuurlijk of recombinant FSH-hormoon en
duurt gemiddeld twaalf dagen. Gelijktijdig wordt de gonadotropine secretie ter hoogte van de
hypofyse onderdrukt met een gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) agonist. Deze voorkomt het
vroegtijdig tot stand komen van een lutheïniserend hormoon (LH) piek, welke een vroegtijdige
ovulatie kan uitlokken. Een bijkomend voordeel van het gebruik van GnRH-agonisten is een betere
synchronisatie van de ontwikkeling van de follikels. Deze procedure wordt nauwkeurig opgevolgd
door middel van echografische en hormonale monitoring.
Wanneer de follikels een diameter van ongeveer 20 mm hebben bereikt, zijn het grootste aantal rijpe
eicellen aanwezig ter hoogte van de ovaria. Op dit ogenblik wordt de laatste stap van de eicelrijping
geïnduceerd door toediening van 5000 IU humaan choriongonadotrofine (hCG) hormoon.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
7
2. Inleiding
2.5.2
Follikelpunctie
De follikelpunctie vindt plaats 34 tot 38 uur na inductie van de eicelmaturatie met hCG. Vóór de start
van de punctie worden de proefbuizen die de aspiraten moeten opvangen, gevuld met 2 ml
HEPES-medium en voorverwarmd in een couveuse ingesteld op 37°C. Het medium heeft een pH van
7,2 en bevat onder andere heparine. Dit zorgt ervoor dat het bloed in de proefbuizen niet stolt, zodat de
eicellen gemakkelijker worden teruggevonden in het aspiraat.
De gynaecoloog monteert een voorverwarmde proefbuis op de aspiratieslang en prikt via transvaginale
weg en onder echografische controle een follikel aan. Met behulp van een aspiratiepomp wordt het
follikelvocht met de eicel opgezogen via de naald, waarna deze via de aspiratieslang in de proefbuis
terechtkomen. De proefbuis wordt vervolgens afgesloten met een dop en in een transportbox geplaatst.
Er worden geen afzonderlijke proefbuizen gebruikt per gepuncteerde follikel. Eén proefbuis kan dus
meer dan één eicel bevatten.
2.5.3
Transportfase
In het geval van een transport-IVF procedure worden de follikelaspiraten, door de partner of een derde,
van het A-centrum naar het IVF labo van een B-centrum gebracht. De aspiraten bevinden zich in een
afgesloten transportbox zodat de eicellen met behulp van een verwarmingselement op temperatuur
(37°C) gehouden worden. (Zie verder)
2.5.4
Laboratoriumfase
a. Collectie van de eicellen
De buizen worden één voor één onderzocht op de aanwezigheid van eicellen. De inhoud van de buis
wordt uitgegoten in een Petri-schaaltje. Na controle van de buis op achtergebleven eicellen, wordt de
inhoud van het Petri-schaaltje onder de microscoop onderzocht en worden de erin aanwezige eicellen
met een pipet gecollecteerd en overgebracht in een afzonderlijk schaaltje met eicel wash buffer. Hierna
worden de eicellen geteld en ingedeeld over de verschillende druppels medium aanwezig op een
verzamelplaatje. Op de onderzijde van het plaatje worden de eicellen genummerd.
In het geval van ICSI worden de eicellen in een enzym (hyaluronidase) overgebracht en gespoeld in
fertilisatiemedium alvorens ze in een druppel worden geplaatst. De cumulus wordt enkele uren later
verwijderd. Hiervoor worden de eicellen herhaaldelijk in en uit de pipet geaspireerd tot alle
cumuluscellen verdwenen zijn. Daaropvolgend wordt de maturatiegraad van de eicellen bepaald.
Daarbij worden ze op basis van morfologische kenmerken ingedeeld in eicellen met germinaal vesikel
(GV), eicellen in metafase I (MI) en eicellen in metafase II (MII).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
8
2. Inleiding
Figuur 1: Evaluatie van eicelmaturiteit
Onrijpe eicel
met germinaal vesikel
Onrijpe eicel
in metafase I
Rijpe eicel
in metafase II
Onrijpe eicellen en beschadigde eicellen worden in de laatste druppels van het cultuurplaatje geplaatst.
Deze worden slechts aangewend indien er onvoldoende rijpe eicellen beschikbaar zijn.
Bij IVF worden de eicellen enkel gespoeld met fertilisatiemedium.
b. Bewerking van het sperma
Dezelfde ochtend van de follikelpunctie wordt ook het spermastaal, dat door de partner geproduceerd
werd, in het laboratorium voorbereid. Daarbij wordt het sperma ontdaan van schadelijke stoffen en
dode of zwakke zaadcellen.
c. In-vitrofertilisatie
Met behulp van een micropipet wordt aan iedere cultuurdruppel met eicellen een wolkje van het
opgewerkt spermastaal op enige afstand van de eicellen toegevoegd.
d. Intracytoplasmatische sperma-injectie
Ter voorbereiding van de ICSI-procedure wordt een swim-out plaatje en een ICSI plaatje gemaakt. Het
swim-out plaatje wordt aangewend om beweeglijke zaadcellen te verzamelen. Het ICSI plaatje bestaat
uit tien druppels. In de middelste druppel worden de beweeglijke zaadcellen uit het swim-out plaatje
overgebracht. Hieraan wordt nadien een wolk polyvinylpyrolidone (PVP) toegevoegd. In een andere
druppel wordt zuiver PVP overgebracht. De overige acht druppels worden gebruikt voor het
onderbrengen van de eicellen.
Voor de eigenlijke bevruchting wordt gebruik gemaakt van een verwarmde inversiemicroscoop
uitgerust met twee micromanipulatoren en twee microspuiten. Onder microscopisch zicht wordt een
zaadcel geïmmobiliseerd door met de injectiepipet over de staart ervan te rollen. Nadien wordt de
zaadcel aangezogen in de pipet met de staart eerst. Vervolgens wordt de eicel correct gepositioneerd
en gefixeerd. De injectiepipet wordt door de zona pellucida en het oölemma gebracht. Door negatieve
druk wordt het oölemma aangezogen tot het breekt, waarna de zaadcel in het cytoplasma van de eicel
wordt geïnjecteerd. Nadien worden de geïnjecteerde eicellen opnieuw in een cultuurplaatje
overgebracht.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
9
2. Inleiding
e. Evaluatie van de bevruchting en de embryo-ontwikkeling
De bevruchting wordt geëvalueerd 16 à 20 uur na de uitvoering van IVF of ICSI. Bij de beoordeling
van de bevruchting wordt gelet op het aantal voorkernen, het aantal poollichamen en het uitzicht van
het cytoplasma. Voor de evaluatie van de embryonale ontwikkeling, welke elke dag wordt uitgevoerd
gaande van de bevruchting tot de terugplaatsing, wordt de kwaliteit van de embryo’s beoordeeld. Bij
deze kwaliteitsbeoordeling wordt gelet op het aantal cellen en de relatieve grootte ervan, de
fragmentatiegraad en meerkernigheid. Ook de kwaliteit van het cytoplasma wordt beoordeeld.
(Zie verder).
2.5.5
Embryotransfer
Enkele dagen na de fertilisatie worden één of meerdere embryo’s teruggeplaatst in de baarmoeder. De
embryo’s worden opgezogen in een katheter en worden langs de baarmoederhals in de baarmoeder
geplaatst onder echografische controle. Het aantal teruggeplaatste embryo’s wordt bepaald door de
leeftijd van de patiënte en het aantal eerdere IVF pogingen, zoals vastgelegd in de Belgische
wetgeving (zie eerder). Ook de kwaliteit van de beschikbare embryo’s kan bijdragen tot deze
beslissing. Na de terugplaatsing wordt nog gedurende veertien dagen vaginaal progesteron toegediend
ter ondersteuning van de luteale fase.
2.5.6
Cryopreservatie
Indien na embryotransfer nog embryo’s van goede kwaliteit overblijven, kan ervoor gekozen worden
deze te bewaren in vloeibaar stikstof. Ongeveer de helft van de gecryopreserveerde embryo’s zijn
vitaal na ontdooiing en kunnen in de baarmoeder teruggeplaatst worden bij een nieuwe
zwangerschapspoging.
2.6 Transport-IVF
Het principe van transport-IVF (of –ICSI) bestaat erin eicellen te transporteren van een
fertiliteitscentrum waar enkel de stimulatie van de eierstokken en de punctie van de eicellen
plaatsvindt, naar een ander centrum, waar IVF (of ICSI), embryocultuur en embryotransfer gebeurt.
Transport-IVF was aanvankelijk heel populair in Nederland en wordt nu in verschillende landen
toegepast. (De Sutter et al., 1996)
In België zijn er actueel 33 fertiliteitscentra, waarvan vijftien type A-centra en achttien type B-centra
(www.belrap.be). In de A-centra gebeuren de voorafgaande onderzoeken, de indicatiestelling, het
informed consent, de hormonale stimulatie en follow-up, de eicelpunctie en de follow-up na de
embryo terugplaatsing. B-centra vervullen dezelfde taken, maar beschikken daarnaast ook over een
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
10
2. Inleiding
gespecialiseerd IVF-laboratorium. Type A-centra doen voor de laboratoriumfase van de behandeling
een beroep op het laboratorium van een B-centrum. Na de eicelpunctie worden de follikelaspiraten in
een vervoerdoos, die de aspiraten op lichaamstemperatuur houdt, naar een B-centrum overgebracht.
Daar gebeurt de bevruchting van de eicellen, de opvolging van de embryo’s vóór terugplaatsing en de
transfer. (De Cooman, 2007-2008)
De techniek van transport-IVF brengt verschillende voordelen met zich mee. Zo kunnen patiënten
dichter bij huis en bij een vertrouwde arts terecht voor een vruchtbaarheidsbehandeling. Dit draagt bij
tot reductie van emotionele ongemakken en kosten te wijten aan transport en werkverlet. Bovendien
beperkt de samenwerking tussen centra de kosten voor de aankoop en het onderhoud van
gespecialiseerde apparatuur en bevordert het de expertise binnen de IVF-centra. Zo is er sinds de
introductie van ICSI een sterk toegenomen vraag naar transport-cycli, te wijten aan de bijkomende
expertise en grote investering dewelke ICSI vereist. (Alfonsin et al., 1998; Coetsier et al., 1997;
De Sutter et al.,1996)
Hoewel in België een wettelijke regeling voor transport-IVF bestaat, ontbreekt uitgebreid
ondersteunend wetenschappelijk onderzoek dat de invloed van het transport op de resultaten heeft
onderzocht. Slechts enkele studies werden uitgevoerd om de effecten van het transport van gameten op
de eicellen en op de uitkomst na IVF/ICSI na te gaan.
Alfonsin
et
al.
(1998)
vergeleken
in
een
retrospectieve
studie
de
resultaten
van
vruchtbaarheidsbehandelingen tussen drie groepen (transport-IVF, transport-ICSI en conventionele
IVF) om het effect na te gaan van gameettransport op de eicelkwaliteit en op de fertilisatie, de klieving
en de implantatie na IVF of ICSI. Deze toonde aan dat er geen schadelijke effecten zijn op de
eicelkwaliteit door het transport en de vertraging tussen follikelaspiratie en eicelcultuur. Bovendien
werden geen verschillen vastgesteld in de fertilisatie, de klieving en de implantatie.
Vervolgens moest worden nagegaan of de bijkomende handelingen welke deel uitmaken van de
ICSI-procedure, door transport worden beïnvloed. Een retrospectieve studie werd uitgevoerd door
De Sutter et al. (1996) om na te gaan of lange-afstand transport van eicellen de resultaten van ICSI
beïnvloedt. Daaruit bleek dat lange-afstand transport van eicellen niet schadelijk is voor hun capaciteit
tot overleving na sperma-injectie en voor hun verdere embryonale ontwikkeling en implantatiekans.
Omwille van het risico op selectiebias en door het verschil in toegepaste technieken tussen de
verschillende centra in retrospectieve studies, werd door Coetsier et al. (1997) een nieuwe studie
uitgevoerd in een prospectief kader. Opnieuw werd nagegaan of lange-afstand transport van eicellen
voorafgaand aan ICSI de fertilisatie, de embryokwaliteit en/of de implantatiekans beïnvloedt. Hieruit
bleek dat lange-afstand transport geen negatieve invloed heeft op de fertilisatie en de
embryo-implantatie, maar een negatief effect op de embryokwaliteit kan niet worden uitgesloten.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
11
2. Inleiding
Opmerkelijk in deze studie was ook de vaststelling dat het aantal eicellen bij pick-up significant lager
was na transport. Dit is mogelijks het gevolg van een verschil in expertise van de operator bij het
uitvoeren van de follikelaspiratie, alsook het gevolg van de aanwezigheid van eicellen in bloedklonters
in de tube na transport.
Verder is er over de eventuele risico’s van het transport van gameten weinig geweten.
De Cooman (2007-2008) toonde een invloed aan van bloedbijmenging op de embryoscore en de
beslissing tot cryopreservatie. De invloed van pH-schommelingen in het follikelaspiraat tijdens
transport was niet significant gecorreleerd aan de uitkomst van de MBV-behandeling.
2.7 Rol van de pH van het follikelvocht
Belangrijke intracellulaire processen zijn sterk gevoelig aan pH, zoals de synthese van proteïnes, het
metabolisme, de functie van de mitochondria en de regeling van het cytoskelet (Roos en Boron, 1981;
Boron, 1987; Bavister, 1996). Cellen regelen hun intracellulaire pH (pHi) aan de hand van kanalen in
het plasmamembraan. De Na+,HCO3-/Cl- uitwisselaar en de Na+/H+ uitwisselaar zorgen ervoor dat de
pHi wordt verhoogd en de HCO3-/Cl- uitwisselaar verlaagt de pHi. (Roos en Boron, 1981; Boron, 1987)
De pHi van menselijke eicellen bedraagt 7,4 ± 0,1. Ze is niet significant verschillend tussen
GV-stadium eicellen, mature MII-stadium eicellen, verouderde niet bevruchte MII eicellen en
bevruchte twee pronucleair-stadium zygotes. Meiose en vroege ontwikkeling van menselijke eicellen
gaan dus niet gepaard met lange-termijn veranderingen in de pHi. (Dale et al., 1998)
Tijdens de vroege groei van de eicel wordt de pHi geregeld door de pH regelende mechanismen van de
omgevende granulosa cellen, aan de hand van gap junctions. De werking van gap junctions is een
noodzaak voor de groei van de eicel. Zij zorgen voor een metabole samenwerking. Granulosa cellen
metaboliseren glucose en voorzien de eicel van componenten die ze kan gebruiken, zij
vergemakkelijken ook de opname van sommige aminozuren en nucleotiden. Verder zorgen zij er ook
voor dat eicellen tijdens hun groei bestand zijn tegen alkalose, aan de hand van de
HCO3-/Cl- uitwisselaar. Hoewel de pHi van gedenudeerde eicellen stijgt naar het einde van de groei
toe, zal koppeling aan de omgevende granulosa cellen de pHi van de eicel binnen de smalle range van
7,2 - 7,3 houden. Ook de Na+/H+ uitwisselaars en het H+ V-ATPase van de granulosa cellen zouden ter
beschikking staan van de eicel. Zo is de eicel gedurende de groei ook bestand tegen acidose.
(FitzHarris and Baltz, 2006; FitzHarris et al., 2007)
Erdogan et al. (2005) bestudeerden de verdere interne pH regeling door middel van onderzoek op
eicellen van muizen. Pas op het einde van haar groei, wanneer de eicel ongeveer 80% van haar
maximale diameter heeft bereikt, is de eicel zelf in staat om haar interne pH te regelen. Op dit
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
12
2. Inleiding
ogenblik verwerven de eicellen de mogelijkheid de meiotische cyclus te reactiveren. Dit weerspiegelt
de ontwikkeling van de capaciteiten van de eicel om onafhankelijk van de follikel te functioneren.
Naar het einde van de groei toe wordt, naast de activatie van beide types pHi regulatie mechanismen,
ook een merkwaardige toename van de pHi van geïsoleerde eicellen vastgesteld. Dit zou veroorzaakt
worden door de activatie van de Na+/H+ uitwisselaar. Hierna wordt de pH binnen een smalle range
geregeld door de tegengestelde werking van de Na+/H+ en de HCO3-/Cl- uitwisselaars. Alhoewel een
merkwaardige stijging van de pHi wordt vastgesteld bij geïsoleerde eicellen is het niet zeker of deze
stijging ook optreedt bij intacte in vivo eicellen. Mogelijks gedragen eicellen in een intacte follikel
zich gelijkaardig, met een lage pHi voordat de meiotische cyclus wordt gereactiveerd en nadien een
stijging van de pHi. Het is ook mogelijk dat de pHi in vroeg groeiende eicellen op een hoog niveau
wordt gehouden door de granulosa cellen dewelke de eicel omringen.
Gedurende de passage vanuit de follikel naar de uterus, gaat het embryo door drie verschillende
omgevingen. De pH van het folliculair vocht bedraagt 7,2 tot 7,3 (Shalgi et al., 1972; Imoedembe et al.,
1993). Deze van het oviductaal vocht is meer alkalisch (Iritani et al., 1971; Maas et al., 1976), wat
doet vermoeden dat een hoge pH nodig is voor de preïmplantaire ontwikkeling van het embryo
(Maas et al., 1976). De pH van de uterus zou dan weer lager zijn.
Voor de bevruchting van de eicel is een extracellulaire pH van 7,5 vereist. Het binden van de zaadcel
aan de zona pellucida is namelijk pH afhankelijk. Het follikelvocht zou in belangrijke mate bijdragen
tot het creëren van een perfecte omgeving voor de bevruchting van de eicel na de ovulatie. Deze grijpt
plaats in het oviduct, dat meer alkalisch van pH is. De meer alkalische omgeving van de eicel
gedurende de preïmplantaire ontwikkeling zorgt ervoor dat H+-ionen uit de eicellen worden
getransporteerd langs het plasmamembraan, dat erg permeabel is voor H+-ionen. Dit houdt de
acidificatie van de eicel ten gevolge van het metabolisme van het embryo tegen, die kan zorgen voor
fragmentatie van het embryo. De eicel wordt dus meer alkalisch. Dit proces wordt op zijn beurt
gebufferd door de HCO3-/Cl- pomp die de pHi verlaagt door het naar buiten pompen van HCO3-.
Tijdens het transport van oviduct naar uterus ontwikkelt het embryo zuurbufferende mechanismen,
mogelijks om aan de zuurdere pH in de uterus tegemoet te komen. (Dale et al., 1998)
Deze laattijdige activatie van de zuurbufferende mechanismen van de eicel kunnen verklaren waarom
menselijke embryo’s in het pre-blastocytair stadium een lagere implantatiegraad hebben dan
blastocyten na transfer (Menezo et al., 1992; Kauffmann et al., 1994). De zure omgeving van de uterus
kan namelijk niet gebufferd worden door de pre-blastocyten, waardoor verschillende metabole
pathways vertraagd worden die belangrijk zijn bij de ontwikkeling vóór de implantatie (Dale et al.,
1988).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
13
2. Inleiding
Een andere mogelijke verklaring is dat blastocysten verder gevorderd zijn in de ontwikkeling en dat er
al een natuurlijke selectie heeft plaatsgevonden, die op dag twee/drie nog moet gebeuren. Daardoor is
de implantatiekans per teruggeplaatst embryo hoger naarmate de cultuur verder gevorderd is.
2.8 Rol van het bloed in het follikelvocht
In het verleden werden reeds verschillende onderzoeken uitgevoerd om uit te maken of de graad van
bloedbijmenging van het follikelvocht een goede parameter is om te bepalen welke eicellen meest
geschikt zijn voor IVF of ICSI. Het bepalen van de bloedbijmenging gebeurde daarbij meestal aan de
hand van spectrofotometrische analyse. Daarnaast kan de graad van bloedbijmenging ook bepaald
worden aan de hand van hematocrietbepaling, hemoglobinebepaling, urinesticks of visuele inspectie.
Visuele beoordeling, uitgevoerd door een capabele observator, is een snelle en relatief betrouwbare
methode om follikelvocht met bloedbijmenging op te sporen. Het voordeel ervan is dat het snel is,
geen bijkomende kosten met zich meebrengt, een groter discriminerend vermogen heeft dan
hematocriet of spectrofotometrie en minder arbeidsintensief is. Het is echter niet zo betrouwbaar als de
combinatie van hematocriet en spectrofotometrie samen en het is operatorafhankelijk. (Levay et al.,
1997)
Cosyn en Jacobs (2007-2008) ontwikkelden een kleurenkaart voor het standaardiseren van de visuele
inspectie van bloedbijmenging. Deze kleurenkaart bestaat uit twintig kleuren die elk gecorreleerd zijn
aan een bepaalde hematocrietwaarde. Hoe lichter de kleur, hoe lager de hematocrietwaarde, en
omgekeerd. Het afkappunt van de test werd gezet op kleur vijftien. Bij stalen met een kleur lichter dan
kleur vijftien is het gemiddeld hematocriet lager dan één. Naarmate de kleur van het follikelvocht
donkerder wordt dan kleur vijftien neemt de graad van bloedbijmenging toe. Met het ontwikkelen van
deze kaart werd een handig medium voor onderzoek van follikelvocht verkregen. Zo kan men op een
snelle manier zuiver follikelvocht selecteren zonder dat men een staal moet nemen om er verdere
proeven op uit te voeren. De kans dat bij deze staalafname een eicel verloren gaat, wordt hierbij dus
ook vermeden.
Spectrofotometrische analyses uitgevoerd door Bayer et al. (1988) toonden een 415- en 455 nm piek
van maximale absorptie, die beide in het gele spectrum liggen. Deze gele kleur is het resultaat van
kleine hoeveelheden galpigment, bilirubine en carotinoïden. Bilirubine kan positief gecorreleerd
worden aan de absorptie bij 455 nm. Het is het afbraakproduct van hemoglobine en kan al dan niet
geconjugeerd zijn, afhankelijk van zijn bindingstoestand aan albumine. Dankzij het laag moleculair
gewicht van bilirubine kan het gemakkelijk diffunderen van de gevasculariseerde theca over de lamina
propria in het follikelvocht. Er is een sterk positieve correlatie tussen de graad van eicelbevruchting en
de absorptiegraad bij 415 en 455 nm. De eicellen van follikels met hogere concentratie aan bilirubine
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
14
2. Inleiding
kunnen dus gemakkelijker bevrucht worden, zonder gekende reden. Bayer et al. postuleerden dat de
hoeveelheid bilirubine proportioneel is aan de graad van vascularisatie van de follikel. Deze hogere
vascularisatiegraad zou kunnen zorgen voor een hogere concentratie aan factoren die de bevruchting
bevorderen.
Verder onderzoek van Bayer et al. (1990) toonde opnieuw een sterk positieve correlatie tussen
bevruchting en absorptie bij 455 nm. Daarentegen is de absorptie van het follikelvocht niet
gecorreleerd aan de graad van embryodeling. Embryoklieving is dus afhankelijk van andere factoren.
De hypothese dat 455 nm absorptie een marker is van de graad van vascularisatie werd in dit
onderzoek ontkracht. Indien follikels beter gevasculariseerd zijn, zou de inhoud aan proteïnen en
steroïden in het follikelvocht zijn toegenomen. Hun nieuwe verklaring voor de relatie tussen 455 nm
absorptie en bevruchting is dat de individuele substanties die absorberen aan deze golflengte een
directe impact hebben op de eicelkwaliteit.
Huyser et al. (1992) bepaalden het absorptieprofiel van bloed- en mediumgecontamineerde
follikelvochten, alsook van niet-gecontamineerde follikelvochten. Daarnaast werd de hypothese getest,
die stelt dat bloedcontaminatie de biochemische status van follikelvocht beïnvloedt. Daaruit bleek dat
bloedcontaminatie
en
dilutie
met
medium
de
biochemische
samenstelling,
alsook
het
absorptiespectrum van het follikelvocht beïnvloeden. Spectrofotometrische evaluatie is bijgevolg een
bruikbare en efficiënte screeningsmethode om de normaliteit van follikelvocht te evalueren.
Een jaar later onderzochten Huyser et al. (1993) de mogelijke correlatie tussen de absorptie bij 458 nm
en biochemische variabelen (gonadotropines, hCG, testosteron, prolactine, siaalzuur, alfa1-antitrypsine
en plasminogeen) en IVF parameters (volume van het follikelvocht, aanwezigheid van eicellen in het
follikelvocht, eicelbevruchting, celstadium en embryoscore bij embryotransfer en zwangerschap). Uit
dit onderzoek bleek dat de spectrofotometrische absorptie van follikelvocht dat niet door bloed is
gecontamineerd, niet bruikbaar is als index voor de IVF-capaciteit van humane eicellen. Dit in
tegenstelling tot de vaststellingen van Bayer et al. (1988; 1990) (Zie hoger). Verder werd een
significante correlatie tussen de absorptie bij 458 nm en een kleiner follikelvolume geobserveerd. Dit
zou kunnen betekenen dat grotere follikels, met significant lagere absorptie dan kleine follikels,
eicellen bevatten met een hogere delingscapaciteit en daardoor een hogere kans op klinische
zwangerschap. Hoewel deze studie een significant lagere maximale absorptie in het follikelvocht van
patiënten met klinische zwangerschap aantoonde, was er geen correlatie met de gemeten hormonen en
proteïnen. Absorptie bij 458 nm van niet-gecontamineerd follikelvocht kan dan ook niet beschouwd
worden als een exclusieve parameter om het potentieel van eicellen om in vitro te ontwikkelen, te
voorspellen.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
15
2. Inleiding
Later verscheen nog een onderzoek dat aantoonde dat het niet optreden van de bevruchting van de
eicellen niet significant beïnvloed werd door de aanwezigheid van bloed in het follikelvocht.
(Crane et al., 2004)
Er kon wel een correlatie worden aangetoond tussen de graad van bloedbijmenging en de pH van het
follikelvocht. De pH van het follikelvocht daalt namelijk significant bij een stijgende graad van
bloedbijmenging. (Daya, 1988)
De aanwezigheid van bloedklonters in de cumulus is een negatieve predictor van bevruchting en
celdeling. Het is van belang dat eicellen snel worden geïncubeerd na hun aankomst in het labo.
Aanwezigheid van bloedklonters in het Cumulus-Oöcyte Complex (COC) kan voor verlenging van de
tijd tot incubatie zorgen, aangezien het verwijderen ervan meer tijd in beslag neemt. Daardoor kunnen
fluctuaties in de temperatuur optreden dewelke de bevruchting kunnen beïnvloeden. Een andere
verklaring is dat hyaluronidase-loslating verhinderd wordt of dat het contact tussen de zona pellucida
en de zaadcellen wordt geblokkeerd. De aanwezigheid in het maternale bloed van anti-sperma
antilichamen en/of antilichamen tegen de spermareceptor kunnen een mogelijke verklaring voor deze
vaststelling zijn. Het is dus van belang follikelvocht te verzamelen dat vrij is van bloedklonters. (Daya
et al., 1990)
Uit deze onderzoeken blijkt dat er nog niet eenduidig aangetoond kan worden wat de graad van
bloedbijmenging in het follikelvocht betekent voor de resultaten van IVF en ICSI. Verder onderzoek
kan mogelijks het IVF/ICSI-proces optimaliseren en de slaagcijfers nog verbeteren.
2.9 Kwaliteitsbeoordeling van de embryo’s
Het ultieme doel van geassisteerde voortplanting is het bekomen van éénlingzwangerschappen. Het
toepassen van Single Embryo Transfer (SET) is de enige gegarandeerde manier om dit doel te
bereiken (Coetsier en Dhont, 1998). Om die reden wordt in België, zoals eerder besproken, het aantal
embryo’s dat wordt teruggeplaatst, bepaald door de wet. Het aantal teruggeplaatste embryo’s is sterk
gecorreleerd met de slaagkans van de behandeling. Alvorens op SET over te kunnen schakelen, is het
noodzakelijk die embryo’s te selecteren die een grote kans op implantatie hebben. (Van Royen et al.,
1999)
Om het kiezen van de embryo’s met de beste kans op implantatie te vereenvoudigen, werd getracht de
embryo’s langer te bewaren in het cultuurmedium. Hierdoor zouden door zelfselectie (meestal op basis
van aneuploïdie) enkel de beste embryo’s overblijven. Langer wachten tot terugplaatsing is echter niet
evident, aangezien er hierdoor minder embryo’s overblijven voor terugplaatsing. Idealiter zou men een
evenwaardige selectie van de embryo’s moeten kunnen uitvoeren, maar in een vroeger stadium. Om
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
16
2. Inleiding
die reden bepaalden Van Royen et al. (1999) retrospectief de karakteristieken van embryo’s dewelke
aanleiding gaven tot verder evoluerende implantatie. Deze top kwaliteit embryo’s werden gekenmerkt
door vier of vijf blastomeren op dag twee, zeven of meer blastomeren op dag drie, maximaal 20%
fragmentatie op dag drie en afwezigheid van meerkernige blastomeren. De implantatie van deze top
embryo’s is gelijkaardig aan deze van blastocysten. Daarnaast vermindert het minder lang bewaren in
cultuurmedia ook de kostprijs van de behandeling, alsook het risico dat er geen blastocyst embryo’s
zouden over zijn voor transfer (Scholtes en Zeilmaker, 1998; Shoukir et al., 1998). Daarom kan
transfer op dag drie van top embryo’s worden aanbevolen.
Volgens Fauque et al. (2007) werd de beste implantatiegraad vastgesteld na transfer van embryo’s met
vier cellen en minder dan 20% fragmentatie op dag twee. Te snelle of te trage celdeling zorgt voor een
lagere implantatiekans. Ook de fragmentatiegraad heeft een sterke invloed op de implantatie, alsook
op de post-implantaire ontwikkeling. Dit onderzoek toonde ook aan dat, naast de implantatie, ook de
zwangerschapsuitkomst en het aantal levendgeborenen stijgen na de implantatie van een top kwaliteit
embryo.
De twee voornaamste morfologische eigenschappen zijn het aantal cellen op een bepaald tijdstip en de
graad van fragmentatie. Een retrospectief onderzoek van Ziebe et al. (1997) toonde aan dat bij de
kwaliteitsbeoordeling van embryo’s het aantal cellen superieur is aan het aantal fragmenten. Zo dient
een viercellig embryo op dag twee, zelfs met lichte fragmentatie, verkozen te worden voor transfer
boven een tweecellig embryo zonder fragmentatie.
Hesters et al. (2008) toonden aan dat de vroegtijdige evaluatie van de morfologie van ‘early cleaved’
zygotes in een IVF programma een effectieve en valabele methode kan zijn om de viabiliteit van het
embryo in te schatten. Early cleaved zygotes met gelijke blastomeren en minder dan 20% fragmentatie
leiden tot een groter aantal embryo’s van goede kwaliteit. Dit kan als een vroeg criterium gebruikt
worden, complementair aan embryo morfologie op dag twee, om embryo’s op kwaliteit te scoren.
Beoordeling van de morfologie van de pronucleï, vroege celdeling, het aantal cellen op dag twee en de
fragmentatie op dag twee kunnen beschouwd worden als parameters die gecorreleerd worden aan het
ontwikkelingsvermogen van het embryo. De predicatieve waarde van deze vier gecombineerde
parameters blijft echter laag, maar tot nu toe is er nog geen waardig alternatief voor de morfologische
beoordeling van embryo’s beschikbaar. (Guerif et al., 2007)
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
17
2. Inleiding
2.10
Waarom dit onderzoek?
België beschikt over een wettelijke regeling omtrent transport-IVF en transport-ICSI. Deze technieken
werden hoofdzakelijk ingevoerd uit praktische overwegingen. Uit voorgaande literatuurstudie blijkt
dat er nog veel vragen zijn in verband met de ideale transportcondities en de gevolgen van het
transport op de eicelkwaliteit en de fertilisatie. De omstandigheden waarin dit transport dient te
gebeuren, zijn dan ook niet concreet bepaald, op het voorzien van een constante temperatuur aan de
hand van een isolerende vervoerdoos na.
Door de pH en de bloedbijmenging te bepalen van aspiraten die na transport vanuit het AZ Sint Lucas
(Gent) een ICSI-behandeling ondergaan in het UZ Gent, werd de invloed van de pH en de
bloedbijmenging na transport op de eicelkwaliteit en de fertilisatiegraad onderzocht. Deze resultaten
zouden eventueel later het transportproces en de wetgeving daaromtrent kunnen beïnvloeden.
Deze studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van het UZ Gent en van het AZ Sint Lucas
(Gent) (zie appendix 1).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
18
3. Methodologie
3. METHODOLOGIE
3.1 Patiënten
3.1.1
Powerberekening
Vóór de aanvang van de studie werd aan de hand van een steekproef van tien ICSI-patiënten de
gemiddelde waarde en de standaarddeviatie bepaald van de fragmentatie van embryo’s op dag twee.
Op basis van deze waarden en rekening houdend met de verhouding bloedgecontamineerde stalen ten
opzichte van niet-bloedgecontamineerde stalen zoals teruggevonden bij Cosyn en Jacobs (2007-2008),
werd een powerberekening uitgevoerd. Hierbij werd een verschil in fragmentatie van 10% tussen
beide groepen als klinisch relevant beschouwd. Dit was gebaseerd op de embryoscore, waarbij het
verschil tussen goede en excellente embryo’s 10% bedraagt.
Uit deze powerberekening werd afgeleid dat er in elke groep dertig embryo’s nodig waren. Rekening
houdend
met
een
verhouding
van
twee
niet-bloedgecontamineerde
stalen
t.o.v.
één
bloedgecontamineerd staal, betekende dit dat er respectievelijk zestig en dertig embryo’s nodig waren.
Uitgaande van een gemiddelde van vijf à tien embryo’s per patiënte en om enige veiligheidsmarge te
hebben, werd vooropgesteld vijftien à twintig patiënten in het onderzoek op te nemen.
3.1.2
Inclusie- en exclusiecriteria
De patiënten opgenomen in deze studie voldeden allen aan een aantal vooropgestelde selectiecriteria:
De patiënten namen allen deel aan een transport-ICSI behandeling waarbij de stimulatieprocedure en
de follikelpunctie plaatsvond in het AZ Sint-Lucas (Gent) en waarna de aspiraten getransporteerd
werden naar het IVF labo van het UZ Gent. Enkel eicellen behandeld met ICSI en gebruik makend van
vers ejaculaat werden in het onderzoek opgenomen.
Ook patiënten waarvan de helft van de eicellen behandeld werd met ICSI en de andere helft met IVF,
werden in dit onderzoek toegelaten. In de statistische analyse werden echter uitsluitend de eicellen die
met ICSI werden bevrucht, opgenomen.
Patiënten werden enkel in het onderzoek opgenomen na verwerven van het ‘informed consent’ en na
ondertekening van het Nederlandstalig toestemmingsformulier.
Om een eventueel optredende zwangerschap te kunnen linken aan de oorspronkelijke eicel en de
proefbuis waaruit deze afkomstig was, werden in de studie enkel patiënten opgenomen waarbij slechts
één embryo werd teruggeplaatst. Volgens de terugbetalingswet is dit verplicht voor patiënten jonger
dan 36, die een eerste of tweede poging ondergaan.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
19
3. Methodologie
Het was van belang dat er op het ogenblik van de punctie geen ‘flushing’ werd uitgevoerd. Flushing is
een techniek die wordt aangewend bij patiënten met minder dan vijf rijpe follikels op het ogenblik van
de punctie. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een dubbel lumen naald om de follikels met behulp van
medium te spoelen. Dit zorgt ervoor dat de eicellen die in de follikels aanwezig zijn gemakkelijker
loskomen. Dit spoelmedium verdunt de aspiraten en beïnvloedt zo de pH-meting en de visuele
beoordeling van de bloedbijmenging. Daarom werden patiënten enkel in de studie opgenomen indien
de punctie werd uitgevoerd met een single lumen naald.
Om de transportomstandigheden zo constant mogelijk te houden en verschillen in transportcondities
tussen de verschillende patiënten te beperken, werd voor het transport van de aspiraten een beroep
gedaan op een transportbox type LEC-960 portable incubator.
Wegens het potentiële gevaar van virale transmissie via de meetapparatuur werden patiënten met HIV,
hepatitis B of C niet in het onderzoek opgenomen.
Ook patiënten die reeds met een vorige cyclus in deze studie werden opgenomen, werden
geëxcludeerd.
3.1.3
Rekrutering
Op het ogenblik dat bij een welbepaalde patiënte een follikelpunctie werd gepland, werd nagegaan of
de patiënte in het onderzoek kon worden opgenomen. Daarvoor moest aan alle inclusie- en
exclusiecriteria worden voldaan. Bij een eerste cyclus ging de arts bij het plannen van de punctie na of
de patiënte al dan niet akkoord ging met het informed consent. In het geval van een tweede cyclus
moest worden nagegaan of het informed consent aanwezig was in het patiëntendossier van het
UZ Gent.
Gedurende zes maanden (midden juni tot midden december 2009) werd dagelijks (enkel op
weekdagen) contact opgenomen met het secretariaat van het gynaecologisch centrum van het
AZ Sint-Lucas om na te gaan of er de volgende dag puncties gepland waren die voor de studie in
aanmerking kwamen. Het labo werd op de hoogte gesteld indien er de volgende dag metingen voor de
studie zouden plaatsvinden.
3.2 Studieprocedure
In het kader van deze studie werd een beroep gedaan op de standaard ICSI-behandelingsprocedure. Er
traden echter enkele bijkomende interventies op die afweken van het standaard protocol. Deze worden
hieronder opgesomd:
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
20
3. Methodologie
Stimulatie van de eierstokken, follikelpunctie, transport van de aspiraten en bevruchting van de
eicellen d.m.v. ICSI gebeurden volledig zoals beschreven in de standaardprocedure. Voordat de
standaard laboratoriumfase werd aangevat, vonden een aantal extra handelingen en metingen plaats.
Bij aankomst van de transportbox in het UZ Gent werden de proefbuizen genummerd. De pH en de
bloedbijmenging van elke proefbuis werd gemeten. De gemeten waarden werden aan de hand van het
nummer op de proefbuis zorgvuldig in de database opgenomen.
De pH registratie werd uitgevoerd met een pH-meter van het type Beckman 200–ф240 tot op 0,01
nauwkeurig. Deze werd vóór de aanvang van de metingen gekalibreerd met behulp van
standaardbufferoplossingen van Titronorm: kaliumhydrophtalaat (pH 4) en kaliumdihydroxide (pH 7).
Per buis werd de pH drie keer geregistreerd. De elektrode werd bovenaan in het follikelvocht geplaatst
tot net onder de vloeistofmeniscus, om de kans op het ‘meenemen’ van een eicel aan de elektrode te
beperken (aangezien het cumulus-oöcyte-complex naar de bodem van de proefbuis zakt). Dit alles
gebeurde onder strikt gecontroleerde temperatuurscondities. Na elke registratie werd de elektrode
boven een proefbuis afgespoeld met een medium met neutrale pH en zorgvuldig afgedroogd. Deze
procedure zorgde ervoor dat de opeenvolgende metingen elkaar niet beïnvloedden. De spoelvloeistof
werd nadien samen met de andere proefbuizen gecontroleerd op de aanwezigheid van eicellen, zodat
een eventueel meegenomen eicel op de elektrode toch niet verloren ging. Alvorens over te gaan tot een
volgende patiënte werd de elektrode tweemaal grondig ontsmet met ethanol 70% en dan tweemaal
gespoeld met medium.
De graad van bloedbijmenging werd na de meting van de pH geëvalueerd. Dit gebeurde aan de hand
van een kleurenkaart, ontwikkeld door Cosyn en Jacobs (2007-2008) (zie appendix 3). De kaart
bestaat uit een schaal van twintig kleurentinten die overeenstemmen met een bepaalde
hematocrietwaarde (%).
Tijdens transport zakken de rode bloedcellen naar de bodem van de proefbuis. Om de meting van de
bloedbijmenging correct te laten verlopen, werd de vloeistof in de buis gemengd door elke proefbuis
enkele malen om te keren. Om een correcte evaluatie uit te voeren, werden zowel het aspiraat als de
kleurenkaart tegen een witte achtergrond gehouden en dit zonder inval van rechtstreeks licht. Ook
gedurende deze procedure werd een strikte temperatuurscontrole gehandhaafd.
Zoals beschreven in de standaardprocedure werden vervolgens de eicellen in de aspiraten opgespoord.
In het kader van deze studie was het van belang de buizen één voor één afzonderlijk te onderzoeken op
de aanwezigheid van eicellen. Volgens de standaardprocedure kunnen meerdere eicellen in één
druppel fertilisatiemedium in de collectieschaal worden ondergebracht. Tijdens deze studie werden de
eicellen elk afzonderlijk in een druppel bewaard. Op de onderzijde van de collectieschaal werd het
nummer van elke eicel genoteerd. Deze nummers werden overgenomen in het dossier van de patiënte,
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
21
3. Methodologie
alsook in de database van de studie. Zo bleef het mogelijk de bevruchtingsresultaten van elke eicel
verder op te volgen.
3.3 Uitkomstvariabelen
Primaire variabele
Fragmentatie:
Zowel op dag twee als op dag drie werd de fragmentatie van het embryo
beoordeeld. Hierbij werd gekeken naar de hoeveelheid cytoplasmafragmenten
die afgesplitst werden van de blastomeren. Deze variabele wordt uitgedrukt in
procent.
Secundaire variabelen
Eicelmaturiteit:
Deze werd beoordeeld op basis van de morfologie van de nucleus van de eicel.
Er werd onderscheid gemaakt tussen germinaal vesikel (GV), meiose I (MI) of
meiose II (MII). GV en MI werden beschouwd als onrijpe eicellen. Andere
mogelijke beoordelingen van eicelmaturiteit zijn: gedegenereerd (Degener),
beschadigd (B), abnormaal en ‘out of zona’. Ook deze werden beschouwd als
onrijpe eicellen.
Fertilisatie:
Om de bevruchting na te gaan, werd een beoordeling gemaakt van het aantal
pronucleï van de zygote. In normale omstandigheden verwacht men twee
pronucleï (2PN), een mannelijke en een vrouwelijke. Het embryo kan ook één
of drie pronucleï hebben, gedegenereerd of beschadigd zijn. De eicel kan ook
niet bevrucht zijn.
Aantal blastomeren:
Zowel op dag twee als op dag drie na de bevruchting werd de klieving van het
embryo beoordeeld. Eén van de factoren die hierbij bekeken werd, was het
aantal blastomeren in het embryo. Op dag twee verwacht men twee tot vier
blastomeren, op dag drie zijn dat er zeven of acht. Daarnaast werd ook gelet
op de grootte van de blastomeren, de onderlinge gelijkheid van de
verschillende blastomeren en het aantal nucleï in de blastomeren.
Meerkernigheid:
Zowel op dag twee als op dag drie werden de embryo’s beoordeeld op
meerkernigheid. Daarbij werden de blastomeren afzonderlijk beoordeeld op de
aanwezigheid van meer dan één kern.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
22
3. Methodologie
Embryoscore:
Dit is een score die bepaald werd aan de hand van de fragmentatie van het
embryo. Deze score gaat van één tot vijf. Hoe hoger de score, hoe lager de
fragmentatie en hoe beter de kwaliteit van het embryo.
Tabel 4: Percentage fragmentatie en overeenkomstige embryoscore
Percentage fragmentatie (%)
Overeenkomstige embryoscore
Cryopreservatie:
0
5
1 – 10
4
11 – 25
3
26 – 50
2
>50
1
Om na te gaan of een embryo al dan niet invriesbaar was, werden
verschillende factoren beoordeeld. Embryo’s met een fragmentatie tot 25%
komen in aanmerking voor cryopreservatie. Embryo’s die op dag drie uit
minder dan vijf blastomeren bestaan of meerkernige blastomeren bevatten,
worden uitgesloten voor cryopreservatie. Aan de hand van deze criteria werd
een onderscheid gemaakt tussen invriesbare versus niet-invriesbare embryo’s.
Embryotransfer:
Zoals hogerop vermeld, gebeurt de embryotransfer enkele dagen na de
fertilisatie. In de gekozen studiepopulatie werd telkens één embryo
getransfereerd. In het dossier van de patiënte werd opgenomen welk embryo
getransfereerd werd.
Bovenstaande variabelen worden standaard in het IVF-laboratorium gecontroleerd en opgenomen in
het dossier van de patiënte.
Zwangerschap:
De zwangerschap werd beoordeeld aan de hand van de aanwezigheid van hCG
in het bloed. In het onderzoek werd onderscheid gemaakt tussen
hCG-positieve en hCG-negatieve patiënten.
Evolutieve zwangerschap: Hierbij werd gekeken hoe de zwangerschap zich verder zet na één trimester.
Er werd onderscheid gemaakt tussen een normaal verloop en een afwijkend
verloop. Onder een afwijkend verloop werd verstaan miskraam, extra-uteriene
zwangerschap en biochemische zwangerschap. Eénmaal voorbij twaalf weken
werd gesproken van een evolutieve zwangerschap.
Deze gegevens werden geanonimiseerd via de behandelende gynaecologen bezorgd.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
23
3. Methodologie
3.4 Dataverwerking
De verzamelde data werden ingevoerd in een dataset met behulp van MS Excel 2007.
Voor de verdere verwerking van de data in dit onderzoek werd gebruik gemaakt van de statistische
analyse software SPSS 16.0 (Statistical Package for the Social Sciences).
De fertilisatieratio werd berekend volgens het aantal normaal bevruchte eicellen (2PN) ten opzichte
van het aantal mature eicellen (MII).
De ‘embryo utilisation ratio’ werd berekend door de som van het totaal aantal gecryopreserveerde en
getransfereerde embryo’s te delen door het totale aantal eicellen met twee pronucleï (2PN).
De pH van elke proefbuis werd telkens drie maal gemeten. Bij de verdere analyse werd gebruik
gemaakt van het gemiddelde van deze drie pH-waarden. Alvorens deze te gebruiken, werd de
correlatie tussen de metingen onderling en de correlatie tussen de gemiddelde pH en de afzonderlijke
metingen bepaald.
Daarvoor werd de intraclass correlatiecoëfficiënt (ICC) berekend. Deze coëfficiënt drukt de
reproduceerbaarheid van de metingen uit. Hoe dichter de waarde ervan bij één ligt, hoe beter de
reproduceerbaarheid.
Er werd ook een inter-item correlatie matrix opgesteld aan de hand van de Pearson
correlatiecoëfficiënten. Zo kon het verband tussen de metingen onderling bekeken worden. Hoe
dichter de correlatiecoëfficiënt bij één ligt, hoe sterker het verband tussen de pH-waarden. De
correlatie is significant bij een P-waarde die kleiner is dan 0,01 (tweezijdig).
In SPSS werd een beschrijvende tabel opgemaakt voor de gemeten waarden van de pH en de
bloedbijmenging. Deze werden telkens berekend per buis.
Bij de analyses in verband met bloedbijmenging werd deze variabele als dichotoom beschouwd. Zo
werden twee groepen verkregen: een groep met ‘geen bloedbijmenging’ bij waarden van één tot en
met vijftien en een groep met ‘aanwezige bloedbijmenging’ bij waarden van zestien tot en met twintig.
Ook sommige uitkomstvariabelen werden bij de statistische analyse ingedeeld in groepen.
De eicelmaturiteit werd ingedeeld in een groep ‘niet matuur’ en een groep ‘matuur’. De eicellen die
zich in het stadium twee van de meiose (MII) bevonden, werden ingedeeld in de groep ‘matuur’. De
overige eicellen werden ingedeeld in de groep ‘niet matuur’.
Voor de evaluatie van de fertilisatie werd in eerste instantie het al dan niet bevrucht zijn, beoordeeld.
Hiervoor werden twee groepen gemaakt: een groep ‘niet bevrucht’ en een groep ‘bevrucht’. In de
groep ‘niet bevrucht’ werden enkel eicellen opgenomen die niet bevrucht werden. In de groep
‘bevrucht’ werden de eicellen met één, twee of drie pronucleï en gedegenereerde en beschadigde
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
24
3. Methodologie
embryo’s opgenomen. In tweede instantie werd in de groep van de bevruchte eicellen een onderscheid
gemaakt tussen de abnormaal bevruchte en de normaal bevruchte eicellen. In de groep ‘normaal
bevrucht’ werden embryo’s met twee pronucleï ingedeeld. De overige bevruchte embryo’s werden
ingedeeld in de groep ‘abnormaal bevrucht’.
Bij de analyse van het aantal cellen op dag twee werden de embryo’s in twee groepen geanalyseerd.
Een groep ‘viercellig embryo’ met de embryo’s met vier cellen en een groep ‘niet viercellig embryo’
met de overige embryo’s. Deze indeling werd uitgevoerd omdat het viercellig embryo als optimaal
wordt beschouwd op dag twee.
Volgens het aantal cellen op dag drie konden de embryo’s met acht cellen ingedeeld worden in een
groep ‘achtcellig embryo’ aangezien dit als optimaal wordt beschouwd op dag drie. De overige
embryo’s konden worden ingedeeld in de groep ‘niet achtcellig embryo’.
De meerkernigheid van de embryo’s op dag twee en dag drie werd bij de statistische verwerking
ingedeeld in twee groepen. Een embryo werd als meerkernig beschouwd zodra één van de blastomeren
meer dan één kern bevatte. Zo werden de embryo’s ingedeeld in een groep ‘niet meerkernig’ en een
groep ‘meerkernig’.
De embryoscore op dag twee werd ingedeeld in drie groepen. Embryo’s met een score van vijf of vier
werden ingedeeld in de groep ‘excellent embryo’. Bij een score van drie werden zij in de groep ‘matig
embryo’ opgenomen en embryo’s met een score van twee of één werden ingedeeld bij de groep ‘slecht
embryo’.
Er werd nagegaan of er een verband bestaat tussen de pH en de bloedbijmenging van de folliculaire
aspiraten. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de Mann-Whitney U test. In deze analyse werden ook
de buizen met eicellen die later behandeld werden met IVF opgenomen. Dit had geen invloed op het
resultaat, aangezien hier enkel een verband tussen twee parameters van het follikelvocht gezocht werd.
De uiteindelijke behandeling (IVF of ICSI) die de eicellen uit de buizen ondergingen, hing niet samen
met de onderzochte parameters.
Voor de analyse van de invloed van de bloedbijmenging op de eicelmaturiteit, het al dan niet bevrucht
zijn, het al dan niet normaal bevrucht zijn, de viercelligheid, de meerkernigheid op dag twee, de
embryoscore, de achtcelligheid, de embryotransfer en de cryopreservatie werd telkens gebruik
gemaakt van de Chi-kwadraat test.
Bij de analyse van de bloedbijmenging ten opzichte van de meerkernigheid op dag drie, de
biochemische zwangerschap en de evolutieve zwangerschap werd een Fisher’s Exact test uitgevoerd.
De Fisher’s Exact test werd gebruikt indien niet aan de voorwaarde van de Chi-kwadraat test werd
voldaan. Deze voorwaarde stelt dat minder dan twintig procent van de cellen een verwachte waarde
van minder dan vijf hebben.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
25
3. Methodologie
Er werd ook een verband gezocht tussen de bloedbijmenging en de fragmentatie op dag twee. Het al
dan niet normaal verdeeld zijn van de fragmentatie en van het logaritme van de fragmentatie werd
onderzocht aan de hand van een Q-Q plot. Dit gebeurde om na te gaan of een parametrische test kon
worden uitgevoerd. Gezien de normaalverdeling van het logaritme van de fragmentatie op dag twee,
kon gebruik gemaakt worden van de ongepaarde Student T test.
De invloed van de gemiddelde pH op de eicelmaturiteit, het al dan niet bevrucht zijn, het al dan niet
normaal bevrucht zijn, de viercelligheid, de meerkernigheid op dag twee, de achtcelligheid, de
meerkernigheid op dag drie, de embryotransfer, de cryopreservatie, de biochemische zwangerschap en
de evolutieve zwangerschap werd onderzocht aan de hand van de Mann-Whitney U test.
Bij de analyse van het verband tussen de gemiddelde pH en de embryoscore op dag twee werd een
Kruskal-Wallis test uitgevoerd.
Het verband tussen de gemiddelde pH en de fragmentatie op dag twee en dag drie werd onderzocht.
Aangezien het logaritme van de fragmentatie op dag twee normaal verdeeld was, werd gebruik
gemaakt van de parametrische Pearson coëfficiënt om dit verband te onderzoeken. Hoe dichter de
bekomen waarde bij één ligt, hoe sterker het verband.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
26
4. Resultaten
4. RESULTATEN
Van midden juni 2009 tot midden december 2009 werden achttien puncties uitgevoerd bij achttien
verschillende patiënten. Vijf patiënten ondergingen een behandeling waarbij de helft van de eicellen
met IVF werd bevrucht en de andere helft met ICSI. Deze patiënten werden toch geïncludeerd in de
studie vanwege een dreigend tekort aan onderzoeksgegevens. Uiteindelijk werden enkel de eicellen die
behandeld werden met ICSI statistisch verwerkt.
In totaal werden 234 eicellen verkregen. Bij één patiënte werden in geen van de negen aspiraten
eicellen teruggevonden. Vermoedelijk was dit te wijten aan het foutief opvolgen van het
stimulatieschema door de patiënte. De resultaten van één punctie, waarbij 13 eicellen werden
verkregen, werden niet in het onderzoek opgenomen wegens het gebruik van een andere procedure,
waardoor de eicellen niet verder afzonderlijk konden worden opgevolgd. Dit bracht het totale aantal
eicellen die werden opgenomen in de dataset op 221. Daarvan werd voor 195 eicellen een behandeling
met ICSI gepland en voor 26 eicellen een behandeling met IVF. Uiteindelijk werden enkel de 195
eicellen die in aanmerking kwamen voor een behandeling met ICSI verwerkt in de statistische analyse.
Na beoordeling van de eicelmaturiteit bleken 159 van deze 195 eicellen matuur genoeg voor een
behandeling met ICSI. Na de ICSI-behandeling waren 140 van de 159 eicellen bevrucht en hiervan
waren er 121 met twee pronucleï.
De gemiddelde leeftijd van de patiënten bedroeg 30 jaar, met een standaarddeviatie van 3,5 jaar. De
jongste patiënte was 23 jaar en de oudste patiënte was 35 jaar.
Het gemiddeld aantal eicellen per patiënte bedroeg 13 eicellen met een standaarddeviatie van 6,4. Het
maximum was 29 eicellen en het minimum was 0 eicellen.
De normale fertilisatieratio bedroeg 76,1% en de ‘embryo utilisation ratio’ bedroeg 50,4%.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
27
4. Resultaten
Figuur 2: Flowchart resultaten
Transport van het AZ Sint
Lucas (Gent) naar het UZ Gent
18 patiënten
17 patiënten
geïncludeerd
1 patiënte
geëxcludeerd
221 eicellen
13 eicellen
ICSI: 195 eicellen
Immatuur
36 eicellen
Matuur
159 eicellen
Bevrucht
140 eicellen
Normaal bevrucht
121 eicellen
Cryopreservatie
49 embryo’s
Niet bevrucht
19 eicellen
Abnormaal bevrucht
19 eicellen
Embryotransfer
12 embryo’s
Zwangerschap
4
Biochemische
zwangerschap
1
IVF: 26 eicellen
Discarded
60 embryo’s
Geen zwangerschap
8
Evolutieve
zwangerschap
3
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
28
4. Resultaten
4.1 Reproduceerbaarheid van de metingen
Tabel 5: Intraclass correlatiecoëfficiënt pH
95% Betrouwbaarheidsinterval
Intraclass
correlatiecoëfficiënt
Ondergrens
Bovengrens
0,938
0,918
0,954
Gemiddelde metingen
De intraclass correlatiecoëfficiënt bedroeg 0,938. Dit wees op een goede reproduceerbaarheid van de
metingen.
Tabel 6: Inter-item correlatie matrix pH: Pearson
pH-meting 1 pH-meting 2 pH-meting 3
pH-meting 1
pH-meting 2
pH-meting 3
Pearson correlatiecoëfficiënt
1,000
0,838
0,799
Significantieniveau (tweezijdig)
0,000
0,000
Pearson correlatiecoëfficiënt
1,000
0,887
Significantieniveau (tweezijdig)
0,000
Pearson correlatiecoëfficiënt
1,000
Significantieniveau (tweezijdig)
De correlatiecoëfficiënt tussen pH-meting 1 en pH-meting 2 bedroeg 0,838. De correlatiecoëfficiënt
tussen pH-meting 2 en pH-meting 3 bedroeg 0,887. De correlatiecoëfficiënt tussen pH-meting 1 en
pH-meting 3 bedroeg 0,799. Het significantieniveau van elk van deze coëfficiënten was kleiner dan
0,001. De correlatie tussen de metingen onderling was dus sterk significant.
4.2 Beschrijvende tabel
Tabel 7: Beschrijvende tabel gemiddelde pH en bloedbijmenging per buis
Gemiddelde pH
Bloedbijmenging
7,4798
14,55
7,5
15
0,12755
3,561
Minimum
7,07
5
Maximum
7,97
20
Range
0,90
15
Interkwartiel range
0,13
4
Gemiddelde
Mediaan
Standaarddeviatie
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
29
4. Resultaten
De gemiddelde pH van de folliculaire aspiraten bedroeg 7,48 met een standaarddeviatie van 0,13.
De gemiddelde bloedbijmenging bedroeg 14,55 met een standaarddeviatie van 3,56.
4.3 Het verband tussen pH en bloedbijmenging
Tabel 8: Rangschikking Mann-Whitney U test bloedbijmenging en pH
Bloedbijmenging dichotoom
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
83
66,51
5520
Aanwezige bloedbijmenging
62
81,69
5065
Totaal
145
Gemiddelde pH Geen bloedbijmenging
Tabel 9: Resultaat Mann-Whitney U test bloedbijmenging en pH
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
2034
Significantieniveau (tweezijdig)
0,029
Het resultaat van de Mann-Whitney U test was significant (P=0,029). Dit toonde een hogere
gemiddelde pH-waarde bij de aspiraten met aanwezige bloedbijmenging.
Figuur 3: Boxplot bloedbijmenging en pH
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
30
4. Resultaten
In appendix 2.1 worden ook de resultaten weergegeven van de Kruskal-Wallis test waarbij een
verband gezocht werd tussen de pH en de exacte waarden van de bloedbijmenging. Het resultaat van
deze test was niet significant.
4.4 Verband tussen pH, bloedbijmenging en de uitkomstvariabelen
4.4.1
Bloedbijmenging
a. Eicelmaturiteit
Tabel 10: Kruistabel bloedbijmenging en eicelmaturiteit
Eicelmaturiteit
Geen bloedbijmenging
Niet matuur
Matuur
Totaal
16
81
97
17,9
79,1
97,0
16,5%
83,5%
100,0%
20
78
98
18,1
79,9
98,0
20,4%
79,6%
100,0%
36
159
195
36,0
159,0
195,0
18,5%
81,5%
100,0%
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Tabel 11: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en eicelmaturiteit
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
0,496
0,481
Het resultaat van deze test was niet significant (P=0,481).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
31
4. Resultaten
b. Fertilisatie
Tabel 12: Kruistabel bloedbijmenging en bevruchting
Niet bevrucht / Bevrucht
Geen bloedbijmenging
Niet bevrucht
Bevrucht
Totaal
8
73
81
9,7
71,3
81,0
9,9%
90,1%
100,0%
11
67
78
9,3
68,7
78,0
14,1%
85,9%
100,0%
19
140
159
19,0
140,0
159,0
11,9%
88,1%
100,0%
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige bloedbijmenging Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Tabel 13: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en bevruchting
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
0,674
0,411
De uitkomst van deze test (0,674) met een P-waarde van 0,411 was niet significant.
Tabel 14: Kruistabel bloedbijmenging en normale/abnormale bevruchting
Normaal / Abnormaal bevrucht
Geen bloedbijmenging
Abnormaal
bevrucht
Normaal
bevrucht
Totaal
5
68
73
9,9
63,1
73,0
6,8%
93,2%
100,0%
Aantal
14
53
67
Verwacht aantal
9,1
57,9
67,0
20,9%
79,1%
100,0%
19
121
140
19,0
121,0
140,0
13,6%
86,4%
100,0%
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
32
4. Resultaten
Tabel 15: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en normale/abnormale bevruchting
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
5,876
0,015
Het resultaat van deze test (5,876) was significant (P=0,015). De kans op normale bevruchting was
duidelijk hoger in de groep van de eicellen zonder bloedbijmenging.
Figuur 4: Staafdiagram bloedbijmenging en normale/abnormale bevruchting
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
33
4. Resultaten
c. Aantal cellen op dag twee
Tabel 16: Kruistabel bloedbijmenging en viercelligheid
Viercelligheid
Niet viercellig embryo Viercellig embryo
Geen bloedbijmenging Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
27
40
67
29,0
38,0
67,0
40,3%
59,7%
100,0%
24
27
51
22,0
29,0
51,0
47,1%
52,9%
100,0%
51
67
118
51,0
67,0
118,0
43,2%
56,8%
100,0%
Opmerking: Het totale aantal was hier 118. Dat waren drie embryo’s minder dan bij de vorige analyse (121 normaal bevruchte eicellen). Dit
werd verklaard omdat drie ervan niet gedeeld waren.
Tabel 17: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en viercelligheid
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
0,539
0,463
Het resultaat van deze analyse was niet significant (P=0,463).
Ook wanneer de bloedbijmenging in verband werd gebracht met de absolute aantallen van de cellen op
dag twee, na indeling in drie groepen (‘vertraagde celdeling’, ‘viercellig embryo’ en ‘versnelde
celdeling’) en na indeling in twee groepen (‘embryo’s met minder dan vier cellen’ en ‘embryo’s met
vier of meer cellen’) werd geen significant resultaat bekomen (zie appendix 2.2).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
34
4. Resultaten
d. Meerkernigheid op dag twee
Tabel 18: Kruistabel bloedbijmenging en meerkernigheid op dag twee
Meerkernigheid dag twee
Niet meerkernig Meerkernig
Geen
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
56
11
67
56,2
10,8
67,0
83,6%
16,4%
100,0%
43
8
51
42,8
8,2
51,0
84,3%
15,7%
100,0%
99
19
118
99,0
19,0
118,0
83,9%
16,1%
100,0%
Tabel 19: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en meerkernigheid op dag twee
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
0,011
0,915
Het resultaat van de analyse (0,011) was niet significant (P=0,915).
e. Fragmentatie op dag twee
In appendix 2.3 worden de Q-Q plots van de fragmentatie op dag twee en van het logaritme van de
fragmentatie op dag twee weergegeven.
Tabel 20: Ongepaarde Student T test bloedbijmenging en fragmentatie op dag twee
T
Log fragmentatie
-0,808
dag twee
Significantieniveau
(tweezijdig)
Gemiddeld verschil
0,421
-0,05551169
95% Betrouwbaarheidsinterval
van het verschil
Onder
Boven
-0,19172814
0,08070477
Het resultaat van de ongepaarde Student T test was niet significant (P=0,421).
Het resultaat van de Mann-Whitney U test tussen de bloedbijmenging en de fragmentatie op dag twee
wordt weergegeven in appendix 2.4. Ook dit resultaat was niet significant.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
35
4. Resultaten
f. Embryoscore op dag twee
Tabel 21: Kruistabel bloedbijmenging en embryoscore op dag twee
Embryoscore dag twee
Embryoscore Embryoscore Embryoscore
1 en 2
3
4 en 5
Geen bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige bloedbijmenging Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
15
26
26
67
17,0
26,1
23,8
67,0
22,4%
38,8%
38,8%
100,0%
15
20
16
51
13,0
19,9
18,2
51,0
29,4%
39,2%
31,4%
100,0%
30
46
42
118
30,0
46,0
42,0
118,0
25,4%
39,0%
35,6%
100,0%
Tabel 22: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en embryoscore op dag twee
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
1,013
0,603
Pearson Chi-kwadraat
Het resultaat van de Chi-kwadraat test was niet significant (P=0,603).
Het resultaat van de Fisher’s Exact test die een verband zocht tussen de bloedbijmenging en de exacte
embryoscore wordt weergegeven in appendix 2.5. Het resultaat van deze analyse was niet significant.
g. Aantal cellen, meerkernigheid en fragmentatie op dag drie
Gezien het gebrek aan studiegegevens op dag drie waren de resultaten van deze analyses telkens niet
significant (zie appendix 2.6).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
36
4. Resultaten
h. Embryotransfer
Tabel 23: Kruistabel bloedbijmenging en embryotransfer
Embryotransfer
Geen bloedbijmenging
Geen embryotransfer
Embryotransfer
Totaal
58
9
67
60,2
6,8
67,0
86,6%
13,4%
100,0%
48
3
51
45,8
5,2
51,0
94,1%
5,9%
100,0%
106
12
118
Verwacht aantal
106,0
12,0
118,0
%
89,8%
10,2%
100,0%
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige bloedbijmenging Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Tabel 24: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en embryotransfer
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
1,807
0,179
Het resultaat van de analyse (1,807) was niet significant (P=0,179).
i.
Cryopreservatie
Tabel 25: Kruistabel bloedbijmenging en cryopreservatie
Cryopreservatie
Geen cryopreservatie Cryopreservatie
Geen bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
30
28
58
31,2
26,8
58,0
51,7%
48,3%
100,0%
27
21
48
25,8
22,2
48,0
56,2%
43,8%
100,0%
57
49
106
57,0
49,0
106,0
53,8%
46,2%
100,0%
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
37
4. Resultaten
Tabel 26: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en cryopreservatie
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
0,216
0,642
Het resultaat van de Chi-kwadraat test was niet significant (P=0,642).
j.
Zwangerschap
Tabel 27: Kruistabel bloedbijmenging en zwangerschap
Zwangerschap
Geen bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Niet zwanger
Zwanger
Totaal
7
2
9
6,0
3,0
9,0
77,8%
22,2%
100,0%
1
2
3
2,0
1,0
3,0
33,3%
66,7%
100,0%
8
4
12
8,0
4,0
12,0
66,7%
33,3%
100,0%
Tabel 28: Fisher’s Exact test bloedbijmenging en zwangerschap
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau
(tweezijdig)
Exact significantieniveau
(tweezijdig)
2,000
0,157
0,491
Fisher's Exact Test
0,236
Het resultaat van de Fisher’s Exact test was niet significant (P=0,236).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
38
4. Resultaten
k. Evolutieve zwangerschap
Tabel 29: Kruistabel bloedbijmenging en evolutieve zwangerschap
Evolutieve zwangerschap
Geen evolutieve
Evolutieve
zwangerschap zwangerschap
Geen bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
%
Totaal
8
1
9
6,8
2,2
9,0
88,9%
11,1%
100,0%
1
2
3
2,2
0,8
3,0
33,3%
66,7%
100,0%
9
3
12
9,0
3,0
12,0
75,0%
25,0%
100,0%
Aantal
Verwacht aantal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Tabel 30: Fisher’s Exact test bloedbijmenging en evolutieve zwangerschap
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau
(tweezijdig)
Exact significantieniveau
(tweezijdig)
3,704
0,054
0,127
Fisher's Exact Test
0,127
Het resultaat van de Fisher’s Exact test was niet significant (P=0,127).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
39
4. Resultaten
4.4.2
pH
a. Eicelmaturiteit
Tabel 31: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en eicelmaturiteit
Gemiddelde pH
Eicelmaturiteit
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Niet matuur
36
109,90
3956,50
Matuur
159
95,31
15153,50
Totaal
195
Tabel 32: Resultaat Mann-Whitney U test pH en eicelmaturiteit
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
2433,500
Significantieniveau (tweezijdig)
0,157
Het resultaat van deze analyse was niet significant (P=0,157).
b. Fertilisatie
Tabel 33: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en bevruchting
Gemiddelde pH
Niet bevrucht/Bevrucht
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Niet bevrucht
19
78,63
1494,00
Bevrucht
140
80,19
11226,00
Totaal
159
Tabel 34: Resultaat Mann-Whitney U test pH en bevruchting
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
Significantieniveau (tweezijdig)
1304,000
0,889
Het resultaat van de Mann-Whitney U test was niet significant (P=0,889).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
40
4. Resultaten
Tabel 35: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en normale/abnormale bevruchting
Normaal/Abnormaal bevrucht
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
19
78,66
1494,50
Normaal bevrucht
121
69,22
8375,50
Totaal
140
Gemiddelde pH Abnormaal bevrucht
Tabel 36: Resultaat Mann-Whitney U test pH en normale/abnormale bevruchting
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
994,500
Significantieniveau (tweezijdig)
0,339
Het resultaat van deze analyse was niet significant (P=0,339).
c. Aantal cellen op dag twee
Tabel 37: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en viercelligheid
Gemiddelde pH
Viercelligheid
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Niet viercellig embryo
51
65,68
3349,50
Viercellig embryo
67
54,80
3671,50
Totaal
118
Tabel 38: Resultaat Mann-Whitney U test pH en viercelligheid
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
Significantieniveau (tweezijdig)
1393,500
0,082
Het resultaat van deze test was niet significant (P=0,082).
Ook wanneer de pH in verband werd gebracht met de absolute aantallen van de cellen op dag twee, na
indeling in drie groepen (‘vertraagde celdeling’, ‘viercellig embryo’ en ‘versnelde celdeling’) en na
indeling in twee groepen (‘embryo’s met minder dan vier cellen’ en ‘embryo’s met vier of meer
cellen’) werd geen significant resultaat bekomen (zie appendix 2.7).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
41
4. Resultaten
d. Meerkernigheid op dag twee
Tabel 39: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en meerkernigheid op dag twee
Gemiddelde pH
Meerkernigheid dag twee
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Niet meerkernig
99
60,56
5995,00
Meerkernig
19
54,00
1026,00
Totaal
118
Tabel 40: Resultaat Mann-Whitney U test pH en meerkernigheid op dag twee
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
836,000
Significantieniveau (tweezijdig)
0,437
Het resultaat van de test was niet significant (P=0,437).
e. Fragmentatie op dag twee
Tabel 41: Pearson correlatiecoëfficiënt pH en logaritme van fragmentatie op dag twee
Gemiddelde pH Log fragmentatie dag twee
Gemiddelde pH
Log fragmentatie
dag twee
Pearson correlatiecoëfficiënt
1,000
0,089
Significantieniveau (tweezijdig)
0,342
Pearson correlatiecoëfficiënt
1,000
Significantieniveau (tweezijdig)
De Pearson correlatiecoëfficiënt tussen de pH en het logaritme van de fragmentatie op dag twee had
een waarde van 0,089 en een P-waarde van 0,342. Het resultaat was dus niet significant.
In appendix 2.8 werden ook de resultaten van de Spearman correlatiecoëfficiënt tussen de pH en de
fragmentatie op dag twee opgenomen. Het resultaat was niet significant.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
42
4. Resultaten
f. Embryoscore op dag twee
Tabel 42: Rangschikking Kruskal-Wallis test pH en embryoscore op dag twee
Embryoscore dag twee
N
Gemiddelde rangorde
30
68,38
Embryoscore 3
46
54,04
Embryoscore 4 en 5
42
59,13
Totaal
118
Gemiddelde pH Embryoscore 1 en 2
Tabel 43: Resultaat Kruskal-Wallis test pH en embryoscore op dag twee
Gemiddelde pH
Chi-Square
3,302
Significantieniveau
0,192
Het resultaat van de Kruskal-Wallis test was niet significant (P=0,192).
Ook het resultaat van de analyse van het verband tussen de pH en de exacte embryoscores op dag twee
was niet significant (zie appendix 2.9).
g. Aantal cellen, meerkernigheid en fragmentatie op dag drie
Gezien het gebrek aan studiegegevens op dag drie waren de bekomen resultaten van deze analyses
telkens niet significant (zie appendix 2.10).
h. Embryotransfer
Tabel 44: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en embryotransfer
Embryotransfer
Gemiddelde pH
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Geen embryotransfer
106
60,41
6403,50
Embryotransfer
12
51,46
617,50
Totaal
118
Tabel 45: Resultaat Mann-Whitney U test pH en embryotransfer
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
Significantieniveau (tweezijdig)
539,500
0,383
Het resultaat van de Mann-Whitney U test was niet significant (P=0,383).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
43
4. Resultaten
i.
Cryopreservatie
Tabel 46: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en cryopreservatie
Gemiddelde pH
Cryopreservatie
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Geen cryopreservatie
57
60,09
3425,00
Cryopreservatie
49
45,84
2246,00
Totaal
106
Tabel 47: Resultaat Mann-Whitney U test pH en cryopreservatie
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
Significantieniveau (tweezijdig)
1021,000
0,015
Deze analyse leverde een significant resultaat op (P=0,015). Dit wees op een verband tussen een
lagere gemiddelde pH en de keuze tot cryopreservatie.
Figuur 5: Boxplot pH en cryopreservatie
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
44
4. Resultaten
j.
Zwangerschap
Tabel 48: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en zwangerschap
Gemiddelde pH
Zwangerschap
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Niet zwanger
8
5,94
47,50
Zwanger
4
7,62
30,50
Totaal
12
Tabel 49: Resultaat Mann-Whitney U test pH en zwangerschap
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
11,500
Significantieniveau (tweezijdig)
0,441
Het resultaat van de test was niet significant (P=0,441).
k. Evolutieve zwangerschap
Tabel 50: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en evolutieve zwangerschap
Gemiddelde pH
Evolutieve zwangerschap
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Geen evolutieve zwangerschap
9
5,94
53,50
Evolutieve zwangerschap
3
8,17
24,50
Totaal
12
Tabel 51: Resultaat Mann-Whitney U test pH en evolutieve zwangerschap
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
8,500
Significantieniveau (tweezijdig)
0,351
Het resultaat van de analyse was niet significant (P=0,351).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
45
4. Resultaten
4.5 Samenvattende tabel resultaten
Tabel 52: Overzichtstabel resultaten
Variabelen
P-waarde
Verband pH en bloedbijmenging (dichotoom)
0,029
Bloedbijmenging
Eicelmaturiteit
Fertilisatie (bevrucht – niet bevrucht)
Fertilisatie (normaal bevrucht – abnormaal bevrucht)
Aantal cellen op dag twee
Meerkernigheid op dag twee
Fragmentatie op dag twee
Embryoscore op dag twee
Embryotransfer
Cryopreservatie
Zwangerschap
Evolutieve zwangerschap
0,481
0,411
0,015
0,463
0,915
0,421
0,603
0,179
0,642
0,236
0,127
pH
Eicelmaturiteit
Fertilisatie (bevrucht – niet bevrucht)
Fertilisatie (normaal bevrucht – abnormaal bevrucht)
Aantal cellen op dag twee
Meerkernigheid op dag twee
Fragmentatie op dag twee
Embryoscore op dag twee
Embryotransfer
Cryopreservatie
Zwangerschap
Evolutieve zwangerschap
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
0,157
0,889
0,339
0,082
0,437
0,342
0,192
0,383
0,015
0,441
0,351
46
5. Discussie
5. DISCUSSIE
Het gemiddeld aantal eicellen per punctie dat in dit onderzoek werd vastgesteld, bedroeg dertien. Het
lag iets hoger dan het gemiddelde van 10,5 dat werd gerapporteerd door De Sutter et al. (2004), maar
viel nog binnen de standaarddeviatie (10,5 ± 6,8) die erbij werd gerapporteerd. De Sutter et al. (2004)
stelden ook vast dat dit aantal constant bleef na 1994, doordat het basisprotocol voor ovariale
stimulatie met gonadotrofines en GnRH-agonisten sindsdien ongewijzigd bleef. Hetzelfde
stimulatieprotocol werd ook in deze studie gebruikt. Er kan niet geconcludeerd worden dat het
gevonden gemiddelde van dertien eicellen per patiënte op een werkelijke stijging wijst, aangezien deze
studie een beperkt aantal patiënten includeerde, in tegenstelling tot het onderzoek van De Sutter et al.
waarin over een tijdspanne van tien jaar patiëntengegevens werden geregistreerd en geanalyseerd. Dat
er na transport minder eicellen in de aspiraten zouden worden teruggevonden, zoals aangetoond door
Coetsier et al. (1997), kan aan de hand van de huidige bevindingen in twijfel worden getrokken.
De fertilisatieratio in dit onderzoek bedroeg 76,1% en benaderde de fertilisatieratio van 73,2% van de
transport-ICSI cycli in het onderzoek van De Sutter et al. (1996). Dit laatste onderzoek includeerde
echter meer patiënten en het door hen bekomen resultaat is wellicht een betere benadering van de
werkelijkheid. De ‘embryo utilisation ratio’ bedroeg 50,4%. Deze waarde komt overeen met de
bevindingen van een huidig onderzoek in het UZ Gent (tussen 50 en 60%).
De gemiddelde pH van de aspiraten in dit onderzoek was 7,48. Dale et al. (1998) schatten de
fysiologische pH-waarde van het folliculair vocht tussen 7,5 en 7,7. Hun onderzoek werd echter
uitgevoerd op een kleine steekproef. Shalgi et al. (1972) en Imoedembe et al. (1993) toonden een
gemiddelde pH van het folliculair vocht van 7,2 - 7,3 aan. Volgens De Cooman (2007-2008) is er een
significante stijging van de folliculaire pH tijdens transport. In dit laatste onderzoek werd na transport
een gemiddelde pH van 7,41 gevonden. Wanneer een pH van 7,2 tot 7,3 als normale waarde wordt
aangenomen onmiddellijk na aspiratie, zou de pH-stijging van het folliculair vocht tijdens transport de
gevonden waarde van 7,48 kunnen verklaren.
De gemiddelde kleurcode voor bloedbijmenging die werd teruggevonden in de aspiraten was 14,55 en
lag onder het gekozen afkappunt van vijftien, zodat de follikelaspiraten gemiddeld gezien niet
bloedgecontamineerd waren. Volgens Cosyn en Jacobs (2007-2008) die de kleurenkaart ontwikkelden,
komt dit overeen met een hematocriet-waarde van minder dan één procent. Dit gemiddelde verschilt
enigszins van het gemiddeld hematocriet van 1,12%, wat overeenstemt met kleurcode zestien, dat
werd teruggevonden bij voorgaand onderzoek van De Cooman (2007-2008) waarbij dezelfde
kleurenkaart werd gebruikt. Bij dit laatste onderzoek werden echter minder aspiraten onderzocht en dit
zou een mogelijke verklaring kunnen zijn voor het verschil. De gemiddelde waarde van 14,55 is
mogelijks een betere benadering van de werkelijke gemiddelde bloedbijmenging.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
47
5. Discussie
De verhouding van de aspiraten met aanwezige bloedbijmenging (62) tot de aspiraten zonder
bloedbijmenging (83) bedroeg 0,747. Cosyn en Jacobs (2007-2008) vonden in hun studie slechts een
verhouding van 0,572. Hun gevonden waarde lag aan de basis van de powerberekening in deze studie
en dit kan een mogelijk gebrek aan power verklaren.
Tussen de pH en de bloedbijmenging kon slechts een verband worden aangetoond indien de
bloedbijmenging als dichotome variabele werd beschouwd. Mogelijks is de studiepopulatie te klein
om een verband tussen de pH en de categorische waarden van bloedbijmenging aan te tonen. Wanneer
de bloedbijmenging werd verdeeld volgens het afkappunt zoals beschreven in het onderzoek van
Cosyn en Jacobs (2007-2008), kon een significant verband aangetoond worden tussen de pH en de
bloedbijmenging van het follikelvocht. De pH was hoger bij aspiraten met duidelijke bloedbijmenging.
Dit waren stalen met een respectieve kleur van zestien of hoger volgens de gebruikte kleurenkaart of
met een hematocriet vanaf 1,12% (Cosyn en Jacobs, 2007-2008). Volgens Daya (1988) daalt de pH
echter significant naarmate de bloedbijmenging toeneemt. Hij formuleerde verschillende hypothesen
om deze vaststelling te verklaren. Follikelvocht zou de pH beter kunnen bufferen dan bloed. Daarnaast
zou de studieprocedure, namelijk eicelaspiratie door middel van laparoscopie, aan de basis van dit
resultaat kunnen liggen. Zo zou bij een moeilijke of traumatische aspiratie sneller CO2 diffunderen
door een scheur in de follikelwand. Het bloed in het follikelvocht is hoogst waarschijnlijk afkomstig
uit de ovariële venen. De daling in pH zou veroorzaakt worden door de hoge veneuze pCO2, die het
resultaat zou zijn van de diffusie van CO2 langs het peritoneum in het bloed. Het verschil met de
huidige bevindingen kan verklaard worden door het gebruik van een andere studieprocedure, namelijk
eicelaspiratie door middel van laparoscopie in plaats van onder echografie. Gezien bij de huidige
standaardprocedure de follikelpunctie steeds onder echografische controle gebeurt, correleren de
resultaten uit dit onderzoek meer met de klinische realiteit.
Er zijn indicaties dat de bloedbijmenging een negatief effect heeft op de ontwikkeling van murine
embryo’s (Huyser et al., unpublished findings). Zoals verder beschreven kon in dit onderzoek worden
aangetoond dat de bloedbijmenging een negatief effect heeft op de normale bevruchting van humane
eicellen. Hoewel dit effect niet werd teruggevonden voor de pH van het follikelvocht (zie verder), kan
wel gesteld worden dat een hogere graad van bloedbijmenging en de daarmee gepaard gaande
alkalischere pH, niet bevorderend zijn voor de bevruchting. De hypothese van Levay et al. (1997) dat
een extracellulaire pH van 7,5 optimaal zou zijn voor de bevruchting, kan door de bevindingen in deze
studie dus in twijfel getrokken worden.
Er kon geen verband aangetoond worden tussen de bloedbijmenging en de maturiteit van de eicellen.
Ook in voorgaand onderzoek van De Cooman (2007-2008) werd hiertussen geen verband aangetoond.
Daarentegen had het wel een invloed op het al dan niet normaal bevrucht zijn van de eicel (zie verder).
Het is echter belangrijk te weten of het bloed dat aanwezig is in het folliculaire aspiraat reeds vóór de
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
48
5. Discussie
punctie in de follikel aanwezig was, dan wel veroorzaakt werd door trauma gedurende de punctie en
daardoor in het folliculair vocht terechtkwam. In het eerste geval kunnen we op basis van deze
resultaten vermoeden dat de bloedbijmenging mogelijks geen invloed heeft op de meiose, maar wel op
andere eigenschappen van de eicel, die niet (kunnen) onderzocht worden in het labo. In het laatste
geval zou het kunnen zijn dat het bloed dat aanwezig is in het folliculair aspiraat tijdens transport een
negatief effect uitoefent op de eicelkwaliteit. Ook hier zal geen invloed kunnen worden vastgesteld op
de voltooiing van de eerste meiotische deling, noch op de initiatie van de tweede meiotische deling,
gezien deze plaatsvindt vóór de punctie door de toediening van hCG 34 tot 38 uur voordien.
Volgens de verhoudingen in dit onderzoek waren er iets meer mature eicellen (83,5%) in de aspiraten
zonder bloedbijmenging, dan in de aspiraten met bloedbijmenging (79,6%). Het verschil was echter
niet statistisch significant en ook niet klinisch relevant.
Ook op het al dan niet bevrucht zijn van de eicellen die met ICSI werden behandeld, werd geen
invloed van de graad van bloedbijmenging teruggevonden. Dit zou verklaard kunnen worden doordat
bij de ICSI-procedure de zaadcel rechtstreeks in de eicel wordt ingebracht. Hierdoor wordt een deel
van de normale stappen in de bevruchting, waarop de bloedbijmenging een invloed zou kunnen
hebben, overbrugd. Zo kunnen bijvoorbeeld anti-sperma antilichamen en antilichamen tegen de
sperma-receptor, dewelke aanwezig kunnen zijn in het maternale bloed, de bevruchting niet negatief
beïnvloeden bij de ICSI-procedure (Daya et al., 1990). Om een dergelijke invloed van de
bloedbijmenging op de bevruchting te kunnen aantonen, zou men studies kunnen uitvoeren in het
kader van een IVF-procedure.
De verhouding van het aantal bevruchte eicellen in de aspiraten zonder bloedbijmenging (90,1%) ten
opzichte van de bloedgecontamineerde aspiraten (85,9%) was niet significant verschillend en heeft
geen klinisch belang.
Bayer et al. (1988) toonden een sterke positieve correlatie tussen de graad van eicelbevruchting en de
absorptiegraad bij 415 en 455 nm. Dit was volgens hen te wijten aan de graad van vascularisatie van
de follikel, gezien de hoeveelheid bilirubine, dat bepalend is voor de absorptie bij 455 nm, hier
proportioneel aan is. Follikels met een betere arteriële bloedvoorziening zullen bij verbruik van
voedingsstoffen en zuurstof het hemoglobine in het aangevoerde bloed omzetten in bilirubine
(De Cooman, 2007-2008). Net dit bilirubine draagt bij tot de gele kleur in de aspiraten (Bayer et al.,
1988; Huyser et al., 1992). Verder onderzoek van Bayer et al. (1990) toonde opnieuw een sterke
positieve correlatie tussen bevruchting en absorptie bij 455 nm. Daarbij werd de eerder geformuleerde
hypothese met betrekking tot de invloed van de graad van vascularisatie van de follikel echter
ontkracht. Als nieuwe hypothese stelden zij dat de individuele substanties die absorberen aan de
golflengte van 455 nm een directe impact hebben op de eicelkwaliteit. Huyser et al. (1992) vergeleken
de elektrolieten en biochemische samenstelling tussen bloedgecontamineerd en helder vocht. Daarbij
werd een significant verschil in samenstelling aangetoond, met hogere waarden in het
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
49
5. Discussie
bloedgecontamineerde vocht. Ook op dit terrein is verder onderzoek vereist, om antwoord te geven op
de vraag of de graad van vascularisatie van de follikel zelf verantwoordelijk is voor het verband met
de bevruchting, dan wel andere substanties die aan de aanwezigheid van bloed in het follikelvocht
geassocieerd kunnen zijn. Om op deze vraag te kunnen antwoorden kan het opnieuw van belang zijn
om een idee te hebben van de oorsprong van het bloed en het tijdstip waarop het in het folliculair
vocht terecht komt (zie eerder). Daarnaast zou men kunnen nagaan of de meest mature eicellen, met de
beste arteriële voorziening, inderdaad aanwezig zijn in de aspiraten met de meest gele kleur en de
minste bloedbijmenging. Daarvoor zou men een studie kunnen uitvoeren waarbij het aspiraat van elke
follikel in een aparte proefbuis wordt opgevangen (De Cooman, 2007-2008). Een dergelijke
studieprocedure is echter niet mogelijk in het kader van transport-cycli, aangezien het volume van het
folliculair vocht van de kleinere follikels ook kleiner is, waardoor het tijdens transport te snel zou
afkoelen.
Op het al dan niet normaal bevrucht zijn, bleek de bloedbijmenging wel een significante invloed te
hebben. Gezien er meer abnormaal bevruchte eicellen waren in de groep met bloedbijmenging, kan
worden geconcludeerd dat bloedbijmenging een negatieve invloed heeft op de bevruchting. Indien
abnormale bevruchting optreedt bij ICSI is dit vrijwel steeds te wijten aan een eicelprobleem. Zoals
hogerop beschreven, bestaat de kans dat de bloedbijmenging een invloed heeft op de eicelkwaliteit. De
abnormale bevruchting bij eicellen met een hogere graad van bloedbijmenging zou dus eventueel
verklaard kunnen worden doordat deze eicellen ook blootgesteld zijn aan een hogere concentratie
schadelijke stoffen, dewelke in het bloed aanwezig zijn. Bij transport-ICSI worden de eicellen
langdurig blootgesteld aan de schadelijke invloed van de bloedbijmenging, wat de slechtere resultaten
ervan kan verklaren. Volgens gegevens uit grotere reeksen zou transport-ICSI geen significant
slechtere resultaten opleveren (De Sutter et al., 1996; Coetsier et al., 1997). Patiëntenbias lijkt een
aannemelijke verklaring voor de huidige resultaten, waarbij de vraag luidt of de abnormaal bevruchte
eicellen verdeeld zijn over alle patiënten, dan wel of er een patiënte is met opvallend veel abnormaal
bevruchte eicellen.
Verder werd geen verband gevonden tussen de bloedbijmenging en het aantal cellen op dag twee. De
verdeling van de viercellige embryo’s bij niet-bloedgecontamineerde aspiraten (59,7%) ten opzichte
van de aspiraten met bloedbijmenging (52,9%) was niet significant. Onderzoek van Bayer et al. (1990),
Huyser et al. (1993) en De Cooman (2007-2008) kon hiertussen ook geen verband aantonen. Huyser et
al. (1993) stelden vast dat er een significante correlatie bestaat tussen de absorptie bij 458 nm en een
kleiner follikelvolume. Zij stelden dat grotere follikels, met significant lagere absorptie dan kleine
follikels, eicellen bevatten met een hoger delingsvermogen en daardoor een hogere kans op mogelijke
klinische zwangerschap.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
50
5. Discussie
Tussen de bloedbijmenging en de meerkernigheid van de embryo’s kon geen verband aangetoond
worden. Dit was ook het geval in het onderzoek van De Cooman (2007-2008). De verhoudingen
tussen de stalen zonder bloedbijmenging (16,4%) en de stalen met bloedbijmenging (15,7%) doen
eveneens vermoeden dat er werkelijk geen invloed bestaat van de bloedbijmenging op de
meerkernigheid van het embryo.
Een verband tussen de bloedbijmenging en de fragmentatie op dag twee werd niet teruggevonden.
Huyser et al. (1993) toonden aan in hun onderzoek dat bloedbijmenging niet kon gebruikt worden als
indicator voor de IVF capaciteit. Ook zij vonden geen invloed op de eicelbevruchting en het
celstadium (zie hoger). Nu blijkt dat er ook geen invloed kan worden teruggevonden van
bloedbijmenging op de fragmentatiegraad na transport-ICSI. Bij de powerberekening van deze studie,
om te bepalen hoeveel embryo’s er in deze studie geïncludeerd moesten worden, werd het verband
tussen de bloedbijmenging en de fragmentatie op dag twee als uitgangspunt genomen. Hiervoor werd
echter gesteund op de verdeling van stalen met en zonder bloedbijmenging zoals die werd beschreven
door Cosyn en Jacobs (2007-2008). Deze verhouding kwam echter niet overeen met de verhoudingen
in dit onderzoek (zie hoger). Dit kan het bekomen resultaat verklaren. Verder onderzoek is nodig om
hierover uitsluitsel te geven.
De bloedbijmenging had geen invloed op de embryoscore op dag twee. Ook Huyser et al. (1993)
vonden dit resultaat bij eicellen waarbij een IVF-behandeling gebeurde. Recent onderzoek van
De Cooman (2007-2008) kon wel een invloed van de bloedbijmenging op de embryoscore aantonen.
Dit laatste onderzoek werd uitgevoerd op een kleiner aantal patiënten, waarbij ook eicellen behandeld
met IVF werden geïncludeerd. De conclusie ervan kan dus in twijfel getrokken worden door de
huidige bevindingen. Verhoudingsgewijs werden meer embryo’s van topkwaliteit (score 4 en 5) in de
groep zonder bloedbijmenging (38,8%) teruggevonden in vergelijking met de folliculaire vochten met
bloedbijmenging (31,4%). Er waren ook meer slechte embryo’s (score 1 en 2) in de groep met
bloedbijmenging (29,4%), dan in de groep zonder bloedbijmenging (22,4%). Dit was echter niet
statistisch significant.
De resultaten van de testen die een verband moesten aantonen tussen de bloedbijmenging en de
parameters op dag drie zijn allemaal niet significant. Dit kan mogelijks verklaard worden door een
tekort aan onderzoeksgegevens. Aangezien embryotransfer en eventueel ook cryopreservatie in
sommige gevallen reeds op dag twee gebeurde, werden de embryo’s op dag drie niet meer geëvalueerd
en waren deze gegevens ook niet beschikbaar voor analyse. Verder onderzoek met betrekking tot de
embryokwaliteit op dag drie is aangewezen.
Dezelfde opmerking kan gemaakt worden voor de resultaten van de analyses tussen de pH en de
kwaliteitsevaluatie op dag drie.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
51
5. Discussie
De keuze tot het al dan niet cryopreserveren van de embryo’s werd niet beïnvloed door de graad van
bloedbijmenging. Deze keuze berust voornamelijk op de graad van fragmentatie en ook hiermee kon
geen verband worden aangetoond (zie hoger). In eerder onderzoek van De Cooman (2007-2008) werd
wel een verband tussen de bloedbijmenging en de embryoscore aangetoond. Zoals hogerop vermeld
kan dit resultaat in twijfel worden getrokken gezien de kleine studiepopulatie en de aanwezigheid van
zowel IVF- als ICSI-cycli in dit onderzoek. In de groep zonder bloedbijmenging werden 48,3% van de
embryo’s gecryopreserveerd en in de groep met bloedbijmenging 43,8%. Dit verschil was niet
significant.
De graad van bloedbijmenging bleek geen invloed te hebben op de keuze tot embryotransfer, het
optreden van zwangerschap en de mate waarin de zwangerschappen evolutief waren. Aangezien in dit
onderzoek slechts twaalf embryo’s werden getransfereerd, kon moeilijk een conclusie getrokken
worden omtrent een mogelijk verband met de graad van bloedbijmenging wegens een gebrek aan
studiegegevens.
Ook voor pH kunnen dezelfde besluiten getrokken worden.
In de groep van embryo’s zonder bloedbijmenging werden negen embryo’s getransfereerd en in de
groep met bloedbijmenging slechts drie. Huyser et al. (1993) vonden een significant lagere absorptie
in het follikelvocht van de patiënten die klinisch zwanger werden. Zoals hogerop reeds vermeld,
stelden zij vast dat er een significante correlatie bestaat tussen de absorptie bij 458 nm en kleiner
follikelvolume. Zij stelden dat grotere follikels, met significant lagere absorptie dan kleine follikels,
eicellen bevatten met een hoger delingsvermogen en daardoor een hogere kans op mogelijke klinische
zwangerschap.
Gezien het kleine aantal onderzoeksgegevens in deze studie kunnen hieromtrent echter geen besluiten
getrokken worden. Verder onderzoek kan hierover mogelijks uitsluitsel geven.
In dit onderzoek werden enkel single embryo transfers opgenomen om een eventuele zwangerschap te
kunnen linken aan het getransfereerde embryo. Verder onderzoek volgens deze procedure is nodig om
een eventuele invloed van de bloedbijmenging en de pH op de keuze tot embryotransfer en de
zwangerschapsuitkomst te kunnen aantonen.
De pH bleek geen invloed te hebben op de eicelmaturiteit. Ook het onderzoek van De Cooman
(2007-2008) kon geen verband tussen de pH en de eicelmaturiteit aantonen. De immature eicellen
hadden gemiddeld een hogere rangorde qua pH in vergelijking met de mature eicellen, zonder dat dit
verschil significant kon worden aangetoond.
Ook werd geen verband teruggevonden tussen de pH en het al dan niet bevrucht zijn. Dit bevestigt de
resultaten gevonden in het onderzoek van De Cooman (2007-2008). Dale et al. (1998) beschreven in
hun onderzoek dat een extracellulaire pH van 7,5 optimaal zou zijn voor de bevruchting, omwille van
de pH-afhankelijkheid van de spermabinding aan de zona pellucida van de eicel. De stijging van de
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
52
5. Discussie
folliculaire pH tijdens het transport, zoals vastgesteld door De Cooman (2007-2008), zou in dit geval
dus geen negatieve invloed hebben op de bevruchting. Bovendien wordt bij de ICSI-procedure de
zaadcel rechtstreeks in de eicel gebracht en is er geen binding van de zaadcel aan de zona pellucida
van de eicel nodig en kon deze invloed van de pH op de bevruchting niet worden teruggevonden.
Daarnaast werd op het al dan niet normaal bevrucht zijn ook geen invloed van pH aangetoond. De
abnormaal bevruchte eicellen hadden gemiddeld een hogere rangorde qua pH dan de normaal
bevruchte eicellen. Dit was echter niet significant.
De testen waarbij een verband werd gezocht tussen de gemiddelde pH en het aantal cellen op dag twee
leverden geen significant resultaat op. Ook voorgaand onderzoek van De Cooman (2007-2008) kon
geen invloed van pH op het aantal cellen op dag twee aantonen.
De meerkernigheid van het embryo op dag twee bleek niet significant beïnvloed door de pH van het
folliculair vocht. Dit resultaat werd ook teruggevonden door De Cooman (2007-2008). De
meerkernige embryo’s hadden een hogere gemiddelde rangorde qua pH dan de niet-meerkernige
embryo’s, zonder dat dit verschil statistisch significant was.
Tussen de pH en de fragmentatie van het embryo op dag twee kon geen correlatie worden aangetoond.
In de literatuur werden geen onderzoeken hieromtrent teruggevonden.
De embryoscore op dag twee leek niet beïnvloed door de pH in het folliculair vocht. In het onderzoek
van De Cooman (2007-2008) werd dit ook vastgesteld. Aangezien de embryoscore op basis van de
fragmentatiegraad wordt bepaald, is het dan ook logisch dat ook hier geen significant resultaat werd
bekomen. De verhoudingen van de gemiddelde rangorde qua pH toonden een hogere gemiddelde pH
aan bij de embryo’s van de slechtste kwaliteit. De embryo’s van matige kwaliteit bleken gemiddeld
een iets lagere pH te hebben dan de embryo’s van topkwaliteit. Dit onderzoek kan echter geen sluitend
bewijs leveren dat pH een invloed heeft op de embryoscore.
De pH van de aspiraten heeft wel een significante invloed op de beslissing tot cryopreservatie van het
embryo. De embryo’s die niet werden gepreserveerd, hadden duidelijk een hogere pH dan de embryo’s
waarbij cryopreservatie wel werd uitgevoerd. Aan de hand van deze bevindingen kan de stelling
volgens Dale et al. dat een alkalische pH optimaal zou zijn voor de bevruchting, opnieuw in twijfel
worden getrokken. In het onderzoek van De Cooman (2007-2008) werd dit resultaat niet
teruggevonden. Bij dit laatste onderzoek werd echter gewerkt met het verschil in pH vóór en na
transport en niet met de absolute pH-waarden. Bovendien werden in deze laatste studie minder
embryo’s geïncludeerd. Het onderzoek van De Cooman (2007-2008) toonde wel een pH stijging aan
tijdens het transport (zie hoger). De langdurige blootstelling aan het follikelvocht zou mogelijks de
negatieve gevolgen van de pH op de cryopreservatie kunnen verklaren. Daartegenover staat dat geen
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
53
5. Discussie
verschil in ‘embryo utilisation ratio’ gevonden werd tussen de transport-cycli en de ‘in-house’ cycli.
Hierdoor kan de klinische relevantie van de vastgestelde invloed van de pH op de keuze tot
cryopreservatie in twijfel worden getrokken. Ook hier kan worden gedacht aan het bestaan van een
bias op basis van patiëntenkarakteristieken om het gevonden significante verschil te verklaren (zie
hoger).
Zoals hoger beschreven, wordt op basis van de fragmentatie, de meerkernigheid en het aantal cellen
van het embryo bepaald of een embryo al dan niet geschikt is voor cryopreservatie. Dit onderzoek kon
geen invloed van de pH van het folliculair vocht aantonen op elk van deze parameters afzonderlijk.
Gezien de significante invloed van pH op cryopreservatie kan worden gesteld dat er wel een verband
is tussen de pH en de interactie van deze parameters onderling, gezien zij samen bepalen of
cryopreservatie al dan niet plaatsvindt. Dit is een argument om meer onderzoek uit te voeren naar de
mogelijke
invloed
van
de
pH
van
het
follikelvocht
op
de
resultaten
van
een
vruchtbaarheidsbehandeling.
In dit onderzoek konden geen conclusies worden getrokken omtrent het verband tussen de pH en
embryotransfer, zwangerschap en evolutieve zwangerschap door een tekort aan studiegegevens. Voor
cryopreservatie worden enkel de embryo’s van excellente kwaliteit geselecteerd op basis van hoger
vermelde criteria. Ook de keuze van de embryo’s voor embryotransfer gebeurt aan de hand van
dezelfde criteria. Verder onderzoek is nodig om na te gaan of pH ook een invloed zou hebben op de
keuze tot embryotransfer en zwangerschap.
Bepaalde verhoudingen die werden teruggevonden in dit onderzoek doen vermoeden dat pH en
bloedbijmenging een invloed hebben op bepaalde uitkomstvariabelen van de ICSI-behandeling. Dit
kon echter niet significant worden aangetoond. Verder onderzoek is dus nodig om uit te maken of er
een reëel verband bestaat tussen de parameters.
Mogelijks was er een ‘bias’ aanwezig in de analyse doordat de eicellen/embryo’s van de ene patiënte
andere kenmerken kunnen hebben dan de eicellen/embryo’s van een andere patiënte (zie hoger). Om
dit uit te sluiten, is multivariate analyse op grotere schaal noodzakelijk. Bovendien zou men op deze
wijze ook de invloed van o.a. de leeftijd van de vrouw kunnen uitsluiten.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
54
6. Conclusie
6. CONCLUSIE
Dit onderzoek heeft aangetoond dat na transport van de follikelaspiraten de graad van
bloedbijmenging en de pH van het follikelvocht met elkaar gecorreleerd zijn. Daarbij was de pH hoger
bij aspiraten met duidelijke bloedbijmenging. Dit had echter geen significante impact op de daaruit
voortkomende embryokwaliteit, uitgedrukt in de graad van fragmentatie. Ook de meerderheid van de
secundaire uitkomstvariabelen die het verloop van het bevruchtingsproces beschrijven, waren niet
significant verschillend volgens de graad van bloedcontaminatie of pH. Er werden significant meer
abnormaal bevruchte eicellen bekomen in de aspiraten met bloedbijmenging en er konden significant
minder embryo’s gecryopreserveerd worden bij een hogere pH in het aspiraat.
Verder onderzoek is aangewezen om de klinische relevantie van de gevonden significante resultaten te
bepalen en om uit te maken of het belangrijk zou zijn voor de uitkomst van de
vruchtbaarheidsbehandeling om meer aandacht te schenken aan de stijging van de pH en de
aanwezigheid van bloed in het follikelvocht bij transport.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
55
7. Referentielijst
7. REFERENTIELIJST
Alfonsin A.E., Amato A.R., Arrighi A., Blaquier J.A., Cogorno M., Feldman E.S., et al. Transport in
vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection: results of a collaborative trial. Fertil Steril
1998 Mar; 69 (3): 466-70.
Andersen A.N., Goossens V., Ferraretti A.P., Bhattacharya S., Felberbaum R., de Mouzon J., Nygren
K.G. Assisted reproductive technology in Europe, 2004: results generated from European registers by
ESHRE. Hum Reprod 2008; 23: 756-71.
Balasch J. Investigation of the infertile couple: investigation of the infertile couple in the era of
assisted reproductive technology: a time for reappraisal. Hum Reprod 2000; 15: 2251-7.
Bavister B. Culture of preimplantation embryos. Hum Reprod Update 1996; 1: 91-148.
Bayer S.R., Armant D.R., Dlugi A.M., Seibel M.M. Spectrophotometric absorbance of follicular fluid:
a predictor of oocyte fertilizing capability. Fertil Steril 1988 Mar; 49(3): 442-6.
Bayer S.R., Ransil B.J., Shelton S.J., Armant D.R. Spectrophotometric analysis of follicular fluid
related to oocyte fertilization, embryo cleavage, and follicular fluid protein and hormone content.
Fertil Steril 1990 Oct; 54 (4): 606-11.
BELRAP: Report of the college of physicians for assisted reproduction therapy, 2007. Opgehaald op
23 april 2010, van http://www.belrap.be/Public/Reports.aspx
Boron W.F. Intracellular pH regulation. In Andreoli I.E., Hoffman J.F., Fanestil D.D., Schultz S.G.
Membrane Transport Processes in Organised Systems. Plenum, New York 1987; 39-51.
Broekmans F.J., Kwee J., Hendriks D.J., Mol B.W., Lambalk C.B. A systematic review of tests
predicting ovarian reserve and IVF outcome. Hum Reprod Update 2006; 12: 685-718.
Coetsier T., Dhont M. Avoiding multiple pregnancies in in-vitro fertilization: who’s afraid of single
embryo transfer? Hum Reprod 1998; 10: 2663-70.
Coetsier T., Verhoeff A., De Sutter P., Roest J., Dhont M. Transport-in-vitro fertilization/intracellular
sperm injection: a prospective randomized study. Hum Reprod 1997 Aug; 12 (8): 1654-6.
Cosyn E., Jacobs M. Ontwikkelen en evalueren van een kleurenkaart als visuele test voor het meten
van bloedbijmenging in aspiraten van follikelvocht bij IVF. Scriptie in het kader van de opleiding tot
arts, 2007-2008.
Crane M.M., Divine G.W., Blackhurst D.W., Black C.L., Higdon H.L., Price T.M., et al. Conclusions
about the effects on fertilization of time from aspiration to incubation and blood in the aspirate depend
on the use of appropriate statistical techniques. Fertil Steril 2004 Jun; 81 (6): 1548-53.
Dale B., Menezo Y., Cohen J., DiMatteo L., Wilding M. Intracellular pH regulation in the human
oocyte. Hum Reprod 1998 Apr; 13 (4): 964-70.
Daya S. Follicular fluid pH changes following intraperitoneal exposure of Graafian follicles to carbon
dioxide: A comparative study with follicles exposed to ultrasound. Hum Reprod 1988; 3: 727-30.
Daya S., Kohut J., Gunby J., Younglai E. Influence of blood clots in the cumulus complex on oocyte
fertilization and cleavage. Hum Reprod 1990 Aug; 5 (6): 744-6.
De Cooman L. Analyseren van de effecten van pH-schommelingen, temperatuurschommelingen en
bloedbijmenging tijdens transport-IVF: prospectieve observationele studie. Scriptie in het kader van de
opleiding tot arts, 2007-2008.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
56
7. Referentielijst
De Sutter P. Rational diagnosis and treatment in infertility. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2006
Oct; 20 (5): 647-64.
De Sutter P. Blokboek gynaecologie, 1e master geneeskunde, Universiteit Gent. Academiejaar 20082009.
De Sutter P., Dozortsev D., Verhoeff A., Coetsier T., Jansen C.A., Van Os H.C., et al. Transport
intracytoplasmic sperm injection (ICSI): a cost-effective alternative. J Assist Reprod Genet 1996 Mar;
13 (3): 234-7.
De Sutter P., Lejeune B., Dhont M., Leroy F., Englert Y., Van Steirteghem A. Tien jaar registratie van
medisch begeleide voortplanting (MBV) in België. Tijdschr voor Geneeskunde 2004; 60 (13): 905-14.
Devroey P., Fauser B.C., Diedrich K. Approaches to improve the diagnosis and management of
infertility. Hum Reprod Update 2009 Jul; 15 (4): 391-408.
Erdogan S., FitzHarris G., Tartia A.P., Baltz J.M. Mechanisms regulating intracellular pH are
activated during growth of the mouse oocyte coincident with acquisition of meiotic competence. Dev
Biol 2005 Oct 1; 286 (1): 352-60.
ESHRE. Campus Course Report. Prevention of twin pregnancies after IVF/ICSI by single embryo
transfer. Hum Reprod 2001; 16: 790-800.
Fauque P., Leandri R., Merlet F., Juillard J.C., Epelboin S., Guibert J., et al. Pregnancy outcome and
live birth after IVF and ICSI according to embryo quality. J Assist Reprod Genet 2007 May; 24 (5):
159-65.
FitzHarris G., Baltz J.M. Granulosa cells regulate intracellular pH of the murine growing oocyte via
gap junctions: development of independent homeostasis during oocyte growth. Development 2006 Feb;
133 (4): 591-9.
FitzHarris G., Siyanov V., Baltz J.M. Granulosa cells regulate oocyte intracellular pH against acidosis
in preantral follicles by multiple mechanisms. Development 2007 Dec; 134 (23): 4283-95.
Guerif F., Le Gouge A., Giraudeau B., Poindron J., Bidault R., Gasnier O., et al. Limited value of
morphological assessment at days 1 and 2 to predict blastocyst development potential: a prospective
study based on 4042 embryos. Hum Reprod 2007 Jul; 22 (7): 1973-81.
Hesters L., Prisant N., Fanchin R., Mendez Lozano D.H., Feyereisen E., Frydman R., et al. Impact of
early cleaved zygote morphology on embryo development and in vitro fertilization-embryo transfer
outcome: a prospective study. Fertil Steril 2008 Jun; 89 (6): 1677-84.
Huyser C., Fourie F.L., Levay P. Spectrophotometric analysis of human follicular fluid with regard to
in vitro fertilization (IVF) parameters, follicular protein, and hormone content. J Assist Reprod Genet
1993 Jul; 10 (5): 371-8.
Huyser C., Fourie F.L., Wolmarans L. Spectrophotometric absorbance of follicular fluid: a selection
criterion. J Assist Reprod Genet 1992 Dec; 9 (6): 539-44.
Imoedembe D., Chan R., Ramadan I., Sigue A. Changes in follicular fluid gas and pH during carbon
dioxide pneumoperitoneum for laparoscopic aspiration and their effect on human oocyte fertilisability.
Fertil Steril 1993; 59: 177-182.
Iritani A., Nishikawa Y., Gomes W.R., Van Demak N.L. Secretion rates and chemical composition of
oviduct and uterine fluids in rabbits. J Anim Sci 1971; 33: 829-35.
Kauffmann R.A., Servy E., Menezo Y. The use of blastocysts and coculture in advanced reproductive
technologies. Assist Reprod Rev 1994; 4: 192-7.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
57
7. Referentielijst
Koninklijk Besluit van 4 juni 2003. Belgisch Staatsblad / Moniteur Belge 16 juni 2003, 32127.
Laboratoriumprotocols. Kwaliteitshandboek van het Centrum voor infertiliteit van het UZ Gent
(Versie: 10-07-2007).
Levay P.F., Huyser C., Fourie F.L., Rossouw D.J. The detection of blood contamination in human
follicular fluid. J Assist Reprod Genet 1997 Apr; 14 (4): 212-7.
Maas D.H.A., Storey B.I., Mastroianni I. Hydrogen ion and carbon dioxide content in the oviductal
fluid of the rhesus monkey. Fertil Steril 1976; 28: 981-5.
Menezo Y., Hazout A., Dumont M. et al. Coculture of embryos on Vero cells and transfer of
blastocysts in humans. Hum Reprod 1992; 7: 101-6.
Nelson S.M., Yates R.W., Fleming R. Serum anti-Mullerian hormone and FSH: prediction of live birth
and extremes of response in stimulated cycles – implications for individualization of therapy. Hum
Reprod 2007; 22: 2414-21.
Nyboe A.A., Goossens V., Bhattacharya S., Ferraretti A.P., Kupka M.S., de Mouzon J., et al. Assisted
reproductive technology and intrauterine inseminations in Europe, 2005: results generated from
European registers by ESHRE: ESHRE. The European IVF Monitoring Programme (EIM), for the
European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). Hum Reprod 2009 Jun; 24 (6):
1267-87.
Pandian Z., Bhattacharya S., Nikolaou D., Vale L., Templeton A. The effectiveness of IVF in
unexplained infertility: a systematic Cochrane review. 2002. Hum Reprod 2003 Oct; 18 (10): 2001-7.
Practice Committee of Society for Assisted Reproductive Technology and Practice Committee of
American Society for Reproductive Medicine. Guidelines on number of embryos transferred. Fertil
Steril 2008; 90: S163-4.
Reddy U.M., Wapner R.J., Rebar R.W., Tasca R.J. Infertility, assisted reproductive technology, and
adverse pregnancy outcome: executive summary of a National Institute of Child Health and Human
Development workshop. Obstet Gynecol 2007; 109: 967-77.
Roos A., Boron WF. Intracellular pH. Physiol Rev 1981; 61: 296-434.
Scholtes M.C.W., Zeilmaker G.H. Blastocyst transfer in day-5 embryo transfer depends primarily on
the number of oocytes retrieved and not the age. Fertil Steril 1998; 69: 78-83.
Shalgi R., Kraicer P., Soferman N. Gases and electrolytes of human follicular fluid. J Reprod Fertil
1972; 28: 335.
Shoukir Y., Chardonnens D., Campana A. et al. The rate of development and time of transfer play
different roles in influencing the viability of human blastocysts. Hum Reprod 1998; 13: 671-81.
Van Montfoort A.P., Fiddelers A.A., Janssen J.M., Derhaag J.G., Dirksen C.D., Dunselman G.A.,
Land J.A., Geraedts J.P., Evers J.L., Dumoulin J.C. In unselected patients, elective single embryo
transfer prevents all multiples, but results in significantly lower pregnancy rates compared with double
embryo transfer: a randomized controlled trial. Hum Reprod 2006; 21: 338-43.
Van Royen E., Mangelschots K., De Neubourg D., Valkenburg M., Van de Meerssche M., Ryckaert
G., et al. Characterization of a top quality embryo, a step towards single-embryo transfer. Hum Reprod
1999 Sep; 14 (9): 2345-9.
www.belrap.be, Centra, College van Geneesheren ‘Reproductieve geneeskunde”, Lejeune B.,
23 april 2010.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
58
7. Referentielijst
www.brusselsivf.be, Mogelijke oorzaken en cijfers, Tournaye H., De Mesmaeker G., Opsomer van
Magelaan F., Devroey P., 23 april 2010.
www.brusselsivf.be, IVF/ICSI – Mogelijke oorzaken, Tournaye H., De Mesmaeker G., Opsomer van
Magelaan F., Devroey P., 23 april 2010.
Ziebe S., Petersen K., Lindenberg S., Andersen A.G., Gabrielsen A., Andersen A.N. Embryo
morphology or cleavage stage: how to select the best embryos for transfer after in-vitro fertilization.
Hum Reprod 1997 Jul; 12 (7): 1545-9.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
59
Appendix 1
APPENDIX 1: GOEDKEURING ETHISCH COMITÉ UZ GENT EN AZ SINT LUCAS
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
i
Appendix 1
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
ii
Appendix 1
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
iii
Appendix 2
APPENDIX 2: EXTRA RESULTATEN
Appendix 2.1: Additionele test pH en exacte waarden bloedbijmenging
Tabel 1: Rangschikking Kruskal-Wallis test bloedbijmenging en pH
Bloedbijmenging
N
Gemiddelde rangorde
5
3
44,33
6
2
35,50
7
4
66,38
8
3
67,83
9
4
61,00
10
1
35,50
11
4
58,88
12
11
100,14
13
15
78,20
14
22
57,02
15
14
57,36
16
19
92,74
17
13
81,77
18
8
65,31
19
13
84,38
20
9
68,94
Gemiddelde pH
Tabel 2: Resultaat Kruskal-Wallis test bloedbijmenging en pH
Gemiddelde pH
Chi-Square
21,209
Significantieniveau
0,130
Het resultaat van de Kruskal-Wallis test was niet significant (P=0,130).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
iv
Appendix 2
Appendix 2.2: Additionele testen bloedbijmenging en aantal cellen op dag twee
Tabel 3: Kruistabel bloedbijmenging en cellen op dag twee
Aantal cellen op dag twee
Geen
Aantal
bloedbijmenging
Verwacht aantal
%
3
4
5
6
8
Totaal
8
8
40
6
2
3
67
10,8
7,9
38,0
6,8
1,1
2,3
67,0
9,0%
3,0%
4,5%
100,0%
11,9% 11,9% 59,7%
Aanwezige
Aantal
bloedbijmenging Verwacht aantal
%
Totaal
2
11
6
27
6
0
1
51
8,2
6,1
29,0
5,2
0,9
1,7
51,0
0,0%
2,0%
100,0%
21,6% 11,8% 52,9% 11,8%
Aantal
Verwacht aantal
%
19
14
67
12
2
4
118
19,0
14,0
67,0
12,0
2,0
4,0
118,0
1,7%
3,4%
100,0%
16,1% 11,9% 56,8% 10,2%
Tabel 4: Fisher’s Exact test bloedbijmenging en aantal cellen op dag twee
Waarde Significantieniveau (tweezijdig) Exact significantieniveau (tweezijdig)
Chi-kwadraat test
4,189
Fisher's Exact Test
3,823
0,522
0,553
0,599
Gezien vier cellen (33,3%) een verwachte waarde van minder dan vijf hadden, werd niet voldaan aan
de voorwaarde van de Chi-kwadraat test. Het resultaat van de Fisher’s Exact test was niet significant.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
v
Appendix 2
Tabel 5: Kruistabel bloedbijmenging en viercellig/vertraagde groei/versnelde groei
Celdeling dag twee
Vertraagd Viercellig Versneld
Geen
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
16
40
11
67
18,7
38,0
10,2
67,0
23,9%
59,7%
16,4%
100,0%
17
27
7
51
14,3
29,0
7,8
51,0
33,3%
52,9%
13,7%
100,0%
33
67
18
118
33,0
67,0
18,0
118,0
28,0%
56,8%
15,3%
100,0%
Tabel 6: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en viercellig/vertraagde groei/versnelde groei
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
1,296
0,523
Pearson Chi-kwadraat
Geen enkele van de cellen (0%) had een verwachte waarde van minder dan vijf. Er werd dus voldaan
aan de criteria voor de Chi-kwadraat test.
Het resultaat van de Chi-kwadraat test (1,296) was niet significant (P=0,523).
Tabel 7: Kruistabel bloedbijmenging en vertraagd/vier of meer cellen
Vertraagd/Vier of meer cellen
Vertraagd Vier of meer cellen
Geen bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
16
51
67
18,7
48,3
67,0
23,9%
76,1%
100,0%
17
34
51
14,3
36,7
51,0
33,3%
66,7%
100,0%
33
85
118
33,0
85,0
118,0
28,0%
72,0%
100,0%
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
vi
Appendix 2
Tabel 8: Fisher’s Exact test bloedbijmenging en vertraagde celdeling/vier of meer cellen
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
1,284
0,257
Geen enkele cel had een verwachte waarde van minder dan vijf. Het resultaat van de Chi-kwadraat test
was niet significant.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
vii
Appendix 2
Appendix 2.3: Q-Q plots fragmentatie op dag twee en logaritme van fragmentatie op dag twee
Grafiek 1: Q-Q plot fragmentatie op dag twee
Grafiek 2: Q-Q plot logaritme van fragmentatie op dag twee
Het logaritme van de fragmentatie op dag twee was normaal verdeeld. Om een verband op te sporen
tussen de bloedbijmenging en het logaritme van de fragmentatie kon dus gebruik gemaakt worden van
de Student T test. Voor de analyse van het verband tussen de pH en de fragmentatie op dag twee kon
gebruik gemaakt worden van de Pearson correlatiecoëfficiënt.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
viii
Appendix 2
Appendix 2.4: Additionele test bloedbijmenging en fragmentatie op dag twee
Tabel 9: Rangschikking Mann-Whitney U test bloedbijmenging en fragmentatie op dag twee
Fragmentatie op dag
twee
Bloedbijmenging
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
Geen bloedbijmenging
67
56,54
3788,50
Bloedbijmenging
51
63,38
3232,50
Totaal
118
Tabel 10: Resultaat Mann-Whitney U test bloedbijmenging en fragmentatie op dag twee
Fragmentatie op dag twee
Mann-Whitney U
Significantieniveau (tweezijdig)
1510,500
0,281
Het bekomen resultaat was niet significant (P=0,281).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
ix
Appendix 2
Appendix 2.5: Additionele test bloedbijmenging en exacte waarden embryoscore
Tabel 11: Kruistabel bloedbijmenging en embryoscore op dag twee
Embryoscore op dag twee
1
2
3
4
5
Totaal
Geen bloedbijmenging
3
12
26
23
3
67
Aanwezige bloedbijmenging
5
10
20
16
0
51
Totaal
8
22
46
39
3
118
Tabel 12: Fisher’s Exact test bloedbijmenging en embryoscore op dag twee
Waarde
Pearson Chi-kwadraat
3,618
Fisher's Exact Test
3,249
Significantieniveau Exact significantieniveau (tweezijdig)
0,460
0,485
0,543
40% van de cellen hadden een verwachte waarde van minder dan vijf. Er werd dus een Fisher’s Exact
test uitgevoerd. Het resultaat was niet significant (P=0,543).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
x
Appendix 2
Appendix 2.6: Additionele testen bloedbijmenging en evaluatie op dag drie
Tabel 13: Kruistabel bloedbijmenging en achtcelligheid
Cellen op dag drie
Geen bloedbijmenging
Niet achtcellig
Achtcellig
Totaal
11
11
22
11,9
10,1
22,0
50,0%
50,0%
100,0%
9
6
15
8,1
6,9
15,0
60,0%
40,0%
100,0%
20
17
37
20,0
17,0
37,0
54,1%
45,9%
100,0%
Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Tabel 14: Chi-kwadraat test bloedbijmenging en achtcelligheid
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau (tweezijdig)
0,359
0,549
Het resultaat (0,359) was niet significant (P=0,549).
Tabel 15: Kruistabel bloedbijmenging en meerkernigheid op dag drie
Meerkernigheid op dag drie
Niet meerkernig Meerkernig
Geen bloedbijmenging Aantal
Verwacht aantal
%
Aanwezige
bloedbijmenging
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
Aantal
Verwacht aantal
%
Totaal
22
0
22
20,7
1,3
22,0
100,0%
,0%
100,0%
11
2
13
12,3
0,7
13,0
84,6%
15,4%
100,0%
33
2
35
33,0
2,0
35,0
94,3%
5,7%
100,0%
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xi
Appendix 2
Tabel 16: Resultaat Fisher’s Exact test bloedbijmenging en meerkernigheid op dag drie
Pearson Chi-kwadraat
Waarde
Significantieniveau
(tweezijdig)
3,590
0,058
Exact
significantieniveau
(tweezijdig)
Fisher's Exact Test
0,131
Het resultaat van de Fisher’s Exact test was niet significant (P=0,131).
Tabel 17: Rangschikking Mann-Whitney U test bloedbijmenging en fragmentatie op dag drie
Bloedbijmenging
N
Gemiddelde Rangorde
Rangsom
22
18,70
411,50
Bloedbijmenging
14
18,18
254,50
Totaal
36
Fragmentatie op dag drie Geen bloedbijmenging
Tabel 18: Resultaat Mann-Whitney U test bloedbijmenging en fragmentatie op dag drie
Fragmentatie op dag drie
Mann-Whitney U
Significantieniveau (tweezijdig)
149,500
0,883
Het resultaat van de Mann-Whitney U test was niet significant (P=0,883).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xii
Appendix 2
Appendix 2.7: Additionele testen pH en aantal cellen op dag twee
Tabel 19: Rangschikking gemiddelde pH en aantal cellen op dag twee
Aantal cellen op dag twee
Aantal
Gemiddelde rangorde
2
19
65,32
3
14
57,14
4
67
54,80
5
12
71,04
6
2
69,00
8
4
79,50
Totaal
118
Gemiddelde pH
Tabel 20: Resultaat Kruskal-Wallis test
Gemiddelde pH
Chi-Square
4,923
Significantieniveau
0,425
Het resultaat van de Kruskal-Wallis test was niet significant (P=0,425).
Tabel 21: Rangschikking Kruskal-Wallis test pH en viercellig/vertraagde groei/versnelde groei
Gemiddelde pH
Cellen op dag twee
N
Gemiddelde rangorde
Vertraagd
33
61,85
Viercellig
67
54,80
Versneld
18
72,69
Totaal
118
Tabel 22: Resultaat Kruskal-Wallis test pH en viercellig/vertraagde groei/versnelde groei
Gemiddelde pH
Chi-Square
4,232
Significantieniveau
0,121
Ook bij deze analyse was het resultaat niet significant (P=0,121).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xiii
Appendix 2
Tabel 23: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en vertraagde celdeling/vier of meer cellen
Vertraagd/Vier of meer cellen
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
33
61,85
2041,00
Vier of meer cellen
85
58,59
4980,00
Totaal
118
Gemiddelde pH Vertraagde celdeling
Tabel 24: Mann-Whitney U test pH en vertraagde celdeling/vier of meer cellen
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
Significantieniveau
1325,000
0,637
Het resultaat was niet significant (P=0,637).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xiv
Appendix 2
Appendix 2.8: Additionele test pH en fragmentatie op dag twee
Tabel 25: Spearman correlatiecoëfficiënt pH en fragmentatie op dag twee
Gemiddelde pH Fragmentatie op dag twee
Gemiddelde pH
Spearman correlatiecoëfficiënt
1,000
0,143
Significantieniveau (tweezijdig)
0,123
Fragmentatie op dag Spearman correlatiecoëfficiënt
twee
Significantieniveau (tweezijdig)
1,000
De Spearman correlatiecoëfficiënt voor de pH en de fragmentatie op dag twee had een waarde van
0,143 met een significantieniveau van 0,123. Ook dit resultaat was niet significant.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xv
Appendix 2
Appendix 2.9: Additionele test pH en exacte waarden embryoscore
Tabel 26: Rangschikking Kruskal-Wallis test pH en embryoscore op dag twee
Gemiddelde pH
Embryoscore op dag twee
N
Gemiddelde rangorde
1
8
87,75
2
22
61,34
3
46
54,04
4
39
60,04
5
3
47,33
Totaal
118
Tabel 27: Resultaat Kruskal-Wallis test pH en embryoscore op dag twee
Gemiddelde pH
Chi-Square
7,308
Significantieniveau
0,120
Het resultaat van de Kruskal-Wallis test was niet significant (P=0,120).
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xvi
Appendix 2
Appendix 2.10: Additionele testen pH en evaluatie op dag drie
Tabel 28: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en achtcelligheid
Cellen op dag drie
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
20
18,22
364,50
Achtcellig
17
19,91
338,50
Totaal
37
Gemiddelde pH Niet achtcellig
Tabel 29: Resultaat Mann-Whitney U test pH en achtcelligheid
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
154,500
Significantieniveau (tweezijdig)
0,628
Het resultaat van de Mann-Whitney U test was niet significant (P=0,628).
Tabel 30: Rangschikking Mann-Whitney U test pH en meerkernigheid op dag drie
Meerkernigheid op dag drie
N
Gemiddelde rangorde
Rangsom
33
17,92
591,50
Meerkernig
2
19,25
38,50
Totaal
35
Gemiddelde pH Niet meerkernig
Tabel 31: Resultaat Mann-Whitney U test pH en meerkernigheid op dag drie
Gemiddelde pH
Mann-Whitney U
30,500
Significantieniveau (tweezijdig)
0,855
Deze analyse leverde geen significant resultaat op (P=0,855).
Tabel 32: Spearman correlatiecoëfficiënt pH en fragmentatie op dag drie
Gemiddelde pH Fragmentatie op dag drie
Gemiddelde pH Spearman correlatiecoëfficiënt
Fragmentatie
op dag drie
1,000
-0,213
Significantieniveau (tweezijdig)
0,213
Spearman correlatiecoëfficiënt
1,000
Significantieniveau (tweezijdig)
De waarde van de Spearman correlatiecoëfficiënt was -0,213 met een P-waarde van 0,213 en was dus
niet significant.
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xvii
Appendix 3
APPENDIX 3: KLEURENKAART (COSYN EN JACOBS)
De invloed van pH en bloedbijmenging op embryonale ontwikkeling in vitro na ICSI
xviii