Colleges Biochemie 2011 Rijksuniversiteit Groningen Niek Groot 1

Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 8 september 2011
dr. Dirk Slotboom
Op de aarde komen heel veel silicaten en
koolstofmoleculen voor. Koolstof is heel
geschikt om moleculen te bouwen. Dit kun
je ook concluderen uit het feit dat de
moleculen van het leven voornamelijk uit de
meest voorkomende elementen op aarde bestaan. Hiernaast heb ik de meest belangrijke elementen
voor het vormen van leven (op aarde) weergegeven.
Een ander heel belangrijk molecuul is water. Al het leven op aarde bestaat uit/verbruikt water, zelfs
wanneer het lijkt dat er geen water aanwezig is (voorbeeld hete zwavelbronnen in Amerika en
bacteriën in de woestijn). Omdat water een dipoolmolecuul is, kan het waterstofverbindingen
aangaan met andere OH of NH2 groepen.
Thermische energie
De Boltzmannconstante of constante van Boltzmann (k of kB) is een natuurkundige constante die
zowel het verband aangeeft tussen temperatuur en energie als tussen entropie en waarschijnlijkheid.
De meest recente waarde, in SI-eenheden, is:
k = 1,4 · 10-23 J K-1
J voor Joule
K voor Kelvin
De algemene gasconstante R is de Boltzmannconstante vermenigvuldigd met de constante van
Avogadro NA. We kunnen dan in mol rekenen in plaats van het aantal deeltjes, dit is bruikbaarder in
praktisch werk. De formule luidt als volgt:
Boltzman (zie
hierboven) en T de temperatuur in Kelvin.
Omdat je met deze vergelijking alleen de thermische energie van één object berekend, wordt de
uitkomst vaak nog met de constante van Avogadro (Na) vermenigvuldigd. Hiermee kun je dus de
thermische energie van bijvoorbeeld een mol water berekenen. De formule luidt dan als volgt:
*Na
Hierdoor krijgt E nu de waarde J/mol, in plaats van gewoon J.
De thermische energie is hoog genoeg om bijvoorbeeld een
koolstofatoom om zijn as te laten draaien, dit lukt echter niet bij
een dubbele binding.
Om te kunnen zien wordt in onze ogen het stofje 11-cis-retinal
omgezet in all-trans-retinal, ook wel een cis-trans isomerisatie
genoemd.
1
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Omdat water een dipoolmolecuul is, zullen stoffen die ook een dipoolmoment hebben goed in water
oplossen. Lange strengen met alleen C en H atomen zijn apolair en worden alifatisch genoemd. Deze
zullen dus niet goed oplossen in water. Zodra moleculen
zowel een apolair als een polair gedeelte hebben, zal
het polaire gedeelte aan de water kant gaan zitten en
het apolaire gedeelte naar binnen keren (net zoals bij
fosfolipiden, zie plaatje hiernaast).
Zoals je ziet, zoeken alle hydrofobe en alle hydrofiele
uiteinden elkaar op. Hierdoor zullen de moleculen aan
elkaar klonteren, zodat er belletjes ontstaan (zoals bij
olie in water en de waterdruppels op het hydrofobe
blad van een plant). Dit wordt ook wel het Hydrofobe
effect genoemd.
Elektrostatische bindingen ontstaan door een verschil in
lading tussen 2 deeltjes (bijv. moleculen). De sterkte van
deze binding is te berekenen m.b.v. de wet van
Coulomb
Hierin is E de energie, q1 en q2 de ladingen op twee atomen, r de afstand en D de dielectrische
constante van het medium en k een proportionaliteitsconstante.
de factoren die de sterkte van een ionaire binding beïnvloeden, zijn dan:


de grootte van de ionen: hoe groter de ionen, hoe kleiner de aantrekkingskracht en hoe
zwakker de binding.
de grootte van de ladingen: hoe groter de ladingen, hoe sterker de binding.
DNA bestaat uit twee strengen, die door NIET-covalente interactie bij elkaar worden gehouden,
namelijk door H-bruggen. De vorm van DNA wordt
bepaald door de elektrostatische afstoting van de
fosfaatgroepen en door de waterstofbruggen aan de
‘
’
DNA. O
W
interacties spelen een rol bij de 3-dimensionale
structuur van DNA.
2
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 9 september 2011
dr. Dirk Slotboom
De structuur van DNA is onafhankelijk van de nucleotidevolgorde. De 4 nucleotiden zijn Guanine,
Cytosine, Adenine en Thymine.
Verschillende soorten eiwitten:
Een eiwit kan uit 20 verschillende aminozuren bestaan. Het soort aminozuur dat gevormd moet
worden, ligt weer vast in het DNA (3 basenparen).
Lysozymen, zijn enzymen die de
wand van een bacterie aanvallen. Ze
komen voor in traanvocht, bloed,
speeksel, eieren, enz. en ze worden
dan vaak gevonden in witte
bloedcellen.
Rubisco katalyseert (tegenwoordig
vooral) de carboxylatie (aanhechten
van een koolstofdioxide) van
ribulose 1-5 bifosfaat, waardoor er
een C6 suiker gecreëerd wordt,
bijvoorbeeld glucose.
Restrictie enzymen
Een restrictie-enzym of restrictie-endonuclease is een knipenzym dat in staat is om op bepaalde
plaatsen DNA in stukken te knippen.
Elke restrictie-enzym herkent een specifiek stukje (sequentie) DNA. Er worden de volgende drie
typen onderscheiden:



Typ I knipt het DNA op een willekeurige plaats ver van de herkenningsplaats.
Typ II knipt het DNA binnen de herkenningsplaats.
Typ III knipt het DNA ongeveer 20 tot 25 baseparen van de herkenningsplaats verwijderd.
Chiraliteit
Van een stof met een chiraal centrum komen isomeren voor die andere chemische eigenschappen
bezitten. Chirale verbindingen zijn niet superponeerbaar: dat wil zeggen dat hun spiegelbeelden niet
op elkaar te passen zijn. Een chiraal koolstofatoom heeft vier verschillende substituenten. Een
dubbele binding wordt als één binding gezien. In een chiraal-zuivere stof, zal zich dus alleen het
rechtsdraaiende, of alleen het linksdraaiende bevinden.
3
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Vorm van aminozuren
Bij pH=7 bevindt de COOH groep zich vrijwel altijd in de COO- toestand en de NH2-groep zich in de
NH3.I
PDF
“20
z
”
z
20
z
,
daarbij of ze een hydrofiel of een hydrofoob karakter hebben. Let op, Cysteïne is het enige
aminozuur dat disulfide bruggen kan vormen.
Een zwitterion, of een dipolair ion, draagt zowel
een positieve als negatieve lading, op verschillende
onderdelen van het molecuul. In een neutrale
omgeving zijn "alle"(dat wil zeggen van een slechts
verwaarloosbaar deel van de moleculen niet)
ioniseerbare groepen geïoniseerd en ontstaat er
een dipoolmoment. Ook zijn zwitterionen vaak
goede buffers.
Wanneer de pH groter wordt dan de pKa van die
stof, zal het proton (H+) zich afsplitsen
Disulfidebruggen
Een zwavelbrug of disulfidebrug (S-S) is een sterke covalente binding, die normaliter ontstaan is door
reactie tussen twee thiolgroepen.
Zwavelbruggen komen vooral voor bij eiwitten (alleen bij
cysteïne eenheden). Doordat zwavelbruggen, net zoals
andere covalente bindingen, vrij sterke bindingen zijn,
vormen ze belangrijke structurele elementen van eiwitten.
Waar waterstofbruggen en vanderwaals-interacties relatief
zwakke, eerder dynamische bindingen zijn, is het voorkomen
van zwavelbruggen sterk bepalend voor de uiteindelijke
eiwitstructuur.
4
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 16 september 2011
dr. Dirk Slotboom
Structuur van eiwitten
Eiwitten lopen altijd van de N naar de C terminus. Eiwitten vouwen zich in een driedimensionale
vorm. Deze vorm wordt bepaald door de onderlinge aantrekking en afstoting van de verschillende
aminozuren, door de omgeving waarin het eiwit zich bevindt. Er zijn ook enzymen die eiwitten
helpen zich te vouwen in de juiste vorm. De vorm van een eiwit is bepalend voor de specifieke
interacties die een eiwit aan kan gaan. Hierbij is het van belang dat het eiwit zich goed opvouwt.
Wanneer dit niet gebeurt werkt het eiwit niet goed, en kan het in uitzonderlijke gevallen zelfs andere
effecten veroorzaken, zoals bij de ziekte van Creutzfeldt-Jakob.
Primaire structuur: de aminozuursequentie, de keten wordt bij elkaar gehouden door covalente
bindingen, ook wel specifiek de peptidebinding genoemd. Er zijn 20 verschillende aminozuren en een
eiwit kan makkelijk uit enkele duizenden aminozuren bestaan.
Secundaire structuur: de lokale vouwing in driedimensionale structuurelementen, zoals de α-helix en
de β-sheet. Deze structuurelementen worden vooral gestabiliseerd door middel van
waterstofbruggen tussen de ruggengraat van de proteïne.
Tertiaire structuur: de vouwing
van het eiwit als geheel.
Stabilisatie treedt op door
aantrekkingskrachten tussen
verschillende delen van de
eiwitketen, zoals hydrofobe
interacties, ion interacties en
disulfidebruggen.
Quaternaire structuur: de vorm
die voortkomt uit de associatie
van meerdere eiwitketens, ook
het eiwitcomplex genoemd.
Een voorbeeld hiervan is
hemoglobine, dat uit meerdere
eiwitketens bestaat en ook nog
eens in het midden een heem
bevat.
Eiwit-chemie
NH2 wil altijd een proton opnemen wanneer ph < pka. De pka van NH2 is ongeveer 8. In ons lichaam
(ph=7.4), zal NH2 zich dus altijd in een geprotoneerde toestand bevinden. Het omgekeerde gebeurt
ook. COOH wil een proton afstaan wanneer de ph > pka. Aangezien COOH een pka heeft van
ongeveer 3, zal COOH zich in ons lichaam altijd in de COO- vorm bevinden.
Vuistregel:
pH < pKa  neemt proton op (COOH of NH3+)
pH > pKa  staat proton af (COO- of NH2)
5
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Sterk zuur
Dit lijkt me vrij duidelijk. Zodra je een 0,0025 M HCl oplossing hebt, zal de pH van deze oplossing de
-log([H+)] zijn = 2.6.
Zwak zuur
Aangezien het erg belangrijk is dat de pH in ons lichaam constant blijft (7,4), zijn er zogenaamde
buffers nodig. Buffers zijn altijd zwakke zuren. Een buffer of een zuurteregelaar is in de chemie een
waterige oplossing van twee stoffen die zich in een bepaald evenwicht bevinden en een bepaalde pH
aannemen. Bij verdunning, toevoegen van een zuur of een base zal deze pH nagenoeg constant
blijven. De verstoring van het evenwicht en de zuurgraad wordt dus 'gebufferd'.
CH3COOH  CH3COO- + H+
HAc  Ac- + H+
Kz =
[
][
]
Kz = 1,8 . 10-5
Om vervolgens de pka van azijnzuur (CH3COOH) te berekenen gebruik je de volgende formule:
pKa
=
[
=
pKa
pKa
][
[
= pH -
]
]
[
]
[
]
= pH +
[
[
]
]
!!!!
Wanneer pKa = Ph, is de verhouding HAc en Ac- 1. Er zal zich in de oplossing dan evenveel
HAc als Ac- bevinden.
Reverse turn
Een haarspeldbocht in een eiwit wordt ook wel een Reverse Turn of simpelweg Turn
(haarspeldbocht). Deze bochten
kunnen een rol spelen bij de
interacties met andere eiwitten. In
het plaatje hieronder zie je dat een
C=O groep een H-brug vormt met
de NH-groep aan de andere kant
van de bocht.
6
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Genetische gegevensoverdracht
De aminozuursequentie van een eiwit is eenvoudig te voorspellen als je de DNA sequentie van het
gen kent dat ervoor codeert
MAAR: in de cel zeer ingewikkelde machinerie (RIBOSOOM)
De 3D vouwing van een eiwit is heel moeilijk te voorspellen uit de aminozuur sequentie
MAAR: in de cel gaat dit meestal vanzelf (spontaan)
7
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 20 september 2011
dr. D. Slotboom
Myoglobine
Myoglobine is het zuurstofbindende eiwit dat in grote hoeveelheden
voorkomt in de spieren. Het is een relatief klein eiwit en verwant aan de
vier subeenheden van hemoglobine. Het eiwit bestaat uit één keten van
153 aminozuren. De secundaire structuur bestaat uit acht Alpha-helices.
Het actieve centrum van myoglobine vormt de zogenaamde heemgroep.
Het ijzerion van de heemgroep is m.b.v. een histidine, het zogenaamde
proximale histidine. Vier verdere liganden van het ijzerion binden de
stikstofatomen van de NH-groepen (niet-covalent). Op de overblijvende
zesde bindingsplaats van het ijzeratoom zit een zuurstofmolecule. In
fysiologisch actieve toestand bestaat het ijzer uit het tweewaardige ijzer.
Zodra een zuurstofmolecuul aan het
ijzer is gebonden, zal deze worden
gestabiliseerd door een tweede
histidine. Dit histidine zorgt ervoor
dat het geheel stabiel wordt. Als nu
het zuurstofmolecuul los zou raken,
zit het alsnog vast aan de distale
histidine, zodat het geen schade kan
aanrichten.
Dubbele en enkele bindingen
Zodra een molecuul afwisselend veel
dubbele en enkele bindingen heeft,
zal dat gebied in het molecuul een
plat vlak zijn en fotonen kunnen
absorberen.
Koolstofmonoxide
Koolmonoxide (CO) kan zich, net als zuurstof, reversibel aan een ijzeratoom van het hemoglobine
binden om zo carboxyhemoglobine te vormen. De binding tussen koolmonoxide en hemoglobine is
250 keer sterker dan de binding tussen zuurstof en hemoglobine. Doordat koolmonoxide met hogere
affiniteit aan hemoglobine bindt, zal er bij blootstelling aan koolmonoxide, door competitie om de
bindingsplaats, minder zuurstof aan hemoglobine gebonden zijn. Er is dan dus ook minder zuurstof
beschikbaar voor de weefsels.
8
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Berekening
De formule waarmee je het percentage MgO2 kunt
berekenen is als volgt. Hierbij zijn de vergelijkingen voor
de evenwichtsconstante MgO2  Mg + O2 en voor de
hoeveelheid MgO2 (deel delen door geheel) gebruikt.
[ ]
[ ]
Als we vergelijking Y uitzetten in een grafiek, ontstaat er
een zogenaamde hyperbole bindingscurve. De X-waarde
wanneer Y=0,5 is de Kd waarde. Er geldt: Hoe kleiner de
Kd, hoe hoger de affiniteit om O2 te binden.
Mutaties in het myglobine eiwit zitten vooral aan het oppervlak van het eiwit. Hierdoor zal een
bepaald organisme langer zijn adem in kunnen houden dan de ander.
Hemoglobine
Hemoglobine is een eiwit dat in het bloed van de mens en
veel andere dieren voorkomt. Rode bloedcellen zijn vrijwel
geheel gevuld met dit eiwit. Het geeft aan bloed de rode
kleur. In de rode bloedcellen is hemoglobine
verantwoordelijk voor het transport van zuurstof (O2) en
koolstofdioxide (CO2) door het bloed. In elke rode
bloedcel bevinden zich circa 640 miljoen
hemoglobinemoleculen (elke hemoglobinemolecuul kan
maximaal 4 zuurstof (O2) of 4 koolstofdioxide (CO2)
moleculen binden). Een hemoglobine-molecule is
opgebouwd uit 4 polypeptide-ketens (globines) en bevat 4
heemgroepen die elk een ijzeratoom (groen) bevatten. De
zuurstofatomen hechten zich aan het ijzer. De affiniteit
van CO voor hemoglobine is 210 tot 260 keer hoger dan
die van zuurstof. Zelfs bij aanwezigheid van minieme hoeveelheden, zal CO zich in plaats van zuurstof
hechten aan de hemoglobine. Zo wordt het zuurstoftransport naar de cellen verstoord.
Als we nu ook een curve voor hemoglobine gaan tekenen, zien
we dat dit een sigmoidale curve is en geen hyperbool! Ook voor
deze functie kunnen we nu een vergelijking opstellen.
9
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
[
[
D
]
]
z
I
Indien deze zelfde erytrocyt daarna in een O2-arme omgeving komt zal de gebonden O2 terug
loskomen van de heemgroep en uit de cel diffunderen en daar dan opgenomen worden door een
bepaalde cel van het nabijgelegen orgaan. Het ontladen hemoglobinemolecule (zonder zuurstof)
wordt deoxyhemoglobine genoemd.
T en R-state
Naargelang de partiële druk van zuurstofgas in de omgeving neemt hemoglobine zuurstof op of staat
het zuurstof af. Dit opnemen en afstaan van zuurstof gaat gepaard met een vormverandering. Men
onderscheidt twee uitersten: de T-vorm en de R-vorm.
Wanneer één ijzerkern van hemoglobine zuurstof bindt, wordt
het binden van zuurstof door de andere ijzerkernen bevorderd
door de vormverandering van de polypeptidenketen.Wanneer
het zuurstof heeft afgestaan kan hemoglobine een zekere
hoeveelheid koolstofdioxide en protonen binden (de grootste
hoeveelheid koolstofdioxide wordt opgelost in het plasma
vervoerd).
Fine tuning van de bindingsaffiniteit
BPG
When 2,3-BPG binds to deoxyhemoglobin, it acts to stabilize the
low oxygen affinity state (T state) of the oxygen carrier. It fits
neatly into the cavity of the deoxy- conformation, exploiting the
molecular symmetry and positive polarity by forming salt bridges (=ionbindingen) with lysine and
histidine residues in the four subunits of hemoglobin. The R state, with oxygen bound to a heme
group, has a different conformation and does not allow this interaction. By itself, hemoglobin has
sigmoid,
’
(
helps the following to link).
By selectively binding to deoxyhemoglobin, 2,3-BPG stabilizes the T state conformation, making it
harder for oxygen to bind hemoglobin and more likely to be released to adjacent tissues. 2,3-BPG is
part of a feedback loop that can help prevent tissue hypoxia in conditions where it is most likely to
occur. Conditions of low tissue oxygen concentration such as high altitude (2,3-BPG levels are higher
in those acclimated to high altitudes), airway obstruction, or congestive heart failure will tend to
cause RBCs to generate more 2,3-BPG in their effort to generate energy by allowing more oxygen to
10
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
be released in tissues deprived of oxygen. Ultimately,
this mechanism increases oxygen release from RBCs
under circumstances where it is needed most. This
release is potentiated by the Bohr effect in tissues with
high energetic demands. Bohr effect is another useful
way to solve the affinity problem of the hemoglobin, and
’
CO2. I ’
’
in the same way, as 2,3-BPG has no effect on it.
Bohr effect
Het Bohr-effect is een eigenschap van hemoglobine die
voor het eerst door de Deense fysioloog Christian Bohr
in 1904 wordt beschreven. Het Bohr-effect houdt in dat
hemoglobine minder affiniteit heeft voor zuurstof , door het aan omliggende weefsels af te geven.
Hiervoor zijn vier redenen te geven:
- er is een verhoging van het koolstofdioxidegehalte in bepaalde weefsels
- er is een afname van de pH;
- de temperatuur stijgt
- iets met een hogere affiniteit passeert het hemoglobine of iets met een hogere affiniteit drukt de
zuurstof weg.
Omgekeerd bindt koolstofdioxide minder goed aan hemoglobine bij een verhoging van het
zuurstofgehalte. Dit is het Haldane-effect. Er is onder andere sprake van het Haldane-effect wanneer
het bloed langs de longen wordt gevoerd; het hemoglobine neemt hier extra zuurstof op.
Zuurstoftransport
Zuurstof komt vanuit de alveolen via de interstitiële
vloeistof en het plasma in de erythrocytvloeistof terecht,
waar het zal gebonden worden op hemoglobine (Hb).
Toenemende PO2 in de erythrocyten doet hemoglobinesaturatie toenemen, dalende PO2 heeft hemoglobinedesaturatie als gevolg.
Zuurstof lost slechts weinig op in bloed. Bestond de
hoeveelheid zuurstof in het bloed enkel onder deze vorm,
dan zou ongeveer 60 maal zoveel bloed nodig zijn om de
noodzakelijke hoeveelheid zuurstof te kunnen bevatten. Zuurstof in oplossing dient echter enkel om
in of uit de erythrocyten te diffunderen.
Bij een PO2 van 100 mm Hg (normale partieeldruk van zuurstof in arterieel bloed) is het hemoglobine
voor 100% verzadigd met zuurstof. Bij een PO2 van 40 mm Hg (partieeldruk van zuurstof in gemengd
veneus bloed) is hemoglobine toch nog voor 75% verzadigd met zuurstof. In elk van beide gevallen is
de verzadiging van Hb onafhankelijk van de hemoglobineconcentratie!
11
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Uit de zuurstof-hemoglobine-dissociatiecurve
blijkt dat de snelheid waarmee zuurstof van
Hb dissocieert sterk toeneemt naarmate de
dalende PO2 de middenste en laagste
waarden op de zuurstofschaal bereikt : deze
karakteristieke eigenschap van Hb maakt het
mogelijk dat, ter hoogte van de capillairen,
relatief grotere hoeveelheden zuurstof
afgegeven kunnen worden zonder dat de PO2
daarvoor sterk moet dalen. Op die manier
blijft er nog een voldoende groot drukverschil
bestaan om diffusie van zuurstof naar de
weefselcellen toe te laten.
Het komt er dus op neer dat hemoglobine zuurstof loslaat waarin het molecuul in een CO2 rijke of O2
arme omgeving komt. Wanneer een CO2 molecuul een RBC binnenkomt, wordt het m.b.v. het enzym
carbonanhydrase omgezet tot H2CO3 dat weer splitst in H+ en HCO3-. Dit zorgt ervoor dat er meer O2
wordt losgelaten door de hemoglobine. De zure omgeving en CO2 concentraties zorgen er dus voor
dat hemoglobine O2 loslaat. De HCO3- ionen worden door het membraan van de RBC in het plasma
gepompt waar ze samen met Na+, NaHCO3 zullen vormen. Om ervoor te zorgen dat rode bloedcellen
ongeladen blijven, zullen Cl.W
R C’
+
bereiken, zullen de NaHCO3 moleculen splitsen in H2O, CO2 en Na . Dit adem je uit.
Extra over BPG
BPG komt in gelijke hoeveelheden voor in rode bloedcellen als Hb (2mM). BPG is in staat om aan
hemoglobine in de T-state te binden. BPG kan niet aan hemoglobine in de R-state binden omdat de
ruimtelijke bouw van het eiwit veranderd is door het hechten van zuurstof. De BPG bindingsplaats
ontbreekt. Je kunt wel nagaan dat door het binden van BPG hemoglobine minder affiniteit krijgt voor
zuurstof (Kd waarde meer naar rechts op x-as). Dit is logisch omdat er meer ligand (in dit geval
zuurstof) aanwezig moet zij
z
z
.
’
het zo dat zij minder BPG hebben, hierdoor nijgen de hemoglobinemoleculen meer naar de R stand
(zuurstof minnend). Hierdoor zal de Kd van foetaal Hbf lager zijn dan die van maternaal Hba. Hieruit
kun je concluderen dat Hbf een grotere affiniteit voor zuurstof heeft, hierdoor zal het zuurstof van
het maternale oxyhemoglobine naar het foetale deoxyhemoglobine stromen.
Super handige link over hemoglobine:
http://www.vob-ond.be/Biologielexicon/alfabetmap/O/oxyhemoglobine.html
12
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 21 september 2011
dr. M. Linskens
Introns en exons
Een intron (van Engels: intragenic region) is een stukje DNA dat zich bevindt in een gen maar dat niet
wordt gebruikt om het eiwit te coderen. De delen van het gen die wel in het uiteindelijke mRNA
terechtkomen, worden exons genoemd. De situatie is enigszins te vergelijken met een boek waar
tussen de leesbare tekst door opeens enkele regels staan die uit willekeurige letters bestaan. Deze
willekeurige letters zullen in het uiteindelijke "boek" ertussenuit gehaald worden, waardoor een
verhaal zal ontstaan dat volledig leesbaar is.
Alternatieve splicing
Hierbij wordt het RNA net zo gespliced als normaal,
alleen kan hier nog een deel aan blijven hangen, dat
vervolgens weer kan hechten aan een membraan (zie
afbeelding hieronder)
DNA replicatie en topologie
Major en minor groove
Twin helical strands form the DNA backbone. Another double helix
may be found by tracing the spaces, or grooves, between the strands.
These voids are adjacent to the base pairs and may provide a binding
site. As the strands are not directly opposite each other, the grooves
are unequally sized. One groove, the major groove, is 22 Å wide and
the other, the minor groove, is 12 Å wide.[14] The narrowness of the
minor groove means that the edges of the bases are more accessible
in the major groove. As a result, proteins like transcription factors that
can bind to specific sequences in double-stranded DNA usually make
contacts to the sides of the bases exposed in the major groove.[15] This
situation varies in unusual conformations of DNA within the cell, but
the major and minor grooves are always named to reflect the
differences in size that would be seen if the DNA is twisted back into
the ordinary B form. Most proteinDNA contacts are made in the major
grove, because the minor groove is too narrow.
13
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Supercoils
DNA supercoiling refers to the over- or under-winding of a DNA strand, and is an expression of the
strain on the polymer. Supercoiling is important in a number of biological processes, such as
compacting DNA. Additionally, certain enzymes such as topoisomerases are able to change DNA
topology to facilitate functions such as DNA replication or transcription.
Er zijn twee verschillende supercoils te onderscheiden, de positieve supercoil en de negatieve
supercoil. Een positieve supercoil ontstaat wanneer een circulair stuk DNA met de klok mee wordt
“
”.
,
circulaire DNA tegen de klok in wordt opgewonden. In de meeste organismen komen vooral
negatieve supercoils voor. Dit komt omdat DNA in deze vorm makkelijker uit elkaar kan worden
getrokken voor bijvoorbeeld transcriptie.
In het voorbeeld hierboven kun je het proces van supercoiling goed zien. Links bevindt het circulaire
DNA zich in zijn relaxte status. Rechts is het DNA supercoiled.
Topo-isomerase
Topo’
z
underwinding of DNA. The winding problem of DNA arises due to
the intertwined nature of its double helical structure. For
example, during DNA replication, DNA becomes overwound ahead
of a replication fork. If left unabated, this tension would
eventually grind replication to a halt (a similar event happens
during transcription.)
In order to help overcome these types of topological problems
caused by the double helix, topoisomerases bind to either singlestranded or double-stranded DNA and cut the phosphate
backbone of the DNA. This intermediate break allows the DNA to
be untangled or unwound, and, at the end of these processes, the
DNA backbone is resealed again. Since the overall chemical
composition and connectivity of the DNA does not change, the
tangled and untangled DNAs are chemical isomers, differing only
in their global topology, thus their name. Topoisomerases are
isomerase enzymes that act on the topology of DNA.
14
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Type I topoisomerase cuts one strand
of a DNA double helix, relaxation
occurs, and then the cut strand is
reannealed. Let op, het topoisomerase
knipt hier dus maar één streng van het
DNA los. Deze draait hij één keer om
zijn as, tegen de winding in, zodat het
DNA richting de relaxed state gaat. Hier
is geen ATP voor nodig omdat een
supercoil altijd terug wil naar de relaxed state
(denk aan elastiek).
Type II topoisomerase cuts both strands of one
DNA double helix, passes another unbroken DNA
helix through it, and then reanneals the cut
strand. Hierbij worden beide DNA strengen
doorgeknipt, vastgehouden, en wordt de
onderkant van de lus erdoor gehaald (G-segment
is bovenkant, T-segment is onderkant).
DNA polymerisatie/replicatie
Replicatie is het proces waarin DNA verdubbeld wordt. DNA-replicatie is nodig voor de celdeling
(mitose). De replicatie begint op vaste plaatsen op het DNA, de zogenaamde 'origin of replication'.
Deze plaats is een AT-rijke sequentie (veel adenine en thymine) van ongeveer 250 basenparen lang.
Het wordt ook wel de ARS-sequentie genoemd.
Direct betrokken bij dit proces is het DNA-polymerase. De benodigde energie wordt verkregen door
hydrolyse van GTP (guanosinetrifosfaat).
Het enzym DNA-polymerase kan echter het eind van het chromosoom niet repliceren, omdat het
voortijdig van het DNA afvalt. Aan het eind van een chromosoom zit een telomeer dat uit
enkelstrengs DNA bestaat en bij elke celdeling korter wordt. Het bestaat uit repeterende stukjes DNA
dat de belangrijke genen beschermt tegen het korter worden van de chromosomen.
Het enzym helicase ontwindt de dubbele DNA-spiraal en laat door het verbreken van de
waterstofbruggen de twee strengen een stukje uit elkaar gaan, waardoor andere enzymen zoals DNA
polymerase een stukje van de enkelvoudige streng kunnen aflezen (transcriptie). Helicase zorgt er
dus voor dat het dubbelstrengs DNA uit elkaar 'ritst'.
Op de plaats waar de twee strengen een stukje uit elkaar zijn, hecht zich op de zogenaamde 'origin of
replication' (ORI) een door het enzym primase gemaakte RNA-primer. Dit is het beginpunt van de
DNA-synthese. Aan het RNA-molecuul hecht het DNA-polymerase een aan de oude DNA-streng
complementair nucleotide. Er wordt verder bij elke stap een volgende nucleotide hieraan
vastgemaakt tot de hele streng is afgelezen. Dit gebeurt bij beide strengen, maar op verschillende
15
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
z
. DNA
5' → 3'
.D
z
'3 → '5 . O
DNA-strengen hebben echter een tegenovergestelde
richting.
D
5' → 3'
3' → 5'
z ,
stuk van de dubbele DNA-streng is opengeritst. De stukjes
zijn ongeveer 100 tot 200 nucleotiden lang, omdat DNApolymerase er niet meer aan elkaar kan knopen. Na
ongeveer 100 a 200 nucleotiden hecht zich opnieuw een
RNA-primer aan de oude DNA-streng en wordt een nieuw
stukje gemaakt enz. De stukjes worden vervolgens aan
elkaar geplakt. De primer en het daarbij behorende stukje
DNA wordt een Okazaki-fragment genoemd. De benodigde
RNA-primers worden enzymatisch aangemaakt, waardoor
er openingen in de nieuwe DNA-streng ontstaan. Deze
openingen worden door speciale DNA-polymerasen met
DNA-nucleotiden opgevuld. Tenslotte bindt het enzym DNAligase de oude en nieuwe streng aan elkaar.
Proofreading
Error correction is a property of some, but not all, DNA
polymerases. This process corrects mistakes in newly synthesized
DNA. When an incorrect base pair is recognized, DNA polymerase
reverses its direction by one base pair of DNA. The 3'-5'
exonuclease activity of the enzyme allows the incorrect base pair
to be excised (this activity is known as proofreading). Following
base excision, the polymerase can re-insert the correct base and
replication can continue.
Foute base zorgt voor slechtere base-paring, los ’
,
vertraging van polymerase aciviteit. Losse eind van DNA komt
hierdoor makkelijker bij exonuclease site, waar de laatstebase(n)
worden verwijderd.
16
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
DNA replicatievork
Zoals ik al eerder zei, begint de replicatie van DNA op een zogenaamd origin of replication. Omdat
eukaryoten (en dus mensen) veel meer DNA hebben, zullen er op meerdere plaatsen in het DNA
origins of replication ontstaan om zo de replicatie van het DNA sneller te laten verlopen.
In de afbeelding hieronder zie je een zogenaamd primosoom. Volgens mij is dit vrijwel hetzelfde als
het primase enzym in de bovenstaande tekst. Je moet al deze onderdelen herkennen en kunnen
benoemen. Dit
komt sowieso in het tentamen!
Einde-replicatie probleem
Zoals je weet kan een DNA polymerasemolecuul de lagging strand niet constant blijven transleren. Er
ontstaan zogenaamde okazakifragmenten. Op een gegeven moment hecht primase de laatste RNA
primer en komen DNA polymerase en DNA ligase de boel fixen (RNA omzetten in DNA etc.). Maar dit
is moeilijker dan het lijkt. Ook al zorgt primase voor een RNA primer op het uiteinde van de lagging
strand, het is niet mogelijk om de hele DNA streng te dupicleren.
Hier onder zie je dat primase een RNA-primer
op het uiteinde van de lagging strand heeft
gezet. Deze primer heeft een OH-groep waar
DNA polymerase weer op voort kan borduren.
Zodra DNA polymerase zijn werkt heeft gedaan,
moeten de primers nog worden verwijderd, om
ze vervangen voor DNA i.p.v. RNA.
17
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Zodra DNA-polymerase zijn werk heeft gedaan, en
alle RNA primers heeft omgezet in DNA, dienen deze
DNA ‘
’
‘
’
van de RNA-primers op te vullen. Ook hier zal DNApolymerase weer aan de OH-groep hechten, om de
lege plek van de RNA-primers op te vullen. Zoals je ziet
kan dit niet op de laatste plek, omdat er geen –OH
groep is, waar DNA-polymerase aan kan hechten (zie
afbeelding hiernaast). Om dit op te lossen komt
telomerase de langere strand verlengen. Vervolgens
legt DNA primase een primer, waar DNA-polymerase
weer aan kan hechten (blauw in afbeelding).
Op deze manier wordt het telomeer steeds weer
verlengd, zodat het DNA veilig blijft.
video:
http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s
18
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 22 september 2011
dr. M. Linskens
RNA Polymerase
Het holo-enzym RNA polymerase is actief bij de transcriptie. RNA-polymerase heeft, in tegenstelling
tot DNA polymerase, een eigen helicaseactiviteit en daardoor heeft het geen primer nodig.
Het koppelt op een specifieke plaats (de promotor) aan een DNA- of RNA-keten en vouwt zich
eromheen. Vervolgens ontwindt het het DNA of RNA en ritst als het ware de dubbelspiraal open.
Daardoor wordt een stukje in de enkelstrengs-vorm tijdelijk toegankelijk voor andere actieve
componenten van het enzym.
Vervolgens worden steeds nieuwe nucleotiden (basen) aan
de te vormen RNA-streng gekoppeld. Welk nucleotide dit zal
zijn wordt steeds bepaald door de tegenoverliggende DNA of
RNA nucleotide. Het DNA of RNA fungeert dus als een 'mal'
(men spreekt van template). Het RNA polymerase beweegt
z
z
3' → 5'
het DNA of RNA,
waarbij de nieuwe RNA5' → 3'
gesynthetiseerd. Tegelijkertijd wordt het RNA aan de
achterkant weer gescheiden van het DNA of RNA. Wanneer
het hele gen gekopieerd is, koppelt het RNA polymerase los
van het DNA of RNA en wordt tevens de nieuwe RNA-keten
afgestoten.
Er zijn drie soorten RNA-polymerasen bekend met ieder een
eigen functie.



RNA-polymerase I, dat betrokken is bij de productie van pre-rRNA. Daarnaast is dit enzym
betrokken bij de productie van vele snRNA's (sn staat voor het Engelse small nuclear) in de
celkern
RNA-polymerase II, dat betrokken is bij de productie van de meeste mRNA's.
RNA-polymerase III, dat betrokken is bij de productie van tRNA, siRNA en rRNA.
De ‘NOVO’ synthese
Elke keer als er een nieuwe nucleotide aan de RNA streng wordt toegevoegd, zullen er twee
fosfaateenheden worden afgesplitst. RNA polymerase is een primase, d.w.z. dat het een primer kan
leggen en geen begin nodig heeft om de translatie te laten beginnen.
19
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
RNA backtracking
RNA-Polymerasen beschikken over een eenvoudig mechanisme voor foutenherkenning. Wanneer
zich aan een DNA-streng een verkeerd RNA-nucleotide bindt, blijft het RNA-Polymerase langer op de
betreffende DNA-plek stilstaan. Hierdoor wordt de kans groter dat het verkeerde RNA-nucleotide
weer loslaat van het DNA en is de foutenkans 1 op 10.000 basen. Dit komt overeen met ongeveer 1
fout per gesynthetiseerd RNA-molecuul.
In het eerste plaatje is RNA polymerase DNA aan tranleren. Zoals ik al zei komen bij elke
aankoppeling van een nucleotide twee fosfaatmoleculen vrij. Wanneer RNA polymerase een fout
maakt (het zwarte streepje), verplaatst RNA polymerase zich één plek terug (de translocation), zodat
hij weer precies op de plek van de foutieve nucleotide komt te zitten. Vervolgens verwijdert RNA
polymerase de foutieve base, en hydrolyseert hij de goede base (zodat er weer een OH-groep
vrijkomt en de goede nucleotide loslaat). Vervolgens zal RNA polymerase weer vanaf dat punt verder
gaan met het transleren van de template streng.
Promotor sequenties bij prokaryoten
Een promotor is een DNA-element vóór een gen
of genen dat de werking (expressie) van het/de
gen(en) reguleert. Het wordt niet afgelezen bij
de transcriptie. Bij prokaryoten werd de
promotor oorspronkelijk gedefinieerd als de
DNA-sequentie waaraan RNA-polymerase bindt.
Daarom bepaalt de promotor het startpunt van
het gen voor het aanmaken van het
boodschapper-RNA (mRNA). Bij eukaryoten is
de situatie wat complexer. Vaak wordt in die context met promotor in feite een promotor/enhancer
combinatie bedoeld. Strikt genomen is ook daar de promotor de plaats waar transcriptie begint.
20
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Vooraf aan de transcriptie
Voordat RNA polymerase kan hechten aan het DNA,
moeten er eerst wat hulp-eiwitten aan het DNA
binden. Eerst zal TBP (een groot hulpeiwit) zich aan
de TATA-box (of de CAAT-box) op het DNA hechten.
Vervolgens zullen andere eiwitten zoals TFIIA en
TFIIB zich ook aan het ontstaande complex hechten.
Nu kan DNA polymerase zich ook aan het complex
(ook wel het transcription initiation complex
genoemd) hechten. Wanneer RNA polymerase aan
het complex is gehecht, zullen verschillende
‘
’
RNA
polymerasemolecuul gaan fosforyleren. Dit is het teken
voor RNA polymerase dat de transcriptie kan beginnen. Bij prokaryoten werkt dit systeem anders.
Hier wordt het RNA-polymerisatie molecuul niet gefosforyleerd, maar geactiveerd door andere
eiwitten.
Antibiotica
Antibiotica remt de transcriptie van een RNA‘ ’
DNA-RNA hybride zit, te gaan zitten (dit past precies). Hierdoor zal er geen transcriptie meer kunnen
plaatsvinden in de bacterie en zal de bacterie doodgaan.
Transcription termination
ntrinsic termination (also called Rho-independent termination) is a mechanism in prokaryotes that
causes mRNA transcription to be stopped.[1] In this mechanism, the mRNA contains a sequence that
can base pair with itself to form a stem-loop structure 7-20 base pairs in length that is also rich in
cytosine-guanine base pairs. These bases form three hydrogen bonds between each other and are
therefore particularly strong.[2] Following the stem-loop structure is a chain of uracil residues. The
bonds between uracil and adenine are very weak. A protein bound to RNA polymerase (nusA) binds
to the stem-loop structure tightly enough to cause the polymerase to temporarily stall.[3] This pausing
of the polymerase coincides with transcription of the poly-uracil sequence. The weak Adenine-Uracil
bonds lower the energy of destabilization for the RNA-DNA duplex, allowing it to unwind and
dissociate from the RNA polymerase.
Post-transcriptionele modificaties in prokaryoot DNA
Wanneer RNA-polymerase III klaar is met het transleren van
rRNA en tRNA, zullen er nog een paar veranderingen worden
toegepast. Ten eerste worden tRNA en rRNA uit de precursor
geknipt. Vervolgens zullen deze nog allerlei modificaties
ondergaan, deze zijn nu nog niet van toepassing.
Processing van eukaryote transcripten
RNA Polymerase I:
21
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
RNA polymerase II:
5’-gap
The 5' cap is a specially altered nucleotide on the 5' end of precursor messenger RNA and some other
primary RNA transcripts as found in eukaryotes. The process of 5' capping is vital to creating mature
messenger RNA, which is then able to undergo translation. Capping ensures the messenger RNA's
stability while it undergoes translation in the process of protein synthesis, and is a highly regulated
process that occurs in the cell nucleus.
Splicing
Splicing is in de genetica een verandering van genetische
informatie na transcriptie. Tijdens de RNA-processing
worden de introns uit het pre-mRNA geknipt en de exons
van het pre-mRNA aan elkaar geplakt. Introns komen
hoofdzakelijk voor in eukaryotische cellen.
Als de introns uit het pre-mRNA geknipt zijn (dit heet
cleavage) blijven enkel de exons over. Het verbinden van
deze exons tot een nieuw geheel, het mRNA, heet splicing,
na de capping (letterlijk kapje opzetten, is het toevoegen
van 7-methylguanosine aan de kop) en polyadenilatie
(poly-A-staart op het einde) is het mRNA klaar om de
translatie te ondergaan.
Poly-a keten
Polyadenylatie signalen, gewoonlijk in de vorm van AAUAAA of een kleine variatie hierop, die het
afknippen van ongeveer 30 baseparen van de door translatie verkregen streng in gang zet en zo het
miRNA maakt. Vervolgens worden aan dit stuk enkele honderden adenine resten vastgemaakt (polyA). De poly-A staart beschermt waarschijnlijk het mRNA tegen afbraak.
22
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
RNA polymerase III:
Filmpje 1: http://www.youtube.com/watch?v=SMtWvDbfHLo
Filmpje 2: In map
Dit stuk nog even goed leren, niet uitgebreid samengevat.
23
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 23 september 2011
dr. Dirk Slotboom
Entropie en enthalpie
Entropie is een belangrijk begrip in de thermodynamica. Het is op het fundamenteelste niveau een
maat voor de wanorde of de ontaarding in een systeem, of liever de waarschijnlijkheid, als het aantal
mogelijke moleculaire configuraties van een macroscopische toestand (in termen van
macroscopische grootheden druk, temperatuur, etc.) gedeeld door het totale aantal mogelijke
moleculaire configuraties.
Wanneer je iets verwarmd, voeg je energie in de vorm van warmte toe, waardoor de kinetische
energie (thermische energie) van een object toeneemt. Hierdoor zal het object sneller gaan bewegen
en zal de entropie toenemen.
Om een proces (bijvoorbeeld een chemische reactie) te laten verlopen, moet de entropie toenemen.
Voor de totale entropie verandering kunnen we de volgende formule opstellen:
ΔG = ΔH – T ΔS
Hierin is:
ΔG – de vrije energieverandering (kJ/mol)
ΔH – de verandering in de enthalpie
T – de temperatuur in Kelvin
ΔS – de totale entropie verandering
Vrijkomen van warmte
In het volgende voorbeeld kijken we naar de vorming van DNA uit twee enkelstrengs stukken DNA.
Door het mengen van de verschillende stukken DNA, neemt de entropie toe. Wanneer deze stukken
DNA aan elkaar hechten, zal de entropie afnemen (minder chaos). De reactie zal toch verlopen
omdat de toename in warmte meer is dan de afname in entropie.
24
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Het wel of niet verlopen van reacties
Zoals ik al zei hangt het van ΔG af of een reactie wel of niet zal verlopen. Hiervoor geldt de volgende
vuistregel: Een reactie kan alleen verlopen wanneer de ΔG negatief is.Een reactie is in evenwicht en
er treden geen veranderingen meer op wanneer de ΔG gelijk is aan 0. Een reactie verloopt niet
wanneer de ΔG positief is, maar de omgekeerde reactie wel.
Scenario 1: ΔG < 0 De reactie verloopt netto naar rechts
CO2 + H2O  H2CO3
Scenario 2: ΔG > 0 De reactie verloopt netto naar links
CO2 + H2O  H2CO3
Scenario 3: ΔG = 0 Er is evenwicht; er vindt geen netto reactie plaats
CO2 + H2O = H2CO3 (twee pijltjes kan ik niet vinden)
Berekenen van ΔG
O
Δ
volgende reactie: A + B  C + D.
, ebruiken we de formule hieronder. We gaan hier uit van de
[ ][ ]
[ ][ ]
voor elke verschillende reactie weer een andere waarde.
[ ][ ]
[ ][ ]
kan je ook zien als de evenwichtsconstante van de reactie. Je kunt de formule dus ook zo
opschrijven.
Om
te kunnen berekenen, maken we gebruik van het feit dat
. Zoals ik hierboven al beschreven heb, is de
volgende formule afleiden:
Met deze formule kun je de
[ ][ ]
[ ][ ]
in evenwicht gelijk is aan
bij een evenwicht gelijk aan 0. Hieruit kan je
van een reactie uitrekenen.
De rest van de colleges van 23 sept heb ik niet samengevat, de zin ontbrak!
25
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 4 oktober 2011
dr. Dirk Slotboom
Michaelis-Menten
De Michaelis-Menten vergelijking is genoemd naar de ontdekkers Leonor Michaelis en Maud
Menten. De vergelijking beschrijft de kinetiek van een reactie van substraat S met enzym E tot
enzym-substraatcomplex ES dat reageert tot product P:
De vergelijking die de snelheid (V) van vorming van het product
samenbrengt met de substraatconcentratie ([S]), de maximale
snelheid (Vmax) en de Michaelis-Menten-constante Km, is:
Km is gelijk aan de substraatconcentratie waarbij de reactiesnelheid half maximaal is (zie afbeelding hiernaast). Een reactie zal
op een gegeven moment niet sneller kunnen dan Vmax omdat er
niet genoeg enzym aanwezig is.
Omschrijven van de Michaelis-Menten formule
De formule van Michaelis-Menten moet je kunnen omschrijven tot een lineaire formule, omdat dat
het rekenen makkelijker maakt (in de vorm y=ax+b). Hierbij zet je eerst V in de noemer van V.
Vervolgens kun je de formule verder omschrijven totdat hij er als volgt uitziet.
Je kunt zien dat de formule nu in de vorm y=ax+b staat. Het is nu
mogelijk om verschillende waardes af te lezen uit de ontstaande
grafiek (zie afbeelding hiernaast).
(Ir)reversibele remming
Men onderscheidt hierbij de reversibele en de irreversibele
remming. In het eerste geval neemt het toxine de plaats in van
een van de normale stofwisselingsproducten en blokkeert
daarmee de normale gang van zaken. Wanneer de concentratie van een dergelijk gif lager wordt,
wordt ook de binding tussen enzym en remmer weer verbroken zodat de oorspronkelijke toestand
weer bereikt is. Een irreversibele remmer maakt een enzym voor altijd onwerkzaam. Bij verlaging van
de concentratie wordt de oude toestand dus niet meer hersteld. Een voorbeeld van een reversibele
remming is de vergiftiging met koolmonoxide, waarbij het hemoglobine geblokkeerd wordt.
26
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Inhibitie van biochemische reacties
Sterk vereenvoudigd kan men stellen dat een enzym en het substraat binden volgens het sleutelslot
principe om een tijdelijk enzym-substraatcomplex te vormen. Het substraat heeft precies de juiste
ruimtelijke vorm om aan de actieve plaats van het enzym te binden. In werkelijkheid heeft het
substraat van een enzym een goede affiniteit met het actief centrum. Bij adsorptie op het actief
centrum zal de eiwitketen zodanig in een vorm gedwongen worden dat er een biochemische reactie
optreedt. Bij biochemische reacties kan men hierbij twee soorten inhibitie onderscheiden:


competitieve inhibitie
niet competitieve inhibitie
Competitieve inhibitie
Een competitieve inhibitor adsorbeert op de actieve plaats van het enzym waar het substraat had
moeten reageren. Een goede competitieve inhibitor heeft een hogere affiniteit voor het actief
centrum, waardoor het substraat volledig wordt verdrongen. Een minder goede inhibitor heeft veelal
een lagere affiniteit voor het actief centrum en kan relatief gemakkelijk van het actief centrum
weggehouden worden door een overmaat aan substraat. Als we de grafiek er nu bij pakken, kunnen
we zien dat de gemeten Km groter is geworden, terwijl de Vmax constant is gebleven. Dit houdt in
dat het niet uitmaakt of er inhibitie (competitieve) is of niet, de Vmax zal gelijk blijven (als je dit niet
snapt even uittekenen, wat zijn a, x en b etc.). KIJK OOK IN MAP, HYPERBOLISCHE GRAFIEKEN EN
WAT VOOR EFFECT DAT HEEFT OP 1/V)!!
27
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Niet-competitieve inhibitie
Een niet competitieve inhibitor reageert met of bindt op een andere plaats dan het actief centrum
van het enzym. Hierdoor vervormt de actieve plaats van het enzym zodanig dat het substraat niet
goed meer kan binden. In de hyperbolische grafiek kun je ook zien dat V afneemt. Dit houdt in dat
1/V dan groter wordt, ook dit blijkt uit de lineaire grafiek. In tegenstelling tot bij competitieve
inhibitie, verandert bij niet-competitieve inhibitie alleen de Vmax, en niet de Km. Ook dit valt te
verklaren als je kijkt naar de vergelijkingen (ga dit na!).
28
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 6 oktober 2011
dr. Dirk Slotboom
Fosfolipiden
Een fosfolipide is een organische
chemische verbinding die bestaat uit
een fosfaatgroep, een glycerolgroep,
een stikstof bevattend alcoholgroep (bv
ethanolamine) en een vetzuurgroep.
Een fosfolipide heeft door zijn
samenstelling een hydrofiele kop en
een hydrofobe (dubbele) staart. Een
molecuul dat er zo uitziet heet amfifiel.
De hydrofiele kop wordt het liefst door
water omgeven. De hydrofobe kant
daarentegen wordt het liefst door
vetachtige moleculen omgeven. De Rgroep aan de fosfaatgroep kan uit
zowel een alcohol als een suikergroep
bestaan. Deze suikergroepen zullen zich
altijd aan de buitenkant van de cel bevinden omdat de hydrofobe staarten tegen elkaar aan zullen
liggen en zo de binnenkant van het membraan vormen.
De staarten van de fosfolipiden worden door vrijwel alle niet covalente bindingen bij elkaar
gehouden. Van der Waals interacties, Hydrofobe interacties, H-bruggen en elektrostatische
verbindingen/afstotingen spelen allemaal een rol.
Omdat de koppen van de fosfolipiden allemaal hydrofiel zijn, zullen ze allemaal geladen zijn.
Hierdoor zullen hydrofiele of dipoolmoleculen moeilijk door het membraan kunnen diffunderen.
Positionering van eiwitten in het membraan
Eiwitten kunnen op verschillende manieren aan membranen vastzitten d.m.v. niet-covalente
bindingen. Integrale membraaneiwitten steken aan beide kanten uit en perifere membraaneiwitten
zitten maar één kant van het membraan. Membranen bestaan uit een soort zeepachtige moleculen.
Eén deel van het molecuul lost goed op in water, het andere deel heeft meer een soort olieachtige
structuur. De olieachtige delen van de membraanmoleculen gaan naast elkaar liggen en vormen zo
een olieachtige laag tussen twee stukken van een cel, of tussen de cel en de grote boze
buitenwereld. Allerlei goed in water oplosbare stoffen (en die lossen dus slecht op in olie) kunnen
dus niet zomaar het membraan passeren. De eiwitten
die door het membraan heen steken maken het
transport mogelijk van dit soort deeltjes. Tijdens het
transport van een zenuw-signaal worden natrium- en
kalium-ionen van binnen naar buiten de zenuwcel
gebracht via membraan-eiwitten.
29
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Signalering door een membraan
Zoals je in de klapper kunt zien is de receptor voor acetylcholine een integraal eiwit. De twee
uitstekende delen zullen beiden hydrofiel zijn, terwijl het deel binnen het membraan hydrofoob is.
Een alfa-helix is zeer geschikt om het membraan over te steken omdat alle NH en CO groepen
(hydrofiele groepen) uit de ruggengraat
opgeborgen zijn in waterstofbruggen. Het is
belangrijk dat het hydrofobe deel van een
integraal eiwit bestaat uit aminozuren met
hydrofobe zijketens. Dit zullen er ongeveer 20 zijn,
omdat een a-helix per aminozuur ongeveer 1.5 A
stijgt. Als je 20 met 1.5 vermenigvuldigt kom je uit
om ongeveer 3 nanometer, precies de dikte van
een membraan. Hetzelfde geldt ook voor betastrands, hierbij ontstaan er echter relatief grote
gaten in het membraan. Ook hier zullen alle NH en
CO groepen uit de ruggengraad elkaar al
opbergen, zodat het een hydrofoob geheel wordt.
De vloeibaarheid van membranen
Membranen zijn erg dynamisch. De vloeibaarheid
(=dynamiek) van een membraan wordt bepaald
door drie factoren: De lengte van de
vetzuurketens, de mate van onverzadigdheid en
het wel of niet aanwezig zijn van cholesterol.
Wanneer de vetzuurketens langer worden, zullen
er meer niet- covalente bindingen onder de hydrofobe staarten gevormd kunnen worden. Hierdoor
zal het membraan minder vloeibaar worden. Wanneer er veel dubbele bindingen in een vetzuur
aanwezig zijn (een sterk onverzadigd vetzuur), zullen de hydrofobe staarten een andere vorm krijgen,
waardoor er juist minder niet-covalente bindingen tussen de hydrofobe staarten gevormd kunnen
worden. Hierdoor zal een membraan juist meer vloeibaar worden. Wanneer er op een plek veel
z
z z ,
‘
’
tussenmembraan gaan zitten. Hierdoor zal de vloeibaarheid weer afnemen.
30
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Biochemie 6 oktober 2011
dr. Maarten Linskens
Plasmide
Bacteriën kunnen, naast hun (éne) chromosoom,
verschillende kopieën bevatten
van een ánder, veel kleiner, DNA molecuul. Deze
kleine, circulaire DNA moleculen
worden plasmiden genoemd.
Een plasmide is een cirkelvormige streng DNA die
zich buiten het chromosomaal DNA bevindt van
sommige eencellige organismen. Met dit DNA kan
genetische informatie tussen bacteriën onderling
en zelfs tussen verschillende soorten worden
uitgewisseld. Via plasmiden kunnen onder andere
eigenschappen die zorgen voor resistentie tegen
antibiotica worden doorgegeven.
Plasmiden worden ook ingezet voor genetische
modificaties. Zo bestaan er kunstmatige plasmiden
(genconstructen) waarin een stukje DNA geplaatst
kan worden. Zo'n plasmide bevat een multi cloning
site (MCS), een plek die veel specifieke DNAsequenties bevat waar restrictie-enzymen het DNA
kunnen knippen. Op zo'n plek kan het vreemde
DNA geplaatst worden, mits het met dezelfde
restrictie-enzymen geknipt is.
Kloneren
De translatie van de genetische code gebeurt in alle organismen op dezelfde wijze: een gen dat in het
ene organisme codeert voor een bepaald eiwit, codeert in een ander organisme voor eenzelfde eiwit.
Hierdoor is het mogelijk om erfelijke eigenschappen van een soort naar een andere soort over te
brengen. Het overbrengen van een eigenschap van de ene soort naar een andere soort noemt men
transgenese.
Er zijn vele verschillende technieken om genetische modificatie van organismen toe te passen. Deze
technieken verschillen aanmerkelijk per organisme waarop ze worden toegepast (plant of dier) en of
de genetische modificatie tijdelijk of blijvend is.
Het basisprincipe van alle verschillende technieken is in de grondslag hetzelfde en verloopt via een
vast aantal stappen.




1 Isolatie van het gen
2 Het eventueel aanpassen van het geïsoleerde gen
3 Overbrengen van het gen in een geschikte vector.
4 Selectie van de gemodificeerde organismen of cellen.
31
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Stap 1, het isoleren van het gen
Wanneer men een specifiek gen wil isoleren wordt eerst DNA uit de cellen van het organisme
gehaald. Vervolgens kan men het gen waarin men geïnteresseerd is, identificeren op basis van de
kennis die men vooraf van het gen heeft. Deze kennis kan men vaak halen uit cDNA "bibliotheken".
Met deze kennis kan men het gen vervolgens amplificeren door middel van de PCR techniek.
Stap 2, het eventueel aanpassen van het geïsoleerde gen
Soms moet het geïsoleerde en geamplificeerde gen eerst worden aangepast voordat het kan worden
ingebracht in een nieuw organisme. Introns worden vaak verwijderd, dit doen ze als volgt. Enzymen
zorgen ervoor dat de introns uit het RNA-molecuul worden gehaald, als doel dat de exonen aan
elkaar verbonden worden, dit wordt ook wel splicing genoemd. Het aangepaste m-RNA bevat geen
introns meer en kan nu worden gebruikt om er cDNA van te maken. Voordat dit gebeurt, moeten er
eerst nog een promotor en een terminator aan het gevormde m-RNA worden toegevoegd, zodat het
(eenmaal ingebouwd in een plasmide) kan worden afgelezen door een ribosoom.
Stap 3, het overbrengen naar een geschikte vector
Om het gen dat je geïsoleerd hebt in een ander organisme te kunnen brengen moet het eerst
worden ingebracht in een vector, die dient als drager van het DNA. Dit kan een stukje circulair
bacterieel DNA oftewel plasmide zijn, maar ook een virus, een liposoom of een goudkogeltje waarop
het DNA geplakt zit.
Restrictie enzymen
Een restrictie-enzym of restrictie-endonuclease is een knipenzym dat in
staat is om op bepaalde plaatsen DNA in stukken te knippen. Type II volgt
een bepaald palindroom van vier, zes of acht baseparen. De knip kan scheef
(sticky ends/"klevende einden") bijvoorbeeld Eco RI, of recht zijn (blunt
ends/"stompe einden") bijvoorbeeld Alu I. Sticky Ends binden makkelijker.
Het is wel belangrijk dat de uiteindes van de verschillende genen compatibel
met elkaar zijn, zodat de plasmide na het invoegen van het nieuwe gen,
weer kan sluiten. Ook moet er een promotor aanwezig zijn, zodat het RNA
polymerase weet waar het moet beginnen met aflezen van het gen.
32
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
Stap 4, plasmide fixen met ligase
Een enkelstrengs breuk kan makkelijk door DNA-polymerase gemaakt worden, waarbij de
complementaire streng als basis gebruikt wordt, maar een dubbele breuk kan dit enzym niet
repareren. In het laboratorium worden uit organismen of via recombinatie verkregen ligasen
gebruikt voor het weer aan elkaar vastmaken van stukjes
DNA. De uit organisme(n) met restrictie-endonucleasen
geknipte stukjes DNA worden in een ATP bevattende
bufferoplossing met ligase weer aan elkaar vastgemaakt.
Er wordt zo een nieuw plasmide gemaakt dat via
transformatie in een bacterie kan worden ingebracht.
PCR
De polymerase chain reaction (PCR) is een veelgebruikte
en vaak onmisbare techniek in medisch en biologisch
onderzoek. Het woord polymerase in de naam is ontleend
aan één van de belangrijkste stoffen die gebruikt wordt in
de procedure: DNA-polymerase. DNA-polymerase
verdubbelt DNA door aan iedere base de complementaire
base te plakken. Met PCR kan een enkel of enkele
exemplaren van een stuk DNA dusdanig vermenigvuldigd
worden dat miljoenen kopieën ontstaan van het originele
stuk DNA. PCR wordt gebruikt om specifieke delen van
het DNA te vermenigvuldigen. Dit kan een enkel gen, een
deel van een gen, of een sequentie die nergens voor codeert zijn.
De PCR bestaat meestal uit een serie van 20 tot 40 cycli van telkens drie stappen. In iedere stap
wordt de temperatuur aangepast. Bij die drie temperaturen gebeurt steeds iets anders.
In de eerste stap wordt het DNA mengsel verhit tot 90 °C. Dit zorgt ervoor dat de waterstofbruggen
die de DNA strengen verbinden breken, waardoor de dubbele helix uit elkaar valt en het DNA
enkelstrengs wordt.
Na de eerste stap wordt de temperatuur verlaagd tot 37-60 °C waardoor de primers aan de uiteinden
van het te vermeerderen DNA binden. Primers zijn kleine stukjes enkelstrengs DNA met een base
volgorde die complementair is aan het te vermeerderen stukje DNA.
Bij een temperatuur van 72 °C bindt DNA-polymerase aan de primers die hun complementair DNA
hebben gevonden. DNA-polymerase is een enzym dat ervoor zorgt dat basen aan de opengebroken
streng DNA worden verbonden. Op deze manier wordt tussen de primers die aan de opengebroken
streng zijn gaan zitten een compleet nieuw stukje DNA gemaakt: de hoeveelheid van het te
onderzoeken stukje DNA is verdubbeld.
33
Colleges Biochemie 2011
Rijksuniversiteit Groningen
Niek Groot
DNA primers
Een primer is een klein stukje enkelstrengig DNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR
(polymerase ketting reactie). Er zijn steeds twee primers nodig, één voor de 5'-streng en één voor de
3'-streng. De beste primer voor PCR is een relatief korte RNA-streng. Deze streng wordt kunstmatig
gemaakt met een RNA polymerase. De RNA-streng wordt dan door DNA-polymerase omgezet in een
korte enkelstrengs-DNA. Deze DNA-streng is zo kort dat het zich vanzelf aan een ander
complementair stuk enkelstrengsDNA hecht en zo het startpunt
vormt voor de replicatie. Een
goede primer is niet te kort,
omdat daarmee de specificiteit
wordt benadeeld. Een te lange
primer heeft theoretisch een
hogere specificiteit, maar zou
secundaire structuren kunnen
vormen waardoor de PCR niet of
nauwelijks nog effectief is.
34