21 – Genomics II

21 – Genomics II
21.1 Functional genomics
Functional genomics heeft als doel het verklaren van de rol van de verschillende genetische
sequenties.
DNA microarrays
(of ‘gene chip’) = een klein silica, glas of plastic plaatje met erop veel verschillende DNA sequenties.
Hierdoor kan de expressie van duizenden genen tegelijkertijd gecontroleerd worden.
Verschillende samples van DNA wordt op een plaatje gedaan, of kortere
elementen(oligonucleotiden) worden direct op het plaatje gesynthetiseerd. Als de DNA microarrays
gemaakt zijn worden ze gebruikt als een hybridization tool.
Deze technologie wordt gebruikt voor:
- Bestuderen van gen expressie patronen(hoe genen worden gereguleerd en hoe omgeving daar
invloed op heeft)
- Identificatie tool(herkenning en het in categorie brengen van tumor cellen)
- Identificeren van mutant allelen in een populatie en het vinden van duplicaties en deleties.
- Onderzoeken van DNA-eiwit interacties
Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
Voor de analyse van DNA –eiwit interacties. Deze methode kan bepalen of eiwitten kunnen binden
aan bepaalde regio’s in het DNA. Dit gebeurd IN LEVENDE CELLEN, dus niet in vitro.
Eiwitten in levende cellen, die niet-covalent gebonden aan het DNA zijn, kunnen sterker bevestigd
worden aan de chromatide door toevoeging van formalhyde oid -> crosslinkage -> cellen worden
gelyseerd -> DNA wordt gebroken in stukjes(200-1000bp) -> antilichamen worden toegevoegd voor
het eiwit van interesse( het antigen is het eiwit van interesse waarvan gedacht wordt dat het een
DNA-binding eiwit is) -> antilichamen hechten aan de ‘heavy beads’ en aan de DNA-eiwit complexen > pellet(=een geheel) = immunoprecipitation.
-> identificeren van de covalently cressedlinked DNA:
Het eiwit is verwijderd door behandeling met chemische middelen -> breken van die linkage.
-> PCR primers worden gebruikt en PCR start.
DNA microarrays kunnen ook gebruikt worden bij het bepalen waar het eiwit bind door het hele
genoom heen9=ChIP-chip assay)
De einden van het geprecipiteerde DNA worden geligeerd aan korte DNA stukjes(linkers) -> PCR
primers worden toegevoegd -> tijdens PCR wordt het DNA fluorescent gelabeld -> DNA wordt
gehybridiseerd tot een DNA microarray -> de fluorescerende plekken op de microarray zijn de
plekken waar het eiwit bind.
21.2 Proteomics
Proteome: de complete collectie van eiwitten die een cel of organisme kan maken.
Proteomics: study of proteome.
Voorbeelden:
- Alternative splicing
- RNA editing
- Posttranslation covalent midification
- Two dimentional gel electrophoresis: een sample van cellen wordt gelyseerd -> eiwitten worden op
een tube gel(scheid op basis van hun net chage bij een bepaalde pH) gebracht -> de eiwitten
verplaatsen zich naar het punt waar hun net charge 0 is. = isoelectric focusing
-> als de tube gel klaar is wordt de tube horizontaal op een slab gel gelegd en dat begint -> elke vlek
correspondeerd aan een specefiek eiwit.
Eiwitten die maar één animozuur van elkaar verschillen kunnen zo gescheiden worden
- Massa spectrometrie
- Protein microarrays
1) Antibody microarray; hierbij wordt gebruikt gemaakt van het feit dat antilichamen een korte
peptide sequentie herkennen als antigen
2) functional protein microarray; zuivere eiwitten zijn hiervoor nodig.
21.3 Bioinformatics
BLAST
Een heel kleine E-value duidt op het feit dat de overeenkomst tussen de query sequence en de
matching sequences niet toevallig kan zijn. Eigenlijk wordt er dan vanuitgegaan dat ze homoloog zijn
en dat ze dus afstammen van dezelfde voorouder.
E-values hangen af van: lengte, hoeveelheids gaps, databse grootte.
Als de E-value kleiner is dan 10 tot de macht -50, dan is de overeenkomst héél groot en zijn ze
waarschijnlijk homoloog. (Values die kleiner zijn dan 10 tot de macht -100 worden als 0
weergegeven.