Preview

(nl)
Water - Detectie en kwantificering van
Legionella pneumophila - Methode met
kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR)
be
ev
Pr
Water - Detection and quantification of
Legionella pneumophila - Method using
quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
iew
eld
Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen.
toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten.
This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when
a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded.
NEN 6254
or
Vo
Nederlandse norm
Vervangt NEN 6254:2009 Ontw.
ICS 07.100.20; 13.060.70
september 2012
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
be
ev
Pr
or
Vo
iew
Normcommissie 390 020 "Normcommissie Milieukwaliteit"
THIS PUBLICATION IS COPYRIGHT PROTECTED
DEZE PUBLICATIE IS AUTEURSRECHTELIJK BESCHERMD
eld
Apart from exceptions provided by the law, nothing from this
publication may be duplicated and/or published by means of
photocopy, microfilm, storage in computer files or otherwise,
which also applies to full or partial processing, without the written
consent of the Netherlands Standardization Institute.
The Netherlands Standardization Institute shall, with the
exclusion of any other beneficiary, collect payments owed by third
parties for duplication and/or act in and out of law, where this
authority is not transferred or falls by right to the Reproduction
Rights Foundation.
Auteursrecht voorbehouden. Behoudens uitzondering door de
wet gesteld mag zonder schriftelijke toestemming van het
Nederlands Normalisatie-instituut niets uit deze uitgave worden
verveelvoudigd en/of openbaar gemaakt door middel van
fotokopie, microfilm, opslag in computerbestanden of anderszins,
hetgeen ook van toepassing is op gehele of gedeeltelijke
bewerking.
Although the utmost care has been taken with this
publication, errors and omissions cannot be entirely
excluded. The Netherlands Standardization Institute and/or
the members of the committees therefore accept no liability,
not even for direct or indirect damage, occurring due to or in
relation with the application of publications issued by the
Netherlands Standardization Institute.
Hoewel bij deze uitgave de uiterste zorg is nagestreefd,
kunnen fouten en onvolledigheden niet geheel worden
uitgesloten. Het Nederlands Normalisatie-instituut en/of de
leden van de commissies aanvaarden derhalve geen enkele
aansprakelijkheid, ook niet voor directe of indirecte schade,
ontstaan door of verband houdend met toepassing van door
het Nederlands Normalisatie-instituut gepubliceerde
uitgaven.
Het Nederlands Normalisatie-instituut is met uitsluiting van ieder
ander gerechtigd de door derden verschuldigde vergoedingen
voor verveelvoudiging te innen en/of daartoe in en buiten rechte
op te treden, voor zover deze bevoegdheid niet is overgedragen
c.q. rechtens toekomt aan de Stichting Reprorecht.
©2012 Nederlands Normalisatie-instituut
Postbus 5059, 2600 GB Delft
Telefoon (015) 2 690 390, Fax (015) 2 690 190
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
Inhoud
Onderwerp en toepassingsgebied ................................................................................................3
2
Normatieve verwijzingen ................................................................................................................ 3
3
Termen en definities ....................................................................................................................... 3
4
Beginsel ........................................................................................................................................... 5
5
5.1
5.2
5.3
5.4
Controles.......................................................................................................................................... 6
Algemeen .......................................................................................................................................... 6
Kalibratielijn ....................................................................................................................................... 6
Positieve controle .............................................................................................................................. 6
Negatieve controle ............................................................................................................................ 6
6
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
6.9
6.10
6.11
6.12
6.13
6.14
6.15
Ingrediënten en reagentia .............................................................................................................. 6
Algemeen .......................................................................................................................................... 6
Schoonmaakvloeistof ........................................................................................................................ 6
Water ................................................................................................................................................. 6
DNA-extractiekit voor bacteriën ........................................................................................................ 7
Proteïnase K, oplossing geschikt voor PCR-toepassingen. ............................................................. 7
TE-buffer pH 8,0 ................................................................................................................................ 7
Bovine serum albumine (BSA), ρ = 4 mg/ml ..................................................................................... 7
Primers en probes ............................................................................................................................. 7
Kalibratiesuspensie L. pneumophila ................................................................................................. 9
Kalibratiesuspensie interne controle ............................................................................................... 10
Positieve controle ............................................................................................................................ 10
Magnesiumchloride (MgCl2) en PCR-buffer .................................................................................... 10
Taq-polymerase, geschikt voor qPCR. ...........................................................................................10
Deoxyribonucleosidetrifosfaat (dNTP’s), geschikt voor qPCR........................................................ 10
PCR-mengsel .................................................................................................................................. 10
7
7.1
7.2
7.3
Toestellen en hulpmiddelen ......................................................................................................... 11
Toestellen ........................................................................................................................................ 11
Glaswerk ......................................................................................................................................... 12
Diverse hulpmiddelen ...................................................................................................................... 12
8
8.1
8.2
Monsterneming en monstervoorbereiding ................................................................................. 12
Monsterneming................................................................................................................................ 12
Voorbereiding van het monster ....................................................................................................... 12
9
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
Werkwijze ....................................................................................................................................... 13
Fysieke scheiding van werkruimten ................................................................................................ 13
Isolatie ............................................................................................................................................. 13
Voorbereiding .................................................................................................................................. 14
Filtratie van de controles en de monsters ....................................................................................... 14
DNA-isolatie .................................................................................................................................... 14
Bereiden van het PCR-mengsel...................................................................................................... 14
Toevoegen DNA aan PCR-mengsel ............................................................................................... 15
DNA-vermenigvuldiging .................................................................................................................. 15
10
10.1
10.2
10.3
Beoordeling van de resultaten..................................................................................................... 15
Algemeen ........................................................................................................................................ 15
Berekening van het aantal L. pneumophila-mip-kopieën ................................................................ 17
Uitdrukken van het resultaat ........................................................................................................... 18
11
Prestatiekenmerken ...................................................................................................................... 19
12
Verslag ........................................................................................................................................... 19
be
iew
ev
Pr
or
Vo
1
eld
Bijlage A (informatief) Vaststellen gelijkwaardigheid van efficiëntie van DNAextractiemethode van plasmide- en genomisch DNA ............................................................... 20
Bijlage B (informatief) Prestatiekenmerken ................................................................................................ 21
Bijlage C (informatief) Resultaten van een methode evaluerend ringonderzoek ................................... 25
Bibliografie ...................................................................................................................................................... 27
1
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
Voorwoord
Deze norm beschrijft een methode voor het detecteren en kwantificeren van Legionella pneumophila in
water met kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR).
De methode kan worden toegepast voor routinematige screening van watermonsters, maar tevens als het
noodzakelijk is om snel informatie te krijgen over de aanwezigheid en de concentratie van deze bacteriën
en/of het effect van corrigerende maatregelen. De methode is breed inzetbaar en gevalideerd voor
verschillende watertypen zoals leidingwater, oppervlaktewater, koelwater, industriewater en proceswater.
be
iew
ev
Pr
or
Vo
Deze norm is onder verantwoordelijkheid van normcommissie 390 020 “Milieukwaliteit” opgesteld door
normsubcommissie 390 020 06 “Microbiologische parameters”.
eld
2
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
Water – Detectie en kwantificering van Legionella pneumophila – Methode
met kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR)
1 Onderwerp en toepassingsgebied
Deze norm beschrijft een methode voor het detecteren en kwantificeren van Legionella pneumophila
(L. pneumophila) in water met kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR).
Vo
Deze norm is bedoeld om te worden toegepast bij het bacteriologisch onderzoek van alle soorten – al dan
niet verwarmd – water, tenzij de aard en/of het gehalte aan zwevende stof en/of begeleidende flora de
bepaling verstoort. Deze verstoring kan resulteren in een hogere detectiegrens van de bepaling of een
vermindering van de efficiëntie van de polymerase chain reaction.
De aanwezigheid van L. pneumophila in watermonsters wordt aangetoond en gekwantificeerd door een
fragment van het mip-gen (DNA) te vermeerderen met PCR en specifieke primers. Identificatie vindt plaats
door gebruik te maken van een specifieke fluorescent gelabelde probe. De toename van de hoeveelheid van
het specifieke DNA-fragment kan realtime worden gemeten en gevisualiseerd door het PCR-apparaat met
specifieke filters.
or
Kwantificering vindt plaats met een kalibratielijn. De in deze norm beschreven richtlijnen, minimale eisen en
prestatiekenmerken zijn bedoeld om te waarborgen dat de resultaten betrouwbaar zijn en vergelijkbaar en
reproduceerbaar tussen verschillende laboratoria.
WAARSCHUWING L. pneumophila is een opportunistisch pathogeen micro-organisme. Bij het werken met
L. pneumophila behoren dan ook de juiste veiligheidsmaatregelen te worden getroffen volgens
risicoklasse 2 [1]. Vooral de vorming van aerosolen is ongewenst.
be
Pr
2 Normatieve verwijzingen
NEN 6603:2010
NEN-EN-ISO 3696:1995
iew
ev
De volgende documenten waarnaar is verwezen zijn onmisbaar voor de toepassing van dit document. Bij
gedateerde verwijzingen is alleen de aangehaalde versie van toepassing. Bij ongedateerde verwijzingen is
de laatste versie van het document (met inbegrip van wijzigingsbladen) waarnaar is verwezen van
toepassing.
Milieu en voedingsmiddelen – Eerstelijnscontrole met
controlekaarten voor chemische en microbiologische analyses
eld
Water for analytical laboratory use – Specification and test
methods
NEN-EN-ISO 16140:2003
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the
validation of alternative methods
NEN-EN-ISO 19458:2007
Water quality – Sampling for microbiological analysis
3 Termen en definities
Voor de toepassing van deze norm gelden de volgende termen en definities.
3.1
amplificatie
DNA-vermenigvuldiging met als resultaat van de PCR, het vermeerderde DNA-fragment of amplificaat
3
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
3.2
Ct-waarde
threshold cycle
aantal PCR-cycli (denaturatie en amplificatie) noodzakelijk om de oorspronkelijke in het monster aanwezige
DNA-kopieën te vermenigvuldigen zodat de concentratie boven de detectiegrens uitkomt
OPMERKING
De Ct-waarde is het snijpunt van de lijn die de toename van fluorescentie weergeeft in een PCRreactie, met de basislijn.
3.3
denaturatie
proces waarbij de twee strengen van de dubbele helix elkaar loslaten
Vo
3.4
DNA
desoxyribonucleïnezuur
genetisch materiaal van levende organismen bestaande uit generieke en zeer specifieke delen die bepalend
zijn voor de eigenschappen
OPMERKING
de PCR.
Het DNA dient als basis voor de specifieke vermenigvuldiging van het karakteristieke DNA-fragment in
or
3.5
kwantitatieve PCR
qPCR
realtime-PCR
vorming van specifieke DNA-fragmenten die met behulp van een fluorescerende probe zichtbaar wordt
gemaakt
OPMERKING
De fluorescentie-intensiteit is een maat voor de hoeveelheid gevormd specifiek DNA. Op basis van
vergelijking met een kalibratielijn kan men deze intensiteit relateren aan een bepaalde beginconcentratie.
Pr
iew
ev
be
3.6
LODqPCR
Limit of detectionqPCR
onderste analysegrens van de qPCR wat correspondeert met het minimale aantal mip-kopieën dat in de
qPCR met een betrouwbaarheid van 95 % een positief resultaat geeft
3.7
L. pneumophila
gram-negatieve, niet-zuurvaste, beweeglijke bacteriën die sporen noch cysten vormen
OPMERKING 2
legionellose.
eld
OPMERKING 1
Bacteriën uit de familie Legionellaceae zijn staafvormig (2 μm – 20 μm lang en 0,3 μm – 0,9 μm dik).
De celwand bevat vertakte vetzuren. Het organisme groeit alleen in een zuurstofhoudend milieu en heeft onder andere
het zwavelhoudende aminozuur L-cysteïne nodig. Binnen L. pneumophila zijn op basis van serologie ten minste
16 verschillende groepen te onderscheiden. De vermeerdering in het milieu vindt plaats door parasitaire intracellulaire
groei in protozoa. Het onderscheid tussen L. pneumophila en andere soorten van het geslacht Legionella kan onder
andere worden gemaakt op basis van de verschillen tussen de nucleotidevolgorde in het mip-gen.
L. pneumophila is de Legionella-soort die verantwoordelijk is voor de meeste gevallen (> 90 %) van
3.8
LQqPCR
Limit of quantificationqPCR
onderste limiet van de qPCR waarbij met een betrouwbaarheid van 95 % het aantal mip-kopieën kan worden
gekwantificeerd
3.9
mip-gen
macrophage infectivity potentiator-gen
gen aanwezig in Legionella en essentieel voor de infectie van een protozo (gastheer) en de macrofagen bij
de mens
4
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
OPMERKING
De DNA-volgorde of DNA-sequentie kan worden gebruikt voor het identificeren van Legionellabacteriën. De unieke basenvolgorde van het mip-gen van L. pneumophila is toegepast in het ontwerp van de primer- en
probesequenties voor de specifieke qPCR-detectie van L. pneumophila.
3.10
PCR
polymerase chain reaction
enzymatische procedure waarbij een specifiek DNA-fragment wordt vermenigvuldigd door een cyclisch
proces van denaturatie, annealing van specifieke primers en DNA-synthese
Vo
3.11
PCR-product
DNA dat wordt gevormd door de PCR
3.12
primers
enkelstrengs DNA-fragmenten (oligonucleotiden) die als startstuk dienen voor specifieke
DNA-vermenigvuldiging
OPMERKING 1 De keuze van de DNA-volgorde van de oligonucleotide primers bepaalt welk DNA-fragment wordt
vermenigvuldigd. De lengte van de primer varieert van 15 tot 30 nucleotiden.
OPMERKING 2 Een forward primer bevindt zich aan de 5'-kant van het gen, een reverse primer aan de 3'-kant.
or
3.13
probe
enkelstrengs DNA-fragment gelabeld met een fluorescente kleurgroep die kan worden gedetecteerd in het
realtime-PCR-apparaat
be
Pr
OPMERKING
Aan de andere zijde van de probe is een quencher gebonden die detectie van de fluorescentie van de
kleurgroep voorkomt totdat de probe bindt aan het vermenigvuldigde DNA-fragment om vervolgens door het
Taq-polymerase te kunnen worden afgebroken en waarbij het fluorescente signaal vrijkomt.
OPMERKING
4 Beginsel
iew
ev
3.14
Taq-polymerase
polymerase verkregen uit de bacterie Thermus aquaticus die in heetwaterbronnen en geisers leeft
Dit thermostabiele polymerase wordt gebruikt voor de DNA-synthese in de PCR.
eld
De detectie en kwantificering van L. pneumophila bestaat uit drie fasen: (1) concentreren van de bacteriën in
het monster door filtratie, (2) lysis, DNA-extractie en zuivering van het DNA, en (3) vermenigvuldiging van
specifieke DNA-fragmenten met PCR en realtime-kwantificering van het gevormde DNA met een probe.
Concentratie van het monster geschiedt door membraanfiltratie. De bacteriën op het filter worden gelyseerd
en het lysaat wordt verzameld in een reactievat. Aansluitend wordt het DNA gezuiverd met behulp van
glasdeeltjes (beads met een metalen kern) die worden geconcentreerd met een magneet. Na zuivering wordt
het DNA verdund. Het geïsoleerde DNA wordt gemengd met het PCR-mengsel. In de PCR wordt, indien
aanwezig, een fragment (van 149 basenparen) van het mip-gen van L. pneumophila vermenigvuldigd.
Identificatie vindt plaats met een specifieke probe. De voortgang van de DNA-vermenigvuldiging kan realtime
worden gemeten en gevisualiseerd door het PCR-apparaat met specifieke filters. Verschillende
verdunningen van een referentie-DNA-suspensie worden in elke PCR geanalyseerd en zijn de basis voor
een kalibratielijn. Met deze kalibratielijn kan de oorspronkelijke concentratie L. pneumophila in de monsters
worden berekend. Ter controle van de efficiëntie van de DNA-isolatie en eventuele remming of vermindering
van de PCR-vermenigvuldiging wordt aan elk monster na filtratie een bekende hoeveelheid van een interne
controle toegevoegd. Deze interne controle is een DNA-plasmide met een fragment van het DNA van het
denguevirus. In de PCR wordt tegelijk met de specifieke detectie van L. pneumophila de concentratie van
deze interne controle bepaald, in een zogenoemde multiplexreactie. Vergelijking van de concentratie van de
5
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
interne controle in het uiteindelijke DNA-isolaat met de initiële concentratie geeft informatie over de efficiëntie
van de DNA-isolatie en eventuele remming van de PCR.
5 Controles
5.1 Algemeen
In elke monsterreeks moeten de volgende controles in behandeling worden genomen.
5.2 Kalibratielijn
Vo
Voor het kwantificeren van DNA van L. pneumophila en de interne controle wordt gebruikgemaakt van
kalibratielijnen. De kalibratielijn voor L. pneumophila en de interne controle bestaat uit een DNA-plasmide
met daarin het DNA-fragment, dat wordt geamplificeerd door de specifieke primers. De concentratie van het
DNA-plasmide voor L. pneumophila moet nauwkeurig worden bepaald en vervolgens worden verdund tot
een verdunningsreeks van ongeveer 5, 50, 500, 5 000 en 50 000 kopieën/μl (6.9). De kalibratielijn van de
interne controle is gelijk aan het plasmide dat aan elk monster wordt toegevoegd. Deze heeft tot doel om de
begin- en eindconcentratie van de interne controle eenvoudig te bepalen (6.10).
5.3 Positieve controle
or
Bij elke monsterreeks worden twee positieve controles van een L. pneumophila-celsuspensie in behandeling
genomen. Een controle met een relatief lage celconcentratie van ongeveer tienmaal de bepalingsgrens en
een controle met een tien- tot honderdmaal hogere celconcentratie. De resultaten van zowel de
L. pneumophila-concentratie in de controlemonsters als het rendement van de interne controle moeten
worden opgenomen in een controlekaart.
ev
be
Pr
5.4 Negatieve controle
iew
In elke monsterreeks moet de afwezigheid van L. pneumophila-DNA worden vastgesteld met een negatieve
controle. Deze controle bestaat uit 25 ml tot 100 ml DNA-vrij water en moet gelijktijdig met de andere
monsters worden geanalyseerd.
6 Ingrediënten en reagentia
eld
6.1 Algemeen
Bij de bereiding van de reagentia en hulpstoffen volgens de in deze norm gegeven recepten moet zo veel
mogelijk gebruik worden gemaakt van speciaal voor dit doel in de handel gebrachte ingrediënten. Gebruik
alleen chemicaliën van analysekwaliteit, vrij van L. pneumophila-DNA en geschikt voor moleculairbiologische
detectiemethoden waaronder PCR. Het gebruik van commercieel verkrijgbare kant-en-klare reagentia en
hulpstoffen met dezelfde samenstelling en specificaties is ook toegelaten en verdient de voorkeur.
Oplossingen en reagentia moeten bij voorkeur worden verdeeld in kleinere porties (bijv. voor één PCR) en
worden opgeslagen onder de voor het product specifieke condities.
6.2 Schoonmaakvloeistof
Oxidatieve oplossing voor het verwijderen en afbreken van DNA en RNA aan oppervlakken. Gebruik bijv.
een chlooroplossing of kant-en-klare oxidatieve schoonmaakmiddelen.
6.3 Water, van ten minste klasse 3 volgens NEN-EN-ISO 3696, vers bereid en vrij van DNA en DNase en
RNA en RNase.
6
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 6254:2012
6.4 DNA-extractiekit voor bacteriën, DNA-extractie methode die DNA met voldoende rendement kan
extraheren (zie 10.1 en criteria in tabel 4). Het rendement van de extractie van het genomische
L. pneumophila DNA en het plasmide DNA van de interne controle moet gelijkwaardig zijn (bijlage A). Er
wordt vooralsnog geen criterium gesteld aan de efficiëntie van de lysis van de bacteriecellen, als onderdeel
van de extratie van DNA. Over de methode voor het vaststellen van de efficiëntie van de lysis loopt
internationaal onderzoek.
Vo
OPMERKING
Een belangrijke kwaliteitscontrole van de qPCR-methode is het rendement van de interne controle die
aan elk te analyseren monster wordt toegevoegd. Het plasmide DNA van deze interne controle wordt samen met het
DNA uit het monster geëxtraheerd en gezuiverd met behulp van een DNA-extractiemethode. Het rendement van de
interne controle wordt gebruikt om het verlies van genomisch DNA tijdens de opwerking te corrigeren. Deze correctie is
alleen mogelijk als de gebruikte DNA-extractiemethode het plasmide DNA en het genomisch DNA met een vergelijkbare
efficiëntie isoleert, m.a.w. er moet een statistisch lineair verband bestaan tussen het rendement van extractie van de
twee DNA-typen. Uit onderzoek is gebleken dat niet alle DNA-extractiemethoden (kits) de twee verschillende DNA-typen
met vergelijkbare efficiëntie extraheert. Het is dan ook noodzakelijk om voorafgaand aan de ingebruikneming van een
DNA-extractiemethode voor qPCR deze te valideren op dit aspect. In bijlage A is een methode beschreven hoe dit kan
worden uitgevoerd.
6.5 Proteïnase K, oplossing geschikt voor PCR-toepassingen.
6.6 TE-buffer pH 8,0
or
6.6.1 Samenstelling
Tris-oplossing c(Tris) = 10 mmol/l.
EDTA-oplossing c(EDTA) = 1 mmol/l.
Tris = tris(hydroxymethyl)aminomethaan (C4H11NO3) en EDTA = ethyleendiaminetetra-azijnzuur
be
ev
6.6.2 Bereiding
Pr
OPMERKING
(C10H16N2O8).
iew
Los de Tris en het EDTA op in water vrij van DNA en DNase en RNA en RNase (6.3) en stel de pH met HCl
op 8,0. Verdun voor een tienmaal verdunde TE-buffer de oplossing met water vrij van DNA en DNase en
RNA en RNase (6.3).
6.7 Bovine serum albumine (BSA), ρ = 4 mg/ml
6.8 Primers en probes
6.8.1 Forward primer L. pneumophila: LpneuF
6.8.1.1 Samenstelling
DNA-sequentie 5’-CCGATGCCACATCATTAGC-‘3.
eld
BSA-oplossing geschikt voor PCR-toepassingen. Oplossing eventueel verdunnen met water vrij van DNA en
DNase en RNA en RNase (6.3).
Tienmaal verdunde TE-buffer (6.6.2).
6.8.1.2 Bereiding
Bereid een stockoplossing door de primers te resuspenderen in tienmaal verdunde TE-buffer (6.6.2) tot een
concentratie van 100 μmol/l. Bewaar deze stockoplossing bij ten hoogste –18 °C. Verdun de stockoplossing
tot een werkoplossing van 10 μmol/l. Gebruik voor de bereiding van zowel de stockoplossing als de
7
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Bestelformulier
Stuur naar:
NEN Standards Products & Services
t.a.v. afdeling Klantenservice
Antwoordnummer 10214
2600 WB Delft
NEN Standards Products & Services
Postbus 5059
2600 GB Delft
Vlinderweg 6
2623 AX Delft
T (015) 2 690 390
F (015) 2 690 271
Ja, ik bestel
__ ex. NEN 6254:2012 nl Water - Detectie en kwantificering van
<em>Legionella pneumophila</em> - Methode met kwantitatieve polymerase
chain reaction (qPCR)
www.nen.nl/normshop
€ 41.00
Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via
www.nen.nl/normshop
Gratis e-mailnieuwsbrieven
Retourneren
Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen,
Fax: (015) 2 690 271
E-mail: [email protected]
Post: NEN Standards Products
& Services,
t.a.v. afdeling Klantenservice
Antwoordnummer 10214,
2600 WB Delft
(geen postzegel nodig).
normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze
e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven
Gegevens
Bedrijf / Instelling
T.a.v.
O M
O V
Voorwaarden
• De prijzen zijn geldig
tot 31 december 2016,
E-mail
tenzij anders aangegeven.
• Alle prijzen zijn excl. btw,
Klantnummer NEN
verzend- en handelingskosten
Uw ordernummer
BTW nummer
en onder voorbehoud bij
o.m. ISO- en IEC-normen.
Postbus / Adres
• Bestelt u via de normshop een
PostcodePlaats
pdf, dan betaalt u geen
handeling en verzendkosten.
TelefoonFax
• Meer informatie: telefoon
(015) 2 690 391, dagelijks
Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres)
van 8.30 tot 17.00 uur.
Postbus / Adres
• Wijzigingen en typefouten
in teksten en prijsinformatie
PostcodePlaats
voorbehouden.
• U kunt onze algemene
voorwaarden terugvinden op:
DatumHandtekeningwww.nen.nl/leveringsvoorwaarden.
Normalisatie: de wereld op één lijn.
preview - 2016