Biomerkers voor prognose en toxiciteit voor patiënten met
advertisement
Biomerkers voor prognose en toxiciteit voor patiënten met orofaryngeale kanker behandeld met chemoradiotherapie. Eline LUST Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar 2014-2015 Biomerkers voor prognose en toxiciteit voor patiënten met orofaryngeale kanker behandeld met chemoradiotherapie. Eline LUST Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep: Medische basiswetenschappen Academiejaar 2014-2015 “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” 8 mei 2015 Eline Lust Prof. Dr. H Thierens Voorwoord In dit voorwoord wil ik enkele personen bedanken voor hun hulp en steun bij het tot stand brengen van deze masterproef. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. H. Thierens en mijn begeleidster Kim De Ruyck bedanken voor de mogelijkheid om deel uit te maken van dit boeiend onderzoek. Een speciaal woord van dank gaat hierbij uit naar Kim voor het geduldig aanleren van de verschillende technieken in het labo, de inhoudelijke tips, de hulp bij de statistische verwerking en het nalezen van deze masterproef. Je was steeds bereid om mijn vragen te beantwoorden en te helpen waar nodig, bedankt! Ook het dienstpersoneel van het INW verdient een dankwoord voor de aangename sfeer! Bedankt aan het personeel van de dienst Pathologie van het UZ Gent en aan Dr. L. Ferdinande om kostbare tijd vrij te maken en mij wegwijs te maken in het histologisch aspect van deze studie. Ook Astrid De Meulenaere mag hierbij zeker niet vergeten worden, bedankt! Ook het personeel van de dienst Radiotherapie van het UZ Gent wil ik bedanken, met in het bijzonder Dr. F. Duprez voor de hulp bij het verzamelen van gegevens en voor het nauwgezet bijhouden van data en mij hiermee te vertrouwen. Greet en Nikki, bedankt voor alle hulp, steun en de talrijke leuke momenten! Deze laatste twee jaar zullen me altijd bijblijven. Ten slotte wil ik mijn vrienden en familie bedanken voor hun onvoorwaardelijke steun. Een extra dankwoord gaat uit naar mijn mama, bedankt om mij de kans te geven om Biomedische Wetenschappen te studeren en om in mij te geloven! I Inhoud Inhoud Afkortingen Samenvatting .............................................................................................................................. 1 Summary .................................................................................................................................... 2 Inleiding ..................................................................................................................................... 3 1. Hoofd- en halskanker ..................................................................................................... 3 1.1 Anatomie .................................................................................................................. 3 1.2 Epidemiologie .......................................................................................................... 3 1.3 Risicofactoren .......................................................................................................... 3 1.3.1 Tabak en alcohol ............................................................................................... 3 1.3.2 Virussen ............................................................................................................ 4 1.3.3 Andere risicofactoren ....................................................................................... 4 1.4 Behandeling ............................................................................................................. 5 1.5 Stralingsgeïnduceerde toxiciteit ............................................................................... 6 1.5.1 Acute vs. late complicaties ............................................................................... 6 1.5.2 Variabiliteit ....................................................................................................... 7 1.5.3 Scoren van radiotoxiciteit ................................................................................. 7 1.6 2. 3. Orofaryngeale kanker ............................................................................................... 7 Humaan Papillomavirus ................................................................................................. 9 2.1 HPV-geïnduceerde carcinogenese ........................................................................... 9 2.2 Detectie .................................................................................................................. 10 Biomerkers ................................................................................................................... 11 3.1 Biomerkers voor prognose ..................................................................................... 11 3.2 Biomerkers voor toxiciteit ..................................................................................... 12 3.2.1 TXNRD2 rs1139793 G>A .................................................................................. 12 3.2.2 HSPB1 rs2868371 G>C ...................................................................................... 12 II 3.2.3 MDM2 rs2279744 T>G ...................................................................................... 12 3.2.4 TNFα rs1800629 G>A ........................................................................................ 13 3.2.5 TGFβ1 rs1800469 C>T ....................................................................................... 13 4. Probleem- en doelstelling ............................................................................................. 13 Materiaal en methoden ............................................................................................................. 15 1. Patiëntenpopulatie ........................................................................................................ 15 2. HPV-status bepaling ..................................................................................................... 15 2.1 Chromogene In Situ Hybridisatie .......................................................................... 16 2.2 p16-Immunohistochemie ....................................................................................... 16 3. DNA purificatie uit humaan bloed ............................................................................... 17 4. Concentratie- en kwaliteitsbepaling van het DNA ....................................................... 18 5. Polymerase Chain Reaction (PCR) .............................................................................. 18 5.1 Principe .................................................................................................................. 18 5.2 Mix .............................................................................................................................. 19 5.3 Primers ........................................................................................................................ 20 5.4 6. Controle.................................................................................................................. 20 SNP bepaling ................................................................................................................ 21 6.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ............................................ 21 6.2 High Resolution Melting (HRM) ................................................................................ 22 6.3 Kwaliteitscontroles ..................................................................................................... 23 7. Statistische analyse ....................................................................................................... 23 Resultaten ................................................................................................................................. 25 1. 2. Prognose ....................................................................................................................... 25 1.1 Patiënt- en behandelingskarakteristieken ............................................................... 25 1.2 Bepaling van de tumor HPV-status........................................................................ 26 1.3 Associatie van overleving met patiëntgerelateerde en klinische factoren ............. 26 1.4 Associatie van tumor HPV-status met patiëntgerelateerde en klinische factoren . 29 Late radiotoxiciteit ....................................................................................................... 30 III 2.1 Optimalisatie protocols .......................................................................................... 30 2.1.1 HSPB1 rs2868371 G>C ...................................................................................... 30 2.1.2 TXNRD2 rs1139793 G>A .................................................................................. 30 2.2 Patiënt- en behandelingskarakteristieken ............................................................... 31 2.3 SNP data................................................................................................................. 33 2.4 Associatiestudie naar het optreden van late dysfagie............................................. 34 2.4.1 Associatie met patiëntgerelateerde en klinische factoren ................................... 34 2.4.2 Associatie met dosis-volume waarden ................................................................ 36 2.4.3 Associatie met de geselecteerde SNPs ................................................................ 36 Bespreking ................................................................................................................................ 39 1. Prognose ....................................................................................................................... 39 2. Late radiotoxiciteit ....................................................................................................... 40 2.1 Patiëntgerelateerde en klinische factoren ............................................................... 41 2.2 Dosis-volume waarden ........................................................................................... 43 2.3 SNPs ....................................................................................................................... 44 2.4 Mogelijke beperkingen .......................................................................................... 46 Algemeen besluit ...................................................................................................................... 47 Referenties ................................................................................................................................ 48 Addendum IV Afkortingen 5’UTR 5’Untranslated region AL Antilichaam CISH Chromogene In Situ Hybridisatie DD Dosis De-escalatie DFS Disease-Free Survival dH2O Distilled Water DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Trifosfaat DSS Disease-Specific Survival E6AP E6-Associated Protein EtBr Ethidiumbromide FWD Forward Primer Gy Gray HNSCC Head and Neck Squamous Cell Carcinoma HPV Humaan Papillomavirus HRM High Resolution Melting HSP Heat Shock Protein HWE Hardy-Weinberg equilibrium IHC Immunohistochemie IMRT Intensity Modulated Radiation Therapy IPC Inferior Pharyngeal Constrictor KT Kamertemperatuur LCS Liquid Coverslip MAF Minor Allele Frequency MgCl2 Magnesiumchloride min. Minuut MPC Middle Pharyngeal Constrictor N-stage Nodaal stadium Nt Nucleotide OR Odds Ratio OS Overall Survival PCR Polymerase Chain Reaction PD-1 Programmed Death Protein 1 V PD-L1 Programmed Death-Ligand 1 pRb Retinoblastoma Protein RBC Red Blood Cell RE Restrictie-enzym REV Reverse Primer RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism ROS Reactive oxygen species RT Radiotherapie sec. Seconde SNP Single Nucleotide Polymorphism SPC Superior Pharyngeal Constrictor SSC Saline Sodium Citraat Ta Annealing Temperatuur TBE Tris Boraat EDTA TE Tris-EDTA TGF Transforming Growth Factor TIL Tumor Infiltrerende Lymfocyt Tm Melting Temperatuur TNF Tumor Necrosis Factor T-stage Tumor stadium U Unit UZ Universitair Ziekenhuis V Volt VI Samenvatting Hoofd- en halskanker is de zesde meest voorkomende vorm van kanker wereldwijd. In 2012 werden in België ongeveer 2600 nieuwe patiënten gediagnosticeerd. De laatste jaren wordt een toename in incidentie van orofaryngeale kanker waargenomen. Deze toename is voornamelijk te wijten aan infectie met het humaan papillomavirus (HPV). In het eerste deel van deze masterproef werd de tumor HPV-status bepaald aan de hand van twee technieken: p16immunohistochemie (p16-IHC) en chromogene in situ hybridisatie (CISH). De associatie tussen de tumor HPV-status en patiëntgerelateerde factoren, klinische factoren en overleving werd voor een studiepopulatie van 109 orofaryngeale kankerpatiënten onderzocht. Uit deze analyse blijkt dat patiënten met HPV-geassocieerde orofaryngeale tumoren duidelijk een betere prognose vertonen (5-jaar globale overleving: 75,1% vs. 35,9%). Ook orofaryngeale kankerpatiënten die minder tabak en alcohol gebruiken vertonen een betere overleving. In dit deel kon bevestigd worden dat zowel de tumor HPV-status als het gebruik van tabak en alcohol een prognostische waarde hebben. De behandeling voor patiënten met hoofd- en halskanker bestaat voornamelijk uit radiotherapie (RT), chemotherapie of een combinatie van beide. Doordat tijdens RT niet enkel de tumor bestraald wordt maar ook de omliggende weefsels kunnen ongewenste complicaties optreden, zoals dysfagie. Bij het ontstaan van deze neveneffecten spelen zowel patiëntgerelateerde factoren, dosimetrische factoren als een genetische voorbeschiktheid een rol. In het tweede deel van deze masterproef werd de associatie tussen deze factoren en het optreden van late dysfagie na RT nagegaan. Ook werd de associatie tussen het optreden van late dysfagie en het voorkomen van vijf single nucleotide polymorphisms (SNPs) onderzocht. De geselecteerde SNPs zijn: rs1139793 G>A (TXNRD2), rs2868371 G>C (HSPB1), rs2279744 T>G (MDM2), rs1800629 G>A (TNFα) en rs1800469 C>T (TGFβ1). De genotypering werd voor een studiepopulatie van 288 patiënten met hoofd- en halskanker uitgevoerd, met behulp van restriction fragment length polymorphism (RFLP) en high resolution melting (HRM). Uit univariate analyse blijkt dat T-stage en het optreden van acute dysfagie een invloed hebben op de ontwikkeling van ernstige late dysfagie na RT. Late dysfagie is geassocieerd met de totale tumordosis en het aantal pak-jaren. Met betrekking tot de dosis-volume waarden blijkt dat de maximale dosis en de V50 ter hoogte van de slokdarm geassocieerd zijn met het optreden van ernstige late dysfagie. Ook voor de genetische variatie rs1800629 G>A (TNFα) werd een significante associatie aangetoond. Aanwezigheid van het homozygoot variant genotype (AA) geeft een verhoogd risico op de ontwikkeling van late dysfagie. 1 Summary Background: The first aim of this study was to determine tumor HPV-status and its value as prognostic marker. Patient-related factors and clinical parameters were also investigated as prognostic markers. The second aim of this study was to identify five single nucleotide polymorphisms (SNPs) as possible markers for radiation-induced late dysphagia. The association between the risk of radiation-induced dysphagia and patient-related factors, treatment-related factors and dosimetric parameters was also assessed. Methods: Tumor HPV-status was determined for 109 oropharyngeal cancer patients, using p16-immunohistochemistry and chromogenic in situ hybridization. Five SNPs (TXNRD2 rs1139793, HSPB1 rs2868371, MDM2 rs2279744, TNFα rs1800629 and TGFβ1 rs1800469) were genotyped for 288 patients with head and neck cancer. Results: Patients with HPV-positive oropharyngeal tumors have a better prognosis (5-years overall survival: 75,1% vs. 35,9%) compared to HPV-negative patients. Also, patients with >10 pack-years, ≥10 drinks/week and advanced N-stage have a reduced survival. For the second part, univariate analysis showed a significant association between advanced T-stage, presence of acute dysphagia and higher total tumor dose and radiation-induced dysphagia. A significant association with the development of dysphagia was observed between both maximum dose and V50 on the esophagus. The variant A-allele of the TNFα polymorphism was associated with a higher risk of late dysphagia. Conclusions: The prognostic value of tumor HPV-status and the use of tobacco and alcohol was validated in this study. The AA-genotype for TNFα rs1800629 is associated with a higher risk for radiation-induced dysphagia for patients with head and neck cancer. These findings, regarding late radiotoxicity, should be validated in larger and independent cohorts. 2 Inleiding 1. Hoofd- en halskanker 1.1 Anatomie Hoofd- en halskanker omvat een heterogene groep van tumoren die ontstaan op verschillende anatomische plaatsen: mondholte, orofarynx, nasofarynx, hypofarynx en larynx (zie figuur 1). Meer dan 90% van de hoofd- en halskankers zijn plaveiselcelcarcinomen (HNSCC), ontstaan uit de epitheliale aflijning van deze structuren (1, 2). Figuur 1. Anatomische regio’s voor de ontwikkeling van hoofd- en halskanker (3) 1.2 Epidemiologie Hoofd- en halskanker is de zesde meest voorkomende vorm van kanker wereldwijd (2, 4). In 2008 was hoofd- en halskanker, met 6% van alle maligniteiten, de vierde meest voorkomende tumor bij mannen en met 2,1% van alle maligniteiten, de negende meest voorkomende tumor bij vrouwen (5). In 2012 werden in België 2624 nieuwe patiënten gediagnosticeerd, waarvan 1937 mannen en 687 vrouwen (6). In Nederland waren dit in hetzelfde jaar 3013 patiënten, waarvan 2000 mannen en 1013 vrouwen (7). De gemiddelde leeftijd van diagnose ligt rond de 60 jaar (4, 5). Mannen hebben een 2 tot 4 keer grotere kans op het ontwikkelen van hoofd- en halskanker in vergelijking met vrouwen (8). 1.3 Risicofactoren 1.3.1 Tabak en alcohol Het gebruik van tabak en alcohol zijn de belangrijkste risicofactoren geassocieerd met het ontstaan van hoofd- en halskanker. Tabaksgebruik en alcoholconsumptie spelen een rol in meer dan 75% van alle gevallen (2, 4, 9). 3 Tabak bevat nitrosamines en polycyclische aromatische koolwaterstoffen, deze organische verbindingen hebben genotoxische effecten en kunnen zo mutaties veroorzaken (1, 10). Alcohol werkt als een solvent waardoor een verhoogde mucosale blootstelling aan carcinogenen optreedt. Dit leidt tot een toename in cellulaire opname van deze carcinogenen (1). Bovendien kan acetaldehyde, als belangrijk metaboliet van alcohol en ook aanwezig in tabak, DNA-adducten vormen. Deze interfereren met DNA-synthese en -herstel (1, 9). Eveneens zijn bepaalde genetische polymorfismen in enzymen, betrokken bij de metabolisatie van zowel tabak als alcohol, geassocieerd met een verhoogd risico op hoofd- en halskanker (4). Ook is aanzienlijke blootstelling aan tabak en alcohol geassocieerd met mutaties in het tumor suppressor gen p53 (10). Zware rokers hebben een 5 tot 25 maal hogere kans op het ontstaan van hoofd- en halskanker, in combinatie met alcohol wordt dit risico nog groter (10). 1.3.2 Virussen Er bestaan twee virussen die geassocieerd zijn met de ontwikkeling van hoofd- en halskanker. Het humaan papillomavirus (HPV) wordt voornamelijk gekoppeld aan orofaryngeale kanker, het Epstein-Barr virus is geassocieerd met nasofaryngeale kanker (10, 11). De associatie tussen hoofd- en halskanker en high-risk types HPV als risicofactor is het sterkst bij orofaryngeale kanker, voornamelijk bij tonsil tumoren. Bij carcinomen van de larynx en de mondholte is de associatie het zwakst (4, 10). De prevalentie van HPV-geassocieerde orofaryngeale tumoren varieert van 23% tot 73%, afhankelijk van de geografische plaats en de onderzochte periode (12). In Europa varieert deze prevalentie voor orofaryngeale tumoren van 35,3% tot 73,1% over een periode van voor 2000 tot na 2005. Voor diezelfde periode varieert de prevalentie bij nietorofaryngeale tumoren van 23,6% tot 11,7% (13). De globale incidentie van hoofd- en halskanker is aan het stijgen door een gestage toename van de incidentie van orofaryngeale kanker. Deze toename is voornamelijk te wijten aan HPV-infectie. HPV-positieve tumoren zijn voornamelijk geassocieerd met seksueel gedrag, zoals het aantal orale en vaginale seksuele partners (11, 14). 1.3.3 Andere risicofactoren Andere risicofactoren die geassocieerd zijn met het ontstaan van hoofd- en halskanker zijn vitamine A deficiëntie; ijzertekort bij het Plummer-Vinson syndroom; beroepsmatige blootstelling aan bepaalde stoffen zoals asbest, radium en chroom; lage body mass index en familiale voorgeschiedenis (1, 10). 4 Ook individuen met bepaalde syndromen die de gevoeligheid voor kanker verhogen, zoals Ataxia Telangiectasia en het syndroom van Li-fraumeni, hebben een verhoogd risico op hoofden halskanker (4). 1.4 Behandeling Momenteel is het type behandeling voor hoofd- en halskanker voornamelijk afhankelijk van de locatie van de tumor, het stadium en of preservatie van organen haalbaar is (1). Ook is het belangrijk om factoren die geassocieerd zijn met toxiciteit, prognose en de grootste kans op genezing in balans te brengen (15). Ongeveer één derde van de patiënten met hoofd- en halskanker bevindt zich in een vroeg stadium (T1-T2 N0). Deze patiënten kunnen behandeld worden met behulp van chirurgie of radiotherapie (RT), afhankelijk van de plaats van de primaire tumor (2). Beide modaliteiten zijn even effectief in locoregionale controle en -overleving (14, 15). Resectie van de primaire tumor met een halsklierevidement of adjuvante RT is nuttig bij patiënten met vroege lymfekliermetastasen (T1N1, T2N1) (14). Echter, de meerderheid van de patiënten (ongeveer 60%) bevindt zich reeds in een lokaal gevorderd stadium (1, 2). In het algemeen kan de behandeling voor deze patiënten op drie verschillende manieren aangepakt worden. Ten eerste kan er gekozen worden voor chirurgie met een halskierevidement, aangevuld met adjuvante RT of chemoradiotherapie. Postoperatieve chemoradiotherapie op basis van een hoge dosis cisplatinum is hierbij meer effectief dan RT alleen. Ten tweede kan men kiezen voor inductie chemotherapie, dit wordt dan gevolgd door chemoradiotherapie en/of chirurgie. Of men kan concurrente chemoradiotherapie op basis van platinum toedienen (1). Deze behandelingen zijn intensief en gaan gepaard met ernstige toxiciteit (2). Intensiteitsgemoduleerde radiotherapie (IMRT) heeft enkele voordelen in vergelijking met de conventionele technieken. Het gebruik van IMRT zorgt voor een meer homogeen bereik van dosis in het doelvolume en een afname van dosis in de omgevende weefsels. Dit leidt tot een vermindering van de kans op stralingsgeïnduceerde complicaties en een betere tumorcontrole (1, 16). Ondanks recente ontwikkelingen hervalt 50% van de patiënten met tumoren in een lokaal gevorderd stadium binnen de twee jaar na behandeling (2). Bij patiënten met hoofd- en halskanker ligt de overlevingsgraad laag, met een 2-jaar globale overleving (OS) rond 55% en een 5-jaar OS rond 35% (16). 5 1.5 Stralingsgeïnduceerde toxiciteit De ioniserende straling gebruikt bij RT zorgt voor DNA-schade. Dit kan op een directe wijze gebeuren, door ionisaties die enkelstreng- en dubbelstrengbreuken kunnen veroorzaken, of indirect, via vrije reactive oxygen species (ROS). De capaciteit om deze DNA-schade te herstellen is groter bij gezonde cellen dan bij tumorcellen waardoor tumorcellen dus gevoeliger zijn voor straling (17). Doordat tijdens RT niet enkel de tumor bestraald wordt maar ook de omliggende weefsels kunnen ongewenste complicaties optreden, zoals onder andere dysfagie en xerostomie (16, 18). Deze complicaties hebben een grote negatieve impact op de levenskwaliteit van de patiënt (16, 19). 1.5.1 Acute vs. late complicaties Acute complicaties treden op tijdens of binnen enkele weken na RT (18, 20, 21). Deze vroege effecten zijn vaak reversibel en worden voornamelijk in snel prolifererende weefsels, zoals de huid en het gastro-intestinaal stelsel, waargenomen. Acute symptomen ontstaan wanneer functionele cellen verloren gaan als gevolg van DNA-schade (18, 20). Ioniserende straling zorgt bovendien voor de activatie van verschillende signalisatiewegen die onder andere leiden tot een inflammatoire respons (20). Acute effecten zijn dus ofwel inflammatie-gerelateerd of ontstaan als gevolg van een afname van functionele cellen (22). Acute complicaties die kunnen optreden bij patiënten met hoofd- en halskanker zijn onder meer acute dysfagie en mucositis. Late effecten treden op in traag prolifererend weefsel, zoals subcutaan weefsel en vetweefsel, en worden maanden tot jaren na de RT waargenomen (18, 20, 21). Deze complicaties zijn vaak blijvend en ontstaan door een combinatie van vasculaire schade, fibroblast proliferatie, atrofie en inflammatie (20, 22). Consequentiële late effecten daarentegen zijn acute effecten die niet herstellen maar persistent aanwezig blijven (18). Mogelijke late complicaties die kunnen voorkomen bij patiënten met orofaryngeale kanker zijn xerostomie, fibrose en laattijdige dysfagie. Afhankelijk van de behandeling, het bestraalde volume, de totale tumordosis, de fractionatie en de totale duur van de behandeling kan de incidentie van late dysfagie toenemen tot 50% (16, 19). Bij dysfagie heeft de patiënt moeilijkheden met het inslikken van zacht of hard voedsel (16, 21). Ernstige dysfagie kan leiden tot voedseldeficiëntie en gewichtsverlies waardoor een gastrostomiesonde noodzakelijk kan worden. Ook kan er sensorisch verlies optreden wat uiteindelijk kan leiden tot een hoog risico op aspiratie (19, 21). Door de omvang van de tumor kan er al sprake zijn van dysfagie voor de behandeling (19). Slikproblemen die na RT ontstaan zijn voornamelijk het gevolg van fibrose (19, 21). De leeftijd, het tumorstadium en tabaksgebruik zijn de voornaamste risicofactoren voor het optreden van ernstige dysfagie (16, 19). 6 1.5.2 Variabiliteit Stralingsgeïnduceerde complicaties verschillen tussen patiënten inzake risico en ernst. Deze verschillen kunnen enerzijds verklaard worden door patiëntgerelateerde factoren zoals leeftijd en tabaksgebruik. Anderzijds zijn ook behandelingsgerelateerde factoren van belang, zoals de totale tumordosis, de RT-techniek en het bestraald volume (16, 20). Zo zorgt bijvoorbeeld het gebruik van IMRT, waarbij een hoge dosis ter hoogte van het doelvolume en een lagere dosis in de nabije weefsels bereikt wordt, voor een verminderd optreden van bijwerkingen (16). Wanneer echter chemotherapie gecombineerd wordt met radiotherapie neemt de toxiciteit toe (16, 21). Naast de patiënt- en behandelingsgerelateerde variabelen is ook de genetische predispositie van belang bij het ontstaan van stralingsgeïnduceerde toxiciteit (16, 23). Dit wordt verder in de inleiding meer in detail behandeld. 1.5.3 Scoren van radiotoxiciteit De toxiciteit na RT kan aan de hand van verschillende scoringssystemen worden bepaald. In deze studie werd gebruik gemaakt van het Radiation Therapy Oncology Group/ European Organisation for Research and Treatment of Cancer (RTOG-EORTC) scoringssysteem (24) en het Late Effects of Normal Tissues: Subjective, Objective, Management, Analytical (LENTSOMA) scoringssysteem (25). Dit kan teruggevonden worden in bijlage A. De verschillende weefselreacties krijgen een score, gaande van 1 tot 5, afhankelijk van de ernst van toxiciteit. Bijvoorbeeld bij dysfagie met graad 1 en 2 zijn er moeilijkheden bij het eten van hard en zacht voedsel, respectievelijk. Bij graad 3 kan de patiënt enkel nog vloeistoffen innemen. Bij graad 4 is de patiënt niet meer in staat om te slikken en graad 5 leidt uiteindelijk tot de dood. 1.6 Orofaryngeale kanker Orofaryngeale kanker behoort tot de groep van de HNSCCs. De orofarynx is het middelste deel van de farynx en omvat de basis van de tong, het zacht gehemelte, de amandelen en de laterale en posterieure wanden van de farynx (11). Op basis van de HPV-status kunnen orofaryngeale tumoren in twee etiologisch en klinisch verschillende groepen geclassificeerd worden. HPV-geassocieerde orofaryngeale kanker ontstaat door blootstelling aan high-risk types HPV, voornamelijk HPV-type 16, en ontwikkelt onafhankelijk van tabaksgebruik en alcoholconsumptie. Bij HPV-positieve orofaryngeale kanker is er meer kans op de aanwezigheid van kleine primaire tumoren, typisch in een vroeg T-stadium, maar met een vergevorderd N-stadium (2628). Op histologisch vlak zijn deze tumoren voornamelijk niet keratiniserend met basaloide 7 eigenschappen (26). Anderzijds is HPV-negatieve orofaryngeale kanker voornamelijk geassocieerd met langdurige blootstelling aan tabak en alcohol (28). Ook de overlevingsgraad wordt voornamelijk bepaald door de HPV-status (29). Patiënten met HPV-positieve orofaryngeale kanker reageren beter op de behandeling, hebben minder kans op herval en vertonen een betere prognose (26, 30, 31). Zo hebben patiënten met HPV-positieve tumoren een 5-jaar globale overleving van 75-80% vergeleken met 45-50% voor de HPVnegatieve patiënten (26, 29). Naast de HPV-status zijn nog enkele prognostische merkers voor orofaryngeale kanker gekend. Dit zijn tumorstadium (T2-T3 versus T4), nodaal stadium (N0-N2a versus N2b-N3) en het aantal pak-jaren tabaksgebruik (≤ 10 versus > 10) (29, 31). Op basis van deze merkers kunnen patiënten geclassificeerd worden in drie verschillende risicogroepen naar kans op overlijden (zie figuur 2). Volgens dit model van Ang et al. wordt de globale overleving bij HPV-positieve orofaryngeale kanker bepaald door het aantal pak-jaren (≤10) en het nodaal stadium, terwijl dit bij HPV-negatieve bepaald wordt door het aantal pak-jaren (>10) en het tumorstadium (29). Figuur 2. Classificatie van patiënten naar risico op overlijden (29) Er bestaan verschillende hypothesen voor het verschil in prognose. De hogere overlevingsgraad voor patiënten met HPV-positieve orofaryngeale tumoren zou het gevolg zijn van een betere locoregionale controle wegens een grotere stralingsgevoeligheid van deze tumoren, maar specifieke mechanismen zijn nog niet gekend (29, 31). Ook zijn HPV-positieve tumoren minder geassocieerd met tabak en alcohol en zijn er minder p53-mutaties aanwezig (26). Een andere hypothese voor het verschil in prognose is de mogelijke betrokkenheid van het adaptieve immuunsysteem, met onder meer tumor-infiltrerende lymfocyten (TILs) (32, 33). 8 2. Humaan Papillomavirus HPV is een DNA-virus dat voornamelijk de basale epitheliale cellen infecteert, met een voorkeur voor de tonsillen en de tongbasis (11, 28). Er zijn meer dan 100 types HPV, waarbij sommige de voorkeur hebben om de huid te infecteren en andere eerder de mucosa zullen infecteren. Deze laatste kunnen ingedeeld worden in twee groepen, de high-risk en de low-risk HPVs. Bij de high-risk HPVs kan HPV-infectie leiden tot precancereuze letsels. High-risk HPV-infecties zijn asymptomatisch en bij de grote meerderheid wordt de infectie binnen één jaar geklaard. Een klein deel van de individuen zal kanker ontwikkelen (34). Meer dan 90% van de HPV-positieve orofaryngeale tumoren wordt door HPV-type 16 veroorzaakt (28, 35). Andere HPV-types die aanleiding geven tot orofaryngeale kanker zijn onder andere HPV-type 18 en HPV-type 33 (36). 2.1 HPV-geïnduceerde carcinogenese HPV is een klein circulair dubbelstrengig DNA-virus met een genoom van ongeveer 8000 basenparen waarin twee groepen van virale genen aanwezig zijn, de vroege genen en de late genen. De vroege genen coderen voor twee regulatoire proteïnen (E1,E2) en drie oncoproteïnen (E5, E6, E7). De late genen coderen voor twee structurele capsideproteïnen (L1, L2). Deze capsideproteïnen zijn verantwoordelijk voor de initiële binding tussen het virus en de targetcel (11, 34). De regulatoire proteïnen E1 en E2 zijn noodzakelijk voor de virale DNA-replicatie (34). De oncoproteïnen zijn verantwoordelijk voor de carcinogenese. E5 blokkeert apoptose, beïnvloedt cel-matrix adhesie en interfereert met epitheliale differentiatie (34). Oncoproteïnen E6 en E7 promoten tumorprogressie door de inactivatie van tumor suppressor genproducten p53 en retinoblastoma (pRb), respectievelijk (11, 14, 34, 37). High-risk HPV E6 induceert de proteasomale afbraak van p53 via een ubiquitine-gemedieerd proces (34). E6 bindt met het E3 ubiquitine ligase E6-associated protein (E6AP) waarna er een complex gevormd wordt met p53 en deze geïnactiveerd wordt (11, 37). Low risk HPV E6 kan ook binden met het E6AP en hierdoor een complex vormen met p53, maar leidt niet tot degradatie (34). High-risk HPV E7 bindt met het cullin2 ubiquitine ligase complex en inactiveert pRb (11, 34). Dit zorgt voor een aberrante celproliferatie en een toename van cdkinhibitor p16INK4a. Omwille van deze overexpressie kan p16 als surrogaat merker voor HPVinfectie gebruikt worden (37). 9 De tumor suppressor eiwitten p53 en Rb zijn verantwoordelijk voor het regelen van de celcyclus zodat DNA-schade kan gedetecteerd en hersteld worden. Bijgevolg leidt de oncogene werking van E6 en E7 tot een accumulatie van mutaties en uiteindelijk tot genomische instabiliteit (37). 2.2 Detectie Het bepalen van de HPV-status kan gebeuren met behulp van verschillende technieken waaronder polymerase chain reaction (PCR), in situ hybridisatie (ISH) en p16immunohistochemie (p16-IHC) (11, 14, 38). Bij PCR gebeurt de detectie aan de hand van geamplificeerd viraal mRNA of viraal DNA. PCR heeft een hoge gevoeligheid en is kosteneffectief maar heeft een lage specificiteit. Hierdoor kan er geen onderscheid gemaakt worden tussen de aanwezigheid van HPV DNA in neoplastische cellen en de aanwezigheid in niet-neoplastische cellen. Ook kunnen episomaal en geïntegreerd HPV DNA niet van elkaar onderscheiden worden (38). Bij ISH daarentegen kan dit onderscheid wel gemaakt worden doordat de detectie in de kernen van de geïnfecteerde cellen gebeurt, en zo dus enkel de klinisch relevante infecties gedetecteerd worden (38). Ondanks de hoge specificiteit heeft ISH wel een lagere sensitiviteit dan PCR (14, 31, 38). Bij de aanwezigheid van donkerblauwe kernkleuringen wordt een tumor als HPVpositief beschouwd (zie figuur 3) (12). p16-IHC is gebaseerd op de hoge p16-expressie in HPV-positieve tumoren als gevolg van de degradatie van pRb, geïnduceerd door het E7 oncoproteïne (11, 14). p16-IHC heeft, in tegenstelling tot ISH, een hoge sensitiviteit maar een lage specificiteit (14, 38). Hierdoor kan ongeveer 15-20% van de patiënten vals-positief gedetecteerd worden (31). Wanneer p16-IHC in combinatie met ISH wordt gebruikt kan het aantal vals-positieven gereduceerd worden (38). Positieve p16-expressie wordt gedefinieerd als een bruine nucleaire en cytoplasmatische kleuring in meer dan 70% van de tumorcellen (zie figuur 3) (12). Figuur 3. HE-kleuring (A,D), p16-negatief (B) en p16-positief (E), CISH-negatief (C) en CISH-positief (F) (12) 10 3. Biomerkers Biomerkers zijn meetbare indicatoren van een specifieke biologische toestand, relevant voor onder meer prognose, risico en respons van een bepaalde pathologie. Er zijn verschillende types biomerkers, waaronder single nucleotide polymorphisms (SNPs), microRNAs en eiwitten. Biomerkers die gebruikt worden bij onderzoek naar radiotoxiciteit, radiogenomics, zijn voornamelijk genetische variaties. SNPs zijn verantwoordelijk voor het merendeel van de natuurlijke sequentie variatie in het menselijk genoom. Een SNP is een sequentie variatie in het DNA van 1 nucleotide (A, G, C, T) waarbij het variant allel tenminste in 1% van de populatie voorkomt. Deze polymorfe variaties kunnen interfereren met de functie van bepaalde cruciale genen, zoals DNA-herstelgenen, waardoor ze een effect hebben op de ontwikkeling van radiotoxiciteit (23). Voor prognose wordt als biomerker vooral gebruik gemaakt van de expressie van bepaalde eiwitten in tumoren. Door de identificatie van dergelijke biomerkers zou de stratificatie van patiënten naar prognose verfijnd kunnen worden. 3.1 Biomerkers voor prognose Op dit moment gebeurt er volop onderzoek naar additionele biomerkers, waaronder bijvoorbeeld Bcl-2, EGFR en c-Met, die mogelijk gecorreleerd zijn met overleving en eventueel samen met HPV-status bruikbaar zouden kunnen zijn voor patiënt stratificatie naar therapie toe (39-41). Aangezien enkele studies suggereren dat het immuunsysteem een belangrijke rol speelt bij het verschil in prognose tussen HPV-positieve en HPV-negatieve tumoren, kan ook het belang van TILs als biomerker bestudeerd worden. Zo hebben Ward et al. aangetoond dat HPV-positieve orofaryngeale tumoren geassocieerd zijn met een hoog gehalte aan TILs. Bovendien bleek dat patiënten met deze tumoren een betere prognose hebben dan de HPV-positieve patiënten met een laag gehalte aan TILs (33). Een andere studie suggereert dat, meer specifiek, de aanwezigheid van TILs die programmed death protein 1 (PD-1) tot expressie brengen tot een betere prognose leiden bij HPV-geassocieerde tumoren (32). 11 3.2 Biomerkers voor toxiciteit In deze masterproef wordt onderzocht of er een associatie is tussen de aanwezigheid van bepaalde SNPs en het optreden van late radiotoxiciteit bij patiënten met hoofd- en halskanker. De SNPs werden geselecteerd op basis van de beschikbare literatuur. Aangezien er nog niet veel radiogenomic onderzoek is naar deze late effecten bij hoofd- en halskanker werden ook enkele SNPs geselecteerd die geassocieerd zijn met late toxiciteit in andere pathologieën. 3.2.1 TXNRD2 rs1139793 G>A Deze SNP (rs1139793 of Ile370Thr) bevindt zich in de coderende regio van het TXNRD2 gen, gelegen op chromosoom 22, en heeft een minor allele frequency (MAF) van 30% in een Kaukasische populatie (42). De nucleotideverandering leidt tot de substitutie van een isoleucine aminozuur naar een threonine op codon 370. Het TXNRD2 gen is betrokken bij de regulatie van redoxlevels in cellen en bij het herstel van DNA schade veroorzaakt door ROS. TXNRD2 codeert voor thioredoxine reductase 2 dat een grote rol speelt bij de afweer tegen oxidatieve schade, door de reductie van thioredoxine betrokken bij het opruimen van ROS. In 2013 kon de onderzoeksgroep van Edvardsen et al. een associatie aantonen tussen het ontstaan van stralingsgeïnduceerde fibrose bij borstkankerpatiënten en het voorkomen van deze SNP (43). 3.2.2 HSPB1 rs2868371 G>C Deze SNP komt voor in de 5’untranslated region (5’UTR) van het HSPB1 gen, gelegen op chromosoom 7, en heeft in een Kaukasische populatie een MAF van 25% (42). Het HSPB1 gen codeert voor een heat shock protein 1 van 27kDa (HSP27). HSP27 faciliteert de afbraak of het herstel van beschadigde eiwitten, die ontstaan zijn als gevolg van stress-geïnduceerde schade. Ook zorgt HSP27, via zijn chaperone-activiteit, voor een toename in de antioxidante capaciteit van cellen en een beperking van de toxische effecten van geoxideerde eiwitten. Dit is van belang bij de cellulaire respons op ioniserende straling gebruikt bij RT, aangezien op indirecte wijze ROS kunnen gevormd worden. Lopez et al. kon een significante associatie aantonen tussen deze SNP en het optreden van acute stralingsgeïnduceerde slokdarmtoxiciteit bij patiënten met niet-kleincellige longkanker (44). 3.2.3 MDM2 rs2279744 T>G Deze SNP (rs2279744 of SNP309 T>G) bevindt zich in de 5’UTR van het MDM2 (HDM2) gen, gelegen op chromosoom 12, en heeft in een Kaukasische populatie een MAF van 30% (42). MDM2 codeert voor het MDM2-oncoproteïne, een ubiquitine ligase dat een cruciale rol speelt bij de regulatie van het p53 proteïne. Overexpressie van dit oncoproteïne bevordert celoverleving en progressie van de celcyclus, door ubiquitinatie en degradatie van p53. De 12 aanwezigheid van deze SNP verhoogt de affiniteit voor de Sp1 transcriptiefactor wat leidt tot een toename van MDM2 mRNA en eiwitten, en uiteindelijk tot een demping van de p53 signalisatieweg (45, 46). Bij nasofaryngeale kanker werd een associatie gevonden tussen deze SNP en het ontstaan van fibrose na RT (46). 3.2.4 TNFα rs1800629 G>A Deze SNP (rs1800629 of -308SNP) bevindt zich in de 5’UTR van het TNFα gen, gelegen op chromosoom 6, en heeft een MAF van 17,3% in een Kaukasische populatie (42). Het TNFα gen codeert voor een multifunctioneel pro-inflammatoir cytokine, tumor necrose factor alfa (TNFα). Dit cytokine speelt een belangrijke rol bij inflammatie en wordt aangemaakt na schade of infectie. Aangezien dit gen van belang is bij het inflammatieproces kan verwacht worden dat het tot een grote verscheidenheid van stralingsgeïnduceerde effecten zal leiden. Bij borstkankerpatiënten werd een significante associatie gevonden tussen deze SNP en globale late toxiciteit (22). 3.2.5 TGFβ1 rs1800469 C>T Deze SNP (rs1800469 of -509 C>T) komt voor in de promotor regio van het TGFβ1 gen, gelegen op chromosoom 19, en heeft een MAF van 28,9% in een Kaukasische populatie (42). Het TGFβ1 gen codeert voor transforming growth factor beta 1 (TGFβ1), een multifunctioneel cytokine dat aangemaakt wordt als reactie op schade. Dit cytokine stimuleert de differentiatie van fibroblasten en de productie van extracellulaire matrix en inhibeert epitheliale herstelprocessen (47, 48). Dit is van belang bij collageen afzetting en degradatie, wat uiteindelijk aanleiding geeft tot het ontstaan van fibrose (19). Onderzoek naar de associatie tussen deze SNP en stralingsgeïnduceerde effecten geeft tegenstrijdige resultaten. Zo werd bij nasofaryngeale kankerpatiënten een associatie gevonden tussen deze SNP en fibrose na RT (46). Daarentegen werd geen associatie gevonden met het optreden van laattijdige neveneffecten bij onder andere borstkanker en prostaatkanker (47, 48). 4. Probleem- en doelstelling Het doel van het eerste luik van deze masterproef bestond erin om de prognostische waarde van HPV-status samen met een panel van tumorbiomerkers (aantal TILs, expressie van PD-1/PDL1 en Foxp3) te bestuderen. Dit onderzoek kadert in een multicentrische studie bestaande uit een samenwerkingsverband tussen het Universitair Ziekenhuis (UZ) Gent en het Maastricht University Medical Center. Wegens administratieve redenen kon er nog niet gestart worden met de bepaling van de geselecteerde biomerkers. Bijgevolg beperkt dit luik zich tot het bepalen 13 van de tumor HPV-status en het valideren van deze en andere prognostische merkers in orofaryngeale kanker. In het tweede luik werd nagegaan of er een associatie is tussen de eerder vermelde SNPs en het optreden van late dysfagie bij hoofd- en halskankerpatiënten. Hierbij werden klinische karakteristieken, behandelingsparameters en dosis-volume effecten beschouwd. Aangezien late neveneffecten van een behandeling een grote negatieve impact kunnen hebben op de levenskwaliteit van de patiënt, is het belangrijk patiënten met een verhoogd risico op deze neveneffecten te identificeren. 14 Materiaal en methoden 1. Patiëntenpopulatie Voor het eerste luik van deze studie (prognose) werd enkel gewerkt met stalen van patiënten die curatief behandeld zijn voor orofaryngeale kanker in de periode 2004 tot 2012. Een vorige studie van de onderzoeksgroep includeerde reeds 63 patiënten (12). Deze studiepopulatie werd uitgebreid met 46 patiënten, waarvoor de nodige data opgezocht werd in databanken van de dienst Pathologie en van de dienst Radiotherapie van het UZ Gent. Patiënten die behandeld zijn met brachytherapie en/of cetuximab werden niet geïncludeerd. Ook moeten de patiënten de volledige RT dosis ontvangen hebben. Patiënten met een voorgeschiedenis van hoofd- en halskanker werden geëxcludeerd, tenzij deze enkel chirurgisch behandeld werden. Paraffineingebed tumormateriaal werd beschikbaar gesteld door de dienst Pathologie van het UZ Gent. Klinische data, behandelingsdata en outcome data van de patiënten werd via de dienst Radiotherapie van het UZ Gent bekomen. De studiepopulatie voor het tweede luik (late radiotoxiciteit) bestaat uit 288 hoofd- en halskankerpatiënten behandeld met radiotherapie tussen januari 2004 en april 2013. Het merendeel van deze patiënten (n=150) maakte deel uit van de radiogenomics studie in hoofden halskanker (Gent), terwijl stalen van 138 patiënten verzameld werden in het kader van de multicentrische dosis de-escalatiestudie1 (DD-studie). Laatstgenoemde gebeurde in samenwerking met de radiotherapeutische afdeling van het UZ Gent, UZ Leuven, UZ Antwerpen, CMSE Namen en UZ Brussel. Patiënten die binnen de zes maand na RT overlijden, hervallen of verloren gaan uit follow-up werden geëxcludeerd. Ook de patiënten waarvan geen toxiciteitsdata beschikbaar was, worden niet geïncludeerd. Klinische data, behandelingsdata, dosis-volume data en toxiciteitsdata werd via de dienst Radiotherapie van het UZ Gent en via de datamanager van de DD-studie bekomen. 2. HPV-status bepaling Er bestaan verschillende methoden om de tumor HPV-status te bepalen, waaronder Chromogenic In Situ Hybridisatie, p16-Immunohistochemie en Polymerase Chain Reaction. Het bepalen van de HPV-status werd in samenwerking met de dienst Pathologie van het UZ Gent uitgevoerd. 1 Dose de-escalation to the elective nodal sites, the swallowing apparatus and neck soft tissues for head and neck cancer: multicentre, randomized phase III trial using image-guided intensity-modulated radiotherapy (IG-IMRT) 15 2.1 Chromogene In Situ Hybridisatie Chromogene In Situ Hybridisatie (CISH) wordt gebruikt om een specifieke DNA sequentie in een weefsel aan te tonen, aan de hand van een gelabelde complementaire DNA sequentie (in dit geval wordt een probe voor high risk HPV DNA gebruikt). Dit gebeurt door middel van peroxidase of alkaline fosfatase reacties. Deze reacties kunnen gevisualiseerd worden met een standaard lichtmicroscoop. De stalen waarbij donkerblauwe kernkleuringen in de tumorcellen aanwezig zijn, worden als positief beschouwd. CISH gebeurt op automatische wijze aan de hand van een BenchMark XT (Ventana Medical Systems) toestel. CISH wordt uitgevoerd op paraffine coupes met een dikte van 5 μm. Op elke glaasje is een positieve controle aanwezig. Er wordt gestart door de glaasjes op te warmen (tot 75˚C) en gedurende 4 min. te incuberen. Na incubatie wordt EZ prep buffer toegevoegd en opnieuw verwijderd. Na de derde maal wordt ook liquid coverslip (LCS) toegevoegd. De glaasjes worden opnieuw opgewarmd (tot 76˚C), er wordt gedurende 4 min. geïncubeerd. Hierna wordt de glaasjesverwarming uitgeschakeld en volgt een spoeling. Deze spoeling gebeurt door 900 μl SSC buffer toe te voegen. Vervolgens wordt cell conditioning solution 2 toegevoegd en worden de glaasjes opgewarmd tot 90˚C. Na 8 min. wordt opnieuw LCS toegevoegd en wordt de glaasjesverwarming gedurende 4 min. uitgeschakeld. De glaasjes worden herhaaldelijk gespoeld met reaction buffer waarna ze worden opgewarmd tot 37˚C. Na 4 min. wordt een druppel ISH-protease 3 toegevoegd en er wordt gedurende 4 min. geïncubeerd. Hierna wordt een druppel iview HybReady toegevoegd, ook met een incubatietijd van 4 min. Er worden twee druppels HPV III Fam16(B) toegevoegd. Na 4 min. worden de glaasjes opgewarmd tot 95˚C gedurende 12 min. Dit wordt gevolgd door een incubatietijd van 4 min. op 52˚C. Er wordt opnieuw LCS aangebracht, dit wordt gedurende 2 uur geïncubeerd. Vervolgens wordt er gespoeld met rinse buffer en geïncubeerd op 72˚C. De glaasjes worden opnieuw gespoeld met reaction buffer en ze worden opgewarmd tot 37˚C. Er wordt 1 druppel iview anti-DNP toegevoegd (incubatietijd 20 min.), 1 druppel iview amp (8 min.), 1 druppel iview biotin-Ig (12 min.), 1 druppel iview SA-AP (8 min.) en 1 druppel iview enhancer (4 min.). Hierna wordt 1 druppel iview NBT en 1 druppel iview BCIP toegevoegd. Er wordt gedurende 24 min. geïncubeerd. Uiteindelijk wordt 1 druppel red counterstain toegevoegd als tegenkleuring. 2.2 p16-Immunohistochemie Immunohistochemie (IHC) is een techniek gebruikt voor het lokaliseren van specifieke antigenen aan de hand van specifieke antilichamen (AL). In dit geval worden AL gebruikt die 16 specifiek gericht zijn tegen p16 INK4a. p16 is gecorreleerd met de aanwezigheid van HPVinfectie want p16 wordt geïnduceerd als gevolg van degradatie van pRb door het HPVoncoproteïne E7. De stalen worden als positief beschouwd bij aanwezigheid van een bruine nucleaire en cytoplasmatische kleuring in meer dan 70% van de tumorcellen. p16-IHC gebeurt op automatische wijze aan de hand van een BenchMark XT (Ventana Medical Systems) toestel. p16-IHC wordt uitgevoerd op paraffine coupes met een dikte van 1,5 μm. Op elk glaasje is een positieve controle aanwezig. Er wordt gestart door de glaasjes op te warmen tot 75˚C en gedurende 4 min. te incuberen. Hierna wordt EZ prep buffer toegevoegd en opnieuw verwijderd. Na de derde maal wordt ook LCS toegevoegd. De glaasje worden opnieuw opgewarmd (tot 76˚C) en er wordt gedurende 4 min. geïncubeerd. Hierna volgt een spoeling en wordt cell conditioning solution 1 toegevoegd. Vervolgens worden de glaasjes opgewarmd tot 100˚C. Na 4 min. wordt opnieuw LCS toegevoegd en wordt de glaasjesverwarming uitgeschakeld. Na 8 min. worden de glaasjes herhaaldelijk gespoeld met reaction buffer waarna ze worden opgewarmd tot 37˚C en er wordt gedurende 4 min. geïncubeerd. Er wordt 1 druppel iview inhibitor toegevoegd met een incubatietijd van 4 min. Vervolgens wordt 100 μl van het antilichaam p16 aangebracht en er wordt gedurende 32 min. geïncubeerd. Achtereenvolgens wordt, rekening gehouden met de incubatietijd, 1 druppel iview Biotinylated Ig (8 min.), 1 druppel iview SA-HRP (8 min.), 1 druppel iview DAB en 1 druppel iview H2O2 (8 min.), 1 druppel iview Copper (4 min.) en 1 druppel Haematoxyline (2 min.) toegevoegd. Uiteindelijk wordt 1 druppel Bluing Reagent (2 min.) toegevoegd als tegenkleuring. 3. DNA purificatie uit humaan bloed Om de cellen te lyseren wordt 3 ml vol bloed toegevoegd aan 9 ml RBC lyse (Qiagen Sciences), dit gebeurt in 15 ml buisjes. De buisjes worden enkele malen omgekeerd en er wordt gedurende 5 min. geïncubeerd op kamertemperatuur (KT). Na centrifugatie (5 min. aan 2000xg) (Eppendorf Centrifuge 5804) wordt het supernatans verwijderd, waarna 200 µl vloeistof overblijft. De buisjes worden hevig gevortext om de cellen opnieuw op te lossen in de resterende vloeistof. Er wordt 3 ml cellyse oplossing toegevoegd waarbij opnieuw gevortext wordt. Na deze stap kan het protocol onderbroken worden en kan de oplossing gedurende 2 jaar op KT bewaard worden. De proteïne precipitatie wordt gestart door 1 ml proteïne precipitatie buffer (Qiagen Sciences) aan het cellysaat toe te voegen, waarna de buisjes gedurende 20 sec. gevortext worden. Na 10 min. incubatie op ijs, gevolgd door centrifugatie (5 min. aan 2000xg), vormen de neergeslagen eiwitten een donkerbruin pellet. Het supernatans wordt overgegoten in 17 een 15 ml buisje dat 3 ml 100% isopropanol (VWR) bevat. De buisjes worden omgedraaid totdat de DNA draden zichtbaar worden. Na centrifugatie (3 min. aan 2000xg) wordt het supernatans afgegoten. Er wordt 3 ml 70% ethanol (Sigma-Aldrich) toegevoegd en de buisjes worden enkele malen omgekeerd, dit om het DNA pellet te wassen. Er wordt gecentrifugeerd (1 min. aan 2000xg) en het supernatans wordt opnieuw afgegoten. De resterende vloeistof wordt afgepipetteerd, zodat enkel het pellet overblijft, en de buisjes worden gedurende 10 min. aan de lucht gedroogd. Tenslotte wordt 500 µl DNA hydratie oplossing (Qiagen Sciences) toegevoegd en worden de buisjes gedurende 5 sec. zacht gevortext. Er wordt eerst 1 uur geïncubeerd op 65°C en daarna overnacht op KT. Hierna worden de buisjes kort gecentrifugeerd en wordt de DNA oplossing overgebracht in 1,5 ml buisjes. Deze worden bewaard op 4°C/-20°C. 4. Concentratie- en kwaliteitsbepaling van het DNA De concentratie en kwaliteit van het geïsoleerd DNA wordt bepaald met behulp van de Trinean DropSense-96 Multichannel fotospectrometer, deze is beschikbaar op de afdeling Medische Genetica van het UZ Gent. Deze fotospectrometer bepaalt de absorptie van UVstralen om vervolgens de concentratie (ng/µl) af te leiden. De kwaliteit wordt bepaald door de verhouding van de absorptie bij 260 en 280 nm, deze waarde moet tussen 1,8 en 2,0 liggen. Hierna wordt deze DNA stockoplossing verdund naar een werkoplossing met een concentratie van 25 ng/µl. Deze verdunning gebeurt door toevoegen van een bepaalde hoeveelheid Tris-EDTA (TE) buffer, afhankelijk van de concentratie van de DNA stockoplossing. 5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 5.1 Principe PCR wordt gebruikt om een bepaald DNA fragment te amplificeren voor verdere analyse, dit gebeurt met behulp van een specifiek primerpaar. Deze techniek is gebaseerd op een thermische cyclus, bestaande uit verschillende fasen van opwarming en afkoeling om het DNA te denatureren en enzymatisch te repliceren. De thermische cyclus van het algemeen PCRprogramma bestaat uit drie stappen: denaturatie, annealing en elongatie. In de denaturatiestap wordt de temperatuur verhoogd tot 95°C, hierdoor denatureert het DNA. Tijdens de annealing stap wordt de temperatuur verlaagd tot de hybridisatietemperatuur (Ta), deze temperatuur is afhankelijk van de base samenstelling van de gebruikte primers. Door deze verlaging in temperatuur binden de primers aan hun complementaire regio op het enkelstrengig DNA. In de elongatiestap wordt de temperatuur opnieuw verhoogd tot 72°C. Tijdens deze laatste stap zal het Taq-polymerase deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTPs) inbouwen aan de template streng om zo een complementaire streng te synthetiseren. Deze drie stappen worden 35 maal herhaald, 18 wat resulteert in de amplificatie van het gewenste DNA fragment. Bij een touchdown programma wordt de thermische cyclus opgesplitst, bij de eerste 12 cycli neemt de Ta elke cyclus met 1°C af. De volgende 24 cycli gaan door met een Ta die 12°C lager ligt dan de oorspronkelijke Ta. Beide programma’s worden weergegeven in tabel 1. Het Bio-rad c1000TM Thermal Cycler PCR toestel en het GeneAmp®PCR Systeem 2700 van Applied Biosystems werden hiervoor gebruikt. Tabel 1. PCR programma's ALGEMEEN PROGRAMMA 95°C TOUCHDOWN PROGRAMMA 5 min. 94°C 95°C 30 sec. 94°C Ta 30 sec. 72°C 30 sec. 72°C 10 min. 15°C 10 min. 35 cycli Ta -1°C per cyclus 2 min. 20 sec. 15 sec. 72°C 1 min. 94°C 40 sec. Ta – 12°C 40 sec. 72°C 30 sec. 72°C 10 min. 15°C 10 min. 12 cycli 24 cycli 5.2 Mix Er wordt gebruik gemaakt van een standaard PCR mix, weergegeven in tabel 2, met een eindvolume van 15 µl. Om contaminatie na te gaan wordt ook een negatieve controle mee geanalyseerd. Als negatieve controle wordt 3 µl gedistilleerd water (dH2O, Sigma) toegevoegd in plaats van 3 µl DNA. Tabel 2. Standaard PCR mix Product dNTP mix (Kapa Biosystems) Buffer (Kapa Biosystems) MgCl2 (Kapa Biosystems) Forward primer (IDT) Reverse primer (IDT) Taq (Kapa Biosystems) DNA dH2O (Sigma) Totaalvolume Concentratie 1 mM 5X 25 mM 50 µM 50 µM 0,6 U 25 ng/µl - Volume 3 µl 3 µl 0,9 µl 0,3 µl 0,3 µl 0.07 µl 3 µl 4,43 µl 15 µl 19 5.3 Primers De primers gebruikt voor HSPB1 rs2868371 G>C, MDM2 rs2279744 T>G, TNFα rs1800629 G>A en TGFβ1 rs1800469 C>T zijn reeds beschikbaar op de dienst Medische Fysica. Enkel voor TXNRD2 rs1139793 G>A moeten de primers nog ontwikkeld worden. Deze primers moeten aan een aantal voorwaarden voldoen. Er wordt getracht een primer te zoeken van ongeveer 20 nucleotiden (nt). De forward primer (FWD) eindigt en de reverse primer (REV) begint preferentieel met een G of C. Herhalingen van drie of meer dezelfde nucleotiden wordt best vermeden om lusvorming te voorkomen. De smelttemperatuur (Tm) van FWD en REV zijn best gelijk aan elkaar, waarbij Tm = [(#T/A x2) + (#G/C x4)]. De referentie sequentie van het gen waarin de SNP ligt, is terug te vinden via Ensembl (49) of NCBI (50). In de sequentie kan de locatie van de SNP teruggevonden worden via de rs-code. Voor RFLP is een DNA fragment van 600-800 nucleotiden ideaal, terwijl voor HRM best een kleiner fragment van 100200 nucleotiden gebruikt wordt. De primers kunnen getest worden aan de hand van het programma In Silico PCR, via UCSC Genome Bioinformatics (51). Als alternatief voor het manueel zoeken van primers kan ook gebruik gemaakt worden van het programma Primer3Plus (52). De primers worden in poedervorm geleverd door Integrated DNA Technologies (IDT). Voor gebruik bij RFLP worden de geleverde primers op een concentratie van 250 µM gebracht, door het toevoegen van een bepaalde hoeveelheid TE buffer (10 mM). Er wordt een werkoplossing van 50 µM gemaakt door de stockoplossing van 250 µM vijf maal te verdunnen. Voor HRM wordt een stockoplossing van 100 µM gemaakt en hieruit een werkoplossing van 5 µM. In tabel 3 wordt een overzicht van de gebruikte primers weergegeven. Tabel 3. PCR primers SNP TXNRD2 rs1139793 G>A HSPB1 rs2868371 G>C MDM2 rs2279744 T>G TNFα rs1800629 G>A TGFβ1 rs1800469 C>T Nummer 544 545 358 359 369 370 435 436 39 40 Sequentie 5’-GGACATGGTGCTGACGTGG-3’ 5’-TCAGATCTGAGGACCCGCC-3’ 5’-GGCTGTGGTGAGCTGGATTG-3’ 5’-CCTTGGCTCAAGTGCTCCTC-3’ 5’-GCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3’ 5'-CACACTAGTGACCCGACAGG-3’ 5’-AGGAAACAGACCACAGACCTGG-3’ 5’-CCACTGACTGATTTGTGTGTAGG-3’ 5'–GCAGTTGGCGAGAACAGTTG-3’ 5’-TGGGTCACCAGAGAAAGAGG-3’ Lengte 19 nt 19 nt 20 nt 20 nt 19 nt 20 nt 22 nt 23 nt 20 nt 20 nt Tm 62°C 62°C 62°C 62°C 60°C 64°C 66°C 66°C 60°C 60°C 5.4 Controle Om na te gaan of de PCR reactie gelukt is wordt een gelelektroferese uitgevoerd. Hiervoor wordt een 1,5% agarosegel gemaakt door 1,5 g agarose (Sigma) aan 100 ml Tris Boraat EDTA (TBE) buffer (0,5X) toe te voegen. Dit wordt opgekookt in de microgolf tot de vloeistof 20 volledig helder is. Vervolgens wordt de vloeistof in de voorziene houder gegoten, in deze houder zitten kammetjes die de lanen zullen vormen. Voor een stockoplossing TBE buffer (10X) wordt 54 g Tris; 27,5 g Boraat en 4,65 g EDTA2Na opgelost in 500 ml dH2O. Deze stockoplossing wordt 20 keer verdund met dH2O om de werkoplossing (0,5X) te krijgen. Na 30 min. drogen kunnen de stalen op de gel geladen worden. In het eerste laantje wordt 1 µl DNAladder (BioLabs) geladen, om de grootte van de bekomen fragmenten te bepalen. In de overige laantjes worden de stalen en de negatieve controle geladen door een mix van 1,5 µl ladingsbuffer (500 μl glycerol met 250 μl broomfenolblauw 1% in 250 μl dH2O), 2 µl PCR product en 6,5 µl dH2O. Het elektroforesetoestel (Cosmo Bio) wordt ingesteld op 135 V voor 30 min., nadien wordt de gel gedurende 20 min. gekleurd in een Ethidiumbromide-bad (EtBr) (0,5 µg/ml). Vervolgens wordt het resultaat bekeken door de gel op een UV-plaat (UVTransilluminator, UVP) te leggen. Als het bandje op de verwachte plaats zichtbaar is en als de controle negatief is, is de PCR reactie gelukt. Ook mogen er geen aspecifieke bandjes zichtbaar zijn. Er wordt telkens een foto van het resultaat gemaakt. 6. SNP bepaling 6.1 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Bij RFLP wordt het geamplificeerd DNA fragment verknipt door incubatie met een specifiek restrictie-enzym (RE). Dit RE herkent en knipt een specifieke DNA sequentie waardoor fragmenten met verschillende lengte, afhankelijk van het genotype, verkregen worden. Selectie van het RE gebeurt met behulp van RestrictionMapper (53). Invoeren van de sequentie van het DNA fragment geeft de mogelijke REs die ter hoogte van de SNP knippen. Voor RFLP wordt een mix gebruikt bestaande uit PCR product, RE en enzym-specifieke buffer (10% van het totaalvolume, BioLabs). Dit wordt aangelengd met dH2O tot een eindvolume van 30 µl. De epjes worden in een warmwaterbad (Fisher Scientific) geplaatst gedurende een periode en op een temperatuur afhankelijk van het RE. Na deze incubatie kunnen de fragmenten van elkaar gescheiden worden met behulp van gelelektroforese. Er wordt gebruik gemaakt van een 2% agarosegel, hiervoor wordt 2 g agarose toegevoegd aan 100 ml TBE buffer (0,5X). Opnieuw wordt in het eerste laantje 1 µl DNA-ladder geladen. Daarnaast wordt als controle ongeknipt PCR product (1,5 µl ladingsbuffer, 2 µl ongeknipt PCR product en 6,5 µl dH2O) op de gel geladen. In de overige laantjes wordt het digest product geladen (17 µl digest product en 3 µl ladingsbuffer). Het elektroforesetoestel (Cosmo Bio) wordt opnieuw ingesteld op 135 V voor 30 min. Hierna wordt de gel gekleurd met EtBr (0,5 µg/ml) gedurende 20 min. waarna het resultaat bekeken wordt op de UV-plaat (UV-Transilluminator, UPV). Ook hier wordt van elke 21 gel een foto gemaakt. Deze techniek werd gebruikt bij de genotypering van HSPB1 rs2868371 G>C en bij de genotypering van TGFβ1 rs1800469 C>T. 6.2 High Resolution Melting (HRM) HRM is een snelle methode voor het identificeren van genetische variaties. Het gewenste DNA fragment wordt geamplificeerd in aanwezigheid van een specifieke kleurstof (Meltdoctor HRM dye of Syto 9). Deze kleurstof bindt met het dubbelstrengig DNA en is hierbij sterk fluorescerend. Na amplificatie gebeurt een graduele uitsmelting. Door deze temperatuurstijging denatureert het DNA waarbij de fluorescente kleurstof vrijkomt en gedetecteerd kan worden. Hierdoor wordt een karakteristieke smeltcurve bekomen waaruit de sequentie variatie afgeleid kan worden. Bij HRM wordt standaard gewerkt met een mix van 20 µl, zoals weergegeven in tabel 4. Er wordt gebruik gemaakt van het Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systeem en de Applied Biosystems HRM software v2.0. Tabel 4. HRM mix Product dNTP mix (Applied Biosystems) AmpliTaq Gold® Buffer (Applied Biosystems) MgCl2 (Applied Biosystems) Forward primer (IDT) Reverse primer (IDT) AmpliTag Gold® 360 DNA polymerase (Applied Biosystems) Meltdoctor HRM dye* (Applied Biosystems) DNA dH2O (Sigma) Totaalvolume Concentratie 10 mM 10 X 25 mM 5 µM 5 µM Volume 0,4 µl 2 µl 1,2 µl 1,2 µl 1,2 µl 5 U/µl 0,05 µl 20X 25 ng/µl - 1 µl 1 µl 11,95 µl 20 µl *kan vervangen worden door 0,6 µl Syto 9 (50 µM) (12,35 µl dH2O) De smeltcurve wordt bekomen door fluorescentie (%) uit te zetten in functie van de temperatuur (°C). De vorm van de smeltcurve wordt bepaald door de sequentie. Homozygoten hebben eenzelfde verloop en vorm maar verschillen in smelttemperatuur. Heterozygoten hebben in vergelijking met de homozygoten een andere vorm. Een voorbeeld hiervan wordt weergegeven in figuur 4. 22 Figuur 4. Smeltcurve TNFα rs1800629 G>A 6.3 Kwaliteitscontroles Voor elke SNP wordt de genotypering van ongeveer 15% van de stalen opnieuw uitgevoerd om te controleren of de genotypes correct bepaald zijn. Als er afwijkingen zijn wordt de reeks, waarin de afwijking voorkomt, opnieuw geanalyseerd. 7. Statistische analyse In het eerste luik van deze studie omtrent prognose worden overall survival (OS), disease-free survival (DFS) en disease-specific survival (DSS) op 5 jaar als eindpunten beschouwd. OS wordt gedefinieerd als het verschil in tijd tussen de diagnose en overlijden of laatste follow-up, waarbij geen rekening gehouden wordt met de doodsoorzaak. Bij DSS wordt hetzelfde verschil in tijd gebruikt maar wordt enkel sterfte als gevolg van een ziekte-gerelateerde oorzaak beschouwd. DFS wordt gedefinieerd als het verschil in tijd tussen de einddatum van RT en het optreden van herval (lokaal, regionaal, metastase) of laatste follow-up. De associatie van deze eindpunten met patiëntgerelateerde en klinische factoren werd geanalyseerd met behulp van de Kaplan-Meier analyse, waarbij vergelijking door middel van de log-rank test gebeurt. Associatie tussen deze factoren en de tumor HPV-status werd uitgevoerd aan de hand van de Chi-kwadraat analyse. Een p<0,05 wordt als statistisch significant gezien. De analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS Statistics v.22. In het tweede luik, betreffende late radiotoxiciteit, wordt het optreden van late dysfagie na RT als eindpunt beschouwd. Het eindpunt werd gedichotomiseerd op twee manieren. Bij de eerste aanpak (= event I) wordt ernstige dysfagie beschouwd als het minstens eenmaal optreden van dysfagie graad 2 of hoger. Bij de tweede aanpak (= event II) wordt een event gedefinieerd als minstens tweemaal een graad 2 of eenmaal een graad 3, waarbij er minstens twee tijdspunten zijn waarop de toxiciteit gescoord werd. In deze masterproef wordt event I als “late dysfagie” 23 beschouwd en event II als “ernstige dysfagie”. Een univariate analyse met behulp van de Chikwadraat test of de Mann-Whitney U test werd uitgevoerd om na te gaan of er een mogelijke invloed is van patiënt- en dosisgerelateerde parameters op het optreden van late dysfagie. Op eenzelfde manier werd een mogelijke associatie met dosis-volume effecten nagegaan. Om de associatie tussen de SNPs en laattijdige dysfagie te analyseren werd gebruik gemaakt van logistieke regressie, waarbij telkens een odds ratio (OR) en een p-waarde bekomen werd. OR<1 wijst op een beschermend effect terwijl OR>1 op een verhoogd risico duidt. Een p<0,05 wordt als statistisch significant gezien. Om de tijdsafhankelijkheid mee te beschouwen werden ook Kaplan-Meier analyses uitgevoerd. Multivariate logistieke regressie werd toegepast om mogelijke confounding factoren in rekening te brengen. Ook deze analyses werden uitgevoerd door middel van SPSS statistics v.22. 24 Resultaten 1. Prognose Aanvankelijk werd deze studie opgestart als een samenwerking tussen het UZ Gent/UGent en het Maastricht University Medical Center. Wegens administratieve redenen was het voor deze masterproef niet mogelijk om de vooropgestelde biomerkers te bepalen. Hierdoor wordt voor het luik over prognose enkel gewerkt met data afkomstig van het UZ Gent. 1.1 Patiënt- en behandelingskarakteristieken De meerderheid van de patiënten in deze studiepopulatie is mannelijk (78,9%) en de gemiddelde leeftijd is 58,2 jaar. Ongeveer 88% is of was tabaksgebruiker waarvan 75,8% met meer dan 10 pak-jaren. Het aantal pak-jaren wordt berekend aan de hand van deze formule: (aantal sigaretten per dag/20) x aantal jaren. Het merendeel van de patiënten werd behandeld met IMRT (90,8%). Een overzicht van de patiënt- en behandelingskarakteristieken wordt weergegeven in tabel 5. Tabel 5. Patiënt- en behandelingskarakteristieken (prognose) Geslacht man vrouw Leeftijd (jaren) mediaan bereik Type roken never ever missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never ever missing Drinks/week <10 ≥10 missing Subsite tumor tonsil andere T-stage 1-2 3-4 Aantal (n=109) % 86 23 78,9 21,1 58,0 37,2-77,9 - 12 87 10 12,1 87,9 22 69 18 24,2 75,8 11 88 10 11,1 88,9 34 62 13 35,4 64,6 49 60 45,0 55,0 58 51 53,2 46,8 25 Vervolg tabel 5. Patiënt karakteristieken (prognose) N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing HPV-status positief negatief Behandeling RT RT+ChTa RT+Chirurgie RT+ChTa+Chirurgie Type RT IMRT 3DRT Totale tumordosis (Gy) mediaan bereik Dosis/fractie (Gy) mediaan bereik OTTb (dagen) mediaan bereik achemotherapie, boverall 39 67 3 36,8 63,2 25 84 22,9 77,1 34 56 12 7 31,2 51,4 11,0 6,4 99 10 90,8 9,2 69,00 66,0-86,0 - 2,16 2,0-2,7 - 45,0 28,0-61,0 - treatment time 1.2 Bepaling van de tumor HPV-status De HPV-status werd bepaald met behulp van CISH en p16-IHC. Ongeveer 23% van de stalen waarvoor de CISH-techniek werd toegepast wordt als HPV-positief bevonden. Na bepaling door p16-IHC wordt 32,1% van de stalen als positief bevonden. Van de 35 stalen die positief zijn voor p16 worden 10 stalen negatief bevonden door CISH; 28,6% is dus vals-positief. 1.3 Associatie van overleving met patiëntgerelateerde en klinische factoren Voor deze analyse werden volgende variabelen onderzocht: geslacht, leeftijd, tabaksgebruik, alcoholconsumptie, subsite van de tumor, T-stage, N-stage, HPV-status, chemotherapie, chirurgie, type RT, totale tumordosis, dosis per fractie en behandelingsduur. De variabelen die statistische significantie vertonen met OS, DFS en DSS worden weergegeven in tabel 6. Het aantal pak-jaren (≤10 vs. >10) vertoont een significante associatie met overleving (p=0,006, p=0,019, p=0,014 voor OS, DFS en DSS, respectievelijk). Ook voor het aantal drinks/week wordt een significante associatie gevonden. Patiënten die minder dan 10 drinks/week nuttigen, vertonen een betere OS, DFS en DSS (p=0,007, p=0,005, p<0,001, respectievelijk). Deze patiënten hebben een 5 jaar DSS van 93% vergeleken met 54% voor de patiënten die minstens 10 drinks/week nuttigen. Orofaryngeale kankerpatiënten met een tonsiltumor hebben een 26 hogere OS en DSS (58,0% vs. 34,6% voor OS, p=0,030, p=0,036, respectievelijk). Patiënten met een N2b/2c/3 tumor vertonen ook een slechtere OS en DSS (p=0,005, p=0,008, respectievelijk). Zoals verwacht is er een significante associatie tussen tumor HPV-status en overleving, patiënten met HPV-positieve tumoren hebben een betere OS, DFS en DSS (p=0,001, p=0,014, p=0,004, respectievelijk). Figuur 5 toont de overlevingscurve voor OS in functie van het aantal pak-jaren en de HPVstatus. Figuur 5. A: associatie tussen aantal pak-jaren (≤10, blauwe lijn vs. >10, groene lijn) en OS. B: associatie tussen HPV-status (negatief, blauwe lijn vs. positief, groene lijn) en OS. Er werden geen significante associaties gevonden voor de overige variabelen, de resultaten hiervan zijn terug te vinden in bijlage B. 27 Tabel 6. Associatie van patiëntgerelateerde en klinische factoren met OS, DFS en DSS Alle (n=109) Pack-years ≤10 >10 missing Drinks/week <10 ≥10 missing Subsite tumor tonsil andere N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing HPV-status positive negative 22 69 18 Overall survival 5 jaar sterfte % overleving 5 40 72,3 37,4 Disease-free survival 5 jaar p-waarde 0,006 sterfte % overleving 2 22 90,2 62,4 0,007 34 62 13 10 37 60,2 37,4 19 36 4 22 58,0 34,6 83,3 60,1 13 41 62,7 34,0 25 84 5 50 75,1 35,9 % overleving 2 25 89,7 59,5 11 20 2 26 73,6 62,6 93,0 53,9 0,036 10 23 77,2 57,5 0,075 7 21 81,7 64,0 3 28 87,2 60,8 0,001 p-waarde 0,014 <0,001 0,118 0,005 39 67 3 sterfte 0,005 0,030 49 60 p-waarde 0,019 Disease-specific survival 5 jaar 0,008 6 26 84,2 55,7 2 31 90,2 58,9 0,014 0,004 p-waarden werden bekomen via de Kaplan-Meier analyse 28 1.4 Associatie van tumor HPV-status met patiëntgerelateerde en klinische factoren Bij deze analyse worden de patiënten ingedeeld in twee groepen naargelang tumor HPV-status. Voor enkele variabelen werd een statistisch significante associatie gevonden met de HPVstatus, deze worden weergegeven in tabel 7. De HPV prevalentie in deze studiepopulatie is 22,9%. Patiënten met HPV-positieve tumoren hebben een lager tabaksgebruik (≤10 pak-jaren: 88,6% vs. 33,3%, p<0,001) en een lagere alcoholconsumptie (<10 drinks/week: 76,0% vs. 23,8%, p<0,001). Ook is er een significante associatie met een betere OS, DFS en DSS. Zo hebben HPV-positieve patiënten een duidelijk betere OS, zowel op 2 jaar (100% vs. 58,3%, p <0,001) als op 5 jaar (75,1% vs. 35,9%, p=0,001). Een opmerkelijke vaststelling is dat de meerderheid van de HPV-positieve patiënten eerder een gecombineerde behandeling kreeg dan enkel RT (p=0,004). Tabel 7. Associatie van patiëntgerelateerde en klinische factoren met tumor HPV-status HPV-negatief (n=84) aantal % Type roken never ever missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never ever missing Drinks/week <10 ≥10 missing Enkel RT no yes Overall survival 2jaar 5jaar Disease-free survival 2jaar 5jaar Disease-specific survival 2jaar 5jaar 5 73 6 6,4 93,6 HPV-positief (n=25) aantal % 7 14 4 p-waarde 0,001 33,3 66,7 <0,001 8 62 14 11,4 88,6 14 7 4 66,7 33,3 <0,001 4 73 7 5,2 94,8 7 15 3 31,8 68,2 18 57 9 24,0 76,0 16 5 4 76,2 23,8 52 32 61,9 38,1 23 2 92,0 8,0 - 58,3 35,9 - 100 75,1 <0,001 0,001 - 65,5 60,8 - 91,8 87,2 0,011 0,014 - 67,8 58,9 - 100 90,2 0,002 0,004 <0,001 0,004 p-waarden werden bekomen via de Chi-kwadraat analyse, met uitzondering van de OS, DDS en DSS die via de Kaplan-Meier analyse bekomen werden Voor de overige variabelen werden geen significante associaties gevonden, een overzicht van deze resultaten kan teruggevonden worden in bijlage B. 29 2. Late radiotoxiciteit 2.1 Optimalisatie protocols De protocols voor de genotypering van MDM2 rs2279744 T>G, TNFα rs1800629 G>A en TGFβ1 rs1800469 C>T werden reeds geoptimaliseerd binnen de onderzoeksgroep en zijn terug te vinden in bijlage C (RFLP) en D (HRM). 2.1.1 HSPB1 rs2868371 G>C Dit protocol was reeds geoptimaliseerd binnen de onderzoeksgroep met een standaard PCR mix op een algemeen programma van 62°C. Wanneer dit getest werd, bleek er een duidelijke aanwezigheid van aspecifieke bindingen te zijn. Hierdoor werd opnieuw getest op een touchdown programma van 66°C, waarna een bandje werd teruggevonden op 870nt zonder aspecifieke bindingen. De gebruikte primers kunnen worden teruggevonden in tabel 8. Tabel 8. Primers optimalisatie HSPB1 rs2868371 G>C Nummer 358 359 Sequentie 5’-GGCTGTGGTGAGCTGGATTG-3’ 5’-CCTTGGCTCAAGTGCTCCTC-3’ Lengte 20 nt 20 nt Tm 62°C 62°C Voor de RFLP-reactie was het protocol ook reeds geoptimaliseerd binnen de onderzoeksgroep. Er werd gebruik gemaakt van het MboII enzym. Wanneer deze RFLP-reactie getest werd, bleek dat de verschillende genotypes duidelijk onderscheiden kunnen worden. Het protocol voor deze SNP kan teruggevonden worden in bijlage C. 2.1.2 TXNRD2 rs1139793 G>A Voor deze SNP werd gekozen voor een genotypering aan de hand van HRM aangezien geen geschikt RE gevonden werd. Er werd gebruik gemaakt van een standaard HRM mix. Ook werden op voorhand enkele stalen gesequeneerd zodat gekende controles beschikbaar zijn. De verschillende mixen en de primers worden weergegeven in tabel 9. Tabel 9. Primers gebruikt bij optimalisatie van TXNRD2 rs1139793 G>A Mix 1 2 3 4 *primer Nummer 542* 543* 542* 545* 544* 545* 544* 543* 540ǂ 541ǂ Sequentie 5’-GGCAAAGGGTGATGGCATAG-3’ 5’-CGTCCTGCTAGAGAACTCAC-3’ 5’-GGCAAAGGGTGATGGCATAG-3’ 5’-TCAGATCTGAGGACCCGCC-3’ 5’-GGACATGGTGCTGACGTGG-3’ 5’-TCAGATCTGAGGACCCGCC-3’ 5’-GGACATGGTGCTGACGTGG-3’ 5’-CGTCCTGCTAGAGAACTCAC-3’ 5’-CTCAGGAGGACGAGCTCTAG-3’ 5’-AAGCGCACACACACGCATGC-3’ Primerlengte 20 nt 20 nt 20 nt 19 nt 19 nt 19 nt 19 nt 20 nt 20 nt 20 nt Tm 62°C 62°C 62°C 62°C 62°C 62°C 62°C 62°C 64°C 64°C Fragmentlengte 193nt 159nt 122nt 156nt 393nt voor HRM, ǂprimer voor sequenering 30 Voor de optimalisatie werd gebruik gemaakt van een standaard HRM programma op 60°C. Uit het resultaat kon afgeleid worden dat de genotypes het best van elkaar gescheiden worden met mix 3. De smeltpatronen voor de verschillende genotypes worden voorgesteld in figuur 6. Het protocol voor deze SNP kan in bijlage D teruggevonden worden. Figuur 6. Smeltcurve TXNRD2 rs1139793 G>A 2.2 Patiënt- en behandelingskarakteristieken De studiepopulatie voor late radiotoxiciteit bestaat uit 288 patiënten met hoofd- en halskanker. Het merendeel van deze patiënten (n=150) maakte deel uit van de radiogenomics studie in hoofd- en halskanker (Gent), terwijl stalen van 138 patiënten verzameld werden in het kader van de DD-studie. De meerderheid van deze studiepopulatie is mannelijk (82,6%) en de gemiddelde leeftijd is 59,9 jaar. Ongeveer 91% consumeert of consumeerde alcohol en 94% is of was tabaksgebruiker, waarvan 85,9% met meer dan 10 pak-jaren. Late dysfagie (minstens graad 1) komt voor bij 40,5% van de patiënten op 1 jaar en bij 31,3% op 2 jaar. Ernstige late dysfagie (minstens graad 2) komt voor bij 12,9% van de patiënten op 1 jaar en bij 10,4% op 2 jaar. Het merendeel van deze patiënten (52,4%) heeft chemotherapie gekregen, slechts 14,3% van de studiepopulatie heeft chirurgie ondergaan. Deze gegevens worden weergegeven in tabel 10. 31 Tabel 10. Patiënt- en behandelingskarakteristieken (late radiotoxiciteit) Geslacht man vrouw Leeftijd (jaren) mediaan bereik Type roken never former current missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never former current missing Drinks/week <10 ≥10 missing T-stage 1-2 3-4 missing N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing Primary site tumor oral cavity oropharynx larynx hypopharynx CUPa multiple Acute dysfagie 0-1-2 3 missing Prevalentie dysfagie op 1jaar 0 >0 >2 missing Aantal (n=288) % 238 50 82,6 17,4 59,0 33,0-82,0 - 17 160 109 2 5,9 55,9 38,1 39 237 12 14,1 85,9 27 63 195 3 9,5 22,1 68,4 89 179 20 33,2 66,8 117 150 21 43,8 56,2 128 153 7 45,6 54,4 36 106 58 60 22 6 12,5 36,8 20,1 20,8 7,6 2,1 181 101 6 64,2 35,8 69 47 15 22 59,5 40,5 12,9 32 Vervolg tabel 10. Patiënt karakteristieken (late radiotoxiciteit) Chemo no yes Chirurgie no yes missing LNDb no yes Totale tumordosis (Gy) mediaan bereik Dosis/fractie (Gy) mediaan bereik Fractionatieschema daily hybridc OTTd (dagen) mediaan bereik Follow-up periode (maanden) mediaan bereik Baseline dysfagie 0-1-2 3 missing Type studie DD Gent Arm van de DD-studie (n=138) A (experimenteel)e B (standaard) 137 151 47,6 52,4 246 41 1 85,7 14,3 178 110 61,8 38,2 69,12 50,0-81,0 - 2,16 1,65-2,70 - 238 50 82,6 17,4 44,0 28,0-56,0 - 24,0 6,0-36,0 - 272 9 3 96,8 3,2 138 150 47,9 52,1 72 66 52,2 47,8 acancer of unknown primary, blymph node dissection, cfractionatie afhankelijk van deelnemend centrum in de DD-studie , doverall treatment time, elagere dosis 2.3 SNP data Alle SNPs zijn consistent met het Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). De p-waarden voor HWE en ook de MAFs worden weergegeven in tabel 11. Tabel 11. Karakteristieken van de geselecteerde SNPs SNP TXNRD2 rs1139793 G>A HSPB1 rs2868371 G>C MDM2 rs2279744 T>G TNFα rs1800629 G>A TGFβ1 rs1800469 C>T geobserveerde MAF (%) 26,2 23,2 34,6 18,6 28,6 p-waarde (HWE) 0,539 0,522 0,137 0,187 0,161 Wanneer p >0,05 dan consistent met HWE 33 De resultaten van de genotypering kunnen teruggevonden worden in bijlage E. 2.4 Associatiestudie naar het optreden van late dysfagie Het eindpunt voor dit luik van deze masterproef is het optreden van late dysfagie bij patiënten met hoofd- en halskanker. De patiëntpopulatie voor deze analyse bestaat uit 284 patiënten doordat voor enkele patiënten geen toxiciteitsdata beschikbaar was. Voor de analyses werden deze patiënten opgedeeld in twee groepen. Bij event I wordt dysfagie beschouwd als het ten minste eenmaal optreden van een graad 2 of hoger. Bij event II wordt een event gedefinieerd als minstens tweemaal een graad 2 of eenmaal een graad 3, waarbij er ten minste twee tijdspunten zijn waarop de toxiciteit gescoord werd. In deze masterproef wordt event I als “late dysfagie” beschouwd en event II als “ernstige dysfagie”. 2.4.1 Associatie met patiëntgerelateerde en klinische factoren De variabelen gebruikt voor deze analyse werden eerder al weergegeven in tabel 10. Voor enkele variabelen werd een statistisch significante associatie gevonden met event I en event II, deze worden weergegeven in tabel 12 en 13, respectievelijk. Voor T-stage (T1/2 vs. T3/4) werd een associatie gevonden met zowel event I (p=0,060) als event II (p=0,004). Ook voor acute dysfagie (graad 0/1/2 vs. 3) werd met beide events een significante associatie gevonden (p<0,001, p=0,006, respectievelijk). Het optreden van acute dysfagie kan dus als predictief beschouwd worden voor het optreden van late dysfagie. Een associatie met het aantal pak-jaren (≤10 vs. >10) werd uitsluitend voor event I gevonden (p=0,041). Een associatie met het verschil in studie (DD vs. Gent) werd enkel voor event II gevonden (p=0,045). In de DD-studie werd een significante associatie met de arm van de studie gevonden (p=0,004). Patiënten die in deze studie een lagere dosis (experimentele arm A) kregen hebben een lager risico op late dysfagie. Inzake de behandelingsgerelateerde parameters werd enkel voor de totale tumordosis een significante associatie gevonden met event I (p=0,016). Na Kaplan-Meier analyse worden de gevonden significante associaties sterker, uitgezonderd de associatie tussen event II en type studie. De gevonden significante associaties worden als confounding factoren beschouwd zodat deze in rekening gebracht kunnen worden bij de multivariate analyse van de geselecteerde SNPs. 34 Tabel 12. Associatie van patiëntgerelateerde en klinische factoren met event I EVENT I Pack-years ≤10 >10 missing T-stage 1-2 3-4 missing Acute dysfagie 0-1-2 3 missing Totale tumordosis (Gy) gemiddelde standaarddeviatie mediaan bereik Type studie DD Gent Arm van de DD-studie (n=138) A (experimenteel)b B (standaard) a Alle (n=284) n=209 % n=75 % 39 233 12 34 167 8 87,2 71,7 5 66 4 12,8 28,3 0 1 116 147 21 91 100 18 78,4 68,0 25 47 3 21,6 32,0 181 101 2 147 61 1 81,2 60,4 34 40 1 18,8 39,6 69,60 3,21 69,12 50,0-81,0 69,24 3,09 69,12 50,0-81,0 - 70,69 3,33 69,12 66,0-81,0 - 138 146 105 104 72 66 76,1 71,2 62 43 33 42 86,1 65,2 p-waarde 0,041 p-waardea 0,036 0,060 0,039 <0,001 <0,001 0,016 - 0,354 0,487 0,004 0,005 p-waarde 0,004 p-waardea 0,003 0,006 0,002 0,045 0,071 23,9 28,8 10 23 13,9 34,8 p-waarde na Kaplan-Meier analyse, blagere dosis Tabel 13. Associatie van patiëntgerelateerde en klinische factoren met event II EVENT II T-stage 1-2 3-4 missing Acute dysfagie 0-1-2 3 missing Type studie DD Gent a Alle (n=284) n=243 % n=41 % 116 147 21 107 117 19 92,2 79,6 9 30 2 7,8 20,4 181 101 2 163 79 1 90,1 78,2 18 22 1 9,9 21,8 138 146 124 119 89,9 81,5 14 27 10,1 18,5 0 1 p-waarde na Kaplan-Meier analyse Voor de overige variabelen werden geen significante associaties gevonden, een overzicht van deze resultaten kan teruggevonden worden in bijlage F. 35 Deze analyse werd herhaald op een studiepopulatie van 249 patiënten. Deze populatie werd bekomen door patiënten die slechts éénmaal een toxiciteitsscore kregen te excluderen. De resultaten hiervan liggen in eenzelfde lijn als deze hierboven beschreven. 2.4.2 Associatie met dosis-volume waarden De volgende parameters werden beschouwd: Dmax, V20 en V50, op de superior, middle en inferior faryngeale constrictor (SPC, MPC en IPC, respectievelijk) en de slokdarm. De dosisvolumewaarden waarbij een significante associatie met late dysfagie gevonden werd, worden weergegeven in tabel 14. De maximale dosis op de slokdarm (p=0,039, p=0,049, respectievelijk) en de V50 van de slokdarm, het volume dat minimaal 50 Gy krijgt (p=0,034, p=0,032, respectievelijk), zijn significant geassocieerd met zowel event I als event II. Ter hoogte van de slokdarm is een hogere dosis en een groter bestraald volume geassocieerd met late dysfagie. Tabel 14. Associatie van dosis-volume waarden van de slokdarm met event I en event II SLOKDARM 0 Event I 1 Dmax (Gy) gemiddelde SDa mediaan bereik missing V50 (%) gemiddelde SDa mediaan bereik missing 53,73 13,90 56,90 1,75-76,34 42 57,89 11,85 58,25 19,58-74,88 11 41,44 41,74 28,39 0,00-100,00 45 p-waarde 0,039 0 Event II 1 54,21 13,83 56;82 1,75-76,34 45 58,98 10,49 59,21 35,80-74,88 8 48,78 44,46 68,02 41,48 42,18 25,56 56,21 43,91 76,00 0,00-100,00 14 0,00-100,00 50 0,00-100,00 9 p-waarde 0,049 0,034 0,032 aStandaarddeviatie In bijlage F kan een overzicht gevonden worden van alle resultaten van deze analyse. 2.4.3 Associatie met de geselecteerde SNPs De associatie met late dysfagie werd in totaal nagegaan voor vijf SNPs. Enkel voor TNFα rs1800629 G>A werd een significante associatie gevonden met het optreden van late dysfagie. Deze resultaten worden weergegeven in tabel 15 (voor event I) en in tabel 16 (voor event II). Aanwezigheid van het homozygoot variant genotype (AA) van TNFα rs1800629 G>A is significant geassocieerd met een verhoogd risico op late dysfagie bij event I (OR=3,13, p=0,049). Volgens het recessief model hebben patiënten met twee variante A-allelen een 3,5 36 maal hoger risico op het ontwikkelen van late dysfagie (p=0,027). Na correctie voor confounding factoren was deze associatie nog steeds significant (OR°=3,79, p°-waarde 0,031). Tabel 15. Associatie van TNFα rs1800629 G>A met event I Event I TNFα rs1800629 G>A GG GA AA missing recessief GG+GA AA a n=209 137 61 6 5 198 6 0 % 72,9 81,3 46,2 75,3 46,2 1 n=75 51 14 7 3 65 7 % 27,1 18,7 53,8 24,7 53,8 OR p-waarde 0,62 3,13 0,153 0,049 3,55 0,027 p-waardea 0,009 0,005 p-waarde na Kaplan-Meier analyse Bij event II wordt het risicoverhogend effect van het homozygoot variant genotype van TNFα rs1800629 G>A ook teruggevonden voor het recessief model (OR=2,89, p=0,090). Echter, na correctie voor confouding factoren was deze associatie niet meer significant (OR°=1,85, p°=0,398). Tabel 16. Associatie van TNFα rs1800629 G>A met event II Event II TNFα rs1800629 G>A GG GA AA missing recessief GG+GA AA a n=243 162 66 9 6 228 9 0 % 86,2 88,0 69,2 86,7 69,2 1 n=41 26 9 4 2 35 4 % 13,8 12,0 30,8 13,3 30,8 OR p-waarde 0,85 2,77 0,693 0,110 2,89 0,090 p-waardea 0,103 0,034 p-waarde na Kaplan-Meier analyse Ook voor deze analyse worden de gevonden associaties sterker na Kaplan-Meier analyse. De genotypefrequenties voor TNFα rs1800629 G>A bij event I en event II zijn weergegeven in figuur 7 en 8, respectievelijk. 37 TNFα rs1800629 (recessief) 100,0 100,0 80,0 80,0 60,0 40,0 0 20,0 1 Frequentie (%) Frequentie (%) TNFα rs1800629 0,0 60,0 40,0 0 20,0 1 0,0 GG GA AA GG+GA Genotype Genotype AA Figuur 7. Genotypefrequentie van TNFα rs1800629 G>A bij event I TNFα rs1800629 (recessief) 100,0 100,0 80,0 80,0 60,0 40,0 0 20,0 1 0,0 Frequentie (%) Frequentie (%) TNFα rs1800629 60,0 40,0 0 20,0 1 0,0 GG GA AA Genotype GG+GA AA Genotype Figuur 8. Genotypefrequentie van TNFα rs1800629 G>A bij event II Aangezien zowel T-stage als TNFα rs1800629 G>A sterk geassocieerd zijn met het optreden van late dysfagie werden deze gecombineerd. Een Kaplan-Meier analyse werd uitgevoerd zodat ook de tijdsafhankelijkheid in rekening gebracht wordt. Er werd een significante associatie gevonden voor event I (p=0,014), dit wordt weergegeven in figuur 9. Zoals te verwachten is vertonen patiënten met het risicoverhogend genotype (AA) gecombineerd met een T3/4-stage de grootste toxiciteit (paarse lijn in figuur 9). Bij event II zijn er te weinig gevallen om een betrouwbaar resultaat te verkrijgen voor dergelijke analyse. Figuur 9. Associatie van de combinatie van recessief model TNFα rs1800629 G>A en T-stage met late dysfagie bij event I. Blauwe lijn: GG+GA (homozygoot normaal + heterozygoot variant) met T1/2, groene lijn: GG+GA met T3/4, gele lijn: AA (homozygoot variant) met T1/2 en paarse lijn: AA met T3/4 38 Bespreking 1. Prognose Voorafgaande studies hebben aangetoond dat patiënten met HPV-positieve tumoren een betere prognose hebben. In dit deel van de masterproef werd getracht om HPV-status en andere klinische factoren als prognostische biomerkers te valideren bij patiënten met orofaryngeale kanker. Verschillende patiëntgerelateerde en klinische factoren werden geassocieerd met overleving (OS, DFS, DSS). Uit de resultaten blijkt dat tabaksgebruik , alcoholconsumptie en HPV-status de grootste impact hebben op overleving. Er werd ook gevonden dat patiënten met een gevorderde N-stage een slechtere OS en DSS hebben. Dit wordt bevestigd door de literatuur. Bij Ang et al. werd aangetoond dat voornamelijk tabaksgebruik en HPV-status significant geassocieerd zijn met OS op vijf jaar (29). Dit werd ook aangetoond bij De Ruyck et al. (12). In deze masterproef werd geen associatie gevonden tussen de T-stage (T1/2 vs. T3/4) en OS, DFS en DSS. Deze associatie werd daarentegen wel aangetoond bij Ang et al. (T2/3 vs. T4) (29). Dit kan te wijten zijn aan de wijze waarop de variabele gecategoriseerd werd. De HPV-status werd bepaald met behulp van twee verschillende technieken, CISH en p16-IHC. Na bepaling van de tumor HPV-status met de CISH-techniek kunnen ongeveer 23% van de orofaryngeale kankerpatiënten als HPV-positief beschouwd worden, terwijl dit 32,1% van de stalen is na bepaling door p16-IHC. Ongeveer 29% van de stalen is dus vals-positief. Een verschil van 15-20% in aantal HPV-positieve tumoren na analyse met de verschillende technieken wordt ook in de literatuur teruggevonden (31). Dit verschil kan verklaard worden door het feit dat p16-overexpressie aanwezig kan zijn zonder aanwezigheid van HPV-infectie. Een andere reden kan zijn dat bij CISH gebruik gemaakt wordt van een probe die slechts tegen een bepaald aantal high-risk types HPV gericht is. Hierdoor wordt infectie met een andere type HPV niet gedetecteerd met behulp van CISH. De prevalentie van HPV-geassocieerde orofaryngeale tumoren in deze studiepopulatie is 22,9%. Uit de literatuur blijkt dat de prevalentie van HPV-positieve tumoren varieert van 23% tot 73%, afhankelijk van de geografische plaats en de onderzochte periode (12, 13). Bij een vorige studie van de onderzoeksgroep werd een prevalentie van 27,9% gevonden (12). Dit percentage ligt iets hoger doordat ook patiënten uit Nederland geïncludeerd waren. Een ander aspect in dit deel van de masterproef is de associatie van tumor HPV-status met patiëntgerelateerde en klinische factoren. Uit deze analyse blijkt dat patiënten met HPV39 positieve tumoren een lager tabaksgebruik en een lagere alcoholconsumptie hebben. Dit werd eveneens aangetoond in de studie van De Ruyck et al. (12). Er werd ook gevonden dat deze patiënten meer kans hebben op de aanwezigheid van kleine primaire tumoren, typisch in een vroege T-stage (53,2% van de patiënten), maar met een vergevorderde N-stage (63,2%). Dit komt overeen met wat in de literatuur kan teruggevonden worden (26-28). Een opmerkelijke vaststelling is dat de meerderheid van de HPV-positieve patiënten eerder een gecombineerde behandeling kregen dan enkel RT. Dit toont aan dat er nog geen rekening gehouden wordt met de HPV-status naar behandeling toe. In tegenstelling tot andere studies werd geen associatie gevonden met leeftijd en geslacht, terwijl HPV-positieve patiënten doorgaans jonger en mannelijk zijn (26, 28). Met betrekking tot het verschil in prognose werd gevonden dat patiënten met HPV-positieve orofaryngeale kanker een 5-jaar globale overleving van 75,1% hebben in vergelijking met slechts 35,9% voor de HPV-negatieve patiënten. Dit is vergelijkbaar met de literatuur waar een 5 jaar OS van 75-80% vs. 45-50% aangetoond werd (12, 29). Wanneer enkel gekeken wordt naar patiënten die overleden zijn als gevolg van een ziektegerelateerde oorzaak, wordt een overleving gevonden van 90,2% voor patiënten met HPVgeassocieerde tumoren vs. 58,9% voor HPV-negatieve patiënten. De kleine patiëntenpopulatie is een mogelijke beperking van deze studie. Initieel werd gestart met 165 orofaryngeale kankerpatiënten, bovenop de 63 patiënten uit voorgaande studie uitgevoerd door de onderzoeksgroep. Na controle op exclusiecriteria bleek dat er slechts 62 patiënten geschikt waren voor deze studie. Voor deze groep was enkel tumormateriaal beschikbaar voor 46 patiënten. Door aanvulling met de 63 patiënten reeds geïncludeerd in een voorgaande studie van de onderzoeksgroep werd uiteindelijk een studiepopulatie bestaande uit 109 patiënten verkregen. De resultaten gevonden in dit deel van de masterproef zijn een bevestiging van de prognostische waarde van de tumor HPV-status en het gebruik van tabak en alcohol. 2. Late radiotoxiciteit Het optreden van late dysfagie na RT heeft een beduidend negatief effect op de levenskwaliteit van patiënten, waardoor identificatie van patiënten met een hoog risico op dit neveneffect van belang is. In het tweede luik van deze masterproef werd voor vijf SNPs onderzocht of er een associatie is met het optreden van late dysfagie bij patiënten met hoofd- en halskanker. Aangezien stralingsgeïnduceerde complicaties kunnen variëren tussen patiënten werden ook de patiënt- en behandelingsgerelateerde variabelen beschouwd. 40 2.1 Patiëntgerelateerde en klinische factoren De prevalentie van late dysfagie (minstens graad 1) in deze patiëntenpopulatie is 40,5% op één jaar en 31,3% op twee jaar. In de studie van Mortensen et al. werd hiervoor een prevalentie gevonden van 46% op één jaar en 32% op twee jaar (54). Ernstige late dysfagie (minstens graad 2) trad op bij 15,6% van de patiënten na één jaar en bij 13,2% na twee jaar, in de studie van Langendijk et al. (55). Dit komt overeen met de percentages gevonden voor ernstige late dysfagie in onze studiepopulatie, namelijk 12,9% en 10,4%, respectievelijk. Door middel van een univariate analyse werd een associatie gevonden tussen het optreden van late dysfagie en T-stage. Patiënten met tumoren in een gevorderde T-stage (T3/4) vertonen een hoger risico op ernstige late dysfagie. Deze associatie wordt door een aantal studies met grotere patiëntenpopulaties bevestigd (54, 56). In de studie van Caudell et al. werd dit daarentegen niet significant bevonden (57). Nochtans kan verwacht worden dat dysfagie meer zal optreden bij deze patiënten, aangezien slikproblemen ook veroorzaakt kunnen worden door de omvang van de tumor en niet enkel als een gevolg van de RT. Een andere associatie gevonden in deze masterproef is deze met de totale toegediende tumordosis. Hoe hoger deze dosis, hoe groter de kans op late dysfagie. Opmerkelijk is dat dit verband niet gevonden werd voor event II. Deze associatie werd enkel in de studie van Teguh et al. beaamd (58). In het onderzoek van Caudell et al. werd wel een borderline significantie gevonden (57). Een volgende associatie die gevonden werd is deze met het aantal pak-jaren. Deze associatie bleek enkel significant te zijn voor event I. Tabaksgebruikers blijken een hoger risico te hebben op het optreden van laattijdige dysfagie. Deze variabele werd enkel onderzocht in de studie van Caudell et al., waar geen associatie gevonden werd (57). Ook werd voor beide events een significante associatie gevonden met acute dysfagie. Het optreden van acute dysfagie kan dus als predictief beschouwd worden voor het optreden van late dysfagie. Deze variabele werd niet beschouwd in andere studies. Er kon geen associatie gevonden worden met geslacht, leeftijd, N-stage, plaats van de primaire tumor, chemotherapie en de aanwezigheid van dysfagie voor RT (baseline dysfagie). In de literatuur werden deze wel meermaals significant geassocieerd bevonden met het optreden van late dysfagie, echter met soms tegenstrijdige resultaten. Zo werd in de studie van Teguh et al. geen associatie gevonden met geslacht en leeftijd terwijl dit wel significant bleek te zijn bij Mortensen et al. (54, 58). Bij leeftijd werd telkens op basis van een andere cut-off waarde gewerkt. Inzake de plaats van de primaire tumor werden eveneens inconsistenties gevonden. In de studie van Christianen et al. werd deze variabele bijvoorbeeld gecategoriseerd als orofaryngeale en nasofaryngeale kanker vs. andere types van hoofd- en halskanker (56). Bij Mortensen et al. werd eerder glottische kanker (larynx en hypofarynx) ten opzichte van nietglottische beschouwd (54). N-stage, primaire plaats van de tumor en baseline dysfagie zijn 41 variabelen die in bijna elke studie als risicofactor worden aangetoond. Wanneer deze variabelen op eenzelfde manier worden ingedeeld in deze masterproef wordt nog steeds geen significante associatie gevonden. Aangezien ongeveer de helft van de studiepopulatie reeds geïncludeerd was in een vorige studie (DD-studie), is het interessant om binnen deze studie het effect van de experimentele arm A (lagere dosis) na te gaan. Zoals verwacht werd dan ook gevonden dat deze patiënten een lager risico op late dysfagie hebben dan de patiënten met de standaardbehandeling. De moeilijkheid om verschillende studies omtrent mogelijke risicofactoren voor late dysfagie te vergelijken, wordt verklaard door belangrijke discrepanties in de definiëring van de eindpunten, de gehanteerde scoringssystemen, de tijdspunten van scoring en de bestudeerde variabelen. Een overzicht hiervan wordt weergegeven in tabel 17. Tabel 17. Overzicht van de literatuur: associaties van patiëntgerelateerde en klinische factoren met late dysfagie Auteur Masterproef n=284 scoringssysteem LENT-SOMA RTOG/EORTC onderzocht eindpunt Dysfagie (Event I) Dysfagie (Event II) vanaf 6 maand tot 2-3 jaar na RT Teguh et al. (58) n=434 EORTC QLQC-30 vragenlijst H&N35-vragenlijst Mortensen et al. (54) n=1461 DAHANCA scoringb geen slikproblemen (score 0) wel slikproblemen (score >0) tijdspunt niet gedefinieerd graad 3-4 (enkel vloeibaar voedsel of sondevoeding) vanaf 3 maand tot 5 jaar na RT Christianen et al. (56) n=354 RTOG/EORTC Langendijk et al. (55) n=529 Caudell et al. (57) n=122 ap-waarde RTOG/EORTC objectieve scoring graad 2-4 op 6 maand na RT graad 2 of hoger op 6 maand na RT gastrostomiesonde aspiratiepneumonie faryngoesofageale vernauwing risicofactor pack-years (>10) T-stage (T3/4) acute dysfagie (>3) totale tumordosis (hoger) arm van de DD-studie (B: standaard dosis) T-stage (T3/4) N-stage (N2c) totale tumordosis (hoger) primary site (oro/nasofarynx) chemotherapie (yes) T-stage (T3/4) N-stage (N1-3) primary site (niet-glottisch) baseline dysfagie (graad 2-4) geslacht (vrouw) leeftijd (<62 jaar)) T-stage (T3/4) N-stage (N1-3) primary site (oro/nasofarynx) chemotherapie (yes) baseline dysfagie (graad 1) T-stage (T3/4) N-stage (N1-3) primary site (oro/nasofarynx) chemotherapie (yes) baseline dysfagie (graad 1) geslacht (vrouw) leeftijd (<60 jaar) totale tumordosis (hoger) primary site (larynx, hypofarynx, tongbasis) chemotherapie (yes) leeftijd (>55 jaar) p-waarde 0,041 0,004a 0,006a 0,016 0,004 <0,050 <0,050 <0,050 <0,050 <0,050 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,001 0,001 <0,010 <0,010 <0,010 <0,010 <0,010 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,004 0,037 0,010 0,060 0,010 0,010 0,040 voor event II, bgeen universeel scoringssysteem 42 2.2 Dosis-volume waarden De relatie tussen dosis-volume parameters van slikgerelateerde structuren, faryngeale constrictoren en de slokdarm, en het optreden van stralingsgeïnduceerde late dysfagie werd onderzocht. Door voorgaande studies werd reeds gerapporteerd dat het optreden van late dysfagie na RT afhankelijk is van de dosis op de faryngeale constrictoren, hoofdzakelijk op de SPC (56, 59). In deze masterproef werd enkel voor de slokdarm een significante associatie gevonden met de maximale dosis en de V50. Er werd geen significante associatie gevonden met de dosis op de faryngeale constrictoren. Dit resultaat is tegenstrijdig met de meerderheid van de literatuur en eveneens onverwacht, aangezien het eerder evident lijkt dat de hoogste dosis bij het bestralen van patiënten met hoofd- en halskanker op de bovenste slikgerelateerde structuren terechtkomt. Bij Feng et al. werd de hoogste correlatie gevonden met de gemiddelde dosis op de SPC (59). Daarentegen werd enkel de gemiddelde dosis op de MPC en IPC en de V50 van de IPC als significant aangetoond in de studie van Dirix et al. (60). Dit kan verklaard worden door het feit dat sterke correlatie met de SPC voornamelijk teruggevonden wordt bij studiepopulaties bestaande uit patiënten met nasofaryngeale, orofaryngeale en mondholtekanker. Ondanks dat de studiepopulatie in deze masterproef voor 49,6% uit patiënten met deze types kanker bestaat kon deze associatie niet aangetoond worden. Enkel in de studie van Bhide et al. kon geen significante associatie aangetoond worden tussen de gemiddelde dosis op de faryngeale constrictoren en het optreden van late dysfagie (61). De correlatie met de V50 van de slokdarm werd ook gerapporteerd door Christianen et al. (56). Opnieuw is het moeilijk om deze studies objectief te vergelijken, zo is er onder meer geen consensus over het beste tijdspunt om late dysfagie te scoren. Dysfagie gescoord op bijvoorbeeld 3 maand na RT kan het resultaat zijn van weefsels die nog niet voldoende de tijd hebben gehad om volledig te herstellen van de acute reactie. Ook werd in de meerderheid van de studies elke slikstructuur afzonderlijk onderzocht, terwijl de ontwikkeling van slikstoornissen multifactorieel is. Bovendien werden geen confounding factoren in rekening gebracht. Een andere belangrijke vaststelling is dat de onderzochte studiepopulaties zeer beperkt zijn, met uitzondering van de studie van Christianen et al. (56). Ook werd voor de bestudeerde dosis-volume parameter voornamelijk voor de gemiddelde dosis gekozen, terwijl in deze masterproef enkel met de maximale dosis, de V20 en de V50 gewerkt werd. Een mogelijke beperking in deze masterproef is het ontbreken van de dosis-volume data voor een groot aantal patiënten. Een overzicht van de literatuur wordt weergegeven in tabel 18. 43 Aan de hand van deze kennis kunnen nog geen specifieke richtlijnen worden voorgesteld om het optreden van late dysfagie te minimaliseren en op die manier de behandeling te optimaliseren. Tabel 18. Overzicht van de literatuur: associaties van dosis-volume waarden met late dysfagie Auteur Masterproef n=284 scoringssysteem LENT-SOMA RTOG/EORTC Christianen et al. (56) n=354 RTOG/EORTC Feng et al. (59) n=36 objectieve scoring (videofluoroscopie) aspiratie (wel vs. niet) RTOG/EORTC graad 2-3 op 3 maand na RT graad 2-3 vanaf 6 maand tot 45 maanden na RT graad >0 op 1 jaar na RT Dirix et al. (60) n=53 Bhide et al. (61) n=37 ap-waarde RTOG/EORTC RTOG/EORTC onderzocht eindpunt Dysfagie (Event I) Dysfagie (Event II) vanaf 6 maand tot 2-3 jaar na RT graad 2-4 op 6 maand na RT resultaat Dmax op de slokdarm V50 op de slokdarm p-waarde 0,039a 0,034a Dmeanb op de SPC Dmean op de MPC Dmean op de slokdarm V50 op de slokdarm Dmean op de SPC Dmean op de MPC Dmean op de IPC V50 op alle PC (samen) <0,010 <0,010 <0,010 <0,010 0,005 0,034 0,025 0,008 Dmean op alle PC (samen) Dmean op de MPC Dmean op de IPC V50 op de IPC geen significante associaties gevonden 0,010 0,080 0,040 0,040 - voor event I, bgemiddelde dosis 2.3 SNPs SNPs kunnen interfereren met de expressie en functie van bepaalde cruciale genen. Hierdoor kunnen deze polymorfe variaties een rol spelen bij het optreden van stralingsgeïnduceerde complicaties, zoals late dysfagie. Voor HSPB1 rs2868371 G>C werd in deze masterproef geen associatie gevonden met de ontwikkeling van stralingsgeïnduceerde late dysfagie bij patiënten met hoofd- en halskanker. Aangezien dit voor hoofd- en halskanker nog niet onderzocht werd door andere onderzoeksgroepen, is een vergelijking met de literatuur moeilijk. Voor patiënten met nietkleincellige longkanker werd dit wel al nagegaan met betrekking tot acute stralingsgeïnduceerde slokdarmtoxiciteit. In de studie van Lopez et al. werd aangetoond dat patiënten met een homozygoot variant genotype een hoger risico hebben op de ontwikkeling van deze slokdarmtoxiciteit (44). Een mogelijke verklaring hiervoor is nog niet volledig gekend. Overexpressie van HSP27, gecodeerd door HSPB1, is gerelateerd aan een hogere cellulaire resistentie voor ioniserende straling door downregulatie van het inflammatieproces, terwijl een laag gehalte aan HSP27 voor een toename van de radiosensitiviteit zorgt. Hieruit 44 kan afgeleid worden dat het gehalte aan HSP27 vermoedelijk laag is bij patiënten met het variant C-allel. Voor TXNRD2 rs1139793 G>A werd in deze masterproef eveneens geen significante associatie gevonden met het optreden van late dysfagie. Ook voor deze SNP werd voor patiënten met hoofd- en halskanker nog geen onderzoek uitgevoerd naar het optreden van radiotoxiciteit. Voor borstkankerpatiënten werd dit wel al in één studie onderzocht. Door Edvardsen et al. werd een mogelijke associatie met stralingsgeïnduceerde fibrose nagegaan. In deze studie werd aangetoond dat borstkankerpatiënten met twee variante A-allelen, volgens het dominant model, een ernstigere graad van fibrose vertonen. Na Bonferroni correctie bleef deze associatie statistisch significant (43). De wijze waarop deze genetische variatie een invloed uitoefent op de expressie van het thioredoxine reductase 2 moet nog opgehelderd worden. In een studie van Alsbeih et al. werd bij patiënten met nasofaryngeale kanker een significante associatie gevonden tussen de aanwezigheid van rs2279744 T>G (MDM2) en de ontwikkeling van late fibrose na RT. De aanwezigheid van het homozygoot variant genotype (GG) is gecorreleerd met een verlaagd risico op late fibrose, dit wijst op een beschermend effect van het variant G-allel (46). Zoals eerder vermeld in de inleiding leidt de aanwezigheid van deze SNP tot een overexpressie van het MDM2-oncoproteïne. Deze overexpressie bevordert de celoverleving waardoor er een hogere cellulaire resistentie is voor ioniserende straling. Dit beaamt het beschermend effect van het variant G-allel. Aangezien dysfagie na RT grotendeels het gevolg is van fibrose werd in deze masterproef een associatie verwacht voor rs2279744. Dit werd echter niet gevonden en kan te wijten zijn aan het feit dat de beschouwde follow-up periode hier te kort was. In de studie van Alsbeih et al. werd een periode van 15 jaar beschouwd, ook werd een significante associatie gevonden tussen het variant G-allel en een langere followup tijd (46). Een mogelijke associatie tussen rs1800629 G>A (TNFα) en de ontwikkeling van late radiotoxiciteit bij patiënten met hoofd- en halskanker werd tot nu toe nog niet onderzocht. Door Talbot et al. werd wel reeds aangetoond dat de aanwezigheid van twee variante A-allelen, volgens het recessief model, geassocieerd is met een 2,46 maal hoger risico op globale toxiciteit na RT voor borstkanker (22). Dit werd bevestigd in deze masterproef. Hoofd- en halskanker patiënten met het homozygoot variant genotype (AA) hebben volgens het recessief model een 3,5 maal hoger risico op het ontwikkelen van laattijdige dysfagie. Na validatie aan de hand van grotere en onafhankelijke cohorten kan deze genetische variatie gebruikt worden om patiënten met een verhoogd risico te identificeren. 45 Aangezien het multifunctioneel cytokine TGFβ1 een rol speelt bij processen die aanleiding geven tot het ontstaan van fibrose, zoals collageen afzetting en degradatie, kan een associatie voor rs1800469 C>T (TGFβ1) met het optreden van stralingsgeïnduceerde fibrose vermoed worden. In de literatuur worden echter tegenstrijdige resultaten gevonden. Betreffende hoofden halskanker werd in de studie van Alsbeih et al. een beschermend effect voor late fibrose aangetoond bij nasofaryngeale kankerpatiënten met twee variante T-allelen (46). Daarentegen werd in de meta-analyse van Barnett et al. geen associatie gevonden met zowel fibrose als globale late toxiciteit voor patiënten met borstkanker, cervixkanker en prostaatkanker. Bij deze meta-analyse werd rekening gehouden met mogelijke verschillen in de definiëring van het eindpunt fibrose en met de gehanteerde scoringssystemen (47). Ook in deze masterproef kon geen associatie aangetoond worden tussen de aanwezigheid van deze SNP en het optreden van late dysfagie bij patiënten met hoofd- en halskanker. 2.4 Mogelijke beperkingen Ten eerste werd voor dit deel van de studie gewerkt met een patiëntenpopulatie waarvan 150 patiënten eerder deel uitmaakten van de radiogenomics studie in Gent en 138 patiënten eerder deelnamen aan de DD-studie. Bij deze laatstgenoemde werd gebruik gemaakt van het RTOGEORTC scoringssysteem, voor de andere patiënten werd late dysfagie aan de hand van de LENT-SOMA schaal gescoord. Bovendien werd late dysfagie bij de patiënten afkomstig uit de DD-studie om de 6 maand gescoord maar bij deze uit de radiogenomics studie gebeurde dit niet op regelmatige tijdstippen. Er werd getracht rekening te houden met de tijdsafhankelijkheid door de Kaplan-Meier analyse te gebruiken. Een andere mogelijke beperking is dat in deze masterproef enkel naar een periode tot 2-3 jaar werd gekeken. Er is nog geen consensus omtrent het optimale tijdstip om radiotoxiciteit te onderzoeken maar toch is het beter wanneer dit enkele jaren na RT wordt bestudeerd aangezien er nog altijd progressie kan optreden. Ook werd in deze studie geen rekening gehouden met de aanwezigheid van dysfagie voor RT. Uit bovenstaande kan besloten worden dat de resultaten met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd moeten worden. 46 Algemeen besluit In deze masterproef werden enkele statistisch significante associaties gevonden. In het eerste deel betreffende prognose bij patiënten met orofaryngeale kanker kon aangetoond worden dat patiënten met meer dan 10 pak-jaren een slechtere OS, DFS en DSS vertonen. Ook voor het alcoholgebruik werd een significante associatie gevonden. Patiënten die minder dan 10 drinks/week nuttigen hebben een 5 jaar DSS van 93% vs. 54%. De HPV prevalentie in deze studiepopulatie bedraagt ongeveer 23%. Patiënten met HPV-positieve orofaryngeale tumoren vertonen duidelijk een betere prognose. Zo werd voor deze patiënten een 5-jaar OS van 75,1% gevonden vs. 35,9% voor HPV-negatieve patiënten. Ook werd aangetoond dat HPV-positieve patiënten minder tabak en alcohol gebruiken. Een opmerkelijke vaststelling is dat de meerderheid van de patiënten met HPV-positieve tumoren eerder een gecombineerde behandeling kreeg dan enkel RT. Dit toont aan dat er nog geen rekening gehouden wordt met de tumor HPV-status naar de behandeling toe. De gevonden resultaten zijn een bevestiging van de prognostische waarde van zowel de tumor HPV-status als het gebruik van tabak en alcohol. Gecombineerd met additionele prognostische biomerkers kan dit tot een betere stratificatie van orofaryngeale kankerpatiënten leiden teneinde overleving te verbeteren. Ook in het deel met betrekking tot late radiotoxiciteit, bij patiënten met hoofd- en halskanker, werden enkele significante associaties gevonden. Patiënten met acute dysfagie (minstens graad 3) en tumoren in een gevorderde T-stage hebben een hoger risico op de ontwikkeling van ernstige late dysfagie na RT. Verder blijken ook een hogere totale tumordosis en een hoger aantal pak-jaren significant geassocieerd te zijn met late dysfagie. Ook inzake de dosis-volume waarden, meer specifiek de maximale dosis en de V50, werd een significante associatie aangetoond. Ter hoogte van de slokdarm is een hogere dosis en een groter bestraald volume geassocieerd met de ontwikkeling van ernstige late dysfagie. Met betrekking tot de vijf geselecteerde SNPs bleek enkel de variatie rs1800629 G>A (TNFα) significant geassocieerd met het optreden van late dysfagie bij patiënten met hoofd- en halskanker. Volgens het recessief model hebben patiënten met twee variante A-allelen een verhoogd risico op het ontwikkelen van ernstige late dysfagie na RT. Door identificatie van dergelijke patiënten met een verhoogd risico op late radiotoxiciteit kan naar een geïndividualiseerde behandeling, met een maximale tumorrespons en minimale neveneffecten, gewerkt worden. 47 Referenties 1. Galbiatti ALS, Padovani-Junior JA, Maníglia JV, Rodrigues CDS, Pavarino ÉC, Goloni-Bertollo EM. Head and neck cancer: causes, prevention and treatment. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 2013;79(2):239-47. 2. Suh Y, Amelio I, Guerrero Urbano T, Tavassoli M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell death & disease. 2014;5:e1018. 3. National Cancer Institute. Head and neck cancers 2013 [16 oktober 2014]. Available from: http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Sites-Types/head-and-neck. 4. Argiris A, Karamouzis MV, Raben D, Ferris RL. Head and neck cancer. The Lancet. 2008;371(9625):1695-709. 5. Belgian Cancer Registry. Cancer Incidence in Belgium 2008 2011 [20 oktober 2014]. Available from: http://www.kankerregister.be/media/docs/StK_publicatie.pdf. 6. Registry BC. Trends in incidentie n.d. [20 oktober 2014]. Available from: http://www.kankerregister.be/default.aspx?url=p_132.htm. 7. Nederlandse Kankerregistratie. Incidentie Hoofd en hals 2011 [20 oktober 2014]. Available from: http://www.cijfersoverkanker.nl/selecties/dataset_1/img5444c9b516bca. 8. Ang KK, Sturgis EM. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in radiation oncology. 2012;22(2):128-42. 9. Werbrouck J, De Ruyck K, Duprez F, Van Eijkeren M, Rietzschel E, Bekaert S, et al. Single-nucleotide polymorphisms in DNA double-strand break repair genes: Association with head and neck cancer and interaction with tobacco use and alcohol consumption. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2008;656(1–2):74-81. 10. Marur S, Forastiere AA. Head and neck cancer: changing epidemiology, diagnosis, and treatment. Mayo Clinic proceedings. 2008;83(4):489-501. 11. Howard JD, Chung CH. Biology of human papillomavirus-related oropharyngeal cancer. Seminars in radiation oncology. 2012;22(3):187-93. 12. De Ruyck K, Duprez F, Ferdinande L, Mbah C, Rios-Velazquez E, Hoebers F, et al. A let-7 microRNA polymorphism in the KRAS 3'-UTR is prognostic in oropharyngeal cancer. Cancer epidemiology. 2014;38(5):5918. 13. Mehanna H, Beech T, Nicholson T, El-Hariry I, McConkey C, Paleri V, et al. Prevalence of human papillomavirus in oropharyngeal and nonoropharyngeal head and neck cancer--systematic review and metaanalysis of trends by time and region. Head & neck. 2013;35(5):747-55. 14. Marur S, Burtness B. Oropharyngeal squamous cell carcinoma treatment: current standards and future directions. Current opinion in oncology. 2014;26(3):252-8. 15. Chau NG, Rabinowits G, Haddad RI. Human Papillomavirus-Associated Oropharynx Cancer (HPVOPC): Treatment Options. Current treatment options in oncology. 2014;15(4):595-610. 16. Duprez F. Modern IMRT for head and neck cancer: a paradoxical paradigm of simultaneous doseescalation and de-escalation 2010. 17. Hubenak JR, Zhang Q, Branch CD, Kronowitz SJ. Mechanisms of injury to normal tissue after radiotherapy: a review. Plastic and reconstructive surgery. 2014;133(1):49e-56e. 18. Hendry JH, Jeremic B, Zubizarreta EH. Normal tissue complications after radiation therapy. Revista panamericana de salud publica = Pan American journal of public health. 2006;20(2-3):151-60. 19. Platteaux N, Dirix P, Dejaeger E, Nuyts S. Dysphagia in head and neck cancer patients treated with chemoradiotherapy. Dysphagia. 2010;25(2):139-52. 20. Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH. Effects of radiation on normal tissue: consequences and mechanisms. The Lancet Oncology. 2003;4(9):529-36. 21. Bhandare N, Mendenhall W. A Literature Review of Late Complications of Radiation Therapy for Head and Neck Cancers: Incidence and Dose Response. Journal of Nuclear Medicine & Radiation Therapy. 2012. 22. Talbot CJ, Tanteles GA, Barnett GC, Burnet NG, Chang-Claude J, Coles CE, et al. A replicated association between polymorphisms near TNFalpha and risk for adverse reactions to radiotherapy. British journal of cancer. 2012;107(4):748-53. 23. West CM, Dunning AM, Rosenstein BS. Genome-wide association studies and prediction of normal tissue toxicity. Seminars in radiation oncology. 2012;22(2):91-9. 24. Cox JD, Stetz J, Pajak TF. Toxicity criteria of the Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) and the European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC). International journal of radiation oncology, biology, physics. 1995;31(5):1341-6. 25. Pavy JJ, Denekamp J, Letschert J, Littbrand B, Mornex F, Bernier J, et al. EORTC Late Effects Working Group. Late Effects toxicity scoring: the SOMA scale. International journal of radiation oncology, biology, physics. 1995;31(5):1043-7. 26. Benson E, Li R, Eisele D, Fakhry C. The clinical impact of HPV tumor status upon head and neck squamous cell carcinomas. Oral oncology. 2014;50(6):565-74. 48 27. Psyrri A, Rampias T, Vermorken JB. The current and future impact of human papillomavirus on treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2014;25(11):2101-15. 28. Pytynia KB, Dahlstrom KR, Sturgis EM. Epidemiology of HPV-associated oropharyngeal cancer. Oral oncology. 2014;50(5):380-6. 29. Ang KK, Harris J, Wheeler R, Weber R, Rosenthal DI, Nguyen-Tan PF, et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England journal of medicine. 2010;363(1):24-35. 30. Chung CH, Gillison ML. Human papillomavirus in head and neck cancer: its role in pathogenesis and clinical implications. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2009;15(22):6758-62. 31. Mehanna H, Olaleye O, Licitra L. Oropharyngeal cancer - is it time to change management according to human papilloma virus status? Current opinion in otolaryngology & head and neck surgery. 2012;20(2):120-4. 32. Badoual C, Hans S, Merillon N, Van Ryswick C, Ravel P, Benhamouda N, et al. PD-1-expressing tumorinfiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer research. 2013;73(1):128-38. 33. Ward MJ, Thirdborough SM, Mellows T, Riley C, Harris S, Suchak K, et al. Tumour-infiltrating lymphocytes predict for outcome in HPV-positive oropharyngeal cancer. British journal of cancer. 2014;110(2):489-500. 34. Rampias T, Sasaki C, Psyrri A. Molecular mechanisms of HPV induced carcinogenesis in head and neck. Oral oncology. 2014;50(5):356-63. 35. Chung CH, Bagheri A, D'Souza G. Epidemiology of oral human papillomavirus infection. Oral oncology. 2014;50(5):364-9. 36. Michaud DS, Langevin SM, Eliot M, Nelson HH, Pawlita M, McClean MD, et al. High-risk HPV types and head and neck cancer. International journal of cancer Journal international du cancer. 2014;135(7):1653-61. 37. Tornesello ML, Perri F, Buonaguro L, Ionna F, Buonaguro FM, Caponigro F. HPV-related oropharyngeal cancers: from pathogenesis to new therapeutic approaches. Cancer letters. 2014;351(2):198-205. 38. Jimenez AM, Ruttkay-Nedecký B, Zitka O, Adam V, Kizek R. Human papilloma virus (HPV) and methods for its identification. Journal of Metallomics and Nanotechnologies. 2014;4:6-12. 39. Nichols AC, Finkelstein DM, Faquin WC, Westra WH, Mroz EA, Kneuertz P, et al. Bcl2 and human papilloma virus 16 as predictors of outcome following concurrent chemoradiation for advanced oropharyngeal cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2010;16(7):2138-46. 40. Perisanidis C, Wrba F, Brandstetter A, Kornek G, Mitchell D, Seemann R, et al. Impact of epidermal growth factor receptor, mesenchymal-epithelial transition factor, and insulin-like growth factor receptor 1 expression on survival of patients with oral and oropharyngeal cancer. The British journal of oral & maxillofacial surgery. 2013;51(3):234-40. 41. Baschnagel AM, Williams L, Hanna A, Chen PY, Krauss DJ, Pruetz BL, et al. c-Met expression is a marker of poor prognosis in patients with locally advanced head and neck squamous cell carcinoma treated with chemoradiation. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2014;88(3):701-7. 42. dbSNP: the NCBI database of genetic variation [Internet]. 2001 [cited 20 april 2015]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/. 43. Edvardsen H, Landmark-Hoyvik H, Reinertsen KV, Zhao X, Grenaker-Alnaes GI, Nebdal D, et al. SNP in TXNRD2 associated with radiation-induced fibrosis: a study of genetic variation in reactive oxygen species metabolism and signaling. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2013;86(4):791-9. 44. Lopez Guerra JL, Wei Q, Yuan X, Gomez D, Liu Z, Zhuang Y, et al. Functional promoter rs2868371 variant of HSPB1 associates with radiation-induced esophageal toxicity in patients with non-small-cell lung cancer treated with radio(chemo)therapy. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2011;101(2):271-7. 45. Al-Hadyan KS, Al-Harbi NM, Al-Qahtani SS, Alsbeih GA. Involvement of single-nucleotide polymorphisms in predisposition to head and neck cancer in Saudi Arabia. Genetic testing and molecular biomarkers. 2012;16(2):95-101. 46. Alsbeih G, El-Sebaie M, Al-Harbi N, Al-Hadyan K, Shoukri M, Al-Rajhi N. SNPs in genes implicated in radiation response are associated with radiotoxicity and evoke roles as predictive and prognostic biomarkers. Radiation oncology (London, England). 2013;8:125. 47. Barnett GC, Elliott RM, Alsner J, Andreassen CN, Abdelhay O, Burnet NG, et al. Individual patient data meta-analysis shows no association between the SNP rs1800469 in TGFB and late radiotherapy toxicity. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2012;105(3):289-95. 48. Zhu ML, Wang M, Shi TY, Li QX, Xi P, Xia KQ, et al. No association between TGFB1 polymorphisms and late radiotherapy toxicity: a meta-analysis. PloS one. 2013;8(10):e76964. 49. Ensembl Genome Database [Internet]. n.d. Available from: http://www.ensembl.org/index.html. 49 50. NCBI. National Center for Biotechnology Information n.d. [19 december 2014]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. 51. Kent J. UCSC In Silico PCR n.d. [19 december 2014]. Available from: http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgPcr. 52. Webportal WB. Primer3Plus 2014 [19 december 2014]. Available from: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi. 53. RestrictionMapper. RestrictionMapper n.d. [19 december 2014]. Available from: http://www.restrictionmapper.org/index.html. 54. Mortensen HR, Overgaard J, Jensen K, Specht L, Overgaard M, Johansen J, et al. Factors associated with acute and late dysphagia in the DAHANCA 6 & 7 randomized trial with accelerated radiotherapy for head and neck cancer. Acta oncologica. 2013;52(7):1535-42. 55. Langendijk JA, Doornaert P, Rietveld DH, Verdonck-de Leeuw IM, Leemans CR, Slotman BJ. A predictive model for swallowing dysfunction after curative radiotherapy in head and neck cancer. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2009;90(2):189-95. 56. Christianen ME, Schilstra C, Beetz I, Muijs CT, Chouvalova O, Burlage FR, et al. Predictive modelling for swallowing dysfunction after primary (chemo)radiation: results of a prospective observational study. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2012;105(1):107-14. 57. Caudell JJ, Schaner PE, Meredith RF, Locher JL, Nabell LM, Carroll WR, et al. Factors associated with long-term dysphagia after definitive radiotherapy for locally advanced head-and-neck cancer. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2009;73(2):410-5. 58. Teguh DN, Levendag PC, Ghidey W, van Montfort K, Kwa SL. Risk model and nomogram for dysphagia and xerostomia prediction in head and neck cancer patients treated by radiotherapy and/or chemotherapy. Dysphagia. 2013;28(3):388-94. 59. Feng FY, Kim HM, Lyden TH, Haxer MJ, Feng M, Worden FP, et al. Intensity-modulated radiotherapy of head and neck cancer aiming to reduce dysphagia: early dose-effect relationships for the swallowing structures. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2007;68(5):1289-98. 60. Dirix P, Abbeel S, Vanstraelen B, Hermans R, Nuyts S. Dysphagia after chemoradiotherapy for headand-neck squamous cell carcinoma: dose-effect relationships for the swallowing structures. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2009;75(2):385-92. 61. Bhide SA, Gulliford S, Kazi R, El-Hariry I, Newbold K, Harrington KJ, et al. Correlation between dose to the pharyngeal constrictors and patient quality of life and late dysphagia following chemo-IMRT for head and neck cancer. Radiotherapy and oncology : journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology. 2009;93(3):539-44. 50 Addendum Bijlage A. Scoringssysteem late toxiciteit 1. RTOG-EORTC Dysfagie graad 1 Slight difficulty in swallowing solid food. No pain on swallowing. graad 2 Unable to take solid food normally. Swallowing semi-soli food. Dilatation may be indicated. graad 3 Able to swallow only liquids. May have pain on swallowing. Dilatation required. graad 4 Necrosis/ Perforation Fistula graad 5 Death directly related to late radiation induced toxicity graad 2 Difficulty eating soft food. graad 3 Can take liquids only. graad 4 Totally unable to swallow. graad 5 Death 2. LENT-SOMA Dysfagie graad 1 Difficulty eating solid food. I Bijlage B. Analyse prognose 1. Associatie van overleving met patiëntgerelateerde en klinische factoren Alle (n=109) Geslacht man vrouw Type roken never ever missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never ever missing Drinks/Week <10 ≥10 missing Subsite tumor tonsil andere T-stage 1-2 3-4 N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing HPV-status positief negatief Behandeling RT RT+ChTa RT+Chirurgie RT+ChTa+Chirurgie Type RT IMRT 3DRT 86 23 Overall survival 5y sterfte % overleving 46 9 43,2 54,6 p-waarde 0,501 0,062 12 87 10 3 47 66,3 41,2 22 69 18 5 40 72,3 37,4 11 88 10 4 45 49,1 44,7 34 62 13 10 37 60,2 37,4 0,006 0,446 0,007 0,030 49 60 19 36 58,0 34,6 0,087 58 51 26 29 49,5 40,1 39 67 3 13 41 62,7 34,0 0,005 0,001 25 84 5 50 75,1 35,9 0,142 34 56 12 7 21 29 2 3 36,4 44,1 70,0 53,6 99 10 51 4 43,2 60,0 0,311 aChemotherapie II Alle (n=109) Geslacht man vrouw Type roken never ever missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never ever missing Drinks/Week <10 ≥10 missing Subsite tumor tonsil andere T-stage 1-2 3-4 N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing HPV-status positief negatief Behandeling RT RT+ChTa RT+Chirurgie RT+ChTa+Chirurgie Type RT IMRT 3DRT 86 23 Disease-free survival 5y sterfte % overleving 27 4 65,8 63,4 p-waarde 0,218 0,098 12 87 10 1 25 90,9 66,5 22 69 18 2 22 90,2 62,4 11 88 10 2 25 81,8 67,0 34 62 13 4 22 83,3 60,1 0,019 0,389 0,005 0,118 49 60 11 20 73,6 62,6 0,554 58 51 16 15 69,9 64,5 39 67 3 7 21 81,7 64,0 0,075 0,014 25 84 3 28 87,2 60,8 0,324 34 56 12 7 9 19 1 2 69,2 60,9 90,0 71,4 99 10 29 2 65,9 80,0 0,497 aChemotherapie III Alle (n=109) Geslacht man vrouw Type roken never ever missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never ever missing Drinks/Week <10 ≥10 missing Subsite tumor tonsil andere T-stage 1-2 3-4 N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing HPV-status positief negatief Behandeling RT RT+ChTa RT+Chirurgie RT+ChTa+Chirurgie Type RT IMRT 3DRT 86 23 Disease-specific survival 5y sterfte % overleving 29 4 62,9 82,1 p-waarde 0,204 0,074 12 87 10 1 29 90,9 62,7 22 69 18 2 25 89,7 59,5 11 88 10 1 29 90,9 63,3 34 62 13 2 26 93,0 53,9 0,014 0,139 <0,001 0,036 49 60 10 23 77,2 57,5 0,318 58 51 16 17 69,0 64,2 39 67 3 6 26 84,2 55,7 0,008 0,004 25 84 2 31 90,2 58,9 0,136 34 56 12 7 10 21 0 2 67,7 58,6 71,4 99 10 31 2 64,6 78,8 0,396 aChemotherapie IV 2. Associatie van tumor HPV-status met patiëntgerelateerde en klinische factoren HPV-negatief (n=84) aantal % Geslacht man vrouw Leeftijd (jaren) mediaan bereik Type roken never ever missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never ever missing Drinks/week <10 ≥10 missing Subsite tumor tonsil andere T-stage 1-2 3-4 N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 Behandeling RT RT+ChTa RT+Chirurgie RT+ChTa+Chirurgie Chemo no yes Chirurgie no yes Enkel RT no yes Type RT IMRT 3DRT 68 18 81,0 19,0 HPV-positief (n=25) aantal % 18 7 p-waarde 0,336 72,0 28,0 0,552 57,9 37,2-73,3 - 61,2 37,9-77,9 0,001 5 73 6 6,4 93,6 7 14 4 33,3 66,7 8 62 14 11,4 88,6 14 7 4 66,7 33,3 4 73 7 5,2 94,8 7 15 3 31,8 68,2 18 57 9 24,0 76,0 16 5 4 76,2 23,8 <0,001 <0,001 <0,001 0,206 35 49 41,7 58,3 14 11 56,0 44,0 44 40 52,4 47,6 14 11 56,0 44,0 29 53 35,4 64,6 10 14 41,7 58,3 32 41 7 4 38,1 48,8 8,3 4,8 2 15 5 3 8,0 60,0 20,0 12,0 36 48 42,9 57,1 10 15 40,0 60,0 0,750 0,573 0,018 0,800 0,415 68 16 81,0 19,0 22 3 88,0 12,0 0,004 52 32 61,9 38,1 23 2 92,0 8,0 0,307 75 9 89,3 10,7 24 1 96,0 4,0 V Vervolg tabel Overall survival 2jaar 3jaar 5jaar Disease-free survival 2jaar 3jaar 5jaar Disease-specific survival 2jaar 3jaar 5jaar 58,3 50,3 35,9 100,0 91,5 75,1 <0,001 <0,001 0,001 65,5 63,8 60,8 91,8 87,2 87,2 0,011 0,019 0,014 67,8 61,6 58,9 100,0 95,5 90,2 0,002 0,002 0,004 aChemotherapie VI Bijlage C. RFLP protocols 1. HSPB1 rs2868371 G>C Primers Primers: Forward : 5’-GGCTGTGGTGAGCTGGATTG-3’ Reverse : 5’-CCTTGGCTCAAGTGCTCCTC-3’ Fragment: 870 bp P358 Tm=62°C 20bp P359 Tm=62°C 20bp %GC=48 PCR Program: Touchdown programma Step Temp Time 94°C 2 min Denaturation 94°C 20 sec Primer annealing 66°C 15 sec 12 cycli -1°C per cyclus Extension 72°C 1 min 94°C 40 sec 54°C 40 sec 72°C 30 sec 72°C 10 min 15°C 10 min 24 cycli PCR Mix: General 15 µl 3 µl dNTP (1 mM) 3 µl Buffer (5X) 0.9 µl MgCl2 (25mM) 0.3 µl forward primer (P358) (50 µM) 0.3 µl reverse primer (P359) (50 µM) 0.07 µl KAPA Taq (0.6U) 3 µl DNA (25 ng/µl) 4.43 µl dH2O VII Digest Enzyme: MboII Incubation: 37°C for 3 hours Digest volume dH2O 30 µl 19.6 µl PCR product 7 µl NEBuffer 4 3 µl MboII 0.4 µl (2U) Expected digest product: GG: 870 GC: 870/482/388 CC: 482/388 VIII 2. TGFβ1 rs1800469 C>T PCR Primers : 39 & 40 PCR mix : Standard PCR conditions : General program : Ta = 60°C PCR fragment size 681 nt Digest -509 C>T Enzyme : Bsu36I Incubation : 37°C overnight (min 22h) Digest volume 30 µl dH2O 18.4 µl PCR product 8 µl NEBuffer 3 3 µl BSA 0.3 µl Bsu36I 0.3 µl Expected digest product -509 : CC : 193 / 488 CT : 193 / 488 / 681 TT : 681 Agarose gel picture -509: CT CC CT CC TT CT CC IX Bijlage D. HRM protocols 1. TXNRD2 rs1139793 G>A PCR-HRM Mix : AB Meltdoctor reagentia : Reagent Concentration Amount (µl) 10mM 0.4 buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1,2 primer 544 5 µM 1.2 primer 545 5 µM 1.2 AmpliTaq 5 U/µl 0,05 HRM dye 20X 1 dNTP mix DNA 25 ng/µl 1 H2O - 11.95 20 PCR conditions : 95° 10 min 95° 60° 15 sec 1 min 95° 60° 95° 60° 10 sec 1 min 15 sec 15 sec 40 cycli PCR fragment size : 122 nt (GC 67%) Pattern X 2. TNFα rs1800629 G>A PCR-HRM Mix : AB Meltdoctor reagentia : Reagent dNTP mix Concentration Amount (µl) 10mM 0.4 buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1,2 Primer 435 5 µM 1.2 Primer 436 5 µM 1.2 AmpliTaq 5 U/µl 0,05 Syto 9 20X 0.6 DNA 25 ng/µl 1 H2O - 12.35 20 PCR conditions : 95° 10 min 95° 62° 15 sec 1 min 95° 60° 95° 60° 10 sec 1 min 15 sec 15 sec 40 cycli PCR fragment size : 109 bp Pattern XI 3. MDM2 rs2279744 T>G PCR-HRM Mix : AB Meltdoctor reagentia : Reagent Concentration Amount (µl) 10mM 0.4 buffer 10X 2 MgCl2 25 mM 1,2 primer 369 5 µM 1.2 primer 370 5 µM 1.2 AmpliTaq 5 U/µl 0,05 HRM dye* 20X 1 dNTP mix DNA 25 ng/µl 1 H2O - 11.95 20 *MeltDoctor can be replaced by 0.6 µl Syto 9 (50 µM) PCR conditions : 95° 10 min 95° 62° 15 sec 1 min 95° 60° 95° 60° 10 sec 1 min 15 sec 15 sec (12.35 µl H2O) 40 cycli PCR fragment size : 100 nt (GC 71%) Pattern XII Bijlage E. Resultaten genotypering HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 Cx001 GC GG TT GA CC Cx003 GG GG TT GG CT Cx004 GG GG TG GA CT Cx008 GG GG TG GA CC Cx009 GC GA TT GA CT Cx010 GC GG TT GG CC Cx012 GG GA TG GG CC Cx032 GG GA TG GA CC Cx033 GG GG TT GG CC Cx034 GG GG TT GA CC Cx035 GC GA TT GG TT Cx037 GG GA TT GA CT Cx038 GC GA TT GG CC Cx040 GC GA GG GG CC Cx048 GC GG TG GA CC Cx050 GC GG TT GA TT Cx056 GG AA TG GG CT Cx059 GG GG TT GG CC Cx061 GC GG GG GG TT Cx064 CC GA TT GA CT Cx071 CC GA TG GG CC Cx072 GC GG TT GG CC RT067 GC GG TT GA CT RT075 GG - GG GG CT RT079 GG GG TG GG CC RT081 GC GG GG GA CT RT082 GG GA TG GA CT RT084 GG GG TG GA CC RT089 GG GA TT GG CT RT099 GC GA TG GG TT RT119 GG GG TT AA CT RT128 - - - - TT RT129 GC GG TT GG CT RT137 GG GG TG GG CT RT138 GC GG TT GG CC RT144 GC GG TT GG CC RT145 GG GG TG GG CC RT147 GG GG TG GA CT RT148 GC AA TT GG CC RT153 GG GG GG AA CC RT163 GG GG TG GG CT RT166 GG AA TG GG CT Code XIII HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 RT168 CC GG TG GG CC RT169 GG GG TT GG CC RT179 GG GA TT GA CT RT191 GG GG TG GG CC RT214 GG GA GG GG CT RT222 GC GA TG GG CC RT224 GC GG GG GA CC RT233 GC GA TG GG CT RT243 GC GA TG GG CC RT246 GG GG TT GG CC RT247 GC GA TG GG CT RT249 GG GA TG GG CT RT251 CC GA GG GA CT RT260 GC GG TT GA CC RT261 GC GG TT GG CT RT262 GC GA TG GG CT RT270 GG GG TT GA CC RT275 GC GA TG AA CT RT284 GG GG TT GG CT RT287 GC GA GG GG TT RT305 GG GA TG GA CT RT310 GG AA TT GG CC RT316 GG GA TG GG CT RT317 GC - TG GG CT RT318 GG GG TG GG - RT333 - GA TG - CC RT357 GG GG GG GG CC RT358 GG GG TT GG CT RT373 GC GA TT AA CT RT378 GG AA TT GA TT RT382 GG GA TG GA CT RT389 GG GG TG GA CC RT391 GC GA TT GG CC RT394 - - - - CC RT399 - - - - CT RT406 GG GG GG GA CC RT408 GG GA TT AA CC RT421 GG GG TT AA CC RT422 GG GA TG GA TT RT426 GG GG TT GG CT RT427 GC GG TG GG CC RT521 GG GG TT GG CT RT522 GG GG TG GG CC RT528 CC GG TT GG CC Code XIV HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 RT530 GG GG TG GA CC RT537 CC GG TG GG CC RT539 GC GA TT GG CC RT540 GG GG TT GG CC RT541 GC GG TT GG CT RT547 GC GG TT GG CT RT551 GG GA TT GG CT RT554 GG GG TT GG CC RT555 GG GG TT GG CC RT556 GG GG TT AA CT RT557 GG GA GG GG TT RT558 CC GG TT GG CT RT561 GC GA GG GG CC RT563 GC GG TG GG CC RT568 GC GA GG GA CC RT576 CC GA GG GG CT RT577 GG GA TG GG CC RT579 CC GG TG GG CC RT580 GG GG TG GA CT RT581 GC GA TT GG CC RT583 GC GG TT GG CC RT584 GG GA TT GG CT RT585 GG GG GG GA CT RT586 GC GG TG GG CC RT587 GC GA TG GA CT RT589 CC GG TG AA CC RT590 GG GA GG GG CT RT597 CC GG TT GA CT RT598 GG GG TT GA CC RT604 GG GA GG GG CC RT605 GC AA TG GG CC RT608 GG GG TT GG CT RT609 GC GG TG GG CC RT610 GC GA TG GA CC RT611 GG GA TG GA CT RT612 GG GG TT GA CC RT613 CC GA TG GG CT RT614 GG AA TT GG CC RT618 GC GA TG GG CC RT619 GG GA GG GG CT RT620 GG - TG AA CT RT621 GC GA TT GG CT RT625 GG AA GG GG CT RT626 GG GG TG GG CT Code XV HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 RT627 GG GA TG GG CC RT628 GC GG GG GA CC RT631 CC GG TT GG CC RT632 GG GG TG GA CT RT633 GG GG TG GA CT RT635 GC GG TG GA CC RT636 GC GG TT GA CC RT637 GC GG TG GG CC RT648 GG GA TT GA CT RT650 GG GG TG GG CC RT653 GG GA TG GA CC RT654 GG GA GG GG TT RT657 GC AA TG - CC RT662 GG GG TT GA CC RT663 GG GG TG GG CC RT664 GG GG TT GG CC RT665 GG GG GG GG TT RT666 GG AA TT GG CC RT667 GG GG TT GG CT RT668 GC GA GG GG CT RT669 GG GA GG GG TT RT670 GG GG TG GG CC RT672 GG GA TT GG CT RT673 GC GG GG GG CT RT674 GG GG TT GG CC RT675 GG GG TT GG CC RT676 GG GG TT GG CC RT677 GG GA TT GG CC RT679 GC GG GG GA CC RT681 GC GA TG GG CC RT683 GG GG TT GG CC RT685 GC GG TT GA CC RT687 GG GA GG GG CT RT688 GC GG GG GG CC RT689 GG GA TT GG TT RT690 GG GA TG GG CT RT692 GG AA TG GG CC RT693 GG GG TT GG CC RT694 GG GA GG GA TT RT696 GG GA TT GG CC RT697 - - - - - RT698 GG GA TG GG TT RT699 GG AA TG GG CT RT700 GC GA TT GG CC Code XVI HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 RT701 GG GG TG GG CC RT703 GG GG TG GA CC RT705 GC GA TT GG TT RT707 GC GA TG GA CT RT709 GG GA TT GA CT RT711 GG AA TG GA CT RT719 CC - TT GA CC RT720 GC GA - GA CC RT721 CC AA TT GG CC RT722 GG - TG GG CC RT723 GC GG TT GA CC RT724 GG GA TG GA CT RT725 GG GA TT GA CC RT727 GC GG TT GA CT RT728 GG GG GG GG TT RT730 GG GA TT GG CC RT731 GC GG TT GG CT RT732 GG GG TG GG CC RT733 GG GA TG GA CC RT735 GC GG - GG CT RT736 GG GG TG GG CC RT737 GC GG GG GA CT RT738 GG GG TT GG TT RT740 GG GG TG GA CC RT741 GG GA TG GG CT RT743 GG GA TG GG - RT744 GC GA TT GG CT RT745 GC GG TG GG CT RT748 GG GG TT GG CT RT750 GG GG TT GG CC RT751 GG GG TG AA CC RT753 GG GA TG GG CT RT754 GG AA TG GG CC RT755 GC GG TG GG TT RT756 GG GG TT GG CC RT757 GC GA TG GG CC RT758 GG GG TG GG CT RT761 GG GG TG GG CC RT762 GC GA TT GA CT RT763 GC GA TG GG CC RT764 GG GG GG GG CT RT765 GC GA TT GG CT RT768 GC GA TG AA CT RT769 GG GG TG GG CT Code XVII HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 RT771 GG GG TT GG CC RT772 GG GG GG GG CC RT773 CC GA TT GA CT RT775 GG AA TG GG TT RT776 GC GA TG GG TT RT779 GC GA TT GG CC RT780 GG GA TG GG CC RT782 GG GG TG GG CC RT786 GG GG TG GG CC RT791 - - - - - RT792 GG GG - GG CT RT793 GG GG TG GG CC RT794 GG GA TT GG CT RT796 GG GA TT GG CC RT797 GG GG TT GG CT RT798 GG GG TT GA CC RT799 GG GG TT GG CC RT801 GG GA TG GA CC RT802 GG GG TG GG CC RT803 GC GA TT GA CT RT804 GG GG TG GG CC RT805 GG GG TG GA CT RT807 GG GA TG GG CC RT808 GC GG TG GG CT RT809 GG GA TG GG CT RT812 GC GA TT GG CT RT813 GG GA TT GG CC RT814 GC GG GG GG TT RT815 GG GG GG GG CT RT816 GC GG TT GG CC RT817 GG GG GG GG CT RT818 GC GG TG GA CC RT820 GG GG TT GG TT RT821 GG GG TG GG CT RT823 GC GG TT GG CC RT826 GG GA TT GG CC RT827 GG GG TT GG CC RT828 GC GA TG GA CC RT829 GG GA TG GG CC RT831 GC GA TT GG CT RT832 GG GG TT GG CC RT834 GG GG TT GA CC RT836 GG GA GG GA CT RT837 GG GG TG GA CC Code XVIII HSPB1 TXNRD2 MDM2 TNFα TGFb1 rs2868371 rs1139793 rs2279744 rs1800629 rs1800469 RT839 GG GG TG GG CC RT840 GC GG TG GG CT RT841 GG GA TT GG TT RT843 GC GG TT GG CT RT844 CC GG TT GG CC RT845 GG GA TT AA CT RT846 GG GA TT GA CC RT848 GC GG TT GG TT RT849 GG GA TT GG TT RT850 GG GA TT GA CC RT851 GC GA TT GG CC RT853 GC GA TT GG RT855 GG GG TT GG CC CC RT856 GG GG TG GG CT RT857 GC GG TG GA CT RT858 GG GG TT GA CC RT860 GC GA TT GA CC RT862 - GG TT GA CC RT868 GG GA TG GG CC RT869 GC AA TG GA CC RT872 GC GG TG GG CT RT873 GG GG TT GG CT RT874 GC GA GG GG TT RT879 GC GA TT GG CC RT920 - - - - - RT942 GG GA TT AA TT Code XIX Bijlage F. Analyse late radiotoxiciteit 1. Associatie met patiëntgerelateerde en klinische factoren EVENT I Geslacht man vrouw Leeftijd (jaren) mediaan bereik Type roken never former current missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never former current missing Drinks/week <10 ≥10 missing Primary site oral cavity oropharynx larynx hypopharynx CUPb multiple Primary site categorisch larynx + hypopharynx andere missing T-stage 1-2 3-4 missing N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing N-stage categorisch negative (N0) positive (N1/2/3) missing Alle (n=284) n=209 % n=75 % 236 48 178 31 75,4 64,6 58 17 24,6 34,4 59,0 33,0-82,0 59,0 33,0-82,0 - 57,0 39,0-81,0 - 17 158 107 2 15 121 72 1 88,2 76,6 67,3 2 37 35 1 11,8 23,4 32,7 39 233 12 34 167 8 87,2 71,7 5 66 4 12,8 28,3 27 61 193 3 19 50 140 0 70,4 82,0 72,5 8 11 53 3 29,6 18,0 27,5 0 1 88 176 20 66 130 13 75,0 73,9 22 46 7 25,0 26,1 36 104 57 59 22 6 25 76 46 40 19 3 69,4 73,1 80,7 67,8 86,4 50,0 11 28 11 19 3 3 30,6 26,9 19,3 32,2 13,6 50,0 115 163 6 85 121 3 73,9 74,2 30 42 3 26,1 25,8 116 147 21 91 100 18 78,4 68,0 25 47 3 p-waarde 0,120 p-waardea 0,108 0,295 - 0,090 0,058 0,041 0,036 0,299 0,317 0,842 0,854 0,269 0,221 0,952 0,876 0,060 0,039 0,425 0,375 0,242 0,217 21,6 32,0 127 150 7 96 107 6 75,6 71,3 31 43 1 24,4 28,7 74 206 4 58 147 4 78,4 71,4 16 59 0 21,6 28,6 XX Vervolg tabel Chemotherapie no yes Chirurgie no yes missing LNDc no yes Totale tumordosis (Gy) gemiddelde standaarddeviatie mediaan bereik Dosis/fractie mediaan bereik Fractionatieschema daily hybridd Follow-up periode mediaan bereik OTTe mediaan bereik Baseline dysfagief 0-1-2 3 missing Acute dysfagie 0-1-2 3 missing Type studie DD Gent Arm van de DDstudie (n=138) A (experimenteel)g B (standaard) ap-waarde 134 150 103 106 76,9 70,7 31 44 23,1 29,3 243 40 1 182 26 1 74,9 65,0 61 14 0 25,1 35,0 174 110 133 76 76,4 69,1 41 34 23,6 30,9 69,60 3,21 69,12 50,0-81,0 69,24 3,09 69,12 50,0-81,0 - 70,69 3,33 69,12 66,0-81,0 - 2,16 1,65-2,70 2,16 1,65-2,63 - 2;16 2,00-2,70 - 234 50 174 35 74,4 70,0 60 15 25,6 30,0 24,00 6,00-36,00 24,00 6,00-36,00 - 24,00 6,00-36,00 - 44,0 28,0-56,0 44,0 28,0-56,0 - 44,0 39,0-56,0 - 272 9 3 201 6 2 73,9 66,7 71 3 1 26,1 33,3 181 101 2 147 61 1 81,2 60,4 34 40 1 18,8 39,6 138 146 105 104 76,1 71,2 33 42 23,9 28,8 72 66 62 43 86,1 65,2 10 23 0,237 0,189 0,189 0,281 0,171 0,268 0,016 - 0,057 - 0,526 0,506 0,326 - 0,824 - 0,628 0,558 <0,001 <0,001 0,354 0,487 0,004 0,005 13,9 34,8 na Kaplan-Meier analyse, bcancer of unknown primary, clymph node dissection, dfractionatie afhankelijk van deelnemend centrum in de DD-studie , eoverall treatment time, fdysfagie voor RT, glagere dosis XXI EVENT II Geslacht man vrouw Leeftijd (jaren) mediaan bereik Type roken never former current missing Pack-years ≤10 >10 missing Type alcohol never former current missing Drinks/week <10 ≥10 missing Primary site oral cavity oropharynx larynx hypopharynx CUPb multiple Primary site categorisch larynx + hypopharynx andere missing T-stage 1-2 3-4 missing N-stage 0-1-2a 2b-2c-3 missing N-stage categorisch negative (N0) positive (N1/2/3) missing Alle (n=284) n=243 % n=41 % 236 48 205 38 86,9 79,2 31 10 13,1 20,8 59,0 33,0-82,0 59,0 33,0-82,0 - 57,0 40,0-81,0 - 0 1 17 158 107 2 15 139 87 2 88,2 88,0 81,3 2 19 20 0 11,8 12,0 18,7 39 233 12 35 199 9 89,7 85,4 4 34 3 10,3 14,6 27 61 193 3 21 56 164 2 77,8 91,8 85,0 6 5 29 1 22,2 8,2 15,0 88 176 20 73 155 15 83,0 88,1 15 21 5 17,0 11,9 36 104 57 59 22 6 29 88 49 52 20 5 80,6 84,6 86,0 88,1 90,9 83,3 7 16 8 7 2 1 19,4 15,4 14,0 11,9 9,1 16,7 115 163 6 100 138 5 87,0 84,7 15 25 1 13,0 15,3 116 147 21 107 117 19 92,2 79,6 9 30 2 7,8 20,4 127 150 7 111 125 7 87,4 83,3 16 25 0 12,6 16,7 74 206 4 66 173 4 89,2 84,0 8 33 0 10,8 16,0 p-waarde 0;167 p-waardea 0,144 0,432 - 0,302 0,224 0,470 0,422 0,189 0,170 0,254 0,259 0,894 0,909 0,591 0,637 0,004 0,003 0,342 0,292 0,277 0,227 XXII Vervolg tabel Chemotherapie no yes Chirurgie no yes missing LNDc no yes Totale tumordosis (Gy) gemiddelde standaarddeviatie mediaan bereik Dosis/fractie mediaan bereik Fractionatieschema daily hybridd Follow-up periode mediaan bereik OTTe mediaan bereik Baseline dysfagief 0-1-2 3 missing Acute dysfagie 0-1-2 3 missing Type studie DD Gent Arm van de DDstudie (n=138) A (experimenteel)g B (standaard) ap-waarde 134 150 119 124 88,8 82,7 15 26 11,2 17,3 243 40 1 211 31 1 86,8 77,5 32 9 0 13,2 22,5 174 110 152 91 87,4 82,7 22 19 12,6 17,3 69,60 3,21 69,12 50,0-81,0 69,45 3,11 69,12 50,0-81,0 - 70,63 3,69 69,12 66,0-81,0 - 2,16 1,65-2,70 2,16 1,65-2,67 - 2,16 2,00-2,70 - 234 50 199 44 85,0 88,0 35 6 15,0 12,0 24,00 6,00-36,00 24,00 6,00-36,00 - 24,00 9,00-36,00 - 44,0 28,0-56,0 44,0 28,0-56,0 - 44,0 39,0-56,0 - 272 9 3 234 7 2 86,0 77,8 38 2 1 14,0 22,2 181 101 2 163 79 1 90,1 78,2 18 22 1 9,9 21,8 138 146 124 119 89,9 81,5 14 27 10,1 18,5 72 66 68 56 94,4 84,8 4 10 0,142 0,120 0,120 0,192 0,280 0,339 0,506 - 0,112 - 0,589 0,613 0,421 - 0,691 - 0,486 0,411 0,006 0,002 0,045 0,071 0,062 0,074 5,6 15,2 na Kaplan-Meier analyse, bcancer of unknown primary, clymph node dissection, dfractionatie afhankelijk van deelnemend centrum in de DD-studie , eoverall treatment time, fdysfagie voor RT, glagere dosis XXIII 2. Associatie met dosis-volume waarden EVENT I Dmax gemiddelde SDa mediaan bereik missing V20 gemiddelde SDa mediaan bereik missing V50 gemiddelde SDa mediaan bereik missing Superior pharyngeal constrictor 0 1 p 0,473 70,93 70,95 4,81 5,28 71,20 71,90 42,20-82,95 51,05-83,24 41 12 0,208 95,58 98,07 13,50 6,86 100,00 100,00 0,00-100,00 58,60-100,00 44 14 0,131 79,98 87,49 27,42 20,42 96,00 98,40 0,00-100,00 11,90-100,00 44 14 Middle pharyngeal constrictor 0 1 p 0,186 69,17 69,87 6,94 6,52 71,10 71,80 40,10-79,94 50,70-82,10 46 12 0,121 87,52 27,11 100,00 0,00-100,00 47 90,41 23,74 100,00 4,00-100,00 14 Inferior pharyngeal constrictor 0 1 p 0,091 66,35 68,65 9,16 8,77 70,05 70,90 34,90-80,72 40,40-83,03 47 14 0,179 98,99 99,75 7,51 1,85 100,00 100,00 0,00-100,00 86,00-100,00 48 16 0,084 72,94 82,99 39,19 31,79 100,00 100,00 0,00-100,00 0,00-100,00 48 16 0 53,73 13,90 56,90 1,75-76,34 42 Slokdarm 1 p 0,039 57,89 11,85 58,25 19,58-74,88 11 0,485 89,61 22,81 100,00 0,00-100,00 44 84,28 27,68 100,00 1,74-100,00 13 41,44 41,74 28,39 0,00-100,00 45 48,78 44,46 68,02 0,00-100,00 14 0,034 a Standaarddeviatie XXIV EVENT II Dmax gemiddelde SDa mediaan bereik missing V20 gemiddelde SDa mediaan bereik missing V50 gemiddelde SDa mediaan bereik missing Superior pharyngeal constrictor 0 1 p 0,882 71,01 71,09 4,65 4,35 71,40 71,49 42,20-82,95 60,19-83,24 44 9 0,173 96,18 99,56 12,20 2,29 100,00 100,00 0,00-100,00 74,51-100,00 48 10 0,130 81,06 90,78 26,25 16,99 96,00 99,70 0,00-100,00 43,00-100,00 48 10 Middle pharyngeal constrictor 0 1 p 0,803 69,37 69,19 6,88 6,70 71,17 71,23 40,10-82,10 52,70-81,51 49 9 0,231 88,08 26,11 100,00 0,00-100,00 51 89,21 27,97 100,00 4,00-100,00 10 Inferior pharyngeal constrictor 0 1 p 0,643 66,79 67,92 8,99 10,02 70,42 70,58 34,90-82,32 40,40-83,03 51 10 0,178 99,07 6,99 100,00 0,00-100,00 53 0,155 74,50 83,77 38,29 32,19 100,00 100,00 0,00-100,00 0,00-100,00 53 11 0 Slokdarm 1 54,21 13,83 56,82 1,75-76,34 45 58,98 10,49 59,21 35,80-74,88 8 87,93 24,82 100,00 0,00-100,00 48 89,62 20,66 100,00 18,00-100,00 9 41,48 42,18 25,56 0,00-100,00 50 56,21 43,91 76,00 0,00-100,00 9 p 0,049 0,993 0,032 aStandaarddeviatie XXV 3. Associatie met de geselecteerde SNPs EVENT I HSPB1 rs2868371 GG GC CC missing dominant GG GC+CC recessief GG+GC CC TXNRD2 rs1139793 GG GA AA missing dominant GG GA+AA recessief GG+GA AA MDM2 rs2279744 TT TG GG missing dominant TT TG+GG recessief TT+TG GG TNFα rs1800629 GG GA AA missing GG GA+AA GG+GA AA TGFβ1 rs1800469 CC CT TT missing dominant CC CT+TT recessief CC+CT TT ap-waarde Alle n=284 % 165 94 17 8 165 111 259 17 59,8 34,1 6,2 146 110 14 11 146 127 256 17 53,5 40,3 6,2 121 115 39 9 121 154 236 39 44,0 41,8 14,2 188 75 13 8 188 88 263 13 68,1 27,2 4,7 147 105 27 5 147 132 252 27 52,7 37,6 9,7 59,8 40,2 93,8 6,2 53,5 46,5 93,8 6,2 44,0 56,0 85,8 14,2 68,1 31,9 95,3 4,7 52,7 47,3 90,3 9,7 0 1 p-waardea n=209 % n=75 % OR p-waarde 124 68 13 4 124 81 192 13 75,2 72,3 76,5 41 26 4 4 41 30 67 4 24,8 27,7 23,5 1,16 0,93 0,620 0,904 1,12 0,685 0,665 0,88 0,831 0,824 112 75 14 8 112 89 187 14 76,7 68,2 82,4 34 35 3 3 34 38 69 3 23,3 31,8 17,6 1,54 0,71 0,129 0,601 1,41 0,216 0,270 0,58 0,404 0,470 92 85 26 6 92 111 177 26 76,0 73,9 66,7 29 30 13 3 29 43 59 13 24,0 26,1 33,3 1,12 1,59 0,707 0,250 1,23 0,459 0,428 1,50 0,275 0,241 137 61 6 5 137 67 198 6 72,9 81,3 46,2 51 14 7 3 51 21 65 7 27,1 18,7 53,8 0,62 3,13 0,153 0,049 0,84 0,565 0,790 3,55 0,027 0,005 108 77 20 4 108 97 185 20 73,5 73,3 74,1 39 28 7 1 39 35 67 7 26,5 26,7 25,9 0,97 1,01 0,948 0,981 0,99 0,998 0,878 0,97 0,941 0,971 75,2 73,0 74,1 76,5 76,7 70,1 73,0 82,4 76,0 72,1 75,0 66,7 72,9 76,1 75,3 46,2 73,5 73,5 73,4 74,1 24,8 27,0 25,9 23,5 23,3 29,9 27,0 17,6 24,0 27,9 25,0 33,3 27,1 23,9 24,7 53,8 26,5 26,5 26,6 25,9 0,847 0,309 0,464 0,009 0,984 na Kaplan-Meier analyse XXVI EVENT II HSPB1 rs2868371 GG GC CC missing dominant GG GC+CC recessief GG+GC CC TXNRD2 rs1139793 GG GA AA missing dominant GG GA+AA recessief GG+GA AA MDM2 rs2279744 TT TG GG missing dominant TT TG+GG recessief TT+TG GG TNFα rs1800629 GG GA AA missing GG GA+AA GG+GA AA TGFβ1 rs1800469 CC CT TT missing dominant CC CT+TT recessief CC+CT TT ap-waarde Alle n=284 % 165 94 17 8 165 111 259 17 59,8 34,1 6,2 146 110 14 11 146 127 256 17 53,5 40,3 6,2 121 115 39 9 121 154 236 39 44,0 41,8 14,2 188 75 13 8 188 88 263 13 68,1 27,2 4,7 147 105 27 5 147 132 252 27 52,7 37,6 9,7 59,8 40,2 93,8 6,2 53,5 46,5 93,8 6,2 44,0 56,0 85,8 14,2 68,1 31,9 95,3 4,7 52,7 47,3 90,3 9,7 0 1 p-waardea n=243 % n=41 % OR p-waarde 142 80 16 5 142 96 222 16 86,1 85,1 94,1 23 14 1 3 23 15 37 1 13,9 14,9 5,9 1,08 0,39 0,833 0,367 0,97 0,920 0,936 0,38 0,348 0,328 126 93 15 9 126 108 219 15 86,3 84,5 88,2 20 17 2 2 20 19 37 2 13,7 15,5 11,8 1,15 0,84 0,693 0,825 1,11 0,766 0,816 0,79 0,760 0,817 103 100 33 7 103 133 203 33 85,1 87,0 84,6 18 15 6 2 18 21 33 6 14,9 13,0 15,4 0,86 1,04 0,685 0,938 0,90 0,770 0,779 1,12 0,816 0,731 162 66 9 6 162 75 228 9 86,2 88,0 69,2 26 9 4 2 26 13 35 4 13,8 12,0 30,8 0,85 2,77 0,693 0,110 1,08 0,834 0,688 2,89 0,090 0,034 125 89 25 4 125 114 214 25 85,0 84,8 92,6 22 16 2 1 22 18 38 2 15,0 15,2 7,4 0,46 1,02 0,306 0,953 0,89 0,752 0,688 0,45 0,291 0,305 86,1 86,5 85,7 94,1 86,3 85,0 85,5 88,2 85,1 86,4 86,0 84,6 86,2 85,2 86,7 69,2 85,0 86,4 84,9 92,6 13,9 13,5 16,7 5,9 13,7 15,0 14,5 11,8 14,9 13,6 14,0 15,4 13,8 14,8 13,3 30,8 15,0 13,6 15,1 7,4 0,601 0,929 0,860 0,103 0,590 na Kaplan-Meier analyse XXVII
