Tijdelijk meiotisch arrest door middel van een phosphodiësterase

Tijdelijk meiotisch arrest door middel van een phosphodiësterase - 3 inhibitor
verhoogt de kwaliteit van in vitro gematureerde eicellen bij de muis
L. Vanhoutte1, J. Van der Elst2, P. De Sutter1, J. Gerris1, M. Dhont1
1
Centrum voor Infertiliteit, Universitair Ziekenhuis Gent, Gent;
2
Centrum voor Reproductieve Geneeskunde, Academisch Ziekenhuis, Vrije Universiteit
Brussel, Brussel
Introductie
Het tijdelijk blokkeren van spontane nucleaire maturatie tijdens in vitro cultuur van
onrijpe germinale vesikel (GV) eicellen kan de synchronisatie tussen nucleaire en
cytoplasmatische maturatie verbeteren. Inhibitie van de eicel - specifieke
phosphodiësterase type 3 (PDE - 3) houdt intra - cellulaire cAMP concentraties hoog en
kan op die manier de nucleaire maturatie blokkeren. Om na te gaan of een pre-maturatie
cultuurperiode met een specifieke PDE - 3 inhibitor de kwaliteit van eicellen kan
verbeteren, werd de subcellulaire morfologie (vorm van de spoelfiguur en lokalisatie
van de chromosomen op het evenaarsvlak), bevruchting en embryonale
ontwikkelingscapaciteit van gearresteerde eicellen vergeleken met die van spontaan
gematureerde eicellen.
Materiaal en methode
Onrijpe GV eicellen werden gecollecteerd uit kleine antrale follikels, 24 uur na
stimulatie van 7-8 weken oude B6D2 muizen met eCG (Folligon). Enkel eicellen
omgeven door een compacte laag van cumuluscellen werden gebruikt in het experiment.
De eicellen werden 24 uur blootgesteld aan een PDE - 3 inhibitor (Cilostamide, 1 µM).
De inhibitor werd vervolgens weggewassen en in vitro maturatie werd gestimuleerd
door de eicellen in een medium te brengen met 1.5 IU/ml rechCG (Pregnyl) en 5 ng/ml
Epidermal Growth Factor (EGF) voor 16 tot 18 uur. Nadien werd de eicelkwaliteit
geëvalueerd. Bij een deel van de eicellen werden de spoelfiguur en de lokalisatie van de
chromosomen geanalyseerd aan de hand van confocale microscopie. De overige eicellen
werden in vitro bevrucht en de embryonale ontwikkeling werd gevolgd gedurende 4
dagen na bevruchting. Deze evaluaties werden ook uitgevoerd bij spontaan in vitro
gematureerde eicellen (in vitro controle) als bij in vivo gematureerde eicellen (in vivo
controle). Elk experiment werd 3 x herhaald.
Resultaten
Na blootstelling aan PDE - 3 inhibitor gedurende 24 uur bleven alle eicellen (n = 315)
geblokkeerd in het GV stadium. Na het wegwassen van de inhibitor konden 92.7% van
de eicellen maturatie in vitro ondergaan. Het aantal eicellen met een normaal gevormde
spoelfiguur was significant hoger dan bij de spontaan in vitro gematureerde controle
(88.9% versus 69.3%; P<0.05). Het aantal eicellen met correct gelokaliseerde
chromosomen was niet verschillend van de in vitro controle (45.8% versus 50%), maar
wel lager dan bij de in vivo controle (95.2%). Na in vitro bevruchting was het
percentage 2-cellige embryo’s significant hoger in gearresteerde eicellen dan in
spontaan gematureerde eicellen (47.7% versus 17.5%, P<0.05). Het percentage
blastocysten per 2-cellige embryo’s bij gearresteerde eicellen was hoger, maar niet
significant verschillend dan bij de in vitro controle (39.5% versus 27.7%). In vitro
embryonale ontwikkeling was echter significant beter bij in vivo gematureerde eicellen
(2-cellige embryo’s: 76%, blastocysten/2-cellige embryo’s: 67.7%).
Conclusies
Een pre-maturatie cultuurperiode met PDE - 3 inhibitor verhoogt de kwaliteit van in
vitro gematureerde eicellen inzake morfologie van de spoelfiguur en in vitro
ontwikkelingscapaciteit. Verdere optimalisatie van cultuursystemen is nodig om de in
vivo condities nog beter te benaderen.