Practicum Biotechnologie

Practicum Biotechnologie
4/5VWO
Inhoudsopgave
Pag. 3
Planning
Pag. 4-5
Inleiding in de biotechnologie
Pag. 6
Voorbeeld uit de Biotechnologie
Pag. 7-8
Opzet Practicum (les 1)
Pag. 9
Oefenen met Pipetteren (les 1)
Pag. 10-11
DNA-Isolatie uit Tomaat (les 2)
Pag. 12-14
Isolatie Resistentie-gen uit Tomaat (les 3)
Pag. 15-16
Gel Elektroforese (les 4)
Pag. 17-18
Miniprep (les 4)
Pag. 19-20
Plasmid DNA knippen (les 4)
Pag. 21
Planttransformatie (les 5)
Pag. 22
Nabespreking (les 5)
MSc. Maaike de Jong
FNWI, afd. Celbiologie van de Plant
Heyendaalseweg 135
6525AJ Nijmegen
T: 024-3652869
@: [email protected]
2
Planning
Les
Datum
1
Inleiding practicum + Oefenen met Pipetteren
2
DNA isolatie tomaat
Carnavalsvakantie
3
College PCR reactie + inzetten PCR
4
Gel elektroforese + Miniprep + Plasmide DNA knippen
5
Bespreking resultaten + uitleg planttransformatie
3
Inleiding in de Biotechnologie
De term ‘biotechnologie’ bestaat uit twee delen: bios, het Griekse woord voor ‘leven’, en
technologie, wat wijst op menselijke tussenkomst. Biotechnologie wordt gedefinieerd als
de toepassing van levende organismen, zoals planten, dieren of micro-organismen voor
het maken of verbeteren van producten, bijvoorbeeld in de voedingsmiddelenindustrie of
voor de productie van medicijnen. De biotechnologie speelt een belangrijke rol in de
landbouw. Al honderden jaren lang maken landbouwers nieuwe en verbeterde
landbouwproducten door planten te veredelen met behulp van kruising en selectie, ook
wel de ‘klassieke biotechnologie’ genoemd. Onze voorouders hadden al snel
begrepen dat een gewenste eigenschap, bijvoorbeeld een grote opbrengst, verbeterd
kon worden door verder te kweken met planten die deze eigenschap vertoonden. Ze
slaagden er ook in de eigenschappen van twee verschillende planten in één plant te
verenigen door ze met elkaar te kruisen (Fig. 1). Onze voorouders wisten echter niet dat
bij het proces van kruisen en selecteren op het erfelijk materiaal, het DNA, wordt
ingegrepen.
Al de eigenschappen van een plant liggen opgeslagen in het DNA. Het stukje DNA dat
codeert voor een eigenschap, is een gen. Een plant bezit al snel zo’n 30 000
verschillende genen. Tijdens het kruisen worden grote stukken DNA en dus een
heleboel kenmerken onderling uitgewisseld. Ongeveer de helft van het DNA van de ene
plant wordt verenigd met de helft van het DNA van de andere plant. Zo ontstaan
nakomelingen met een unieke mengeling van eigenschappen van de beide
ouderplanten. Het is niet zo makkelijk om slechts één gewenst kenmerk over te dragen.
Daarvoor is een intensief en jarenlang kruisingprogramma vereist. Een ander nadeel van
veredeling, is dat het zich beperkt tot de kenmerken die de soort al bezit. Bovendien
mogen de kenmerken niet samengaan met ongunstige eigenschappen, zoals een
mindere kwaliteit.
In de ‘moderne biotechnologie’ kan men in één stap, heel gericht één kenmerk aan
een plant toevoegen. Men doet dat door het gewenste gen af te zonderen, te isoleren en
in het DNA van de plant in te bouwen (Fig. 1). Deze techniek is een stuk sneller dan de
conventionele veredeling, en bovendien breng je op deze manier geen eigenschappen
over die je liever niet wilt. Genen uit andere plantensoorten of zelfs andere organismen
4
zoals bacteriën of dieren kunnen net zo makkelijk in planten worden ingebouwd
waardoor een enorm scala aan kenmerken ter beschikking komt. Het inbouwen van zo’n
kenmerk wordt ‘genetische modificatie’ genoemd, omdat het genoom (het DNA) van
een plant wordt gemodificeerd (= veranderd).
Figuur 1- Schematische weergave van
de
traditionele
veredeling
en
de
moderne biotechnologie.
In de klassieke biotechnologie, of
traditionele
veredeling,
worden
de
eigenschappen van twee verschillende
planten in één plant verenigd door ze
met elkaar te kruisen. In de moderne
biotechnologie wordt het gewenste
kenmerk, een gen, vanuit de ene plant
in het DNA van de andere plant
ingebouwd (het gele bolletje is de
gewenste eigenschap).
Voor de genetische modificatie van planten wordt gebruik gemaakt van een natuurlijk
systeem uit de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Deze bacterie leeft in de grond
en is van nature bezig met genetische wijziging. Agrobacterium injecteert een plantencel
met genen die in het DNA van de plantencel worden ingebouwd. De plantencel wordt op
deze manier verplicht de geschikte voedingsstoffen aan te maken voor de bacterie.
Twee wetenschappers, Van Montagu en Schell, zijn erin geslaagd deze genen te
vervangen door nieuwe genen. Als je de -gewijzigde- bacterie dan loslaat op de plant
waaraan je de nieuwe genen of kenmerken wilt toekennen, worden deze nieuwe genen
in het DNA van de plant ingebouwd en is de opdracht volbracht. De nieuwe genen
komen meestal maar in een paar celletjes terecht. Maar men wil het kenmerk wel in alle
cellen van de plant. Gelukkig zijn planten gemakkelijke wezens: één cel is voldoende om
uit te groeien tot een nieuwe plant. Als je alleen de cellen met het nieuwe kenmerk
gebruikt, krijg je een volledige transgene plant.
5
Voorbeeld uit de Biotechnologie
Aardappel is een belangrijk voedingsgewas. Het is het
vierde voedselgewas van de wereld na rijst, maïs en
tarwe. Wereldwijd wordt ca. 30 miljoen hectare
aardappel verbouwd, dat is ongeveer 10 maal het
oppervlak van Nederland. Nederland heeft een sterke
positie in de aardappelsector. Dat hebben we te
danken aan de goede rassen die jaarlijks ontwikkeld
Figuur
Blad
2-
van
de
worden en door uitstekende marketingstrategie en
aardappelplant geïnfecteerd met
kwaliteitscontrole.
Phytophthora.
De
eerste
prioriteit
van
de
veredelaars is nog steeds gericht op veredeling tegen
ziekten en plagen. De belangrijkste resistentie waarnaar gezocht wordt is die tegen de
aardappelziekte Phytophthora (Fig. 2). Dit was de ziekte die rond het midden van de 19e
eeuw zorgde voor de hongersnood in Ierland waardoor zeer veel Ieren het land
ontvluchten (Fig. 3). Tegenwoordig wordt gebruik gemaakt van bestrijdingsmiddelen om
de ziekte te bestrijden. Per seizoen wordt wel 15 tot 20 maal gespoten tegen
Phytophthora. Dat is niet alleen een zware economische aanslag, maar ook een aanslag
op het milieu. Mogelijk kan de biotechnologie een oplossing bieden.
Er zijn aardappelrassen die uit zichzelf
resistent
zijn
tegen
de
aardappelziekte
Phytophthora,
maar
helaas
zijn
deze
varianten niet lekker om te koken en niet
geschikt voor het bakken van friet. Met behulp
van de biotechnologie is het mogelijk genen
uit deze rassen te isoleren die resistentie
kunnen geven tegen Phytophthora, en te
introduceren in aardappelrassen die wel
lekker
smaken.
Na
deze
genetische
modificatie zijn de lekkere aardappelrassen
Figuur 3- Inwoners uit Galway, Ierland, vallen
de aardappel winkel van de overheid aan.
London News, juni 1842.
ook resistent tegen de ziekte en hoeven geen
bestrijdingsmiddelen te worden gebruikt.
6
Opzet practicum (1)
Het doel van het practicum is om jullie kennis te laten maken met de basistechnieken uit
de biotechnologie, bestaande uit: het isoleren van DNA, het isoleren van een gen, het
knippen van DNA, en het visualiseren van DNA m.b.v. gel electroforese. Het practicum
is gebaseerd op het voorbeeld van pagina 6 waarin een resistentie-gen tegen de
aardappelziekte Phytophthora wordt geïsoleerd en geïntroduceerd in een aardappelras
met een lekkere smaak. In dit practicum gaan we een resistentie-gen isoleren uit tomaat,
een familielid van de aardappel en doorlopen we de verschillende stappen om dit gen te
kunnen introduceren in aardappel. Helaas mogen we het gen niet werkelijk in de
aardappel introduceren vanwege de strenge regelgeving voor genetische modificatie.
Het stappenplan om dit resistentie-gen van tomaat in aardappel te introduceren ziet er
als volgt uit:
DNA isoleren uit tomaat
Resistentie-gen isoleren uit het DNA van tomaat m.b.v. PCR
Controleren of het juiste gen is geïsoleerd m.b.v. gel elektroforese
*Geïsoleerde resistentie-gen in plasmide DNA plakken
*Plasmide DNA in agrobacterie zetten
Plasmide in agrobacterie controleren m.b.v. miniprep en knippen
*Bladweefsel van de aardappel met de bacterie infecteren
*Opkweken transgene aardappelplant vanuit bladweefsel
* Deze stappen kunnen we niet met dit practicum uitvoeren i.v.m. de regelgeving
genetische modificatie.
7
Opdrachten les 1
1- Bedenk een paar andere voorbeelden van kenmerken die handig zijn om te
introduceren in landbouwgewassen (evt. Internet).
2- Een andere vorm van biotechnologie is het “weghalen” van een kenmerk.
Bedenk ook voorbeelden van dit soort kenmerken.
8
Oefenen met Pipetteren (1)
Biotechnologen werken met veel verschillende vloeistoffen, zoals oplossingen van
zouten, buffers en enzymen. Maar de hoeveelheden zijn meestal ontzettend klein. De
volumes worden dan ook aangegeven in milliliters (ml; 1/1000 liter) of microliters (μl;
1/1000 000 liter). Met behulp van een pipet kunnen deze volumes nauwkeurig worden
afgemeten.
De pipet werkt als volgt:

Kies de pipet die bij het te pipetteren volume past

Draai de pipet op het juiste volume

Zet een plastic pipetpunt op de pipet (houd deze pipetpunten alleen aan het
brede deel vast, zodat reacties niet besmet worden!)

Druk de pipet met de duim in tot de “eerste weerstand”

Zet de punt in de vloeistof en laat de duim rustig omhoog komen, zodat de
vloeistof wordt opgezogen (niet te snel!)

Pipeteer de vloeistof in een reageerbuisje door de pipet weer in te drukken tot de
“tweede weerstand”
Opdracht Pipetteren
Pipetteer de volgende volumes water samen in één reageerbuisje, gebruik iedere keer
dezelfde pipetpunt:
1.
o
1,00 ml
o
0,45 ml
o
450 μl
o
3x 100 μl
o
2x 40 μl
o
2x 10 μl
Wat is het totaal volume water in het reageerbuisje?
(geef het antwoord in ml en in μl)
2.
Wat zou het gewicht van het water in het reageerbuisje moeten zijn ?
3.
Weeg nu je reageerbuisje en controleer of je juist hebt gepipetteerd.
9
DNA-Isolatie uit Tomaat (2)
Iedere cel van een plant bevat DNA. In tomaat heeft
het DNA een lengte van 23 cm verdeeld over 12
chromosomen. In de chromosomen ligt het DNA
molecuul
opgerold
rondom
eiwitten,
histonen
genaamd. Het DNA-molecuul heeft de vorm van een
wenteltrap; een dubbele helix van twee om elkaar
gewonden ketens. De basen of nucleotiden vormen
de traptreden van deze wenteltrap. Elk nucleotide
bestaat uit een fosfaatgroep, een suikermolecuul en
een
stikstofbase.
verschillende
Figuur 4- Opbouw van DNA.
In
het
stikstofbasen
DNA
voor:
komen
vier
adenine
(A),
cytosine (C), guanine (G) en thymine (T). De twee
ketens zijn met elkaar verbonden door basenparen.
Tegenover de T in de ene keten zit altijd een A in de andere keten; evenzo vormen C en
G een basenpaar (Fig. 4).
10
Protocol DNA-Isolatie
(K. Edwards et al., 1991, Nucleid Acids Research)
1-
Pak een klein stukje blad door deze “uit te ponsen”. Dit doe je door een stukje
blad tussen het epje en de dop te houden en de dop dicht te drukken.
2-
Vermaal het stukje blad tot prut met behulp van een pesteltje.
3-
Voeg met de pipet 0,4 ml extractiebuffer toe. Deze buffer zorgt ervoor dat de
celwanden kapot gaan het dat het DNA vrijkomt. Het DNA lost vervolgens op
in de extractiebuffer.
4-
10 seconden goed schudden.
5-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm. Door het centrifugeren komen de
celresten op de bodem te liggen. Het DNA blijft opgelost in de extractiebuffer
en zit dus in de bovenste laag.
6-
Zuig met een pipet 0,3 ml van de extractiebuffer (bovenste laag) voorzichtig
op en pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op
de bodem laat liggen.
7-
Voeg met de pipet 0,3 ml isopropanol toe en meng door het epje een paar
keer om te keren (niet schudden!). DNA lost niet op in isopropanol en zal dus
gaan neerslaan).
8-
Laat het epje 2 minuten staan.
9-
Centrifugeer 5 minuten bij 13 000 rpm. Het neergeslagen DNA komt nu op de
bodem te liggen.
10-
Zuig met de pipet de vloeisof af. Let erop dat het neergeslagen DNA op de
bodem van het epje blijft liggen.
11-
Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm en zuig het laatste restje vloeistof af.
12-
Laat het epje 10 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten
isopropanol verdampen.
13-
Los het DNA op in 0,2 ml water en pipetteer een paar keer op en neer.
14-
Merk het epje en bewaar het in de koelkast bij 4 ۫C.
Opdrachten les 2
1-
De extractiebuffer bestaat bevat o.a. zeep, welke celonderdelen gaan kapot
door de zeep?
2-
De extractiebuffer bevat ook veel zouten, deze veranderen de structuur van
eiwitten. Wat doet zout met de chromosomen?
11
Isolatie Resistentie-gen Tomaat (3)
Om het resistentie-gen te isoleren, wordt gebruik gemaakt van een polymerasekettingreactie, afgekort PCR. De PCR is een methode om zeer kleine hoeveelheden
DNA te vermenigvuldigen (amplificeren) tot er genoeg van is om het zichtbaar te kunnen
maken op een gel. De PCR-reactie bestaat uit de volgende componenten:

het geïsoleerde DNA,

Taq DNA polymerase,

losse basen (A, T, G of C) en

primers
Figuur 5- Taq DNA polymerase plakt de
basen aan elkaar zodat ze op de
bestaande streng DNA passen.
De PCR maakt gebruik van het enzym Taq DNA polymerase, die losse basen aan
elkaar plakt. De twee strengen van het geïsoleerde DNA worden uit elkaar gehaald door
de temperatuur te verhogen, waardoor twee enkele strengen DNA overblijven. De Taq
gebruikt deze enkele strengen als matrijs, of mal, voor het maken van een nieuwe streng
DNA. De Taq beweegt over de enkele DNA streng en leest deze af. Bij iedere “T” die de
Taq tegenkomt, plakt deze een “A” vast, en bij ieder “C” een “G”, enzovoorts. Zo ontstaat
opnieuw een dubbele streng DNA (fig. 5).
Om het DNA dubbelstrengs te maken, heeft de Taq al een klein stukje dubbelstrengs
DNA nodig als startpositie. Daarvoor dienen de primers. Dit zijn kleine stukjes DNA, die
zo gemaakt zijn dat zij overeenkomen met de basen-volgorde van het resistentie-gen.
Omdat zij alleen op het resistentie-gen passen, is dat gen het enige stuk DNA dat uit het
gehele genoom van de plant wordt vermeerderd.
12
De PCR reactie bestaat uit drie fasen (fig. 6):
-
Denaturatie: door de temperatuur tot
94 ۫C te verhogen splitsen de twee
DNA ketens uit elkaar.
-
Hybridisatie:
bij
een
lagere
temperatuur, 55 ۫C, binden de primers
op het geïsoleerde DNA, maar alleen
op de basen van het resistentie-gen.
-
Extensie:
de
temperatuur
wordt
verhoogd
tot
72
deze
۫C.
Bij
temperatuur begint de Taq vanuit de
primers, een kopie te maken van het
resistentie-gen uit het geïsoleerde
DNA.
De
Taq
plakt
de
losse
nucleotiden (dNTPs) aan elkaar en
Figuur 6- Polymerase kettingreactie
gebruikt daarbij dus één van de
ketens als voorbeeld om te zien in
welke volgorde de basen aan elkaar
geplakt moeten worden.
De kopieën kunnen op hun beurt ook weer worden gekopieerd, dus na iedere stap is er
dus twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door deze stappen een aantal
malen te herhalen, bijvoorbeeld 35 of 40 keer (cycli), krijgt men een enorme hoeveelheid
DNA.
http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/PCR.html
13
Protocol PCR
1-
Pipetteer 5 μl DNA-oplossing in een PCR-buisje.
2-
Maak een mix voor de PCR-reactie klaar in een epje:
3-
10x PCR buffer
2,5 μl
25 mM MgCl2
2,5 μl
10mM dNTPs
1
μl
Forward primer
1
μl
Reverse primer
1
μl
Taq polymerase
1
μl
Water
16 μl
Totaal
25 μl
Pipetteer de mix bij de 5 μl DNA-oplossing en pipetteer een paar keer op en
neer om te mengen.
4-
Verzamel alle PCR-buisjes op ijs zodat alle buisjes tegelijk in het PCRapparaat kunnen.
5-
PCR-programma:
94 ۫C
2 min.
94 ۫C
30 sec.
55 ۫C
30 sec.
72 ۫C
30 sec.
72 ۫C
2 min.
15 ۫C
∞
40x
Opdrachten les 3
1-
De vermeerdering van het DNA volgt een wiskundig verband, welk verband is
dat?
2-
Hoeveel strengen DNA hebben we van het resistentie-gen na een PCR
reactie van 40 cycli?
14
Gel elektroforese (4)
Gel elektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder invloed van een
elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen bewegen naar
beneden waar de positieve pool zich bevindt. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze
kunnen bewegen; hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen bewegen. DNA
moleculen hebben een negatieve lading. Gel elektroforese kan dus ook worden gebruikt
voor het analyseren van DNA. Naast de PCR-reactie, wordt ook een mengsel van
verschillende DNA fragmenten op de gel gebracht, een ladder. De lengte van deze
fragmenten is bekend, zodat we de lengte van het PCR-product kunnen bepalen.
Protocol gel elektroforese
(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning)
1-
Maak een gel door in een bekerglas 1 gram agarose op te lossen in 100 ml
TAE Buffer.
2-
Verwarm het bekerglas boven een brander om de agarose op te lossen
(voorzichtig, wordt erg heet!).
3-
Tape de gel-tray af met plakband en plaats de kam op de tray.
4-
Giet de agarose-oplossing in de tray en laat de gel 15 min. afkoelen.
5-
Verwijder plakband van de tray en plaats de gel (met tray) in de
elektroforesebak.
6-
Vul de elektroforesebak met TAE buffer
7-
Meng 8 μl PCR-product met 2 μl Loading buffer. Deze buffer verzwaart het
DNA, daardoor is het PCR-product makkelijker in de gel te pipetteren.
8-
Pipetteer de 10 μl in de gel. Zet er 6 μl DNA-ladder naast.
9-
Zet de deksel op de electroforesebak, en breng de spanning op 100V.
10-
Laat de gel 20 min lopen.
11-
Laat de gel overnacht incuberen in water met 0,02% methyleenblauw (20 μl
in 100 ml water).
12-
Maak een foto van de gel.
15
Opdrachten les 4
1-
Hoe groot is het PCR fragment dat je verwacht (gebruik het word document
met daarin de sequentie-informatie van het resistentie-gen en de
bijbehorende primers)?
2-
Klopt de grootte van het PCR-product met de verwachtte fragmentgrootte?
16
Miniprep (4)
Voor de genetische modificatie van planten wordt gebruik gemaakt van een natuurlijk
systeem uit de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium injecteert een
plantencel met genen, die vervolgens in het DNA van de plantencel worden ingebouwd.
Het DNA van een bacterie is anders georganiseerd dan het
DNA van mensen, dieren en planten. In plaats van
chromosomen hebben bacteriën één groot ringvormig DNAmolecuul. Dit molecuul draagt alle informatie die voor de
levensprocessen
van
de
bacterie
van
belang
zijn,
bijvoorbeeld de genen voor productie van verteringsenzymen.
Daarnaast bevat een bacterie plasmiden, deze dragen de
genen
voor
niet-essentiële
eiwitten.
Het
DNA
wat
Agrobacterium in planten inbouwt is afkomstig van zo’n
Figuur 6- Organisatie van
DNA in een bacterie
plasmide (Fig. 6). Om de Agrobacterium te gebruiken voor de
genetische modificatie van aardappel, moeten we eerst een plasmide met het tomaten
resistentie-gen maken en dat kan met behulp van enzymen die het PCR-product in het
plasmide plakken. Het resulterende plasmide wordt vervolgens in de agrobacterie
gestopt en vermeerderd. Helaas mogen we deze stappen niet tijdens het practicum
uitvoeren vanwege de strenge regels voor genetische modificatie, want in deze stappen
wordt het genoom van de bacterie veranderd (gemodificeerd). Voordat het blad van de
aardappel wordt geïnfecteerd met deze ‘nieuwe’ agrobacterie, moet worden
gecontroleerd of het PCR-product wel echt in het plasmide zit. Maar daarvoor moet het
plasmide eerst opnieuw uit de agrobacterie worden geïsoleerd, dat gaat met behulp van
een ‘miniprep’.
17
Protocol Miniprep
(www.pcb.science.ru.nl/protocols.html)
1-
Giet 1,5 ml Bacteriecultuur in een epje
2-
Centrifugeer 2 min op 14 000 rpm.
3-
Giet de vloeistof af, de bacteriën vormen nu een pellet onderin het epje
4-
Voeg 100 μl TEG toe aan de bacteriën en schud totdat alle bacteriën weer zijn
opgelost.
5-
Voeg 200 μl 0,2 M NaOH en 1% SDS toe. Meng, door het epje een paar keer om
te draaien (niet schudden!!).
6-
Wacht totdat de oplossing helder wordt. Maximaal 5 min.
7-
Voeg 150 μl 5 M KAc toe. Meng, door het epje een paar keer om te draaien (niet
schudden).
8-
Centrifugeer 10 min bij 14 000 rpm.
9-
Zuig met een pipet 0,4 ml supernatant (bovenste laag) voorzichtig op en
pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem
laat liggen.
10-
Voeg 0,8 ml 96% Ethanol toe en meng door een paar keer op en neer te
pipetteren.
11-
Centrifugeer 10 min bij 14 000 rpm.
12-
Zuig met de pipet de vloeisof af. Let erop dat het neergeslagen DNA op de
bodem van het epje blijft liggen.
13-
Centrifugeer 1 minuut bij 14 000 rpm en zuig het laatste restje vloeistof af.
14-
Laat het epje 5 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten
ethanol verdampen.
15-
Los het plasmide DNA op in 50 μl water.
Opdrachten les 4
1-
Waarvoor dienen de NaOH (zout, basisch) en SDS (zeep) bij stap 5?
2-
Waarom moet na max. 5 min KAc (zuur) worden toegevoegd?
18
Plasmide DNA knippen (4)
Na
de
manieren
plasmide-isolatie
worden
kan
gecontroleerd
op
of
twee
het
plasmide het resistentie-gen bevat: door
middel van PCR of met behulp van restrictieenzymen. Restrictie-enzymen knippen de
dubbele DNA-streng op een specifieke plaats,
bij een bepaalde volgorde van nucleotiden
(sequentie). Ieder restrictie-enzym knipt dus
Figuur 7- Voorbeelden van restrictieenzymen.
heel specifiek op een andere sequentie en
dus op een andere plek in het DNA (Fig. 7).
Opmerkelijk is dat deze sequenties altijd een
palindroom structuur hebben.
Protocol Plasmid DNA knippen
1-
Pipetteer in een epje:
17,25 µl Water
5
µl Plasmid DNA
2,5
µl Restrictie buffer Tango
0,25 µl Restrictie enzym AscI
0,25 μl Restrictie enzym NotI
2-
Pipeteer een paar keer op en neer om te mengen
3-
Zet het epje voor 1-1,5 uur bij 37 ۫C.
4-
Tijdens de volgende les: voeg 5 μl loadingbuffer toe aan de reactie en zet 10 μl
van de reactie op gel (zie pag. 13).
Opdrachten les 4
1-
Op de volgende pagina staat een schematische tekening van het plasmide met
daarin aangegeven: de grootte van het plasmide met resistentie-gen en de
knipplaatsen van verschillende restrictie-enzymen. Wat is de grootte van de
fragmenten na het knippen?
2-
Wat zou de fragmentgrootte worden als het PCR fragment niet in het plasmide
zit?
19
Resistentie-gen
NotI 698 bp
AscI 1190 bp
DraII 565 bp
AcsI 1505 bp
HincII 502 bp
AcsI 1689 bp
3072 bp
PvuI 1892 bp
BsmFI 2343 bp
SapI 112 bp
20
Planttransformatie (5)
Om het resistentie-gen van tomaat uiteindelijk in aardappel te introduceren, worden
kleine stukjes blad van een aardappelplant geïnfecteerd met de ‘nieuwe’ agrobacterie.
Deze bacterie zet het resistentie-gen vanuit zijn plasmide over in het genoom van de
aardappelplant. Maar meestal komen de nieuwe genen in een paar cellen van het
bladweefsel terecht en uiteindelijk wil men het kenmerk in alle cellen van de plant. Bij
planten is het mogelijk om één cel uit te laten groeien tot een nieuwe plant.
Cellen in bladweefsel zijn gespecialiseerde cellen, maar onder invloed van hormonen
kunnen deze weer veranderen in cellen zonder specifieke functie. Deze cellen gaan zich
dan vermeerderen (vormen callus; Fig. 8) en kunnen vervolgens uit groeien tot volledige
plant met bladeren en wortels. Als je alleen de cellen met het nieuwe kenmerk gebruikt,
bijvoorbeeld de resistentie tegen Phytophthora, krijg je dus een volledige transgene
aardappelplant. Helaas mogen we deze stappen niet tijdens het practicum uitvoeren, de
regels voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen zijn zeer streng.
Figuur 8- Planttransformatie
ABladweefsel verliest onder invloed van hormonen zijn specifieke functie en gaat callus vormen
(pijltje).
B-D
Vanuit het callus groeien stengels.
EEn door de steeltjes over te brengen naar een oplossing met een andere
hormoonsamenstelling, gaan de steeltjes wortels vormen.
Opdrachten les 5
1Kunnen dierlijke cellen met een specifieke functie weer van functie veranderen?
2Greenpeace en andere milieuorganisaties zijn tegen het veranderen van planten
door middel van deze moderne technieken. Wat is volgens hen het grootste
gevaar?
21
Nabespreking (5)
Bekijken gel: PCR + plasmide DNA knippen
Nabespreking van de opdrachten en practica
22