De genetische revolutie in beeld gebracht: nieuwe

DOSSIER
Peer-reviewed article
De genetische revolutie in beeld
gebracht: nieuwe diagnostische
mogelijkheden voor aandoeningen
van de geslachtsontwikkeling
Dorien Baetens1, Elfride De Baere1, Martine Cools2
1. Centrum voor Medische Genetica, UZ Gent en Universiteit Gent;
2. Afdeling Kinderendocrinologie, Dienst Pediatrie, UZ Gent en vakgroep Pediatrie en Genetica, Universiteit Gent
Aandoeningen van de geslachtsontwikkeling, verder afgekort als DSD (disorders/
differences of sex development), vormen een bijzonder heterogene groep van aandoeningen
waarbij er een discordantie is tussen het chromosomale, het gonadale en het fenotypische
geslacht. Ze worden veelal veroorzaakt door mutaties in genen die betrokken zijn bij de
geslachtsontwikkeling (1).
P1244N
Momenteel zijn er meer dan 40 dergelijke genen gekend, maar desondanks kan een
specifieke genetische diagnose in de meerderheid (tot 80%) van de gevallen niet worden
gesteld (2). Men vermoedt dan ook dat er wellicht nog honderden tot nog toe ongekende
genen eveneens een rol spelen in dit complexe ontwikkelingsproces. Een bijkomende
moeilijkheid is dat eenzelfde ziektebeeld (bv. complete gonadale dysgenesie) kan worden
veroorzaakt door mutaties in verschillende genen (SRY, NR5A1, WT1, DHH…) terwijl
andersom verschillende mutaties in eenzelfde gen aanleiding kunnen geven tot verschillende
ziektebeelden. Androgeenreceptormutaties kunnen bijvoorbeeld aanleiding geven tot
complete androgeenongevoeligheid, wat leidt tot de ontwikkeling van een typisch vrouwelijk
fenotype bij een kind met een 46,XY-chromosomenkaart, maar ook tot partiële of zelfs minimale
androgeenongevoeligheid, waarbij infertiliteit bij een verder gezonde man soms het enige
klinische symptoom kan zijn.
De genetische diagnostiek heeft echter in de laatste jaren een enorme
opmars gemaakt. Met de opkomst van nieuwe sequencingtechnologieën
is de mogelijkheid tot het vinden van de onderliggende genetische
oorzaak van genetisch heterogene aandoeningen sterk toegenomen.
Het kennen van deze moleculaire achtergrond biedt heel wat voordelen:
een betere inschatting van de prognose, een meer gepersonaliseerde
behandeling voor de patiënt en een betere evaluatie van het herhalingsen overervingsrisico zijn daarvan slechts enkele voorbeelden. In dit artikel
bespreken we de vooruitgang en de huidige mogelijkheden binnen de
genetische diagnostiek voor de diagnose van DSD-condities. Dit kan
model staan voor andere genetisch heterogene ziektebeelden waarvoor
een gelijkaardige vooruitgang geboekt is in de laatste jaren.
1953-2000: de kinderschoenen
Van aneuploïdie tot de detectie van
submicroscopische deleties en duplicaties
Genetica is een relatief nieuwe discipline binnen de geneeskunde
en dankt haar ontstaan aan de ontrafeling van de structuur van DNA
in 1953 door James Watson en Francis Crick (3). Enkele jaren later,
in 1956, werd de eerste cytogenetische techniek geoptimaliseerd.
Dankzij karyotypering kon men voor het eerst de humane chromosomen,
en numerieke afwijkingen ervan, visualiseren (4). Ook vandaag wordt
deze techniek nog steeds gebruikt in de klinische cytogenetica, onder
meer bij vermoeden van het syndroom van Turner, het syndroom van
10
Percentiel|Vol 21|Nr 3|2016
Klinefelter of geslachtschromosomaal mosaïcisme (45,X/46,XY). Dankzij
verdere optimalisatie van de techniek en de introductie van G-banding
werd het mogelijk om numerieke afwijkingen (duplicaties en deleties)
van slechts een deel van een chromosoom (kopieveranderingen of copy
number variations, CNVs) op te pikken met een grootte van 5-10
Megabasen (Mb).
genoom hebben geleid tot een drastische verbetering van de tot dan
toe gekende sequencingtechnieken en tot de ontwikkeling van de
zogenaamde tweedegeneratie- of next generation sequencing(NGS) technologieën.
Hoewel er vandaag meerdere technologieën op de markt zijn, is de
grootste gemene deler dat zij een groot aantal DNA-fragmenten in
parallel (en niet in serie, zoals sanger sequencing) kunnen uitlezen, wat
gepaard gaat met een revolutionaire stijging in sequencingcapaciteit
en een sterk dalende kostprijs. De eerste stap is het fragmenteren van
het DNA, gevolgd door aanrijken van de doelwitfragmenten met behulp
van een aangepaste reactie, specifiek voor de gebruikte technologie. De
derde stap omhelst het eigenlijke sequeneren, waarbij gemodificeerde
nucleotiden worden losgelaten op de aangerijkte DNA-moleculen
waarna het signaal met een camera kan worden afgelezen (10). Op die
manier kan men in parallel verschillende DNA-fragmenten sequeneren,
daar waar men met sanger sequencing slechts één sequentie per reactie
verkrijgt. De nieuwstegeneratie sequencing (third generation
sequencing) gaan nog een stap verder, en laten toe om enkele
moleculen uit te lezen (single molecule sequencing) (11), waardoor het
risico op het inbouwen van fouten kleiner is.
In de daaropvolgende decennia werden verschillende andere
technieken op punt gesteld voor het oppikken van CNVs zoals
fluorescente in-situ-hybridisatie (FISH, locus-specifiek) en microarraycomparatieve-genoom-hybridisatie (array-CGH, genoomwijd). Bij FISH
wordt gebruikgemaakt van een specifieke fluorescent gemerkte probe
die complementair is met een genregio van interesse. In het geval van
een kindje met een 46,XY karyotype maar met een typisch vrouwelijk
genitaal uitzicht en bilateraal streakgonaden zal deze techniek worden
toegepast om een deletie van het SRY-gen, dit is het gen op het
Y-chromosoom dat verantwoordelijk is voor testisdifferentiatie, uit te
sluiten (5). De ontwikkeling van array-CGH vloeide voort uit FISH. Het
is een techniek waarbij over het volledige genoom gezocht kan worden
naar CNVs. De huidige commercieel gebruikte platformen hebben een
zeer hoge resolutie, van 3 tot 50kb (6).
Array-CGH wordt vandaag vooral gebruikt voor het bevestigen van een
klinisch vermoeden van een gekend microdeletiesyndroom (bv. het
WAGR (wilmstumor, aniridie, genito-urinaire malformatie, mentale
retardatie) -syndroom) of als diagnostische screening wanneer een
syndromale aandoening wordt vermoed. Een gekend voorbeeld is
het 9p-deletiesyndroom, waarbij het terminale deel van de korte arm
van chromosoom 9 afwezig is, wat naast o.a. verstoorde spraak- en
taalontwikkeling en mentale retardatie aanleiding geeft tot 46,XY
gonadale dysgenesie ten gevolge van de afwezigheid van het DMRT1-gen.
Toepassingen in de genetische
diagnostiek van DSD-condities
Deze nieuwe sequencingtechnologieën hebben ook de mogelijkheden
voor de genetische diagnostiek van genetisch heterogene aandoeningen
zoals DSD-condities drastisch veranderd. Daar waar het vroeger
door zowel praktische als budgettaire beperkingen slechts mogelijk
was om de meest frequent betrokken genen voor een aandoening te
sequeneren, kunnen we nu in hetzelfde tijdsbestek en voor een lagere
kost alle betrokken genen of zelfs alle coderende bouwstenen in het
genoom (dit is het exoom) sequeneren in parallel.
Sanger sequencing van een kandidaat-gen
Naast deze technieken om CNVs op te sporen werd het in de jaren
70 mogelijk om de basevolgorde van specifieke genen te bepalen
dankzij de introductie van sanger sequencing (7). Sanger sequencing
heeft de moleculaire oorzaak van heel wat ziektebeelden blootgelegd
(bv. het androgeenongevoeligheidssyndroom, veroorzaakt door mutaties
in het gen dat codeert voor de androgeenreceptor). Het nadeel van deze
techniek is echter dat ze duur en tijdrovend is omdat bij elk experiment
slechts één gen kan worden onderzocht (gen-per-gen-analyse). Voor
ziektebeelden die door mutaties in verschillende genen kunnen worden
veroorzaakt, zoals voor DSD typisch het geval is, bleek deze techniek
niet zo geschikt; ze is wel uitermate geschikt voor het stellen van de
diagnose bij aandoeningen veroorzaakt door fouten in één specifiek
ziektegen, bijvoorbeeld mucoviscidose.
Zoals hogerop gezegd worden DSD-condities gekenmerkt door een
grote genetische heterogeniteit, dit wil zeggen dat een gelijkaardig
ziektebeeld kan worden veroorzaakt door mutaties in verschillende
genen (bv. complete gonadale dysgenesie ten gevolge van mutaties
in SRY, NR5A1, WT1…). Tot voor kort werd elk gen achtereenvolgens
gesequeneerd tot men uiteindelijk het juiste gen te pakken had,
wat een tijdrovende en dure onderneming was. Door middel van
doelgerichte NGS van betrokken ziektegenen is het echter mogelijk
om een ziektespecifiek panel van genen samen te stellen en deze
genen in parallel te sequeneren. Het Centrum voor Medische Genetica
Gent (CMGG) heeft als enige in België een DSD-specifiek genenpanel
ontwikkeld (Tabel 1). Deze DSD-specifieke test kan aangevraagd
2000-…: het humaangenoomproject
en de sequencingrevolutie
Tabel 1: Overzicht van de genen geïncludeerd in het DSD-panel.
In de jaren 90 werd één van de grootste wetenschappelijke projecten ooit
opgezet: het humaangenoomproject, met als doel het sequeneren en
annoteren (aanduiden waar genen zich bevinden) van het hele genoom.
Simultaan werkten twee onderzoeksteams aan ditzelfde doel: de
publiek gesponsorde onderzoeksgroep onder leiding van Francis Collins
en de private onderneming Celera onder leiding van Craig Venter.
Beiden gebruikten een verschillende techniek en slaagden er omstreeks
2000 in een eerste proefversie van het humane genoom te publiceren
(8, 9). Deze eerste pogingen tot het sequeneren van een dergelijk groot
Genen betrokken
bij gonadale
ontwikkeling
Genen betrokken
bij steroïd-hormoonsynthese
en werking
NR5A1
CYP17A1
GATA4
NR5A1
SOX9
AR
SRY
WT1
DMRT1
11
Percentiel|Vol 21|Nr 3|2016
worden wanneer er voldoende klinische argumenten zijn voor een DSDconditie (aanvragen op https://cmgg.be/nl/content/aanvraagformulieren).
Dit DSD-panel wordt stapsgewijs uitgebreid met andere genen
betrokken bij 46,XY en 46,XX DSD. Gelijkaardige genenpanels werden
ook opgezet voor andere genetisch heterogene aandoeningen zoals
mentale handicap, blindheid, erfelijke bindweedselaandoeningen,
erfelijke hartaandoeningen, erfelijke vormen van kanker, etc.
(https://cmgg.be/en/content/constitutional-genetic-conditions).
is het probleem nu verschoven naar het vinden van de juiste causale
variant. Door middel van verschillende bio-informaticaprogramma’s en
toepassingen wordt het mogelijk om hier de causale variant uit te filteren.
Conclusie
De laatste jaren kende het gebruik van genetische testen voor erfelijke
aandoeningen een opmerkelijke opmars. Dit werd voornamelijk
bewerkstelligd door de ontwikkeling van nieuwe technologieën
Hoewel er in de afgelopen jaren, mede door de komst van de verwaardoor het mogelijk werd om op kortere tijd immense hoeveelheden
schillende NGS-technologieën, onder meer voor DSD, verschillende
data te verkrijgen. De introductie van deze technieken in een
nieuwe ziektegenen geïdentificeerd werden, kan men voor genetisch
routinesetting heeft ervoor gezorgd dat men nu op meer vragen een
heterogene aandoeningen toch niet
antwoord kan bieden, wat leidt tot
voor alle patiënten de onderliggende
een meer specifieke aanpak van zorg
genetische oorzaak vinden. Zo kan men
en verbeterde mogelijkheden voor
door het sequeneren van gekende DSDgenetische counseling. Daar waar men
genen slechts 20-40% van de casusvroeger slechts één of enkele genen kon
sen oplossen (cfr supra) (2). In 60-80%
sequeneren, kan men dat nu voor vele
van de gevallen is het antwoord op de
genen (ziektespecieke panels) of voor
diagnostische vraag dus niet te vinalle genen tegelijk (exoomsequencing).
Men kan nu op meer vragen
den, ondanks het gebruik van zelfs
Deze technologie biedt de mogelijkheid
een antwoord bieden, wat leidt
zeer uitgebreide panels. Redenen hierom genen die een tot nog toe ongekende
voor zijn onder andere mutaties in nog
rol spelen bij bijvoorbeeld het ontstaan
tot een meer specifieke aanpak
ongekende genen, of mutaties in reguvan DSDs te identificeren, wat niet
latorische regio’s van genen. Een gesevan zorg en verbeterde mogelijkheden alleen tot verbeterde diagnostiek leidt
lecteerd aantal patiënten bij wie de
maar ook toelaat om dit complexe
voor genetische counseling.
hierboven aangehaalde DSD-specifieke
ontwikkelingsproces beter te begrijpen.
test geen mutatie oplevert, zullen onder‑
De keerzijde van deze medaille zit
zocht worden door middel van exoomin de interpretatie van de massieve
sequencing, waarbij virtueel alle
hoeveelheden gegenereerde data.
gekende ziektegenen in parallel onder‑
Hierbij is moet ook het ethisch kader
zocht kunnen worden en waardoor ook
voldoende uitgeklaard worden.
nieuwe genen verantwoordelijk voor
DSD-condities kunnen worden gevonden. Hierbij wordt een groot aantal varianten van het referentiegenoom
Ontvangen: 10/03/2016 – Aanvaard: 15/03/2016
geïdentificeerd, wat leidt tot een enorme massa aan data.
De moeilijkheid bestaat erin om de causale variant die het ziektebeeld
veroorzaakt, te onderscheiden van de vele andere (12, 13). Om deze taak
te vereenvoudigen wordt er gebruikgemaakt van verschillende filters.
Zo is het mogelijk om in eerste instantie naar alle gekende ziektegenen
te kijken, ook naar diegene die niet opgenomen zijn in het ziektespecifiek DSD-panel. Wanneer deze filtering negatief is, kan het zoekvenster
opengetrokken worden naar de andere genen in het exoom. Hierbij
kunnen ook genen die niet direct in relatie staan tot het ontstaan
van DSD onder de loep genomen worden, wat kan leiden tot ethische
dilemma’s. Zo kan het voorkomen dat er bij een patiënt met een
diagnostische vraag in het kader van DSD bijvoorbeeld een mutatie
wordt vastgesteld in een gen dat betrokken is bij het krijgen van erfelijke
borstkanker. Over het te volgen beleid bij deze zogenaamde incidentele
bevindingen zijn er verschillende strekkingen (14).
Referenties
1. Hughes IA, Houk C, Ahmed SF, LeePA. Consensus statement on management of intersex disorders,
Endocrine 2006;91:554-62.
2. Ono M, Harley VR. Disorders of sex development: new genes, new concepts. Nature reviews.
Endocrinology 2013;9(2):79-91.
3. Watson JD, Crick FHC. Molecular structure of nucleic acids. Nature 1953;171:737-8.
4. Tjio JH, Levan A. The chromosome number of man. Hereditas 1956;42(1-3):1–6.
5. Langer-safer PR, Levine M, Ward DC. Immunological method for mapping genes on Drosophila
polytene chromosomes. PNAS 1982;79:4381-5.
6. Solinas-toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A. Matrix-Based Comparative
Genomic Hybridization: Biochips to Screen for Genomic Imbalances 1997;407:399-407.
7. Sanger F, Coulson AR. A Rapid Method for Determining Sequences in DNA by Primed Synthesis with
DNA Polymerase. J Mol Biol 1975;94:441-8.
8. The international Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the
human genome 2001, vol. 409.
9. Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al. The Sequence of the Human Genome. Science 2001;291:1304-51.
10. Morey M, Fernández-Marmiesse A, Castiñeiras D, Fraga JM, Couce ML, a Cocho J. A glimpse into past,
present, and future DNA sequencing. Molecular genetics and metabolism 2013;110(1-2):3-24.
11. Schadt EE, Turner S, Kasarskis A. A window into third-generation sequencing. Human molecular
genetics 2010;19(R2):R227-40.
12. Bamshad MJ, Ng SB, Bigham AW, Tabor HK, Emond MJ, a Nickerson D, Shendure J. Exome sequencing
as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nature reviews. Genetics 2011;12(11):745-55.
13. Cooper GM, Shendure J. Needles in stacks of needles: finding disease-causal variants in a wealth of
genomic data. Nature reviews Genetics 2011;12(9):628-40.
14. Green RC, Berg JS, Grody WW, et al. ACMG recommendations for reporting of incidental findings in
clinical exome and genome sequencing. Genetics in medicine: official journal of the American College
of Medical Genetics 2013;15(7):565-74.
Vooraleer deze exoomtest kan worden geïmplementeerd in een routine
klinische context is het van belang dat de daaraan gekoppelde ethische
aspecten vooraf goed uitgeklaard zijn en dat patiënten die deze test
ondergaan goed geïnformeerd worden. Naast het ethische aspect moet
men ook rekening houden met de complexiteit van de data-analyse. Bij
het sequeneren van het exoom worden 100.000’den varianten gevonden.
Daar waar men vroeger problemen had met het vinden van een variant,
12
Percentiel|Vol 21|Nr 3|2016