Cover Page The handle http://hdl.handle.net/44297 holds

Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/44297 holds various files of this Leiden University
dissertation
Author: Valk, Ramon van der
Title: Responding to environmental cues : the adaptive qualities of chromatin
compaction proteins
Issue Date: 2016-11-22
Nederlandse samenvatting
129
Het effectieve volume van de genomen van alle vormen van leven is veel groter dan dat van de cellen
waarin ze zich bevinden. Alle organismen beschikken daarom over mechanismen voor het compact
vouwen en functioneel organiseren van hun genetisch materiaal. Door recente ontwikkelingen in
fluorescentiemicroscopie en 3C-gebaseerde technologieën hebben we eindelijk een eerste inkijk in de
complexe mechanismen die de driedimensionale vouwing van genomen bepalen. Dit proefschrift
beschrijft onderzoek aan drie mechanismen voor het samenpakken van DNA: DNA-brugvorming (door
bijvoorbeeld het bacteriële eiwit H-NS), DNA-buiging, en het wikkelen van DNA rondom een eiwitkern
(zoals in het geval van de archaeale HMfA- en HMfB-eiwitten). Deze studies suggereren dat er een
complexe relatie bestaat tussen de functies van deze eiwitten en de omgeving waarin de cel zich
bevindt. Doordat de DNA-bindingseigenschappen van deze eiwitten worden beïnvloed door externe
factoren, kunnen hun functies (b.v. de regulatie van genexpressie) worden gemoduleerd.
Bacteriën zijn genoodzaakt zich regelmatig aan te passen aan verandering in hun leefomgeving.
Aanpassing vereist veranderingen in genexpressie, vaak gestuurd door globale transcriptieregulatoren. Het nucleoïde-geassocieerde eiwit H-NS is een belangrijke globale regulator in Gramnegatieve bacteriën en wordt beschouwd als een sleutelspeler in bacteriële chromatine-organisatie
door DNA-brugvorming. In vivo wordt H-NS-activiteit gemoduleerd door fysisch-chemische factoren
(osmolariteit, pH, temperatuur) en interactiepartners. Het is onbekend hoe de functie van H-NS wordt
gemoduleerd door deze factoren. In Hoofdstuk 2 wordt aangetoond dat een breed spectrum van
factoren het vermogen van H-NS om DNA-DNA-bruggen te vormen kan veranderen. Door het
veranderen van de concentratie van tweewaardige of eenwaardige ionen is het mogelijk om DNADNA-brugvorming door H-NS te bevorderen, terwijl DNA-binding grotendeels onaangetast blijft.
Evenzo moduleren synergetische en antagonistische co-regulatoren de efficiëntie van de DNA-DNAbrugvorming door H-NS. DNA-brugvorming kan worden bevorderd in wisselwerking met H-NSbindende eiwitten zoals Hha en YdgT met H-NS, terwijl van andere eiwitten zoals H-NST en gp 5,5
gedacht wordt dat ze het omgekeerde effect teweeg kunnen brengen. Simulaties van de structuur van
H-NS laten onder sommige van deze omstandigheden een overgang zien tussen een vorm van H-NS
die in staat is tot brugvorming en een vorm die daar niet toe in staat is.
Het is niet altijd eenvoudig de effecten van eiwitten die binden aan DNA te doorgronden en te
kwantificeren. In de afgelopen jaren zijn veel nieuwe biofysische technieken ontwikkeld die gebruikt
kunnen worden om dit soort systemen met grote nauwkeurigheid te onderzoeken. Een dergelijke
techniek, Atomic Force Microscopy (AFM), blijkt een krachtig hulpmiddel voor de studie van de
wisselwerking van DNA-eiwit interacties vanwege zijn vermogen om enkelvoudige moleculen op
nanoschaal in beeld te brengen. De AFM kan ook worden gebruikt voor krachtspectroscopie, maar
deze techniek wordt zelden toegepast om de interacties tussen DNA en eiwit te bestuderen. In
Hoofdstuk 3 wordt het gebruik van een AFM-toepassing besproken waarbij op grote schaal de
stabiliteit van DNA-DNA-bruggen gevormd door eiwitten wordt gemeten met een “Pulling assay". Als
modelsysteem, onderzochten we de interacties tussen DNA en H-NS. Middels deze analyse waren we
in staat om informatie over de kracht en brugvormende eigenschappen van H-NS te verkrijgen. Deze
methode zal in de toekomst gebruikt worden om de effecten van fysisch-chemische factoren en
interactiepartners van H-NS, zoals beschreven staan in Hoofdstuk 2, verder te kwantificeren.
130
Zoals hierboven vermeld, is de organisatie van genomen een essentieel aspect in alle domeinen van
leven. In Hoofdstuk 4 onderzoeken we het derde domein van leven, de Archaea. Het phylum Archaea
is het nieuwste domein in de phylogenetische stamboom, dat slechts vier decennia geleden erkend
werd, en zoals de naam aangeeft (afkomstig van het Griekse arkhaios, wat betekent oud of primitief)
verondersteld wordt de oudste van de drie te zijn. Archaea zijn te vinden in uiteenlopende
omgevingen, variërend van omgevingen met extreme temperaturen (‘hot tubs’ etc.) en met hoge druk
(diepzee) tot menselijke ingewanden. Archaea vouwen en organiseren hun genomen op verschillende
manieren. Veel Archaeasoorten brengen eiwitten homoloog aan de eukaryote histonen H3 en H4 tot
expressie. Het meest gangbare model, gebaseerd op data uit in vitro-experimenten, suggereert de
vorming van nucleosoomachtige structuren waarbij een histontetrameer betrokken is. Echter,
recente in vivo studies wijzen op de vorming van histon-DNA complexen van verschillende groottes
bestaande uit een aantal dimere eenheden. Hier gebruiken we de Methanothermus fervidus HMfA en
HMfB eiwitten als een modelsysteem om de samenstelling en structuur van archaeale histon-DNAcomplexen te onderzoeken. Onze studies tonen aan dat deze histon-achtige eiwitten coöperatief
multimeriseren langs het DNA en daarbij zorgen voor sterke samenpakking. Daarnaast suggereren de
resultaten dat de vorming van nucleosoomachtige structuren door tetrameren op specifieke
sequenties multimerisatie stimuleert, waardoor de beide modellen samen een nieuw model
opleveren.
Risico analyse en beoordeling van de techniek (Risk analysis and
technology assessment, RATA)
De RATA van dit proefschrift heeft betrekking op de beoordeling van de risico’s verbonden aan het
werken met de biologische onderzoekssystemen, evenals het sociaal-economische nut van de
bevindingen. Alle experimenten en bevindingen in dit proefschrift worden als laag risico beschouwd,
aangezien de genetisch gemodificeerde Escherichia coli stammen niet-pathogeen zijn. Als
veiligheidsmaatregel werden deze stammen dealniettemin alleen in een laboratoriumomgeving
bestudeerd. Dit werd gedaan om te voorkomen dat genen die niet van nature in Escherichia coli
voorkomen, zoals genen coderend voor archaeale chromatine-eiwitten of antibioticaresistentie,
overgedragen worden aan andere stammen via horizontale genoverdracht,. De experimenten in dit
proefschrift werden uitgevoerd volgens standaard laboratoriumveiligheidsrichtlijnen en maatregelen
zijn genomen om de risico’s te beperken (o.a. door het dragen van labjassen en het dragen van
handschoenen). Bacteriegerelateerde experimenten werden uitgevoerd in Biosafety niveau 1
gekwalificeerde laboratoria, en zorgvuldige maatregelen werden genomen voor de veilige opslag en
afvoer van biologische materialen. Experimenten met radioactiviteit werden uitgevoerd in speciaal
voor dit doel aangewezen en gekwalificeerde laboratoria. Sommige experimenten vereisten het
gebruik van micro- of nanodeeltjes, zoals polystyreenbolletjes gebruikt in diverse biochemische
studies en in de TPM-experimenten. Geen nadelige effecten zijn bekend ten aanzien van het gebruik
van deze deeltjes. Niettemin werden voorzorgsmaatregelen genomen om het risico op blootstelling
te beperken, zoals het dragen van handschoenen en het minimaliseren van de gebruikte concentraties
van deze deeltjes.
131
Alhoewel de bevindingen van deze studie niet direct toegepast kunnen worden, zijn we ervan
overtuigd dat ze uiteindelijk nieuwe mogelijkheden kunnen bieden op het gebied van antibiotica of
behandeling van ziektes die het gevolg zijn van foutief gereguleerde genen of afwijkingen in
chromatineorganisatie.
132