Interacties van bacteriofagen met de menselijke gastheer
advertisement
1.1.1. Interacties van bacteriofagen met de menselijke gastheer Cara DE GALAN Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte Wetenschappelijk begeleider: Drs. Jonas Van Belleghem Vakgroep: Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie Academiejaar 2015-2016 Interacties van bacteriofagen met de menselijke gastheer Cara DE GALAN Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Mario Vaneechoutte Wetenschappelijk begeleider: Drs. Jonas Van Belleghem Vakgroep: Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie Academiejaar 2015-2016 Voorwoord Als beginnende wetenschapper stort je je telkens weer in een nieuw avontuur waarin nog veel terrein te ontginnen is. Onwetend start je aan een parcours met vele wendingen en hindernissen. Dit was binnen mijn masterproef niet anders. Om deze reden wil ik iedereen bedanken die mij geholpen heeft om mijn masterproef tot een goed einde te brengen. Eerst en vooral wil ik mijn promoter, Prof. Dr. Mario Vaneechoutte, bedanken om mij de mogelijkheid te geven mijn masterproef in het LBR uit te voeren. Mij steeds de belangrijkheid van de details aan te duiden en mijn interpretatie steeds in vraag te trekken. Vervolgens wil ik ook mijn begeleider Drs. Jonas Van Belleghem bedanken voor de introductie in de intrigerende wereld van de faag-biologie. Tevens wil ik hem ook bedanken voor de aangename en interactieve samenwerking. Ook dank aan iedereen in het labo die ervoor zorgde dat er een aangename werksfeer was gedurende mijn masterproef. Graag wens ik ook mijn dank te betuigen aan Prof. Dr. Kathleen Van Craenenbroeck en Dr. Karen Heyninck van het L-GEST om hun expertise omtrent visualisatie met de fluorescentiemicroscoop en de confocale laser scanningsmicroscoop met mij te delen. Eveneens wil ik Frédéric Clement, het hoofd van het CEVAC, en zijn collega’s Sabrina, Anja en Peter bedanken om mij toe te laten mijn stimulaties in hun labo uit te voeren en mij de kunst van de flow cytometrie aan te leren. Net als Prof. Dr. Rob Lavigne voor het gebruik van de swinging bucket ultracentrifuge in het Laboratorium van gentechnologie (KU Leuven). Hiernaast wil ik ook mijn ouders bedanken die mij alle mogelijkheden hebben gegeven om mezelf te ontplooien tot een zelfstandig individu en die me steeds steunden in alles wat ik wou bereiken. Bedankt ! Inhoudstafel Samenvatting ............................................................................................................................ 1 Summary ................................................................................................................................... 2 1. Inleiding ............................................................................................................................. 3 1.1. Wat zijn bacteriofagen? ............................................................................................... 3 1.2. Algemene geschiedenis ............................................................................................... 4 1.3. Replicatie van de fagen in de gastheerbacterie ............................................................ 5 1.3.1. Lytische versus lysogene levenscyclus ................................................................ 5 1.3.2. Adherentie ............................................................................................................ 5 1.3.3. Injectie: translocatie van het faag-genoom ........................................................... 6 1.3.4. Lysogene replicatiecyclus .................................................................................... 7 1.3.5. Lyse veroorzaakt door endolysines en holines ..................................................... 7 1.4. Faagtherapie en het belang van de farmacokinetiek .................................................... 8 1.5. Het immuunsysteem .................................................................................................. 11 1.5.1. Interacties van bacteriofagen met het adaptief immuunsysteem ........................ 12 1.5.2. Interacties van bacteriofagen met het innate immuunsysteem ........................... 12 1.5.2.1. Adherentie van fagen aan het mucosaal epitheel ............................................... 13 1.5.2.2. Fagocytose .......................................................................................................... 13 1.5.2.2.1. Partikel-opname door fagocyten volgens diverse pathways ....................... 13 1.5.2.2.2. Maturatie van het fagosoom en antigen-presentatie ................................... 16 1.5.2.2.3. Invloed van fagen op fagocytose ................................................................ 17 1.5.2.2.4. Interacties van bacteriofagen met fagocyten ............................................... 18 1.6. 2. Doel van de masterproef ............................................................................................ 19 Materialen en Methoden ................................................................................................ 20 2.1. Bereiding van solid (1.5 %) agar platen en semi-solid (0.6 %) agar ........................ 20 2.2. Faagtitratie: Double agar overlay methode ............................................................... 20 2.3. Propagatie van bacteriofagen ..................................................................................... 21 2.4. Cesium-Chloride (CsCl) zuivering van fagen ........................................................... 21 2.5. DNA extracties .......................................................................................................... 22 2.5.1. Voorbehandeling bij alle DNA extracties .......................................................... 22 2.5.2. DNA extractie met behulp van fenol/ chloroform zuivering ............................. 22 2.5.3. Verhitting van fagen bij 95 °C en de freezing-heatshock methode .................... 23 2.5.4. EasyMAG DNA isolatie ..................................................................................... 23 2.5.5. De Norgen faag-DNA isolatiekit........................................................................ 23 2.6. Bepaling van de DNA-concentratie ........................................................................... 23 2.7. Faag-kwantificatie met behulp van qPCR ................................................................. 24 2.7.1. Optimalisatie met behulp van de gradiënt PCR ................................................. 24 2.7.2. Agarose gelelektroforese .................................................................................... 25 2.7.3. Faag-kwantificatie met qPCR ............................................................................ 25 2.8. PBMC isolatie............................................................................................................ 25 2.9. Faag-stimulatie van de PBMCs ................................................................................. 26 2.10. Faag-centrifugatie experiment ................................................................................... 27 2.11. Labelling van de fagen ............................................................................................. 27 2.11.1. Fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) labelling van de fagen ............................... 27 2.11.2. pH sensitieve pHrodo labelling van de fagen .................................................... 27 2.11.3. Testen van de infectiviteit van de gelabelde fagen ............................................ 28 2.11.4. Controle van de fluorescentie-intensiteit ........................................................... 28 2.11.4.1. Fluorescentie-intensiteit van FITC-gelabelde fagen ......................................... 28 2.11.4.2. Fluorescentie-intensiteit van pHrodo-gelabelde fagen ...................................... 28 2.12. Flow cytometrie: detectie fagocyt verantwoordelijk voor faag-fagocytose ........... 28 2.13. Visualisatie van faag-fagocytose. ........................................................................... 29 2.13.1. Adherentie van de PBMCs bepalen na faag-fagocytose .................................... 29 2.13.2. Visualisatie van faag-fagocytose met behulp van microscopie ......................... 29 3. Resultaten en bespreking................................................................................................ 30 3.1. Optimalisatie van de faag kwantificatie .................................................................... 30 3.1.1. Optimalisatie van P. aeruginosa faag PNM kwantificatie ................................. 30 3.1.1.1. Bepaling hybridisatietemperatuur primerparen PNM-1, 2, 3 ............................. 30 3.1.1.2. Optimalisatie van DNA extractie uit P. aeruginosa faag PNM ......................... 31 3.1.2. Optimalisatie van S. aureus faag ISP kwantificatie ........................................... 32 3.1.2.1. Bepaling hybridisatietemperatuur primerparen ISP en ISP-1,2,3,4 ................... 32 3.1.2.2. Optimalisatie van DNA extractie uit S. aureus faag ISP ................................... 33 3.2. Bepaling van faag-fagocytose door faag-titering ...................................................... 33 3.3. Bepaling van faag-fagocytose met qPCR .................................................................. 35 3.4. Visualisatie van faag-fagocytose ............................................................................... 36 3.4.1. Bepaling infectiviteit van de gelabelde fagen .................................................... 36 3.4.1.1. Infectiviteit van de FITC-gelabelde fagen ......................................................... 36 3.4.1.2. Infectiviteit van de pHrodo gelabelde fagen ...................................................... 37 4. 3.4.2. Bepaling fluorescentie-intensiteit van de proteïne gelabelde fagen ................... 37 3.4.3. Microscopische bepaling van faag-fagocytose .................................................. 38 3.4.4. Co-lokalisatie van de FITC-gelabelde fagen en de celkernen ............................ 38 3.4.5. Faag-fagocytose bepaling met pHrodo gelabelde fagen .................................... 39 3.4.6. EEA1 labelling van PBMCs wijst op faag-opname door fagocyten .................. 39 3.4.7. Bepaling van verantwoordelijke fagocyt voor faag-fagocytose ......................... 40 Conclusie .......................................................................................................................... 41 4.1. Aanduiding van faag-fagocytose op kwantitatief niveau .......................................... 41 4.1.1. Optimalisatie van faag-fagocytose kwantificatie met qPCR. ............................. 41 4.1.2. Kwantificatie van faag-fagocytose ..................................................................... 43 4.2. Microscopische visualisatie van faag-fagocytose ...................................................... 45 4.3. Relatie tussen faag-fagocytose visualisatie en kwantificatie ..................................... 47 4.4. Flow cytometrie detectie van de fagocyt verantwoordelijk voor faag-fagocytose .... 48 5. Algemeen besluit ............................................................................................................. 48 6. Referenties ....................................................................................................................... 49 7. Addendum........................................................................................................................... i 7.1. Ondersteuning van materialen en methoden ................................................................ i 7.2. Ondersteuning van de resultaten.................................................................................. ii 7.2.1. Optimalisatie van P. aeruginosa faag PNM kwantificatie ................................... ii 7.2.2. Optimalisatie voor S. aureus faag ISP kwantificatie.......................................... iv 7.3. Visualisatie van faag-fagocytose .............................................................................. viii 7.3.1. Bepaling intensiteit van de proteïne gelabelde fagen ........................................ viii 7.4. Determinatie verantwoordelijke fagocyt voor faag-fagocytose ................................. ix 7.5. Ondersteuning van de bespreking............................................................................... xi Afkortingenlijst ACK Ammonium-Chloride-Kalium Arp2/3 Actin-related proteins 2/3 BAM Bacteriophage adherence to mucus Bp Basenparen BSA Bovine serum albumine CR3 Complement receptor 3 CD Cluster of differentiation CDC42 Cell division control protein 42 CLSM Confocale laser scanning microscoop cRPMI Complete RPMI CsCl Cesium Chloride DAG Diacylglycerol DAPI 4,6-diamine-2-phenylindole dihydrochloride DBPS Dulbecco’s fosfaat gebufferd saline DMSO Dimethylsulfoxide DNA Desoxyribonucleïnezuur dsDNA Dubbelstrengig desoxyribonucleïnezuur EDTA Ethyleendiaminetetra–azijnzuur EE Vroege endosomen EEA1 Early endosome autoantigen 1 EM Elektronenmicroscoop Ena Drosophila Enabled ERK Extracellular signal regulated kinase EtBr Ethidium Bromide EU Endotoxin unit FACS Fluorescence activated cell sorting FcγR Fcγ receptoren FCS Foetaal kalf serum FITC Fluoresceïne isothiocyanaat GEF Guanine nucleotide exchange factor GFP Green Fluorescent Protein gp Glycoproteïne GTP Guanine trifosfaat HBSS Hank’s balanced salt solution Hoc Highly antigenic outer capsid protein Ig Immunoglobuline ITAM Immunoreceptor tyrosine-gebaseerd activatie motief LB Luria-Bertani LE Late endosomen LIMK LIM kinase LPS Lipopolysacchariden MEM Minimum essential medium MHC Major histocompatibility complex MRSA Methicilline/multi-resistente Staphylococcus aureus MWCO Molecular weight cut-off n Aantal testen NK Natural killer cellen PAMP Pathogen-associated molecular pattern PBMCs Perifere bloed mononucleaire cellen PBS Fosfaat gebufferd saline PBST PBS met 0.1 % Tween 20 PCR Polymerase keten reactie pfu Plaque forming unit PI3K Fosfatidylinositol 3 - kinase PIP Fosfatidylinositolfosfaat PI(3)P Fosfatidylinositol-3’-fosfaat PI(4,5)P2 Fosfatidylinositol-4,5-bifosfaat PI(3,4,5)P3 Fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfaat PKA Proteïne kinase A PKC Proteïne kinase C PLC Fosfolipase C pmf Proton motive force PRR Pattern recognition receptors qPCR Kwantitatieve polymerase keten reactie Rac1 Ras-gerelateerd-C3-botuline-toxine substraat 1 RAP1 Ras-related protein 1 rfu Relative fluorescence unit RhoA Ras homolog gene family, member A RILP Rab7-interacting lysosomal protein RNA Ribonucleïnezuur ROS Reactieve zuurstof soorten RPMI Roswell Park Memorial Institute medium SAR Signal arrest release SDS Natriumdodecylsulfaat SHIP SH2-bevattende inositol fosfatase Soc Small outer capside protein Src Sarcoma SYK Spleen tyrosine kinase TAE Tris-acetaat-EDTA TAP Transporter associated with antigen processing TE Tris-EDTA TEM Transmissie elektronenmicroscopie TKD Thymus kalf DNA TLR Toll-like receptoren VASP Vasodilator stimulated phosphoprotein WASP Wiskott-Aldrich syndrome protein WIP WASP interacting protein YG Yellow-Green Samenvatting De laatste jaren is er een groeiende interesse in bacteriofagen, of fagen, als mogelijk alternatief voor de bestrijding van antibiotica-resistente bacteriën. Fagen zijn immers in staat zeer specifiek hun gastheerbacterie te infecteren, om zichzelf te multipliceren en lyse van de bacteriële gastheer te induceren. Faagtherapie werd voor Wereldoorlog II reeds gebruikt in het Westen, maar werd door de ontdekking van antibiotica niet meer toegepast. Voor het toekomstig gebruik van faagtherapie is het noodzakelijk de respons van het humaan immuunsysteem op fagen na te gaan. Gedurende deze masterproef werd gefocust op faagfagocytose, omdat dit een belangrijk aspect vormt bij het opstellen van mogelijke farmacokinetische/-dynamische modellen. En omdat voorgaande onderzoeken omtrent faagfagocytose beperkt waren en tegenstrijdige resultaten opleverde. Binnen deze masterproef werd geopteerd om faag-fagocytose na te gaan met behulp van in vitro stimulatie van de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) met Pseudomonas aeruginosa faag PNM en Staphylococcus aureus faag ISP. Faag-fagocytose werd op 2 manieren bestudeerd, namelijk (1) kwantitatief met behulp van faagtitratie en qPCR en (2) microscopisch met verschillende kleuringstechnieken in combinatie met de confocale laser scanning microscoop (CLSM). De fagen werden hierbij voor de eerste maal ooit gelabeld met FITC en pHrodo proteïne merkers. De PBMCs werden, na stimulatie met de gelabelde fagen, nog gemerkt met de EEA1-labelling om het endosoommembraan te visualiseren als extra aanduiding van faag-fagocytose. Nadat faag-fagocytose kwantitatief en visueel werd aangetoond, werd eveneens gepoogd te bepalen welke fagocyt verantwoordelijk was voor dit proces met behulp van flow cytometrie. De P. aeruginosa faag PNM werd gefagocyteerd na 2 min en de concentratie aan fagen in het supernatans nam niet af naarmate de stimulatieperiode toenam, zodat besloten kon worden dat P. aeruginosa faag PNM - fagocytose snel wordt geïnduceerd en reeds maximaal is na enkele minuten. Microscopisch kon faag-fagocytose slechts aangeduid worden na een incubatieperiode van 90 min. De S. aureus faag ISP werd gefagocyteerd na 90 min volgens de microscopische beelden, maar de qPCR leverde geen betrouwbare resultaten op. De flow cytometrie bood geen uitsluitsel over welke fagocyten verantwoordelijk zijn voor faagfagocytose, dit kon mogelijks een gevolg zijn van een te zwak FITC-signaal van de gelabelde fagen. 1 Summary Background Antibiotic resistance is becoming one of the world’s biggest health problems, whereby in the past years the interest in bacteriophage therapy increased. Before phage therapy can be used, it is necessary to test its safety and efficiency. The focus of this master dissertation will be on the innate immunity, more specifically on phage phagocytosis. Methods Phage phagocytosis was quantified by in vitro stimulation of the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with Pseudomonas aeruginosa phage PNM and Staphylococcus aureus phage ISP by means of plaque assays and qPCR. Phage phagocytosis was also visualized with confocal laser scanning microscopy (CLSM). The visualized phages were for the first time labeled with protein labels FITC and pHrodo. The PBMCs were also labeled with EEA1 to visualize the endosome membrane to obtain more direct evidence of phage phagocytosis. Finally, we attempted to pinpoint the phagocyte by means of flow cytometry. Results P. aeruginosa phage PNM was phagocytized after 2 min and the concentration in the supernatans stayed constant during longer stimulation periods. The S. aureus phage ISP was phagocytized after 90 min, according to visualization, but qPCR didn’t deliver significant results. Phage phagocytosis could be confirmed by microscopic techniques. It was not possible to determine the responsible phagocyte. Conclusions Phagocytosis of phages start on different times and reaches its maximum on different time points. It is possible to visualize phages in short time with protein labels as FITC and pHrodo. At the moment it was not possible to pinpoint the cells responsible for phagocytosis. 2 1. Inleiding De toename aan antibiotica-resistente bacteriën zorgt ervoor dat er een groeiende interesse is in bacteriofaagtherapie als een mogelijk alternatief voor de bestrijding van deze nieuwe generatie micro-organismen [1]. De reden hiertoe en de problematiek omtrent het gebruik van faagtherapie zal binnen deze inleiding uiteen worden gezet. Zo zal kort worden omschreven wat bacteriofagen zijn en hoe ze werden ontdekt. Het tweede gedeelte zal extra uitweiden over de wijze waarop ze zich repliceren om een beter begrip te krijgen van de mogelijke gebruikswijze binnen de bestrijding van bacteriële infecties. En uiteindelijk zal gefocust worden op de tot nog toe gekende effecten van de toediening van fagen op het menselijk immuunsysteem en hoe dit al dan niet een positief effect kan hebben op het gebruik van fagen als een antibacteriële therapie. 1.1. Wat zijn bacteriofagen? Bacteriofagen, of fagen, zijn virussen die in staat zijn bacteriën te infecteren en uiteindelijk leiden tot de lyse van hun bacteriële gastheer [2]. Naar schatting zijn er meer dan 1031 faagpartikels in elke mogelijke niche op aarde aanwezig, waardoor ze de meest abundante repliceerbare entiteiten vormen [1-3]. Deze virussen zijn voornamelijk terug te vinden in oceanen, vers bronwater, de rhizosfeer (regio rond plantenwortels), op planten en voedsel, industriële fermentatie, in de menselijke en dierlijke darmholten [2,4]. Kortom, waar er bacteriën zijn, zijn er ook fagen terug te vinden. De meeste fagen hebben een gemeenschappelijke morfologie, waarbij ze opgebouwd zijn uit een icosahedrale proteïnekop, die het volledige genoom omvat, een kraag en een naaldvormige staart die eindigt in een basisplaat waaraan verschillende vezels verbonden zijn (Fig. 1) [1]. Fig. 1: De basis morfologie van fagen. (A) Elektronenmicroscopische visualisatie van de T4 faag (86 nm) [5] en (B) Grafische weergave van de T4 faag met een duidelijkere weergave van de details [6]. 3 1.2. Algemene geschiedenis De ontdekking van bacteriofagen is niet meteen toe te schrijven aan één persoon. Zo merkte de Britse bacterioloog, Ernest Hankin (1896), op dat de verspreiding van de cholera epidemie in India ingeperkt werd door de aanwezigheid van een ongeïdentificeerd antibacterieel agens in het water van rivieren, de Ganges en de Jumna [1]. Ongeveer twintig jaar later toonde Frederick William Twort, een Britse medisch geschoolde microbioloog, aan dat het antibacterieel agens geïsoleerd kon worden en nood had aan bacteriën om te repliceren, maar gaf aan deze bevindingen geen gevolg [1,7]. Félix d’Hérelle zorgde met de publicatie van ‘Un bactériophage obligatoire’ ervoor, dat fagen herkend werden binnen de microbiologie [8]. Hij maakte gebruik van faagsuspensies om mensen met dysenterie te behandelen. Dysenterie is een ernstige vorm van diarree, veroorzaakt door o.a. de Shigella bacterie, die gepaard gaat met bloed in de ontlasting, en waarvoor in het begin van de 20ste eeuw nog geen behandeling ter beschikking was [2,8]. Na het succes van de klinische trials bij toepassing van faagtherapie leidde dit tot een algemeen enthousiasme omtrent het gebruik van bacteriofagen [1,2]. Na Wereldoorlog II werden fagen door de ontdekking van antibiotica (penicilline; Alexander Fleming) nog nauwelijks gebruikt voor de bestrijding van bacteriële infecties in het Westen [1,9]. De reden hiervoor was dat antibiotica bijna overal beschikbaar waren en konden toegepast worden zonder voorafgaande gedetailleerde kennis van de bacteriële soort, terwijl faag-preparaten slechts tegen een beperkt aantal soorten of stammen binnen een soort effectief waren [10]. In Oost-Europa, vooral in Georgië, en de voormalige Sovjet Unie werd faagtherapie verder ontwikkelt en toegepast bij de behandeling van patiënten voor diverse bacteriële infecties [1,8]. De laatste jaren is er in het Westen een toenemende interesse in faagtherapie door de opkomst van antibiotica-resistente bacteriën, waaronder methicilline/multi-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de nieuwe antibiotica-resistente Clostridium difficile stammen [1,2]. Bacteriën kunnen resistentie opbouwen door middel van veranderingen geïntroduceerd in het bacterieel genoom als gevolg van replicatie en de overdracht van resistentiegenen door conjugatie [11]. Samen met de beperkte ontwikkeling van nieuwe antibiotica leidt dit tot een toenemende interesse in bacteriofaagtherapie [1,12]. Fagen zijn vergelijkbaar met antibacteriële agentia, zoals antiseptica en antibiotica, vanwege hun bacteriolytische eigenschap. Het voordeel van deze virussen is dat ze in staat zijn hun 4 specifieke gastheerbacteriën te infecteren om zich te multipliceren [2]. Deze sterke gastheerspecificiteit zorgt er mogelijks voor dat fagen geen schadelijk effect hebben op de gewenste bacteriën binnen het microbioom [8]. Bacteriofaagtherapie vormt dan ook een mogelijk alternatief voor de bestrijding van bacteriële infecties [2,8]. 1.3. Replicatie van de fagen in de gastheerbacterie 1.3.1. Lytische versus lysogene levenscyclus Fagen kunnen eveneens op basis van hun levenscycli onderverdeeld worden in virulente (lytische) en getemperde (lysogene) fagen (Fig. 2). De lytische fagen kunnen bij aankomst in het cytoplasma van hun gastheerbacterie enkel de lytische cyclus ondergaan waarbij het faaggenoom na injectie autonoom repliceert tot vorming van nieuwe virions, die uiteindelijk leiden tot lyse van de gastheer (Fig. 2A). De getemperde fagen daarentegen alterneren tussen de lytische en de lysogene levenscyclus [13,14]. Gedurende de lysogene replicatiecyclus integreert het faag-genoom in het bacterieel genoom tot vorming van een profaag, dat als onderdeel van het bacterieel genoom mee repliceert gedurende de volgende bacteriële celdelingen (Fig. 2B) [13]. A. Lytische replicatiecyclus B. Lysogene replicatiecyclus Fig. 2: De lytische en lysogene replicatiecyclus. (A) Lytische replicatiecyclus: (1) adsorptie, (2) injectie faaggenoom, (3) replicatie faag-genoom, (4) productie faag- proteïnen tot vorming van nieuwe fagen, (5) lyse van de gastheerbacterie. (B) Lysogene replicatiecyclus: de drie laatste stappen van de lytische replicatiecyclus worden vervangen: (6) integratie van faag-genoom in het bacterieel genoom tot vorming van de profaag, (7) replicatie van de profaag samen met het bacterieel genoom, (8) inductie. Overgenomen uit De Paepe et al. (2014) [14]. 1.3.2. Adherentie Vooraleer fagen zich kunnen repliceren, moeten ze hun specifieke gastheerbacterie infecteren. Dit is enkel mogelijk nadat ze zich vasthechten aan het oppervlak van de gastheer door middel van specifieke aminozuren tussen receptor-bindingseiwitten. Deze binding zorgt voor de initialisering van de DNA transfer doorheen de celwand van de gastheerbacterie [5,15]. De staartuiteinden, variërend van een staarttip tot een complexe basisplaat, spelen een rol bij de 5 adherentie aan het bacterieel celoppervlak en zorgen voor gastheer specifieke herkenning. De faag-gastheer interactie vindt voornamelijk plaats tussen de staartproteïnen en de componenten van het gastheeroppervlak, m.n. oppervlakte proteïnen, polysacchariden en lipopolysacchariden (LPS) [15]. 1.3.3. Injectie: translocatie van het faag-genoom Na adherentie aan specifieke gastheerreceptoren wordt het faag-genoom vanuit het virion geïnjecteerd in de gastheerbacterie [5,16]. Het is hierbij noodzakelijk dat het faag-genoom doorheen het buitenste en het binnenste celmembraan van de Gram-negatieve bacteriën en het celmembraan van de Gram-positieve bacteriën wordt getransporteerd zonder de vitaliteit van de gastheerbacterie te beïnvloeden [5,17]. Hoe dit proces verloopt, is nog niet helemaal gekend, maar de literatuur omtrent genoom injectie handelt over de Myoviridae [16]. Zo zal, bvb. bij de Escherichia coli faag T4, de binding van minimaal 3 staartvezels aan een gastheerreceptor leiden tot conformationele veranderingen van de basisplaat tot een koepelen stervorm (Fig. 3) [5,18]. De verandering van een hoog-energie koepelvormige naar een laag-energie stervormige basisplaat wordt veroorzaakt door contractie van de staartschede, waardoor het contactoppervlak toeneemt (Fig. 3) [18]. Dit leidt er toe dat het onbuigbare binnenste helicale polymeer zich doorheen het buitenste celmembraan van de bacterie kan persen. Sommige fagen zijn echter niet in staat de periplasmatische peptidoglycaanlaag te doorbreken op basis van enkel de contractie, maar maken nog gebruik van specifieke lysozym domeinen ter hoogte van de tip van hun injectiebuis. Het faag-genoom wordt uiteindelijk onder invloed van de opgebouwde druk in de faag-capside in het bacterieel cytoplasma geïnjecteerd [5]. Ontspannen (hoogenergetische conformatie) Koepel Contractie (laagenergetische conformatie) Ster Fig. 3: DNA transfer doorheen bacteriële wand. DNA wordt doorheen de faagstaart gestuurd onder invloed van contractie, door de conformationele verandering van de hoog-energetische koepelvormige structuur naar de laag-energetische stervormige structuur. Aangepast vanuit Garcia-Doval & van Raaij (2013) [5]. 6 1.3.4. Lysogene replicatiecyclus Gedurende de lysogene replicatiecyclus produceren getemperde fagen het integrase enzym, wat na injectie kan leiden tot integratie in het bacterieel genoom en tot vorming van een profaag. Integrase is een enzym dat efficiënt gemedieerde ‘knip en plak’ recombinaties veroorzaakt tussen de herkenningssites met de inbreng van het faag-genoom tot gevolg. Zo zijn er in de -faag, de best bestudeerde lysogene faag, twee verschillende DNA sequenties aanwezig, met name attP en attB, waarop alle soorten integrasen inwerken. Deze sequenties zijn voornamelijk kort en hebben een kern waar cross-over van de basenparen kan plaatsgrijpen. De integrasen worden gegroepeerd in 2 grote families, m.n. de serine- en tyrosine-recombinasen. De recombinatie vindt plaats door covalente binding tussen het DNA en het recombinase [19]. De faag kan echter, onder invloed van bacteriële SOS signalen, terug in de lytische cyclus terecht komen om uiteindelijke lyse van de bacteriële gastheer te induceren (Fig. 2) [3]. 1.3.5. Lyse veroorzaakt door endolysines en holines Gedurende de lytische levenscyclus wordt het faag-genoom met behulp van het bacterieel replicatie en transcriptie/translatie systeem gerepliceerd en dit leidt tot de productie van nieuwe faag-partikels [3]. Deze worden vrijgesteld door lyse van de bacteriële gastheer. Dit fenomeen vindt bij de dsDNA fagen plaats onder invloed van twee proteïnen, de holines en de endolysines [20]. Deze laatste zorgen voor de degradatie van het peptidoglycaan door zijn muralytische activiteit [21]. Er zijn 4 types endolysines die op basis van de geknipte peptidoglycaanbinding worden ingedeeld in de N-acetylmuraminidasen, N-acetyl- -Dglucosaminidasen/transglycosidasen, N-acetylmuramoyl-L-alanine amidasen en de L-alanoylD-glutamaat endopeptidasen/ interpeptide brug-specifieke endopeptidasen [20,22]. Het endolysine is echter enkel in staat om vanuit het cytoplasma het peptidoglycaan van de bacterie te bereiken met behulp van een tweede eiwit, namelijk het holine [20]. Dit zijn kleine membraanproteïnen die ter hoogte van het binnenste celmembraan samenkomen om nietspecifieke kanalen te vormen, die het endolysine toelaat het peptidoglycaan te bereiken en af te breken (Fig. 4A). Naast dit conicaal holine-endolysine model is er ook nog het vergelijkbare pinholin-signal arrest release (SAR) endolysin model (Fig. 4B). Dit is een holine-onafhankelijk model, waarbij het endolysine een membraangebonden vorm aanneemt. Wanneer het membraangebonden enzym voldoende accumuleert, komt het enzym terecht in het periplasma en neemt het een katalytische vorm aan [21]. 7 Na lyse van de peptidoglycaanlaag, dient ook nog het buitenste celmembraan te worden gedegradeerd [23]. Zo bleek uit een studie omtrent de faag λ lyse dat er een derde proteïne noodzakelijk is om de lyse van de gastheer effectief te voltrekken. Deze proteïnen staan bekend als spaninen, waarbij de spaninen, Rz en Rz1, van de faag noodzakelijk zijn voor de lyse van het buitenste celmembraan [24]. Fig. 4: Lyse modellen. (A) Het holine en endolysine model en (B) het pinholine-SAR endolysine model met vorming van kleinere transmembranaire kanalen. Overgenomen uit Young (2014) [21]. Legende: pmf: proton motive force; : endolysines; : holine. Holines bestaan uit een korte sequentie die voornamelijk hydrofoob is met een zeer hydrofiel carboxy-terminaal domein en kunnen in 2 klassen verdeeld worden. Zo bestaan klasse I holines uit 3 transmembranaire domeinen met de N-terminus aan de buitenzijde en de Cterminus aan de binnenzijde van het cytoplasmatisch membraan van de bacterie, en de klasse II holines beschikken over 2 transmembranaire domeinen, waarvan zowel de N- als de Cterminus zich aan de binnenzijde bevinden [20,25]. 1.4. Faagtherapie en het belang van de farmacokinetiek De ontdekking van antibiotica was een belangrijke gebeurtenis binnen de medische geschiedenis voor de bestrijding van bacteriële infecties [26]. De recente toename aan antibiotica-resistente bacteriën, door het misbruik van antibiotica in ziekenhuizen samen met het overmatig voorschrijven van antibiotica in onnodige gevallen zoals bij verkoudheden, hoesten en andere virale infecties, zorgden ervoor dat er een grote nood ontstond aan een alternatief voor de bestrijding van bacteriële infectieuze ziekten. Fagen zouden hierbij een mogelijke oplossing kunnen vormen. Deze virussen hebben immers enkele voordelen ten opzichte van antibiotica. Zo zijn deze ecologisch veilig door hun reeds sterke abundantie in mensen, dieren en planten, en zijn ze gemakkelijk toe te passen en te produceren. Eveneens zijn er momenteel nog geen indicaties dat faagtherapie neveneffecten, zoals deze veroorzaakt 8 door de vrijstelling van endotoxines door lyse van de bacteriële gastheer, zou veroorzaken na toediening [1,27]. Tot slot zijn antibiotica gericht tegen verschillende bacteriële pathogenen, terwijl fagen specifiek gericht zijn naar één bacteriële gastheer. Dit vormt zowel een voordeel als nadeel voor faagtherapie, want dit zorgt ervoor dat de normale microflora van de patiënt nauwelijks wordt aangetast, maar slechts enkel toepasbaar is op die infecties waarbij het pathogene micro-organisme gekend is. Dit probleem zou in de praktijk echter opgelost kunnen worden door gebruik te maken van multi-componente faag bereidingen, ook bekend als cocktails [7,10,27,28]. Fagen werden snel na hun ontdekking gebruikt voor de behandeling van dysenterie. De eerste studie omtrent faagtherapie werd uitgevoerd in het Hôpital des enfants-malades in Parijs (1919), waar d’Hérelle voor de eerste maal een 12-jarige jongen met ernstige dysenterie behandelde met fagen. Dit vormde het eerste experiment, dat nooit werd gepubliceerd, maar wel de eerste aanduiding gaf van de efficiëntie van faagtherapie [7]. Nadat ook andere studies de efficiëntie aanduidden, startten enkele bedrijven, zoals the Eli Lilly Company en L’Oréal, met de commerciële productie van fagen tegen verschillende bacteriën. Zo werden in de US fagen gebruikt voor de productie van ‘vaccins’ gericht tegen onder andere staphylokokken voor mensen en dieren. Deze werden onder regulatoire druk teruggetrokken voor het gebruik op mensen, maar zijn nog steeds op de markt beschikbaar voor de toepassing op dieren [7]. In de voormalige Sovjet Unie werden fagen na de ontdekking van antibiotica nog uitgebreid gebruikt om bacteriële infecties te bestrijden. Één van de bekendste centra voor bacteriofaagonderzoek en de productie van therapeutische faagpreparaten is het George Eliava Instituut van Bacteriofagen, Microbiologie en Virologie in Tbilisi (Georgië) [27]. Deze preparaten werden onderworpen aan pre-klinische en klinische studies in Rusland. Echter zijn de Russische standaarden voor klinische studies minder strikt dan de internationaal aanvaarde standaarden [7,27]. Bovendien zijn de resultaten niet in de westerse literatuur beschikbaar, vanwege het feit dat de gegevens niet in het Engels werden gepubliceerd, wat leidde tot wantrouwen en terughoudendheid om internationale toestemming te verlenen [27]. Faagtherapie zal kunnen toegepast worden binnen de westerse geneeskunde, nadat enkele aspecten omtrent de efficiëntie en de veiligheid verduidelijkt worden zoals onder andere de farmacokinetiek en farmacodynamiek. Zo zal binnen farmacokinetische studies dieper ingegaan worden op de concentratiefluctuaties aan fagen ter hoogte van de plaats van infectie. Hiernaast zullen ook de farmacodynamische aspecten bestudeerd worden waarbij de relatie 9 tussen de therapeutische toepassing en de reductie van de bacteriële pathogenen worden omschreven [2,10]. Diverse onderzoeksgroepen bestuderen de factoren die een mogelijke invloed hebben op de farmacokinetiek (Fig. 5). Hun bevindingen verwerken ze in theoretische mathematische modellen om te voorspellen of specifieke faagtherapie zal slagen of niet [29-32]. Wanneer er geen invloed van het immuunsysteem, antibiotica of fagen aanwezig is, bleek de bacteriële populatie exponentieel toe te nemen in aantal tot de niet-bacteriële gastheer overlijdt. Faagtherapie wijkt af van de farmacokinetiek die we bij antibiotica therapieën waarnemen, omdat ze een specifieke faag-densiteitsdrempelwaarde bereiken, terwijl antibiotica start met een toegediende beginconcentratie die gedurende metabolisatie volledig wordt gedegradeerd [31]. De relatie met het immuunsysteem speelt eveneens een belangrijke rol bij faagtherapie, omdat rekening gehouden moet worden met de afbraak van fagen door middel van macrofagen, neutrofielen en andere immuuncellen, zoals de cytotoxische T-cellen en specifieke antilichamen (Fig. 5) [29]. Een recente publicatie van Hodyra-Stefaniak et al. (2015) gaf aan dat het innate immuunsysteem binnen de muizen gestimuleerd kon worden door geïnfecteerde bacteriën, waardoor de fagen door middel van fagocytose werden gedegradeerd. Deze belemmering van de efficiëntie van faagtherapie kan mogelijks opgelost worden door aanpassingen door te voeren bij de dosering en toedieningstijden/frequentie. Naast fagocytose bleek bestaande immuniteit door eerdere blootstelling aan een gelijkaardige faag een grote belemmering te zijn van de goede werking van faagtherapie [32]. Fig. 5: Model van de in vivo dynamiek tussen bacteriën, fagen en de humane immuuunafweer. Deze symbolen werden toegepast als variabelen in mathematische modellen. P = fagen, S = bacteriën, I = innate immuunsysteem, A = adaptief immuunsysteem als reactie op de fagen, B = adaptief immuunsysteem als reactie op de bacteriën. De rode pijlen staan voor een stimulerend effect en de blauwe pijlen staan voor een inhiberend effect. Overgenomen van Hodyra-Stefaniak et al. (2015) [32]. 10 1.5. Het immuunsysteem Naast de interactie van faag en bacterie komt er steeds meer interesse naar de mogelijke interactie van fagen met het immuunsysteem, meer specifiek met dat van de mens [33]. De immunogeniciteit van de fagen in het menselijk lichaam vormt immers een factor die bepalend is voor de uitkomst van toekomstige klinische trials [32,34]. Het innate immuunsysteem zorgt voor de eerste niet-specifieke immuunreactie tegen mogelijke pathogenen, waarna het leidt tot de inductie van het adaptief immuunsysteem [35]. Het innate immuunsysteem gaat van start na de herkenning van pathogen associated molecular patterns (PAMPs). Een typisch voorbeeld dat zorgt voor een sterke activatie van het innate immuunsysteem zijn de lipopolysacchariden (LPS, endotoxines) die een onderdeel vormen van het buitenste celmembraan van de Gram-negatieve bacteriën. Deze componenten worden in het lichaam herkend aan de hand van toll-like receptoren (TLRs) en andere pattern recognition receptors (PRR). De herkenning van deze lichaamsvreemde partikels induceert de productie van cytokines door specifieke immuuncellen en wordt geassocieerd met inflammatie [32]. De witte bloedcellen die bijdragen tot het innate immuunsysteem zijn de eosinofielen, basofielen, natural killer (NK) cellen en de fagocyten. Deze laatste groep bestaat voornamelijk uit monocyten/macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen [26,36]. Het adaptief immuunsysteem, in tegenstelling tot het innate immuunsysteem, leidt tot een antigen-specifieke immuunrespons, die daarenboven leidt tot de opbouw van geheugen tegen een bepaald antigen [34]. Afhankelijk van het type cellen en de functie kunnen we het adaptief immuunsysteem onderverdelen in de humorale en cellulaire immuniteit. De humorale immuniteit, of antilichaam-gemedieerde immuniteit, wordt veroorzaakt door Bcellen die specifieke antilichamen produceren. Deze antilichamen vormen belangrijke componenten in de bestrijding van diverse pathogenen. Zo binden antilichamen op antigenen van het pathogeenoppervlak om herkenning van de pathogenen mogelijk te maken en deze te verwijderen op basis van neutralisatie, complement activatie en opsonisatie. De cellulaire immuniteit beschermt daarentegen het lichaam met antigen specifieke cytotoxische T-cellen die in staat zijn apoptose van geïnfecteerde cellen te induceren, macrofagen en NK cellen te stimuleren, samen met de productie van cytokines om de immuunrespons verder te reguleren [33,37]. 11 1.5.1. Interacties van bacteriofagen met het adaptief immuunsysteem Recente studies tonen aan dat fagen effectief interageren met het adaptief immuunsysteem [32,34]. Zo werd voornamelijk nagegaan welke antilichamen tegen fagen worden geproduceerd in muizen na blootstelling aan oraal en intraveneus toegediende fagen [34,38]. Uit de studie van Dabrowska et al. (2014) bleek dat bepaalde capside proteïnen van de T4 faag, zoals het highly antigenic outer capsid protein (Hoc) en glycoproteïne 23 (gp23), zorgden voor een sterkere inductie van specifieke immunoglobuline G (IgG) en IgM ten opzichte van de small outer capsid protein (Soc) en gp24 eiwitten. Men kan dus besluiten dat de sterkst immunogene capside-antigenen van de T4-fagen mede bijdroegen tot de ontwikkeling van het immunogeen geheugen. De onderzoeksgroep van Ishii en Yanagida maakten reeds 40 jaar geleden bekend dat het Hoc proteïne zeer immunogeen is, wat ook blijkt uit de naam die het proteïne toegewezen heeft gekregen [34]. Naast de inductie van het immunologische geheugen zijn voornamelijk neutralizerende antilichamen terug te vinden na faag-stimulatie. De meeste individuen beschikken reeds over een lage vorm van natuurlijke immuniteit doordat fagen alomtegenwoordig zijn in onze omgeving [33]. Om deze redenen wordt in een klinische setting gebruikgemaakt van de E. coli faag X175 om de humorale respons na te gaan in mensen met primaire en secundaire immunodeficiënties en zo in staat zijn een diagnose te stellen [39]. De CD8+ en CD4+ T-cellen spelen een belangrijke rol in de cellulaire immuniteit om virale infecties te bestrijden, maar omtrent dit deel binnen het adaptief immuunsysteem is in relatie met fagen nog maar weinig onderzoek uitgevoerd. De reeds bekende gegevens zijn daarentegen ook nog tegenstrijdig. Zo werd in 1978 gepubliceerd dat E. coli fagen MS-2 lymfocyten activeren, maar in de studie van Srivastava et al. (2004) bleek dat muis T-cellen een beperkte invloed zouden hebben op het degradatie-proces van de E. coli faag T7 [33,40]. 1.5.2. Interacties van bacteriofagen met het innate immuunsysteem Binnen het innate imuunsysteem spelen zoals eerder vermeld neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen en NK cellen een belangrijke rol. Gedurende deze masterproef zullen we ons voornamelijk focussen op de interacties van bacteriofagen met fagocyten (monocyten/macrofagen en granulocyten). De gegevens over dit soort interacties zijn zeer beperkt en gevarieerd [26]. 12 1.5.2.1. Adherentie van fagen aan het mucosaal epitheel Naast de directe interacties tussen fagen en fagocyten zijn er reeds aanduidingen dat fagen ook zelf zullen bijdragen tot de bescherming van de menselijke gastheer. Zo wordt er gesproken van het ‘bacteriophage adherence to mucus’ (BAM) model, waarbij fagen adhereren aan de mucuslaag van de gastheer door middel van Ig - like domeinen en zich daardoor subdiffuus doorheen de mucuslaag zullen bewegen zoals werd aangetoond voor de Hoc bevattende T4-fagen. De mucuslagen vormen immers een eerstelijnsdefensie tegen infectie van de mucosale epithelen door o.a. bacteriële pathogenen. De adherentie van de fagen aan de mucuslaag zorgde voor een reductie in microbiële kolonisatie en pathologie. Dit model zou dus aanzien kunnen worden als een niet-gastheer gebonden antimicrobiële defensie van de mucuslagen [41,42]. 1.5.2.2. Fagocytose Partikels kunnen op verschillende wijze in de cel worden geïnternaliseerd, m.n. door endocytose, macropinocytose, autofagie, cel-kannibalisme en fagocytose [35]. Deze laatste is een sterk geconserveerd mechanisme dat aan de hand van gespecialiseerde immuuncellen, zoals macrofagen, dendritische cellen en neutrofielen, een constante bescherming levert tegen pathogenen, verzwakte cellen en debris door opname en afbraak volgens een meerstappenproces dat van start gaat na de herkenning van de partikels op basis van PAMPs [43-45]. De wijze waarop deze worden geïnternaliseerd, is zeer divers en afhankelijk van de receptoren waarop het lichaamsvreemde partikel gebonden is. De receptoren die bijdragen tot fagocytose kunnen volgens het tethering and tickling model onderverdeeld worden in 2 groepen, namelijk de receptoren die zelf de internalisatie induceren en degenen die zorgen voor de adherentie van het antigen aan het fagocytair oppervlak, zoals opsonisatie [35]. Voorbeelden van inducerende receptoren zijn dectine 1, dat interageert met de fungale β-1,3glycanen, de Fc receptoren en complement receptor 3 (CR3), die respectievelijk de IgG- en C3b gelabelde partikels herkennen [35,45]. 1.5.2.2.1. Partikel-opname door fagocyten volgens diverse pathways Fagocytose inductie verloopt volgens receptor-specifieke pathways. Zo zal de binding van IgG complexen aan Fcγ receptoren (FcγR) onder invloed van de Sarcoma (Src)-familie tyrosine kinase zorgen voor de fosforylatie van de tyrosine residuen in het immunoreceptor tyrosine-gebaseerd activatie motief (ITAM) domein (Fig. 6) [45]. Vervolgens zal voornamelijk spleen tyrosine kinase (SYK) binden ter hoogte van het gefosforyleerde ITAM, 13 waarna het zorgt voor de fosforylering van de tyrosine residuen in proteïnen die downstream noodzakelijk zijn voor de actine reorganisatie [44,45]. Naast SYK kan ook het type I fosfatidylinositol-3’-kinase (PI3K) zorgen voor fosforylatie van fosfatidylinositolfosfaat (PIP) tot vorming van fosfatidylinositol-4,5-bifosfaat (PI(4,5)P2) en fosfatidylinositol-3,4,5trifosfaat (PI(3,4,5)P3) [44]. Dit zou mogelijks bijdragen tot de aanlevering van membranen, afkomstig van cellulaire compartimenten, naar het celmembraan om grotere pseudopoden, of membraan extensies, te vormen die het pathogeen partikel omgeven bij verdere opname in de fagocyt [45]. De aanlevering van interne membranen naar het celoppervlak wordt ‘focale exocytose’ genoemd [44,45]. De accumulatie van 3’-fosfoinositiden aan de pseudopoden wordt gereguleerd door het lipide fosfatase SHIP (SH2-bevattend inositol fosfatase). Fosfolipase C (PLC) zorgt voor de productie van diacylglycerol (DAG) uit PI(4,5)P 2, dat niet enkel een substraat is van PI3K. Diacylglycerol leidt op zijn beurt tot de activatie van de oorspronkelijke en nieuwe isovormen van proteïne kinase C (PKC). Deze kinasen worden vervolgens aangebracht op het geproduceerde fagosoom. De hier besproken kinasen worden voornamelijk gedetecteerd bij de FcγR-gemedieerde fagocytose in macrofagen. Bij neutrofielen is opgemerkt dat ook MEK1, proteïne kinase A (PKA) en/of extracellulair signaal gereguleerd kinase (ERK) bijdragen tot de FcγR-gemedieerde fagocytose [46]. De CR3 pathway maakt geen gebruik van fosforylatie, maar wel van het kleine G proteïne Ras-related protein 1 (RAP1), dat geactiveerd wordt door inflammatoire mediatoren. De aanwezigheid van RAP1 in de cel zorgt ervoor dat CR3 bindt met mogelijke liganden en fagocytose initieert [45]. Eveneens is duidelijk dat de FcγR-pathway gebruikmaakt van Vav en dat de CR3gemedieerde opname enkel gebaseerd is op Ras homolog gene family member A (RhoA) [45]. Vav is een guanine nucleotide exchange factor (GEF) die zorgt voor de activatie van Rasgerelateerd C3 botulinum toxine substraat 1 (Rac1). Samen met cell division control protein 42 (CDC42) beïnvloeden ze de samenstelling van het actine netwerk bij de vorming van het fagosoom [44,45]. Echter vervullen CDC42 en Vav complementaire functies. Zo leidt CDC42 accumulatie tot de uitstrekking van de pseudopoden en Rac1, verspreid over de volledige Factine gevormde fagocytose-kelk, draagt bij tot de sluiting van het fagosoom. Net als bij de FcγR-geïnduceerde pathway zal RhoA de fagocytose-kelk vormen met behulp van F-actine, maar ook met andere cytoskeletaal geassocieerde proteïnen. Guanine trifosfaat (GTP)gebonden CDC42 en PI(4,5)P2 zorgen voor de downstream activatie van Wiskott-Aldrich 14 syndrome protein (WASP), waarna het actin-related proteins 2/3 (Arp2/3) complex wordt geactiveerd en WASP interageert met het WASP interacting protein (WIP) om de fagocytosekelk te vormen op de plaats van partikel adherentie samen met behulp van het Drosophila enabled/Vasodilator stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) dat zorgt voor de accumulatie van F-actine bij het vormende fagosoom [45]. F-actine wordt beïnvloed door gelsoline, cofiline en myosine (Fig. 6). Gelsoline is een molecule dat gereguleerd wordt door de aan- of afwezigheid van PI(4,5)P2 en Ca2+. Deze molecule draagt bij tot de aanlevering van F-actine in de FcγR pathway. Cofiline zal mede de actine-dynamiek reguleren met behulp van de inhibitor LIM kinase (LIMK), die actine binding en depolymerisatie van cofiline tegengaat. Myosine zorgt echter voor de contractiliteit als motor-proteïne. Er zijn diverse types myosine-proteïnen die allen een functie hebben ter hoogte van de fagocytose-kelk, maar inwerken op diverse tijdstippen. Zo draagt bijvoorbeeld myosine II bij tot de pseudopoden-extensie en myosine IC bij de effectieve opname van het fagosoom in de fagocyt [44]. Naast de opname van het partikel produceren de neutrofielen en monocyten reactieve zuurstof soorten (ROS), die mede deel uitmaken van het beschermingsmechanisme tegen microbiële pathogenen [47]. Fig. 6: FcγR-gemedieerde fagocytose pathways. De figuur duidt aan dat diverse fagocytose pathways doorlopen kunnen worden om de pathogene partikels in de macrofaag te internaliseren. Overgenomen van de site: https://www.qiagen.com/be/shop/genes-and-pathways/pathway-details/?pwid=179 [48]. 15 1.5.2.2.2. Maturatie van het fagosoom en antigen-presentatie Na de opname van het partikel in de fagocyt depolymeriseert F-actine van het fagosoom en fuseert het met diverse organellen van de endocytische pathway [43,44]. De snelheid waarmee het fagosoom fuseert met het lysosoom is afhankelijk van de inhoud, die het fagosoom heeft opgenomen. Na opname zorgt VPS34 type III PI3K voor de accumulatie van fosfatidylinositol-3’-fosfaat (PI(3)P) op het fagosomaal membraan (Fig. 7). Dit proces wordt gereguleerd met GTPase Rab5 dat interageert met VPS34 PI3K en fuseert met het vroege fagosoom [44]. Naast Rab5 is ook early endosome autoantigen 1 (EEA1) (Fig. 7A), een proteïne dat vroege endosomen aantrekt om te adhereren en te fuseren met het fagosoom. Syntaxin 13, afkomstig van de gerecycleerde endosomen en Syntaxin 6, afkomstig van de late endosomen, spelen mogelijks een rol bij fagosoom maturatie. Syntaxin 7 daarentegen is een proteïne dat zich lokaliseert ter hoogte van Golgi-afgeleide vesikels en waarvan gekend is dat ze interageren met EEA1 om zo te fuseren met zowel de vroege endosomen als de fagosomen [49]. Deze aspecten worden mogelijks mede gereguleerd onder invloed van Rab proteïnen [43]. Na de diverse fusies zorgt Rab5 voor de aantrekking van de Rab7-bezittende late endosomen [44,49]. Het Rab7-interacting lysosomal protein (RILP) interageert met het dyneine-dynactine complex dat gedurende de maturatie zorgt voor de fagosoom-mobilisatie doorheen de cel met behulp van de microtubuli om de kans op interacties met een mogelijke lysosoom/endosoom te verhogen [35,44]. A B Fig. 7: Schematische weergave van fagosoom maturatie na opname van een IgG geopsoniseerd microorganisme. (A) Het IgG-geopsoniseerde micro-organisme wordt opgenomen door de fagocyt om vervolgens te fuseren met een early endosome en vervolgens te interageren met een late endosome en een lysosoom tot vorming van een fago-lysosoom. Symbolen: PI(3,4,5)P3, PI(3)P, Actine filament, Rab5, Rab7, EEA1, syntaxin-6, EE: vroege endosomen, LE: late endosomen, PI3K III: type III PI3K. Aangepast uit Gillooly et al. [49] (B) Schematische weergave van de fagosoom maturatie en antigen productie om uiteindelijk te presenteren aan de adaptieve immuuncellen met behulp van MHCI enen MHCII. Overgenomen uit Niedergang & Chavrier [44]. 16 De fusie van de lysosomen met het fagosoom induceert een daling in pH door middel van de aangeleverde hydrolasen, waarna degradatie van het opgenomen partikel plaatsgrijpt. Peptiden die gevormd worden gedurende de afbraak worden gepresenteerd met behulp van de major histocompatibility complex (MHC) klasse II moleculen en MHC klasse I moleculen. Deze moleculen worden na opname van het peptide geëxpresseerd op het celoppervlak van de fagocyt om respectievelijk de CD4+ en de CD8+ T-lymfocyten te activeren. Dit proces staat ook bekend als cross-presentation. De aanloop naar deze vorm van peptide-presentatie verloopt bij de MHCI moleculen echter niet onmiddellijk na degradatie. Het fagosoom zou voorafgaand moeten fuseren met het endoplasmatisch reticulum om over verschillende componenten te beschikken die zouden bijdragen tot MHCI-presentatie (Fig. 7B). Zo zou een peptide uit het fagosoom getransporteerd worden doorheen het Sec61-kanaal naar het cytosol waar het verder gedegradeerd wordt door het proteosoom na ubiquitinylatie om vervolgens teruggevoerd te worden naar het fagosoom via de transporter associated with antigen processing (TAP). Eens in het fagosoom kunnen de MHCI-moleculen het gevormde peptide presenteren aan de CD8+ T-cellen [44]. 1.5.2.2.3. Invloed van fagen op fagocytose Fagen zijn in staat om zich doorheen de darmwand te verplaatsen naar de bloedbaan, waarna ze interageren met het human immuunsysteem, zoals bijvoorbeeld met de fagocyten [50]. Zo zou de aanwezigheid van fagen het complexe proces van fagocytose in een zoogdier kunnen stimuleren of inhiberen, en dit zou een belangrijk effect kunnen hebben op de farmacokinetiek van de fagen [26]. D’Hérelle trachtte in 1922 de relatie tussen de fagocytose-respons en de aanwezigheid van fagen aan te tonen door leukocyten met de Shigella faag en zijn bacteriële gastheer te stimuleren. Deze experimentele condities leidden uiteindelijk tot een toename in fagocytose. Dit werd later weerlegd door Kantoch et al. die aantoonden dat bij cavialeukocyten na faag T5-stimulatie met E. coli er geen verschil was in fagocytose respons met de conditie waar enkel E. coli toegevoegd werd [33]. Gedurende voorgaande studies werd geen onderscheid gemaakt tussen de verschillende fagocyten. Een studie uitgevoerd door Weber-Dabrowska et al. (2002) maakte wel onderscheid tussen de verschillende fagocyten. Hun studie omvatte neutrofielen om na te gaan of faag-therapie mogelijks een invloed zou hebben op de fagocytose door humane neutrofielen gericht tegen Staphylococcus aureus. Na toediening van de fagen aan de patiënten en gezonde vrijwilligers werd duidelijk dat de fagocytose activiteit afnam gedurende de therapie, maar dit kon 17 mogelijks verklaard worden door de vooraf ingenomen antibiotica. Meer opvallend was dat er na faagtherapie meer immature neutrofielen werden waargenomen in het bloed dan mature neutrofielen. Fagen zouden de regeneratie van neutrofielen kunnen versnellen [51]. Dit effect was echter afhankeljk van de faag/bacterie/fagocyten–stimulatie, want de E. coli faag T4 samen met de E. coli bacterie versterkte de fagocytose respons wanneer de bacteriële gastheer en de fagen voor 15 minuten werden geïncubeerd. Wanneer alles samen werd toegevoegd op hetzelfde ogenblik leek de bacteriële fagocytose gedeeltelijk afgeremd te zijn, maar in minder mate dan bij pre-incubatie van de fagen met fagocyten. Deze feiten werden zowel bij neutrofielen als bij de monocyten teruggevonden [47]. ROS werd reeds aangehaald als extra beschermingsmechanisme van de fagen. Uit de luminolafhankelijke chemiluminescentie test had men kunnen afleiden dat ROS productie dosisafhankelijk afgeremd werd door fagen, wat een extra aanduiding is van de bacteriële fagocytose respons limitering door fagen [47]. 1.5.2.2.4. Interacties van bacteriofagen met fagocyten Fagocytose zou mogelijks ook bijdragen tot de eliminatie van bacteriofagen in de menselijke gastheer. Monocyten/macrofagen en de granulocyten werden hiervoor reeds verantwoordelijk gesteld [26,33]. De eerste studies omtrent dit onderwerp dateren van de late jaren 50 en de vroege jaren 60 waarbij Kantoch et al. aantoonden dat fagen in staat waren aan cavialeukocyten te binden en waarbij het aantal leukocyten toenam naarmate de faag concentratie steeg. Later werd aan de hand van in vitro studies duidelijk dat fagen effectief door de leukocyten werden opgenomen [26]. Dit werd reeds in 1968 door Nelstrop et al. ondersteund aan de hand van een in vitro experiment met peritoneale macrofagen verkregen van konijnen, die op basis van faagtitratie aantoonde dat er een reductie was van het faag-aantal in het supernatans. Men kon echter wel opmerken dat de fagocytose sneller plaatsgreep wanneer de konijnen reeds voorheen geïmmuniseerd werden met de T1 faag [52]. Het belang van macrofagen binnen de eliminatie van fagen werd verder geduid door de sterke toename aan faag-opname door de Kupffercellen (lever-macrofagen). Zo zou de lever 99 % van de intraveneus geïntroduceerde fagen degraderen door middel van fagocytose door de Kupffer cellen [53]. De opname van fagen door de peritoneale macrofagen werd in dezelfde periode gevisualiseerd met de electronenmicroscoop (EM). Binnen de studie van Aronow et al. leken de fagen eerst te adhereren aan het celoppervlak, waarna ze door middel van fagocytose na ongeveer 7 minuten werden opgenomen door de cellen, terwijl voor neutrofielen dit tot 18 ongeveer 15 minuten zou duren [54]. Er kon worden aangetoond dat fagocytose door peritoneale macrofagen gemiddeld na 7 minuten plaatsvond, terwijl fagocytose door neutrofielen na 15 minuten plaatsvond. Aan hand van in vivo experimenten in muizen werd door de onderzoeksgroep van Srivastava et al. (2004) aangetoond dat macrofagen niet verantwoordelijk zijn voor faag-fagocytose, terwijl Uchiyama et al. (2009) aantoonde dat eveneens neutrofielen bij dit proces geen functie uitvoeren [40,55]. Recent werd door HodyraStefaniak et al. (2015) echter aangetoond dat fagen wel zouden opgenomen worden door macrofagen op basis van de visualisering van de opgenomen GFP gelabelde fagen, die aanduidde dat macrofagen binnen de menselijke gastheer zorgen voor de degradatie van de intraveneus toegediende fagen [32]. 1.6. Doel van de masterproef De opkomst van antibiotica-resistente bacteriën leidde tot een toegenomen interesse in fagen, vanwege hun bacteriolytische eigenschappen, als een mogelijk alternatief om deze microorganismen te bestrijden. Alhoewel er reeds gegevens bekend zijn over de effectiviteit van faagtherapie bij dieren en mens, blijft het onduidelijk hoe toediening van bacteriofagen als een mogelijke behandeling, zou interageren met het humaan immuunsysteem. Faagtherapie staat of valt met de farmacokinetiek/dynamiek. Net als bij antibiotica is de mate waarop een bacteriële infectie wordt behandeld afhankelijk van de verandering in concentratie van antibiotica in de geïnfecteerde patiënt. Bij fagen moeten we eveneens rekening houden met het feit dat de fagen repliceren in de menselijke gastheer [10]. Om de onzekerheid omtrent het al dan niet plaatsgrijpen van faag-fagocytose op te lossen, zullen we met behulp van in vitro stimulatie van de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) met Staphylococcus aureus faag ISP en Pseudomonas aeruginosa faag PNM kwantitatief nagaan of fagocytose plaatsgrijpt met behulp van faagtitratie en qPCR. Wanneer duidelijk is geworden dat fagocytose voorkomt, zullen we de gefagocyteerde fagen trachten te visualiseren na opname in de fagocyt. Hierbij zal onmiddellijk ook getracht worden een eenvoudigere wijze van faag-visualisatie te creëren op basis van eiwitkleuringen. Waarna ook gepoogd wordt de verantwoordelijk fagocyt voor faag-fagocytose te bepalen. 19 2. Materialen en Methoden 2.1. Bereiding van solid (1.5 %) agar platen en semi-solid (0.6 %) agar Solid agar (1.5 %) platen werden bereid door 16 g Luria-Bertani (LB) broth (BD Difco, Sparks, Canada) en 12 g Bacto agar (BD Difco) samen te voegen in een steriele 1 l fles met 800 ml gedistilleerd water, waarna deze in de autoclaaf werden geplaatst. Na het opkoken in de autoclaaf werd het medium overgebracht in de flow, naar petrischalen in volumes van 20 tot 25 ml (+/- 5 mm diepte). Na ongeveer 15 min waren de media gestold en werd het deksel erop geplaatst om ze gedateerd te bewaren bij 4 °C. Semi-solid agar (0.6 %) werd bereid door de samenvoeging van 4 g LB broth, 1.2 g agar (BD Difco) en 200 ml gedistilleerd water in een steriele 250 ml fles. Deze werd geautoclaveerd en hierna bewaard bij kamertemperatuur. Deze semi-solid agar werd gebruikt voor de experimenten beschreven onder punten 2.2., 2.3., 2.10, 2.11.3. 2.2. Faagtitratie: Double agar overlay methode Voorafgaand aan de faagtitratie werd één kolonie van de gekweekte bacteriële gastheer (Tabel 1) overgeënt naar een buis met schuine agar (slant) en overnacht gegroeid bij 37 °C. Om de concentratie van bestaande faagstocks te bepalen, werd een deci-normale verdunning (log(0) tot log(-12)) van de fagen bereid. Er werd gebruikgemaakt van de Staphylococcus aureus faag ISP en de Pseudomonas aeruginosa faag PNM (geleverd door het Eliava Instituut, Tbilisi, Georgië) (Tabel 1). Van elke verdunning werd 1 ml overgebracht naar een 15 ml Falcon buis. Hieraan werd 100 µl van de bacteriële gastheer toegevoegd. De semi-solid agar werd opgekookt en daarna afgekoeld tot 45 °C en per Falcon buis werd ongeveer 3 ml hiervan toegevoegd. Deze suspensie werd gemengd door de Falcon tussen de handen te rollen. Elke suspensie werd daarna onmiddellijk uitgespreidt naar één van de solid agar platen. Deze werden overnacht geïncubeerd bij 32 °C, waarna de faag-concentratie werd bepaald door de plaques bij één verdunning verder te tellen dan de webbing (2.3.; Addendum: Fig. 17). Tabel 1: Karakteristieken van de gebruikte fagen en hun bacteriële gastheren. Faag soort Orde Familie Genoom Genoom grootte (bp) ISP Caudovirales Myoviridae Lineair dsDNA 138.339 PNM Caudovirales Podoviridae Lineair dsDNA 42.721 Bacteriële gastheer Staphylococcus aureus SA6538 Pseudomonas aeruginosa PA573 Legende: bp = basenparen. 20 2.3. Propagatie van bacteriofagen Bacteriofagen werden gepropageerd door eerst de concentratie te bepalen waarbij webbing optreedt met behulp van de double agar overlay methode (2.2.). Webbing kan waargenomen worden wanneer de faag-oplossing zo sterk verdund is dat er maximale lyse van de gastheercultuur plaatsgrijpt, waarbij nog individuele plaques waar te nemen zijn. Webbing wordt verkregen bij de hoogste faag-concentratie die met zekerheid gedetecteerd kan worden op de petrischaal. Deze concentratie werd gebruikt om een nieuwe faagstock te produceren aan de hand van de double agar overlay methode. De fagen in de semi-solid agar werden geoogst door de platen om te draaien en 200 µl chloroform op het omgekeerde deksel aan te brengen, waarna deze gedurende 1 h bij 4 °C werden geïncubeerd. Vervolgens werd de semisolid agar laag van elke petrischaal in kleinere deeltjes gebroken en overgebracht naar een 30 ml centrifugeerbuis, waaraan 5 druppels chloroform werden toegevoegd. Na uitbalancering met behulp van fysiologisch water werden de buizen bij 4 °C gedurende 20 min gecentrifugeerd bij 6000 g. Het faag-bevattende supernatans werd met een 20 ml spuit en een 30G naald (BD Microlance) doorheen de filter (0.22 µm) (ThermoFisher scientific, Waltham, Massachusetts) gebracht om zo de fagen te isoleren. De faagstock werd in een 15 ml buis bewaard bij 4 °C. 2.4. Cesium-Chloride (CsCl) zuivering van fagen De faagsuspensies, verkregen door centrifugatie (2.3.), bezaten nog fracties van de gastheerbacterie, zoals LPS, membraanfragmenten en bacteriële eiwitten. Door middel van een CsCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) gradiënt kunnen deze bacteriële contaminaties grotendeels verwijderd worden. De gradiënt werd aangemaakt in het Laboratorium van gentechnologie (Prof. Dr. Rob Lavigne, KU Leuven) door vier verschillende densiteitsoplossingen te bereiden: 1.33 g/cm3; 1.45 g/cm3; 1.50 g/cm3 en 1.70 g/cm3. Deze vier densiteiten werden laag onder laag aangebracht, beginnende met de laagste densiteit. De volgende laag werd zorgvuldig met een 5 ml pipet onder de reeds aanwezige lagen aangelegd, waardoor de zwaarste laag onderaan komt te liggen en de lichtste bovenaan. Na het vormen van de gradiënt werd aan 15 ml van de faagoplossing 7.5 g CsCl (0.5 g/ml) toegevoegd en 5.7 ml van deze oplossing werd bovenop de gradiënt in elk van drie 15 ml buizen aangebracht en gecentrifugeerd met de swinging bucket ultracentrifuge gedurende 3.5 h bij 128000 g en 4 °C. Na de centrifugatie waren de fagen zichtbaar als een licht blauwe band tussen de 1.45 – 1.50 g/cm3 densiteit. Deze werd met een 5 ml pipet verzameld, wat een volume van 3 à 5 ml opleverde. De verkregen faag-oplossing werd drie maal gedialyseerd (Slide-A-Lyzer dialyse 21 cassette (10k MWCO), ThermoFisher Scientific) in 2 l fysiologisch water bij 4 °C gedurende 30 min, waarbij het water telkens werd vervangen. De faag-oplossing werd dan bewaard in een 15 ml Falcon buis bij 4 °C. De faag-concentratie werd opnieuw bepaald, zoals beschreven in 2.2. 2.5. DNA extracties Gedurende deze masterproef werden vijf types van DNA extractie met elkaar vergeleken. Er werd nagegaan welk type DNA extractie in staat was uit een beperkte hoeveelheid fagen het gewenste faag-DNA te isoleren. Er werd hierbij vertrokken vanuit een faag-verdunningsreeks. 2.5.1. Voorbehandeling bij alle DNA extracties Aan 200 µl fagen werd 4 µl DNase I (1 mg/ml) (Qiagen, Venlo, Nederland) en 1.6 µl RNase A (12.5 mg/ml) (Qiagen) toegevoegd, waarna de behandelde faagsuspensie werd geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C. Vervolgens werd 10 µl natriumdodecylsulfaat (SDS) (Life Technologies, Carslbad, CA) en 4 µl Proteïnase K (10 mg/ml) (Life Technologies) toegevoegd en geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C. Bij de effectieve faag-kwantificatie in de PBMCs werd de celpellet voorafgaand aan dit proces nog 30 min behandeld met Ammonium-Chloride-Kalium (ACK) lysebuffer (Life Technologies) bij kamertemperatuur om lyse van de PBMCs te bekomen. 2.5.2. DNA extractie met behulp van fenol/ chloroform zuivering Er werd 500 µl fenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) (Sigma-Aldrich) toegevoegd aan 500 µl van de voorbehandelde fagen (2.5.1.), en dit mengsel werd 30 min geïncubeerd bij 37 °C. De faag-suspensie werd vervolgens voor 5 min gecentrifugeerd bij 1500 g, waarna de bovenste waterige fase, die de nucleïnezuren bevat, werd overgebracht in een nieuwe 1.7 ml buis. Deze 3 stappen werden herhaald om vervolgens bij 6000 g gedurende 5 min te centrifugeren. Het supernatans werd in een nieuwe Eppendorftube opgezuiverd door toevoeging van v/v chloroform: isoamyl alcohol (24:1) en centrifugatie gedurende 5 min bij 6000 g. Daarna werd het supernatans behandeld met 45 µl natriumacetaat (3 M, pH 5.2) (Sigma-Aldrich) en 500 µl isopropanol (100 %) (Sigma-Aldrich). Bij kamertemperatuur werd het geïsoleerde DNA gedurende 20 min geprecipiteerd en werd even lang gecentrifugeerd bij maximale snelheid. Het verkregen supernatans werd verwijderd en de DNA pellet werd gewassen met 200 µl ethanol (70 %) (Sigma-Aldrich). Deze stap werd nogmaals herhaald om 22 vervolgens de DNA pellet te laten drogen en te bewaren in 100 µl Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8.0) (Sigma-Aldrich). 2.5.3. Verhitting van fagen bij 95 °C en de freezing-heatshock methode Er werd 500 µl faag-oplossing (3x1011 pfu/ml) in een 1.7 ml Eppendorftube verhit bij 95 °C. Bij de freezing-heatshock methode werd de faag-oplossing overnacht bevroren. 2.5.4. EasyMAG DNA isolatie De voorbehandelde faagoplossingen (2.5.1.) werden aangelengd met easyMAG lyse buffer (Biomérieux, Marcy-l’Etoile, Frankrijk) tot een totaal volume van 2 ml. Vervolgens werd 100 µl van de 1 op 2 verdunde silica (Biomérieux) toegevoegd aan de easyMAG extractiecartridge (Biomérieux). De cartridges werden op het toestel geladen en het standaard protocol werd doorlopen om een finaal eluaat van 100 µl te bekomen. Dit werd bewaard bij -20 °C. 2.5.5. De Norgen faag-DNA isolatiekit Het DNA werd ook uit de fagen geëxtraheerd met de Norgen faag-DNA isolatiekit (Norgen Bioteck Corporation, Thorold, Canada), zoals beschreven door de fabrikant. De fagen werden op dezelfde wijze als bij de voorgaande extracties voorbereid (2.5.1.) en vervolgens behandeld met 780 µl lyse buffer B, waarna deze werden verhit tot 65 °C gedurende 15 min. Dit werd gevolgd door de toevoeging van 320 µl isopropanol. Deze faagsuspensie werd per 650 µl op de spinkolommen van de Norgen faag-DNA isolatiekit aangebracht om te centrifugeren bij 6000 g gedurende 1 min. De doorgestroomde vloeistof werd verwijderd en de kolommen werden daarna gewassen met 400 µl was-oplossing. Het supernatans werd tweemaal verwijderd en vervolgens werd het membraan gedroogd door centrifugatie bij 14000 g gedurende 2 min bij kamertemperatuur. Na het opdrogen van het membraan werd 75 µl elutie-buffer toegevoegd aan de kolom om zo het faag-DNA te elueren. 2.6. Bepaling van de DNA-concentratie De DNA-concentratie werd gemeten met de Qubit en de Nanodrop. De Qubit-metingen werden uitgevoerd, zoals beschreven door de fabrikant. Er werd een Qubit werkingsoplossing bereid door de Qubit dsDNA HS assay (ThermoFisher Scientific) 1/200 te verdunnen met Qubit dsDNA HS buffer (ThermoFisher Scientific). Deze werkingsoplossing werd gebruikt om de Qubit standaarden te creëren, bestaande uit 190 µl werkingsoplossing en 10 µl Qubit reagentia (ThermoFisher Scientific). Deze werden gebruikt voor de calibratie van de Qubit. 23 Aan elke assay buis werd vervolgens 190 µl Qubit werkingsoplossing en 10 µl van het DNAextract toegevoegd om vervolgens in de Qubit aan te brengen na een incubatie van 2 min. De spectrofotometer ‘NanoDrop 1000’ kan een nucleïnezuurconcentratie meten van 5 tot 3000 ng/µl. De bovenste en onderste optische oppervlakken werden eerst gereinigd met water. Vervolgens werd het oplosmiddel gemeten van het geëxtraheerde DNA om achtergrondsignalen in rekening te brengen. Na deze instelling werd 2 µl van het staal op het onderste optische oppervlak aangebracht, waarna de hendel van de Nanodrop naar beneden werd gebracht en de DNA-concentratie werd gemeten. De faag-concentratie werd dan berekend aan de hand van deze formule: 2.7. Faag-kwantificatie met behulp van qPCR 2.7.1. Optimalisatie met behulp van de gradiënt PCR De ideale hybridisatietemperatuur van elk primerpaar werd bepaald aan de hand van een gradiënt PCR. Er werd 2.5 µl van het faag-DNA extract samengevoegd met 7.5 µl van de mastermix bestaande uit het Fast Start polymerase mix (Roche, Bazel, Zwitserland), forward en reverse primers (Eurogenetec, Luik, België) (Tabel 2) en HPLC. Tabel 2: Gebruikte primers voor de optimalisatie van faag-kwantificatie met de qPCR. Faag Primers Sequentie (5’ → 3’) Amplicon lengte (bp) PNM_1_Forward CTGTACCACGAGATCGACGG 136 PNM_1_Reverse CCGATGTAGTCCTCGACGTG P. aeruginosa faag PNM PNM_2_Forward GATCAATGCGCGGTTCTTCC 140 PNM_2_Reverse TTGATGGTGCAAGCGTTGTG PNM_3_Forward CCGAAGAGCGCAATGTGATG 122 PNM_3_Reverse AGTTTCCCTGCCGTGTGTAG ISP_1_Forward GCGGGAAGAGACTCGTTAGG 204 ISP_1_Reverse CCTTTGCTTTCGTGGGTGTG ISP_2_Forward GGGGTTTGTCCCTTGCCTTA 205 ISP_2_Reverse GCTGTTCCCTTGCTGTACCT S. aureus faag ISP ISP_3_Forward TACGGTGGGACATTTGTCGG 104 ISP_3_Reverse GCTCCTTCTGCAAAAGCTCG ISP_4_Forward AGGTACAGCAAGGGAACAGC 138 ISP_4_Reverse TCTGCACATCTGTAGCCGTC ISP_Forward GCAGTAGCTATGGCAATT 446 ISP_Reverse CCTGCTAATCTTACAACT Legende: bp = baseparen Het PCR protocol is weergegeven in Tabel 3. Deze amplificatie werd geëvalueerd met agarose gelelektroforese (2.7.2.). 24 Tabel 3: Samenvatting van gradiënt PCR protocol Temperatuur (°C) 95 Denaturatie 50, 53, 56, 59, 62, 65 Hybridisatie 72 Elongatie Aantal cycli X 45 2.7.2. Agarose gelelektroforese Een 2 % agarose gel werd bereid door 4 g agarose (Invitrogen, Carlsbad, CA) driemaal op te koken in 200 ml Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer (Sigma-Aldrich), waarna de gel werd afgekoeld tot 55 °C. Vervolgens werd 4 µl ethidium bromide (EtBr) (ThermoFisher Scientific) doorheen de gel gemengd en in de houder met kam overgebracht. Deze opstelling bleef voor 15 min staan bij kamertemperatuur. Na stolling van de gel werd de kam verwijderd, werd de gel in het elektroforese toestel gebracht en werden de ontstane slotjes geladen met 6 µl van het PCR product, waaraan 1.5 µl loading buffer was toegevoegd. In enkele slotjes werd een GeneRulerTM DNA ladder van 100 kb (ThermoFisher scientific) aangebracht. Na de gelelektroforese werd de gel gefotografeerd bij UV-belichting. 2.7.3. Faag-kwantificatie met qPCR Het DNA verkregen uit de faag-verdunningsreeksen werd gebruikt voor de optimalisatie van de faag-kwantificatie. Er werd een standaardverdunningsreeks gemaakt vertrekkende vanuit het DNA extract met de grootste DNA concentratie. Dit werd 1/10 verdund tot een concentratie van 10-8 in thymus kalf DNA (TKD). Hierbij werd gestart met de samenstelling van de mastermixen, bestaande uit water, LC480 HRM polymerase (Roche), MgCl2 (0.002 µM) en verschillende forward en reverse primerparen (Eurogentec) (0.2 µM) (Tabel 3). Aan 7.5 µl mastermix werd 2.5 µl DNA-extract toegevoegd. De gevormde multiwell plaat werd na centrifugatie in de ‘LightCycler 480’ aangebracht om het faag-DNA te kwantificeren aan de hand van de Cq waarden van de amplificatiecurven. Zo werd berekend hoeveel fagen er in de oorspronkelijke verdunning aanwezig waren door de vergelijking van de regressiecurve te bepalen en de gemeten Cq-waarde toe te passen. 2.8. PBMC isolatie Buffycoats (Rode Kruis Vlaanderen, Gent, België) werden overgebracht naar een 300 ml Falcon fles en verdund met Hank’s balanced salt solution (HBSS) (zonder Mg2+ en Ca2+) (Gibco, Waltham, Massachusetts) tot een totaal volume van 300 ml. Vervolgens werd de buffycoat onderverdeeld in 50 ml Falcon buizen met 35 ml hoeveelheden en werd 13 ml Lymphoprep (Axis-Shield, Dundee, Schotland) hieronder aangebracht tot vorming van 2 25 lagen. De buizen werden gecentrifugeerd bij 900 g gedurende 20 min bij 4 °C. De densiteitsverschillen van de cellen in het bloed zorgen voor het ontstaan van 3 hoofdfasen: de onderste fase bestaat uit erythrocyten en bloedplaatjes. Vervolgens bevindt er zich een troebele witte ring bovenop de Lymphoprep die de PBMCs omvat en de bovenste laag is het plasma, dat herkenbaar is door zijn semi-transparante kleur. De PBMCs werden geïsoleerd met een 10 ml pipet en overgebracht naar een 50 ml Falcon met 25 ml HBSS. De oplossing werd hieropvolgend gecentrifugeerd gedurende 10 min bij 450 g om uiteindelijk het supernatans te kunnen verwijderen. Vervolgens werd de pellet geresuspendeerd in 10 ml HBSS en alle pellets van dezelfde buffycoat werden samengevoegd met HBSS tot een totaal volume van 50 ml werd bereikt. Met behulp van de Sysmex-KX 21 werd de concentratie aan witte bloedcellen gemeten, waarna de celpellet met hitte geïnactiveerd foetaal kalf serum (FCS) en 10 % dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 2 x 107 cellen/ml werd gebracht. Bij deze concentratie werd de celsuspensie verdeeld in 1 ml vials, waarna de cellen op basis van de slow freezing methode werden ingevroren om uiteindelijk te bewaren in vloeibare stikstof. 2.9. Faag-stimulatie van de PBMCs De PBMCs, bewaard in vloeibare stikstof, werden ontdooid in een warmwaterbad bij 37 °C, waarna de inhoud van de vials werd toegevoegd aan HBSS tot een totaal volume van 10 ml werd bereikt. Na centrifugatie bij 350 g gedurende 10 min werd het supernatans verwijderd en de celpellet geresuspendeerd in 5 ml HBSS waarvan 80 µl werd gebruikt om met de Sysmex KX-21 de cel-concentratie na te gaan. De suspensie werd gecentrifugeerd bij 350 g gedurende 10 min, waarna de verkregen celpellet werd geresuspendeerd in de gewenste hoeveelheid complete Roswell Park Memorial Institute medium (cRPMI) (ThermoFisher scientific) om tot een concentratie te komen van 107 cellen/ml. cRPMI1640 bestaat uit RPMI 1640 aangevuld met minimum essential medium (MEM), niet-essentiële aminozuren, natrium-pyruvaat, penicilline, L-glutamine, 2-mercaptoethanol en hitte geïnactiveerd FCS. De PBMCs werden in een 96-well plaat met V-vormige bodem aangebracht in volumes van 100 µl. Deze werden al dan niet gestimuleerd met 10 µl van de S. aureus faag ISP, P. aeruginosa faag PNM en/of LPS (104 EU/ml). Vervolgens werd de 96-well plaat in de incubator van 37 °C met 5 % CO2 geplaatst voor 2, 5, 10 of 90 min. Na incubatie werd de multiwell-plaat gecentrifugeerd bij 350 g gedurende 5 min en werd het supernatans per conditie verzameld en overgebracht naar een 1.7 ml Eppendorftube. De celpellets werden in 100 µl HBSS geresuspendeerd, overgebracht naar een Eppendorftube, en ingevroren bij -80 °C. Na stimulatie werd de 26 overgebleven hoeveelheid fagen in het supernatans en in de celpellet bepaald door faagtitratie (2.2.) of met de qPCR (2.7.). 2.10. Faag-centrifugatie experiment Er werd in een 1.7 ml Eppendorftube 100 µl fysiologisch water toegevoegd samen met 10 µl van S. aureus faag ISP of P. aeruginosa faag PNM. Deze Eppendorftube werd gecentrifugeerd bij 350 g gedurende 5 min, waarna het supernatans werd weggenomen en de pellet werd geresuspendeerd met HBSS om te verzamelen in een 1.7 ml Eppendorftube, waarna de faagtiter van het supernatans en de pellet werd bepaald zoals in 2.2. . 2.11. Labelling van de fagen 2.11.1. Fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) labelling van de fagen De P. aeruginosa faag PNM en S. aureus faag ISP werden gelabeld met behulp van de FITCproteïne labellingskit (Invitrogen). Het gebruikte protocol is een aangepaste versie van dat beschreven door de fabrikant. Van een 1/100 verdunde faagstock (3.109 pfu/ml) werd 200 µl gebruikt, waaraan 20 µl natriumbicarbonaat buffer (84 mg/ml) met een pH 9 werd toegevoegd. Hieropvolgend werden de fagen in het donker behandeld met 10 µl van de gewenste oplossing 10 mg FITC/ml DMSO (Invitrogen). Om de gelabelde fagen van de nietgebonden kleurstofpartikels te scheiden, maakten we gebruik van de Pierce concentrator (ThermoFisher scientific). Hierbij werden de FITC-gelabelde fagen aangebracht op de vochtige concentrator sample chamber en dit werd in zijn geheel aangebracht op een collectiebuis. Deze opstelling werd in een hoek-vaste centrifuge gecentrifugeerd bij 15000 g gedurende 2 min 30 sec. Het eluaat werd verwijderd en de voorgaande stappen werden drie maal herhaald, waarna de fagen die op het membraan achterbleven, werden geresuspendeerd in 100 µl met fysiologisch water en verzameld in een nieuwe Eppendorftube. 2.11.2. pH sensitieve pHrodo labelling van de fagen De P. aeruginosa faag PNM en S. aureus faag ISP, werden ook gelabeld met de pH-sensitieve pHrodo-labelling (ThermoFisher scientific). Zoals de fabrikant voorschreef, werd 20 µl van de 1 M natriumbicarbonaat-oplossing toegevoegd aan 200 µl van de faagstock (3 x 109 pfu/ml). Na oplossen van een vial pHrodo-rood succinimidylester in 10 µl DMSO werd 10 µl van deze kleuroplossing toegevoegd aan 200 µl van de faagsuspensie. Na 15 min incuberen bij kamertemperatuur werden de fagen opgezuiverd met de Pierce concentrator (ThermoFisher scientific) zoals beschreven in 2.11.1.. 27 2.11.3. Testen van de infectiviteit van de gelabelde fagen Om te bepalen in welke mate de labelling de infectiviteit van de fagen beïnvloedde, werd faagtitratie uitgevoerd (2.2). 2.11.4. Controle van de fluorescentie-intensiteit 2.11.4.1. Fluorescentie-intensiteit van FITC-gelabelde fagen De fluorescentie-intensiteit van de gelabelde fagen werd bepaald met de Clariostar (BMG Labtech, Offenburg, Duitsland) op het L-GEST. Van de FITC-gelabelde fagen werd 10 µl overgebracht naar de wells van een Greiner 96-well plaat met een vlakke bodem (Greiner Bio-one, Kremsmunster, Oostenrijk). Fysiologisch water werd hierbij als negatieve controle gebruikt. Deze plaat werd in de Clariostar geplaatst waarna de FITC-intensiteit werd gemeten bij een excitatie/emissie-lengte van 494/518 nm. 2.11.4.2. Fluorescentie-intensiteit van pHrodo-gelabelde fagen De fluorescentie-intensiteit van de pHrodo-gelabelde fagen werd op dezelfde wijze gemeten als in 2.11.4.1. Elk type faag werd in de wells blootgesteld aan 10 µl zure buffer met een pH 6, 5, 4 en 3. Deze zure buffer werd gevormd door 15 ml fosfaat gebufferd saline (PBS) in een 50 ml Falcon aan te brengen en druppelgewijs HCl (1 M) (Sigma-Aldrich) en NaOH (1 M) (Sigma-Aldrich) toe te voegen tot de gewenste pH werd bereikt. De zure buffers en de pHrodo gelabelde fagen zonder zure buffer werden gemeten als negatieve controles. De aangegeven excitatie/emissie-lengte voor pHrodo was 566/590 nm. 2.12. Flow cytometrie: detectie fagocyt verantwoordelijk voor faag-fagocytose De PBMCs werden gestimuleerd zoals beschreven in 2.9. Na stimulatie werd de 96-well plaat afgecentrifugeerd bij 350 g op 4 °C gedurende 5 min. Het supernatans werd afgenomen en de celpellet werd geresuspendeerd met 50 µl Dulbecco’s fosfaat gebufferd saline (DBPS) met 1 % hitte geactiveerd FCS, anti-CD14 (10X stock) en anti-CD4 (20X stock) (ThermoFisher scientific). Deze suspensie werd in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd gedurende 40 min, waarna 125 µl DPBS met 1 % hitte geïnactiveerd FCS werd toegevoegd. Vervolgens werd bij 350 g gecentrifugeerd voor 5 min. Het supernatans werd verwijderd en de celpellet werd geresuspendeerd in 250 µl DPBS met 1 % hitte-geïnactiveerd FCS, waarna de gelabelde cellen werden gekwantificeerd met het LSR-toestel. De Fluoresbrite Yellow-Green (YG) latex microspheres (Polysciences, Warrington, Florida) (diameter = 0.1 µm of 0.01 µm) werden toegepast als positieve controle, gebaseerd op de studie van Gu et al. (2014) [56]. 28 2.13. Visualisatie van faag-fagocytose. 2.13.1. Adherentie van de PBMCs bepalen na faag-fagocytose De cellen werden in volumes van 1 ml in de wells gebracht. Deze cellen werden op dezelfde wijze als in punt 2.9. gestimuleerd. Zo kon met de fluorescentiemicroscoop achterhaald worden welke cellen adhereren aan de bodem van de wells. 2.13.2. Visualisatie van faag-fagocytose met behulp van microscopie PBMCs werden net als in 2.9. gestimuleerd met FITC- of pHrodo-gelabelde fagen. Deze stimulaties werden uitgevoerd in een 6-well plaat, waaraan vooraf bij 200 °C gebakken dekglazen werden toegevoegd, waarop 1 ml PBMCs (1 x 106 cellen/ml) werden aangebracht samen met 10 µl van de fagen of de Fluoresbrite YG latex microspheres (Polysciences), als positieve controle [56]. Na stimulatie werden de dekglazen gewassen met PBS, waarna druppelgewijs paraformaldehyde werd toegevoegd gedurende 10 min voor fixatie. De stalen werden vervolgens gewassen met PBS en PBS Tween (1 %) (PBST). De celkernen werden blauw aangekleurd met 4’,6’-diamidine-2’-phenylindole-dihydrochloride (DAPI) (SigmaAldrich). Na 10 min incuberen in het donker werd op het draagglas 15 µl mowiol (SigmaAldrich) aangebracht, voor intensificatie en behoud van de fluorescentie, om daarop het dekglas te plaatsen en dit vast te hechten met nagellak. Deze preparaten werden vervolgens bekeken bij een 63X vergroting met behulp van immersie-olie op de confocale laser scanning microscoop (CLSM) (Leica, Wetzlar, Duitsland) en de fluorescentiemicroscoop (Zeiss, Thornwood, NY). Faag-fagocytose werd ook met een EEA1 endosoom-labelling opgespoord. Early endosome autoantigen 1 (EEA1) is immers een proteïne dat vroege endosomen aantrekt om te adhereren met het fagosoom (Fig. 7A) [49]. Voor deze EEA1 endosoom-labelling werden, na het fixeren en het wassen met PBS, de cellen gepermeabiliseerd met 0.2 % Triton X-100 voor 10 min. Hierna werden de cellen drie keer gewassen met PBS en 30 min geïncubeerd in een oplossing bestaande uit 1% bovine serum albumine (BSA), 22.52 mg/ml glycine in PBS met 0.1 % PBST. Vervolgens werden de cellen gedurende 30 min geïncubeerd met het anti-EEA1 (1/100) in PBS met 1 % BSA. De cellen werden daarna drie keer gewassen met PBS en gedurende 1 h blootgesteld aan de secundaire antilichamen ezel antikonijn Alexafluor 488 (ThermoFisher Scientific) of ezel anti-konijn Alexafluor 633 (ThermoFisher Scientific). De gelabelde cellen werden daarna 3 keer gewassen met PBS en behandeld met DAPI zoals hierboven werd beschreven. De verkregen preparaten werden vervolgens gevisualiseerd met de CLSM (Leica) bij een vergroting X63 met behulp van immersie-olie. 29 3. Resultaten en bespreking 3.1. Optimalisatie van de faag kwantificatie Gedurende deze masterproef werd getracht faag-fagocytose kwantitatief aan te tonen met behulp van qPCR en faagtitratie. Voor de qPCR werd bij aanvang van de studie faag-DNA geëxtraheerd met behulp van de klassieke DNA extractietechniek, namelijk de fenol/chloroform zuivering, waarna de hybridisatietemperatuur en het meest efficiënte primerpaar werden bepaald om de P. aeruginosa faag PNM te kwantificeren (3.1.1.1.). Deze extracten werden gebruikt om de qPCR te optimaliseren. Vervolgens werden verschillende DNA-extractiemethoden vergeleken, m.n. de fenol/chloroform zuivering, verhitting bij 95 °C, de freezing-heatshock methode, de EasyMAG DNA extractie en de Norgen faag-DNA isolatiekit (3.1.1.2.). In de beginfase werd gefocust op de P. aeruginosa faag PNM om vervolgens ook verder te gaan met de S. aureus faag ISP. 3.1.1. Optimalisatie van P. aeruginosa faag PNM kwantificatie 3.1.1.1. Bepaling hybridisatietemperatuur primerparen PNM-1, 2, 3 Bij aanvang van de qPCR optimalisatie werd de hybridisatietemperatuur van de gebruikte primers achterhaald (Tabel 2) d.m.v. gradiënt PCR. Na amplificatie van het faag-DNA werd met behulp van de agarose-gelelektroforese duidelijk dat de optimale hybridisatietemperatuur 59 °C was (Fig. 8). Dit bleek uit de zeer intense banden bij de verwachtte lengte van het amplicon voor alle primerparen (Tabel 2), in combinatie met de afwezigheid van aspecifieke amplificatie, m.n. de primer-dimeren. Deze dimeren worden waargenomen als een lichte band bij een lagere bp-lengte dan deze verwacht voor het specifieke P. aeruginosa faag PNM DNA fragment. Op basis van de intensiteit van de banden en de afwezigheid van vals positieve amplificatie werd besloten om verder te werken met het primerpaar PNM-2 (zie rode kader Fig. 8). Fig. 8 Bepaling hybridisatietemperatuur en primerpaar voor P. aeruginosa faag PNM kwantificatie met qPCR. Legende: L = DNA ladder (moleculair gewicht: 100 bp), 1 = PNM-1 primerpaar, 2 = PNM-2 primerpaar, 3= PNM-3 primerpaar, C = negatieve controle bestaande uit mastermix, rode kader = optimale conditie voor faag-DNA amplificatie. 30 3.1.1.2. Optimalisatie van DNA extractie uit P. aeruginosa faag PNM Er werd een vergelijkende studie uitgevoerd tussen de verschillende DNA-extractiemethoden. Het DNA van een faag-verdunningsreeks werd hierbij geëxtraheerd met behulp van de fenol/chloroform zuivering om de drempelwaarde van de faag-DNA extractie en qPCR kwantificatie na te gaan. Deze faag-verdunningsreeks werd gevormd door eerst de stock van 2 x 1012 pfu/ml, zoals bepaald door faagtitratie (2.2), driemaal 1/100 te verdunnen en vervolgens 4 keer 1/10, waarna deze verder verdund werd in stappen van 1/2 tot er theoretisch geen fagen meer in de oplossing te detecteren zouden zijn. De qPCR kwantificatie van het verkregen DNA met de fenol/chloroform methode leverde bij qPCR kwantificatie enkel ruis op, alhoewel met de Nanodrop een DNA concentratie werd gemeten van 33.6 ng/µl. Om deze reden werd elk verkregen DNA-extract bij voorgaande fenol/chloroform zuivering nogmaals 1/10 verdund met fysiologisch water. Deze verdunning resulteerde niet in sterkere amplificatie, zo was amplificatie door middel van qPCR slechts in beperkte mate mogelijk (Addendum: Tabel 11). De verhitting bij 95 °C en de freezing-heatshock methode (2.5.3.) leverden geen amplificatie van het faag-DNA op. Vervolgens werd overgegaan naar de EasyMAG DNA extractie om faag-DNA te extraheren uit een 1/10 - P. aeruginosa faag PNM-verdunningsreeks. Deze DNA-extractie leverde amplificatie van het faag-DNA op. Een theoretische log-concentratie lager dan 5.30 gaf geen daling in faag-DNA hoeveelheid weer, wat betekent dat slechts een log-concentratie hoger dan 5.30 pfu/ml met zekerheid kon worden gekwantificeerd. Dit was een hoge drempelwaarde, niet bruikbaar voor de mogelijks lage faag-concentraties die gedurende deze studie moesten worden gekwantificeerd. Daarom werd de Norgen faag-DNA isolatiekit, specifiek voor faag-DNA extracties, getest. Deze techniek had een lagere drempelwaarde bij een theoretische log concentratie van 4.30 (Addendum: Tabel 11). De Norgen faag-DNA isolatiekit maakte het mogelijk een faag-concentratie van 2 x 104 pfu/ml of hoger te kwantificeren terwijl dit voor de EasyMAG extractie 10 keer hoger lag. De Norgen faagDNA isolatiekit is dus een mogelijke kandidaat om de beperkte hoeveelheid fagen in het supernatans en de celpellet te kwantificeren na faag-fagocytose. Wanneer fysiologisch water onderworpen werd aan de DNA extractiemethoden leverde dit bij de EasyMAG DNA extractie en de Norgen faag-DNA isolatiekit ook P. aeruginosa faag PNM DNA amplificatie op. Om deze reden werden verschillende buffers getest op P. aeruginosa faag PNM contaminatie samen met alle producten gebruikt bij de EasyMAG 31 DNA extractie en de Norgen faag-DNA isolatiekit, door deze te onderwerpen aan beide extractieprotocols. Uit deze extracties bleek dat er geen rechtstreekse relatie was tussen de DNA amplificatie en de toevoeging van één product of handeling (Addendum: Tabel 12). We konden de bron van contaminatie, die ervoor zorgt dat het amplificatiesignaal niet negatief werd gekregen in de buffers, dus niet opsporen. 3.1.2. Optimalisatie van S. aureus faag ISP kwantificatie 3.1.2.1. Bepaling hybridisatietemperatuur primerparen ISP en ISP-1,2,3,4 Net als bij de kandidaat primerparen voor P. aeruginosa faag PNM kwantificatie werd de hybridisatietemperatuur van primerparen ISP en ISP-1,2,3,4 gecontroleerd. De agarose gelelektroforese duidde aan dat primerparen ISP-1 en ISP-2 zorgden voor faag-DNA amplificatie bij de verwachte lengte (Fig. 9, Addendum: Fig. 18). De intensiteit van de banden waren ook hier het sterkst bij een hybridisatietemperatuur van 59 °C (Addendum: Fig. 18). Fig. 9: Agarose gelelektroforese na qPCR voor bepaling geschikt primerpaar bij S. aureus faag ISP kwantificatie. Legende: L = DNA ladder (moleculair gewicht: 100 bp), S = staal van de standaardverdunningsreeks, N = Norgen faag DNA extractie stalen uit faag-verdunningsreeks, S1→ S8 = verdunning van de oorspronkelijke faag ISP-DNA stock, N1 → N12 = faag-DNA verkregen uit de faag-verdunning. Om na te gaan of het primerpaar ISP-1 of ISP-2 accuratere kwantificatie van de S. aureus faag ISP opleverde, werd een faag-verdunningsreeks gevormd waaruit DNA werd geëxtraheerd met de Norgen faag-DNA isolatiekit. Het verkregen faag-DNA werd geamplificeerd met primerparen ISP-1 en ISP-2 in de LightCycler480 (Roche). Beide primerparen werden toegepast bij een concentratie van 0.2 µM of 0.5 µM. Een hogere primerconcentratie in de mastermix verhoogt de kans op primer-dimeer vorming en het verkrijgen van een tweede piek bij de smeltcurve-analyse (Addendum: Fig. 20). Na deze gelelektroforese had het primerpaar ISP-2, bij een concentratie van 0.2 µM in de mastermix, de sterkste amplificatie van het faagDNA weergegeven, samen met een reductie in intensiteit van de banden naarmate de faagDNA concentratie afnam (Fig. 9). Bij een concentratie van 0.5 µM werd waargenomen dat het 32 primerpaar ISP-1 geen DNA amplificeerde en bij primerpaar ISP-2 enkel DNA waargenomen werd bij de hoogste faag-concentratie (Addendum: Fig. 19). 3.1.2.2. Optimalisatie van DNA extractie uit S. aureus faag ISP De resultaten van de DNA extractie optimalisatie voor P. aeruginosa faag PNM duidde aan dat de EasyMAG extractie en de Norgen faag-DNA isolatiekit mogelijke technieken zijn om faag-DNA te verkrijgen. Er werd dan ook voor de S. aureus faag ISP voornamelijk op deze technieken toegespitst. De eerste vergelijking tussen de Norgen faag-DNA isolatiekit en de EasyMAG extractie, vertrekkende van dezelfde faag-verdunningsreeks, toonde aan dat de EasyMAG de efficiëntste faag ISP-DNA extractie opleverde t.o.v. de Norgen faag-DNA isolatiekit (Addendum: Tabel 13). Zo kwam de berekende log(concentratie) op basis van de qPCR sterk overeen met de theoretische log(concentratie) die op basis van titering werd bekomen (Tabel 4). Na een uitgebreidere faag-verdunningsreeks extractie met de EasyMAG werd eveneens bevestigd dat de qPCR kwantificatie niet minder dan 4.61 x 104 pfu/ml (een grootteorde log(concentratie) van 4) kan detecteren (Tabel 4). Er werd geen faag ISP-DNA gedetecteerd in fysiologisch water (Addendum: Tabel 13). Tabel 4: Drempelwaarde van de S. aureus faag-ISP kwantificatie met qPCR Kwantificatie o.b.v. titer qPCR kwantificatie Staal Log(concentratie*)(pfu/ml) Log(concentratie**)(pfu/ml) Concentratie** (pfu/ml) ISP_1 9.48 9.60 4.00x109 ISP_2 8.48 8.37 2.33x108 ISP_3 7.48 7.22 1.68x107 ISP_4 6.48 6.33 2.12x106 ISP_5 5.48 5.38 2.40x105 ISP_6 4.48 4.66 4.61x104 ISP_7 3.48 GD GD ISP_8 2.48 GD GD ISP_9 1.48 GD GD ISP_10 0.48 GD GD Legende: ISP: S. aureus faag ISP; 1 → 10: ISP faag-verdunning; concentratie*: faag-concentratie bepaald o.b.v. titering; concentratie**:berekende faag-concentratie o.b.v. de Cq-waarde met de qPCR; GD: geen detectie. 3.2. Bepaling van faag-fagocytose door faag-titering Er werd een vergelijkende studie tussen faag-titering en qPCR kwantificatie uitgevoerd om faag-fagocytose te kwantificeren. Eerst werd nagegaan op welk tijdstip faag-fagocytose reeds plaatgreep, door te incuberen gedurende 2, 5, 10 en 90 min. De P. aeruginosa faag PNM werd snel gefagocyteerd, waarna het faag-fagocytose effect voor P. aeruginosa faag PNM werd aangetoond vanaf 2 min. De S. aureus faag ISP werd niet opgenomen door de PBMCs, ook niet na een incubatie van 90 min. 33 De faag-titering experimenten duidden aan dat de P. aeruginosa faag PNM na een PBMC blootstelling van 2 min leidde tot een afname van de faag hoeveelheid met een factor 100 in het supernatans. Na deze 2 min nam de P. aeruginosa faag PNM niet meer af in aantal. Zo bleef de faag-concentratie in het supernatans na een PBMC stimulatie met fagen na 2, 5, 10 en 90 min constant (Fig. 10A). Eveneens werd waargenomen dat in dezelfde omstandigheden de S. aureus faag ISP toenam (Fig. 10B). Fig. 10: Faag-fagocytose op verschillende tijdstippen. Blauw: P. aeruginosa faag PNM en rood: S. aureus faag ISP (A) Faag-fagocytose vanaf 2 min voor P. aeruginosa faag PNM. De faag PNM werd reeds na 2 min gefagocyteerd, maar na dit tijdstip werd de fagocytose gestopt. Significantie: * p-waarde < 0.01, ** p-waarde < 0.05. (B) S. aureus faag ISP wordt niet gefagocyteerd na een stimulatie van 10 min ( aantal testen (n) = 9) en 90 min (n=6). Geen significant verschil waar te nemen. Significantie: * p-waarde < 0.01. Om met zekerheid te kunnen stellen dat de P. aeruginosa faag PNM werd opgenomen door de fagocyten, werden de achtergebleven fagen die aan de celpellet kleefden, na een incubatie van 10 min, getiterd. Dit resulteerde in een faagconcentratie die de reductie aan fagen in het supernatans niet oversteeg, wat dus betekent dat een deel van de toegevoegde faagstock werd opgenomen door de fagocyten en dat slechts een deel van de fagen (blauw gearceerd in Fig. 11) kleefde aan het celmembraan van de PBMC. Zo zullen de fagen in 3 fracties terug te vinden zijn, m.n. in de celpellet, aan het celmembraan van de PBMCs en in het supernatans. Fig. 11: Detectie van de adherente P. aeruginosa faag PNM aan de buitenzijde van de PBMCs. Blauw: P. aeruginosa faag PNM; Arcering: de P. aeruginosa faag PNM gedetecteerd aan de celpellet. P. aeruginosa faag PNM is reeds na 10 (n =15) en 90 min (n=6) gefagocyteerd. Een deel van de verdwenen fagen uit het supernatans blijft aan de cel kleven (n=3). Significantie: *p-waarde < 0.01, ** p-waarde < 0.05. 34 Om een verklaring te vinden voor de achtergebleven fagen in de celpellet werd een faagcentrifugatie experiment (2.10.) uitgevoerd waarna er 2 x 106 pfu/ml (log-waarde = 6.3) van de P. aeruginosa faag PNM werd teruggevonden in de pellet. Dit komt overeen met de grootteorde van de faag-concentratie die aangetoond werd in de celpellet na stimulatie (Fig. 11). Deze waargenomen hoeveelheid fagen in de celpellet kan dus een gevolg zijn van de centrifugatie-stap onmiddelijk na incubatie. Het verschil in faag-fagocytose voor de S. aureus faag ISP en P. aeruginosa PNM kan een gevolg zijn van het verschil in LPS concentratie. Momenteel wordt nog volop onderzoek gedaan binnen het LBR om de beste manier te achterhalen om LPS te verwijderen uit faagbereidingen. Tijdens de hier uitgevoerde experimenten, bezit de P. aeruginosa faag PNM nog LPS (2680 EU/ml gemeten met Endozyme). Om na te gaan of LPS een mogelijke oorzaak was voor de sterke faag-fagocytose inductie bij de P. aeruginosa faag PNM werd de S. aureus faag ISP-incubatie herhaald gedurende 10 min in aanwezigheid van LPS (104 EU/ml) (Fig. 12). De aanwezigheid van LPS veroozaakt geen fagocytose, omdat de gemeten faag-hoeveelheid in het supernatans tussen beide proefopstellingen niet significant verschillend was (one-sided students T-test). Fig. 12: De stimulatie van de PBMC met de S. aureus faag ISP en LPS (104 EU/ml). Rood: S. aureus faag ISP, Gearceerd: S. aureus faag ISP met 10 µl LPS. De S. aureus faag ISP werd niet gereduceerd na 10 min (n=3) en na LPS toevoeging was er beperkte reductie (n=3). 3.3. Bepaling van faag-fagocytose met qPCR Naast faag-titering werd de hoeveelheid fagen aanwezig in het supernatans en in de PBMCs na incubatie ook gekwantificeerd met qPCR. De qPCR-resultaten toonden aan dat er fagen aanwezig waren in de celpellet en in het supernatans voor zowel de P. aeruginosa faag PNM als de S. aureus faag ISP. De hoeveelheid fagen in het supernatans verminderde bij de P. aeruginosa faag PNM reeds na 2 min met een log 1 en de achtergebleven concentratie in het supernatans nam niet verder af naarmate de stimulatieperiode langer duurde (Fig. 10A, Tabel 5). Dit is in overeenstemming met wat bij de faagtitratie werd waargenomen. De qPCRresultaten toonde aan dat de S. aureus faag ISP tussen de 10 en 90 min werd gefagocyteerd, 35 want de hoeveelheid van deze faag in het supernatans nam af met een log 3 na 90 min (Tabel 5). De fagocyten fagocyteerden maximaal 108 pfu/ml en na LPS toevoeging daalde het aantal fagen in het supernatans en de celpellet (Tabel 5). Een deel van het toegevoegde aantal (±109 pfu/ml) fagen aan PBMCs is met qPCR niet terug te vinden in beide fracties (Tabel 5). Tabel 5: Hoeveelheid fagen in het supernatans en in de celpellet bepaald met de qPCR Supernatans Celpellet Type Stimulatielog(toegevoegde faaglog(faag-concentratie na log(faag-concentratie stimulans duur (min) concentratie) (pfu/ml) stimulatie) (pfu/ml) supernatans + celpellet) (n=3) (n=3) 2 8.54 7.92* 8.63 (n=3) (n=9) Faag PNM 9.72 5 8.47 8.11 8.63 (n=3) 10 8.49* (n=12) 8.14* 8.65 (n=3) 90 8.59* (n=6) 7.90** 8.67 (n=11) (n=8) Faag ISP 10 9.52 9.37 8.76 9.46 (n=7) (n=4) 90 6.30 9.05 9.05 (n=3) (n=5) Faag ISP + 10 9.52 5.87 3.93** 5.87 10 µl LPS Legende: qPCR kwantificatie van faag-DNA in het supernatans en in de celpellet. Type stimulans = oplossing toegevoegd aan de PBMC; Significantie: *p-waarde <0.01, **p-waarde <0.05. 3.4. Visualisatie van faag-fagocytose 3.4.1. Bepaling infectiviteit van de gelabelde fagen 3.4.1.1. Infectiviteit van de FITC-gelabelde fagen De FITC-labelling werd, op basis van de gevonden literatuur, voor de eerste maal toegepast op fagen. Er werd nagegaan of deze behandeling de faag-infectiviteit beïnvloedde door de aanwezigheid van DMSO (Fig. 13). De mate waarin de infectiviteit werd beïnvloed was verschillend tussen P. aeruginosa faag PNM en S. aureus faag ISP. Zo daalde de infectiviteit van de P. aeruginosa faag PNM met een log 2 (Fig. 13A) en deze van S. aureus faag ISP met een log 5 (Fig. 13B). Wanneer de fagen in een gelijke concentratie als bij de FITC-labelling werden blootgesteld aan enkel DMSO, werd een even grote reductie in infectiviteit waargenomen als bij de FITC-labelling (Fig. 13). Bijgevolg kan besloten worden dat DMSO verantwoordelijk is voor de afname in infectiviteit van de fagen na FITC-labelling. Fig. 13: Infectiviteit van fagen na FITC-labelling. Blauw: P. aeruginosa faag PNM; Rood: S. aureus faag ISP. De FITC-labelling reduceerde de infectiviteit (n=5) en DMSO is verantwoordelijk voor deze daling (n=2). Significantie:*p-waarde < 0.01; **p-waarde < 0.05; /p-waarde= niet te berekenen door tekort aan metingen 36 3.4.1.2. Infectiviteit van de pHrodo gelabelde fagen Gedurende deze masterproef werden de fagen ook gelabeld met pHrodo, een labelling waarbij het fluorofoor enkel fluoresceert wanneer de pH daalt tot pH 4. Deze proteïne labelling veroorzaakt net als bij de FITC-labelling (3.4.1.1.) een reductie in de P. aeruginosa faag PNM en S. aureus faag ISP infectiviteit (Tabel 6). Zo daalde de infectiviteit van de P. aeruginosa faag PNM na de pHrodo labelling met een log 3 en bij de S. aureus faag ISP met een log 7. Tabel 6: Bepaling infectiviteit van de pHrodo gemerkte fagen Type faag Log( hoeveelheid fagen in de oorspronkelijke faagstock) (pfu/ml) (n=3) Faag PNM 11.72 Faag ISP 11.82 Log( hoeveelheid infectieuze fagen na pHrodo labelling) (pfu/ml) (n=1) 8.40 4.68 3.4.2. Bepaling fluorescentie-intensiteit van de proteïne gelabelde fagen De fluorescentie-intensiteit van de gelabelde fagen werd gemeten om een indicatie te hebben of de fagen effectief gelabeld waren met de proteïne labels, dit al dan niet in relatie met een aanpassing van een omgevingsconditie, zoals de pH verandering bij de pHrodo gelabelde fagen. De intensiteit van de FITC-gelabelde P. aeruginosa faag PNM en S. aureus faag ISP was het sterkst bij de hoogste concentratie aan toegevoegde FITC-labelling en nam af naarmate de toegevoegde FITC-hoeveelheid daalde. De S. aureus faag ISP leverde de sterkste FITC-fluorescentie intensiteit op. Wanneer de toegevoegde faag-concentratie lager was dan 1 x 10-3 mg/ml werd geen FITC-fluorescentie meer waargenomen, want de waarde lag lager dan de negatieve controle bestaande uit geautoclaveerd fysiologisch water, m.n. 168 rfu (Tabel 7). Tabel 7: Fluorescentie-intensiteit (rfu) van de FITC-gelabelde fagen Toegevoegde FITC-concentratie (mg/ml) 1 1x10-1 1x10-2 1x10-3 1x10-4 Type faag 46368 2484 19 -32 -20 P. aeruginosa faag PNM 207046 433 225 3 -24 S. aureus faag ISP Legende: negatief getal = controle (PW) had een hogere intensiteit dan gemeten waarde. De fluorescentie-intensiteit van de pHrodo gelabelde fagen nam toe naarmate de toegevoegde buffer zuurder werd. Dit bleef het geval tot een pH 4. Maar wanneer een zure buffer met een pH 3 werd toegevoegd, was een reductie in fluorescentie-intensiteit waar te nemen voor zowel de P. aeruginosa faag PNM als de S. aureus faag ISP. De P. aeruginosa faag PNM had, in tegenstelling met de FITC-labelling (Tabel 7), de sterkste fluorescentie-intensiteit bij alle toegevoegde buffers (Tabel 8). 37 Tabel 8: Fluorescentie-intensiteit (rfu) van de pHrodo-gelabelde fagen in relatie tot pH pH(buffer) 6 5 4 3 pHrodo gelabelde fagen 99266 136244 224699 191986 P. aeruginosa faag PNM 4517 5878 39324 15019 S. aureus faag ISP 3.4.3. Microscopische bepaling van faag-fagocytose Na het kwantitatief aantonen van faag-fagocytose met qPCR en faagtitratie werd getracht faag-fagocytose te visualiseren met de CLSM, na labelling van de fagen met FITC of pHrodo merkers en de kleuring van de PBMCs met DAPI en EEA1 antilichamen. 3.4.4. Co-lokalisatie van de FITC-gelabelde fagen en de celkernen De FITC-gelabelde fagen (2 x 109 pfu/ml) werden gebruikt om na te gaan of er co-lokalisatie kon worden aangetoond met de DAPI-gekleurde kernen (Fig. 14). Ter positieve controle werden de incubatie-experimenten uitgevoerd met de FITC-gemerkte microbeads (0.01 µm). De P. aeruginosa faag PNM vertoonde na 10 min geen co-lokalisatie met de PBMC-kernen die aangekleurd werden met DAPI. Er werden fagen gedetecteerd, maar deze waren op een te grote afstand gelegen van de celkernen om gefagocyteerd te kunnen zijn (Fig. 14, punt 1A). Na incubatie van 90 min werd er wel overlap gevonden tussen de FITC-gelabelde P. aeruginosa faag PNM en de DAPI gekleurde kernen (Fig. 14, punten 3D/5D). Enkele van de P. aeruginosa faag PNM partikels werden nabij de kernen gevonden, wat aanzien kan worden als gefagocyteerde fagen (Fig. 14, punt 4D) of als adherentie van de fagen aan de fagocyt. Fig. 14: Bepaling van faag-fagocytose d.m.v. CLSM van FITC-gemerkte fagen (groen) en DAPI-gekleurde PBMC-kernen (blauw). (Vergroting 63X). Rode pijlen en cirkel: gefagocyteerde FITC-gelabelde fagen. De S. aureus faag ISP leverde net als de P. aeruginosa faag PNM enkel co-lokalisatie op met de DAPI-gekleurde kernen na een stimulatie van 90 min (Fig. 14, punten 6E en 7E). 38 3.4.5. Faag-fagocytose bepaling met pHrodo gelabelde fagen De co-lokalisatie tussen de FITC-gelabelde fagen en de DAPI-gekleurde PBMC-kernen zijn een eerste aanwijzing van faag-fagocytose, maar zijn geen echt bewijs van fagocytose, omdat hetzelfde beeld ook zou verkregen kunnen worden als fagen adhereren aan de celwand van de fagocyten, zonder dat fagocytose plaatsgrijpt. Daarom werden de fagen gelabeld met pHrodo, een merker die enkel fluoresceert wanneer de pH daalt. Fagocytose is een proces, waarbij door fusie van een endosoom met een lysosoom, het opgenomen partikel bij een zure pH van ongeveer 5 wordt gedegradeerd door de lysozymen uit het lysosoom [57]. De S. aureus faag ISP werd gefagocyteerd binnen de 10 min en leverde een rode fluorescentie op in de nabijheid van de celkernen van de PBMC (Fig. 15B, punt 1 en 2). Na 90 min werden er geen fagen meer gedetecteerd (Fig. 15D), wat er op kan wijzen dat alle fagen gelyseerd waren. Fig. 15: Visualisatie van faag-fagocytose adhv de pHrodo labelling. (Vergroting CLSM: 63 X) Blauw: DAPI-gekleurde PBMC-kernen; rood: gefagocyteerde fagen, rode pijlen: besproken fagen in de tekst. De P. aeruginosa faag PNM werd volgens hetzelfde principe als de S. aureus faag ISP blootgesteld aan de PBMCs. Na 10 min konden nog geen gefagocyteerde fagen worden waargenomen (Fig. 15A). Dit is in tegenstelling met de kwantitatieve gegevens uit 3.2., waar we na 10 min reeds een sterke reductie waarnamen in faag-concentratie in het supernatans. Na 90 min werd wel één cel met een gefagocyteerde faag waargenomen (Fig. 15C, punt 3), maar de overgrote meerderheid van de PBMCs hadden geen fagen opgenomen (Fig. 15C). 3.4.6. EEA1 labelling van PBMCs wijst op faag-opname door fagocyten Naast de pHrodo labelling werd gepoogd om faag-fagocytose aan te tonen met een EEA1 labelling, die zorgt voor de visualisatie van het vroege endosoommembraan (1.5.2.2.2.). De gefagoyteerde pHrodo-fagen zouden dan bij opname omringd worden met de groene EEA1labelling als aanduiding voor het endosoom-membraan. Dit kon niet worden bevestigd omdat de pHrodo kleuring in de preparaten reeds na een bewaring van 2 dagen zijn fluorescentieintensiteit verloor. Wanneer dit experiment herhaald zal worden, moet er onmiddelijke visualisatie plaatsgrijpen. De PBMCs werden ook gestimuleerd met de FITC-gelabelde fagen 39 en onderworpen aan een EEA1 labelling. Dit toonde aan dat na 10 min geen faag-fagocytose kon worden gedetecteerd, maar wel na 90 min voor beide fagen. Zo was een sterke accumulatie van rode EEA1 labelling rond de DAPI-gekleurde kernen te vinden (Fig. 16A, punt 1) en in Fig. 16A is ook een groene P. aeruginosa faag PNM te zien in de nabijheid van de kern omgeven door rode EEA1 kleuring (Fig. 16A, punt 2). Ook de FITC-gelabelde S. aureus faag ISP vertoonde opname in de cel door de omringing met de EEA1-labelling (Fig. 16, punt 3). Bij afwezigheid van de gelabelde fagen werden, op basis van de vorm en de grootte, groene stofpartikels als artefact waargenomen (Fig. 16C, punt 4). Rond de kern werd ook EEA1 labelling teruggevonden, dit kan het gevolg zijn van de mogelijke opname van een contaminant. De groene fluorescentie werd niet omgeven door de rode EEA1-merker (Fig. 16C). Het gebrek aan overlap toont aan dat Fig.16A/B faag-fagocytose weergeven. Fig. 16: Visualisatie van de faag-fagocytose mbv de EEA1 labelling na een stimulatie van 90 min. (Vergroting CLSM: 63X) Blauw: DAPI-gekleurde kernen, rood: EEA1 labelling (Alexafluor 633), groen: FITC-gelabelde fagen (A) Visualisatie van P. aeruginosa faag PNM-fagocytose. (B) Visualisatie van S. aureus faag ISP-fagocytose. Rode pijlen 1 t.e.m. 3: overlap tussen de EEA1-labelling en de FITC-gelabelde fagen. (C) Visualisatie van PBMC zonder toevoeging van de FITC-gelabelde fagen. Rode pijl 4: artefact. 3.4.7. Bepaling van verantwoordelijke fagocyt voor faag-fagocytose Na de verschillende aanwijzingen, dat faag-fagocytose wel degelijk plaatsgrijpt, werd getracht de verantwoordelijke fagocyt voor faag-fagocytose te bepalen met behulp van FluorescenceActivated Cell Sorting (FACS). Na analyse van de PBMC werd niet duidelijk welke fagocyten verantwoordelijk zijn voor faag-fagocytose. Zo werden er nauwelijks PBMCs gedetecteerd die over FITC-gelabelde fagen beschikten en er werd geen relatie gevonden tussen de CD4+ of CD14+ cellen met faag-fagocytose (Addendum: Fig. 21). CD14 wordt teruggevonden op de monocyten en niet bij de lymfocyten, die voornamelijk gekenmerkt worden door CD4+ receptoren. Als positieve controle werd gebruikgemaakt van de FITC-gelabelde microbeads (0.01 µM). Wanneer deze op dezelfde wijze werden toegevoegd aan de PBMCs, werden de FITC-gelabelde microbeads opgenomen door CD4+ cellen (Addendum: Fig. 21). Dit toont aan dat het experiment in de toekomst herhaalt zal moeten worden, want de CD4+ cellen voeren geen fagocytose uit. Er is dus mogelijks iets fout gelopen in het experiment (4.4.). 40 4. Conclusie 4.1. Aanduiding van faag-fagocytose op kwantitatief niveau De meeste experimenten, die in de literatuur beschreven werden over faag-fagocytose, handelden over macrofagen afkomstig van specifieke organen, zoals splenocyt macrofagen of de peritoneale macrofagen afkomstig van muizen en konijnen [32,52-54]. Er zijn geen studies bekend die zich focussen op de faag-fagocytose door humane PBMCs. De studie van Inchley et al. (1969) duidde immers aan dat faag-fagocytose vooral plaatsgreep ter hoogte van de lever en de milt [32,53]. Wat betreft het onderzoek van deze masterproef werd besloten om in vitro onderzoek uit te voeren op humane PBMCs. Dit had als extra voordeel dat een directe indicatie werd geleverd over hoe faag-fagocytose plaatsgrijpt bij de mens, want de immuunresponsen kunnen sterk verschillen tussen mens en muis/konijn. Deze masterproef had als voornaamste doel faag-fagocytose, door humane PBMCs, kwantitatief aan te tonen met behulp van qPCR en faagtitratie (plaque assay), om vervolgens te visualiseren met de CLSM. Faagtitratie (2.2.) is een techniek dat als gouden standaard wordt toegepast om fagen te kwantificeren [58,59]. Deze techniek heeft echter ook zijn beperkingen (Tabel 9), waaronder het feit dat alleen de actieve infectieuze fagen worden gekwantificeerd. In gepubliceerde studies omtrent faag-fagocytose werden dan ook enkel de fagen in het supernatans gedetecteerd, maar niet de gefagocyteerde fagen, waardoor nooit werd aangetoond dat de fagen effectief werden opgenomen door de cel. Tabel 9: De voor- en nadelen van faagtitratie en qPCR bij de bestudering van faag-fagocytose [58,59]. Kwantificatie Kwantificatie Arbeidsintensief Tijdsduur infectieuze niet-infecieuze Kost Optimalisatie (h) fagen fagen + 24 + + / Faagtitratie 4 + + - (kits) w qPCR Legende: + = voordeel; - = nadeel/beperking; / = geen optimalisatie; w: wel optimalisatie 4.1.1. Optimalisatie van faag-fagocytose kwantificatie met qPCR. Door de hierboven besproken beperkingen van faagtitratie werd getracht qPCR kwantificatie toe te passen, aangezien deze techniek als veel sensitiever wordt beschouwd en in staat zou zijn gedegradeerde fagen in de celpellet te kwantificeren [58,59]. Edelman et al. (2003) heeft in een studie aangetoond dat faag-kwantificatie met qPCR mogelijk is, waarbij het optimale concentratiebereik voor faag-DNA extractie ongeveer gelegen is rond de 106-108 pfu/ml [59]. Voorafgaand aan de qPCR kwantificatie was het noodzakelijk de laagst mogelijke drempelwaarde van de faag-DNA extractie te achterhalen, waarbij het mogelijk is de 41 geëxtraheerde faag-hoeveelheid te kwantificeren met qPCR. Binnen deze studie werd ervan uitgegaan dat slechts een beperkte hoeveelheid fagen in de celpellet zouden worden gedetecteerd, omdat verwacht werd dat fagocytose nauwelijks zou plaatsgrijpen. Diverse types van DNA extracties, waaronder de fenol/chloroform zuivering, de verhitting, de freezing-heatshock methode, de EasyMAG en de Norgen faag-DNA isolatiekit, werden dan ook met elkaar vergeleken om te achterhalen welke techniek het meest geschikt was om DNA te extraheren uit een lage hoeveelheid P. aeruginosa faag PNM en S. aureus faag ISP. De fenol/chloroform zuivering van de P. aeruginosa faag PNM (109 pfu/ml) leverde een DNA-concentratie van 33.6 ng/µl op. Deze klassieke faag-DNA extractie resulteerde, net als de verhitting en de freezing-heatshock methode, niet in amplificatie (Addendum: Tabel 11) [60]. Dit zou bij de fenol/chloroform zuivering te wijten kunnen zijn aan fenol resten die niet konden weggewassen worden met Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). Fenol resten kunnen qPCR inhibitie veroorzaken door denaturatie of binding met het polymerase [60]. De inhibitie van qPCR, na faag verhitting en de freezing heatshock methode, kan het gevolg zijn van de aanwezige hoeveelheid proteïnen, die de amplificatie belemmeren, of door het gebrek aan lyse van de faagpartikels (Tabel 10). Dit resultaat komt niet overeen met de studie van Edelman et al. (2003), die na verhitting van de E.coli faag wel faag-DNA amplificatie met de qPCR konden waarnemen [59]. De negatieve controles (buffers of extractiebuffers onderworpen aan de EasyMAG extractie en de Norgen faag-DNA isolatiekit) leverden daarentegen wel een amplificatiesignaal op van P. aeruginosa faag PNM - DNA (Addendum: Tabel 12). Dit zou kunnen verklaard worden door primer-dimeer vorming, maar deze verklaring kon worden uitgesloten op basis van agarose gelelektroforese waarbij er geen band te detecteren was bij de verwachte bp-lengte en er geen amplificatie waar te nemen was bij de toevoeging van enkel de mastermix aan de qPCR. Een mogelijke verklaring voor deze vals-positieve amplificatie wordt geboden door de bevinding van Naccache et al. (2014), die aantoonden dat de silica in de Qiagen nucleïnezuur extractie kit het NIH-CQV virus bevatte. Het NIH-CQV virus is een hybride virus dat een homoloog replicatie-geassocieerd gen bezit van de Circoviridae, samen met een homoloog capside-proteïne gen van de Parvoviridae [61]. Er werd met behulp van de NCBI genome Blast website nagegaan of de gebruikte primers bij de P. aeruginosa faag PNM kwantificatie (Tabel 2) DNA amplificatie van dit virus zouden induceren, maar dit was niet het geval, waarna binnen deze studie aangetoond werd dat er geen specifiek verband was met de 42 gecontamineerde negatieve controles. De bron van contaminatie kon dus niet worden opgespoord (Addendum: Tabel 12). Het S. aureus faag ISP - DNA werd enkel geëxtraheerd met de EasyMAG DNA extractie en de Norgen faag-DNA isolatiekit, omdat de overige DNA-extracties bij de P. aeruginosa faag PNM geen amplificatie induceerde door mogelijke contaminanten (Tabel 10). De S. aureus faag ISP werd het efficiëntst gekwantificeerd met de EasyMAG en de negatieve controle bleef negatief (Tabel 10). Voor kwantificatie van de faag bij de PBMC stimulatie-experimenten werd het DNA geëxtraheerd met het EasyMAG-automaat, omdat dit voor beide faag-extracties efficiënte resultaten opleverde, behalve bij zeer lage faag-concentraties (Tabel 10). Door de detectie van het P. aeruginosa faag PNM-DNA in de negatieve controles werd er rekening gehouden met een mogelijke overschatting en zal verdere optimalisatie van de extractie noodzakelijk zijn. Tabel 10: Overzicht: extractietechnieken voor P. aeruginosa faag PNM (PNM) en S. aureus faag ISP (ISP) Fenol/chloroform Verhitting/ EasyMAG Norgen faag zuivering freezing heatshock DNA isolatie kit Beide fagen Beide fagen PNM ISP PNM ISP Type faag GA GA 5.30 4.66 4.30 5.34 Min. concentratie (log (pfu/ml)) Fenol Proteïnen Buffers* Geen Buffers* Geen Mogelijke Silica Silica contaminanten Nauwelijks genoom Korte tijdsduur Automatisch Werk van +/- 3h Voordelen fragmentatie Werk van +/- 3h Toxische producten Geen amplificatie Detectie Detectie Nadelen Geen amplificatie faag PNM Geen faag PNM Geen Arbeidsintensief in producten in producten Legende: GA = geen amplificatie; Buffers* = alle producten betrokken bij de EasyMAG extractie en de Norgen faag DNA isolatie kit en de faag bewaring 4.1.2. Kwantificatie van faag-fagocytose Na qPCR optimalisatie werden de PBMCs (107 cellen/ml) gedurende 10 en 90 min gestimuleerd met 3 x 109 P. aeruginosa faag PNM of S. aureus faag ISP. De nietgefagocyteerde fagen in het supernatans werden gekwantificeerd met behulp van de faagtitratie en de qPCR. Ondanks het feit dat de qPCR alle fagen (ook niet infectieuze fagen) kan kwantificeren (Tabel 9), werd binnen deze masterproef geopteerd ook de faagtitratie uit te voeren om met de qPCR resultaten te vergelijken. Faagtitratie voor de P. aeruginosa faag PNM resulteerde in een gelijkaardige kwantificatie in het supernatans als de qPCR, met name 108 pfu/ml, desondanks het feit dat de qPCR voor de P. aeruginosa faag PNM contaminatieproblemen vertoonde (Addendum: Tabel 15). De S. aureus faag ISP toonde een overschatting 43 van het aantal fagen aan in het supernatans door middel van faagtitratie (Addendum: Tabel 15). De overschatting van het aantal fagen na PBMC stimulatie was reproduceerbaar, maar het is biologisch onmogelijk dat er meer fagen in het supernatans worden teruggevonden dan er oorspronkelijk werden toegevoegd voor faag-fagocytose, waardoor de gemeten faagconcentratie met de qPCR, die lager is dan de toegevoegde hoeveelheid, betrouwbaarder is dan de faagtitratie. Dit werd ook waargenomen bij de stimulatie met de S. aureus faag ISP en LPS. Door de mogelijke contaminatie van de DNA extractiebuffers met P. aeruginosa faag PNM moet een overschatting in de qPCR echter ook nog in acht worden genomen. Maar het was duidelijk dat het verloop van de faag-fagocytose van beide fagen verschillend was. Gedurende deze studie werd P. aeruginosa faag PNM DNA reeds na 2 min teruggevonden in de celpellet en bereikte de PBMCs reeds na 2 min hun maximale faag-opname (Fig. 5, Tabel 10). In de studies van Hodyra-Stefaniak et al. (2015), Inchley et al. (1969) en Aronow et al. (1964) is hier geen informatie over terug te vinden, omdat ze pas na een incubatie van verschillende uren de mate van faag-fagocytose voor het eerst bepaalden [32,53,54]. Srivastava et al. (2004) vonden dat de hoeveelheid fagen in het bloed van de muizen afnam na 5 min [40]. De studie van Aronow et al. (1964) toonde met behulp van elektronenmicroscopie (EM) de opname van de E. coli faag T2 na 7 min aan [54]. Voor de S. aureus faag ISP was er volgens zowel de faagtitratie als de qPCR, na een stimulatie van 10 en 90 min, nog geen significante opname door de fagocyten (Tabel 5). Het verschil in snelheid waarmee beide fagen gefagocyteerd worden, kan afhankelijk zijn van de grootte van de fagen. Zo is de P. aeruginosa faag PNM, die behoort tot de Podoviridae (kop: 50/60 nm; staart: 10/12 nm), kleiner dan de S. aureus faag ISP, die behoort tot de Myoviridae (kop: 78 nm; staart: 100 nm) [28,62]. Het zou ook kunnen dat het aantal fagen dat adhereert aan het celmembraan van de PBMCs hoger is bij de P. aeruginosa faag PNM en er meer receptor interacties worden aangegaan om de fagocyt te activeren, terwijl door de grootte van de S. aureus faag ISP minder fagen in staat zijn aan de receptoren van de fagocyt te binden. Het zou ook kunnen dat we hier te maken hebben met een PBMC-donor specifieke reactie, doordat een mogelijke eerdere blootstelling van de PBMC-donor aan de P. aeruginosa faag PNM, resulteerde in sterkere fagocytose. Ook Nelstrop et al. (1967) rapporteerde dat macrofagen verkregen uit een E. coli faag T1 geïmmuniseerd konijn bij nieuwe blootstelling aan faag T1 sneller de fagen klaarden [52]. Om deze laatste verklaring uit te sluiten of te bevestigen zal fagocytose bij verschillende PBMC-donors verder bestudeerd moeten worden. 44 Faag-fagocytose voor de P. aeruginosa faag PNM werd na 2 min waargenomen. Zo werd 2 % van de toegevoegde fagen na 2 min teruggevonden in de PBMCs, deze fagen kunnen zich zowel op als in de PBMCs bevinden, en 6 % was terug te vinden in het supernatans. De verdwenen fractie kan mogelijks reeds gedeeltelijk gedegradeerd zijn en aan de rand van de well kleven. Voor de P. aeruginosa faag PNM-fagocytose zou LPS-contaminatie een rol kunnen spelen. Endotoxines, zoals LPS, zijn sterk pro-inflammatoire stoffen die faagfagocytose zouden kunnen induceren, en zijn daarenboven moeilijk uit de faagoplossing te verwijderen [32]. Om dit na te gaan, voegden we LPS (104 EU/ml) toe aan de S. aureus faag ISP. De faagtitratie en de qPCR leverde hierbij tegenstrijdige resultaten, zo werd er bij de faagtitratie geen faag-fagocytose gedetecteerd en bij de qPCR werd wel een opname van de fagen waargenomen. De log concentratie van 3.93 pfu/ml van de fagen in de celpellet bleven beperkt. LPS kan mogelijks zorgen voor een snellere afbraak van het faagpartikel in de cel. Dit experiment was slechts eenmalig uitgevoerd, waarna het verschil in resultaten tussen de faagtitratie en de qPCR de nood benadrukt om dit experiment in de toekomst te herhalen. 4.2. Microscopische visualisatie van faag-fagocytose Faag-fagocytose werd aangetoond door middel van qPCR en faagtitratie, waarna ook getracht werd de fagocytose te visualiseren met de CLSM. Aronow et al. trachtten reeds in 1969 in vitro endocytose van de E. coli faag T2 door peritoneale konijn-macrofagen te visualiseren met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De fagen werden op de EM beelden voorgesteld als zwarte stippen [54]. Het nadeel van EM is dat er geen specifieke merker kan vastgehecht worden aan de faag, waardoor de waargenomen objecten binnenin de cellen ook andere entiteiten dan fagen kunnen zijn. Recentere studies maakten gebruik van de E. coli faag T4 en P. aeruginosa faag F8, die door genetische modificatie gemerkt werden met een green fluorescent protein (GFP). De labelling maakte het mogelijk aan te tonen dat hetgene wat gevisualiseerd werd effectief geïdentificeerd kon worden als faag, terwijl bij de EM dit aangenomen werd op basis van de vergelijking die gemaakt werd tussen de gestimuleerde en de niet-gestimuleerde cellen [32,54,63]. Gedurende deze masterproef werd voor de eerste maal gebruikgemaakt van proteïne labels, zoals FITC en pHrodo, om fagen te visualiseren. Zo bindt FITC op primaire amines, terwijl de pHrodo op alle amines bindt. Deze wijze van faagvisualisatie is minder arbeidsintensief dan GFP labelling en duurt slechts anderhalf uur, terwijl de vorming van GFP gemodificeerde fagen enkele dagen in beslag kan nemen [63]. 45 Visualisatie van de FITC-gelabelde fagen in deze studie leverde gelijkaardige resultaten op als de visualisatie van de GFP-gemodificeerde fagen, zoals verkregen in de studie van Hodyra-Stefaniak et al. (2015). Deze auteurs toonden twee intens groene stippen, die geclusterde fagen voorstelde zoals in figuur 14D en E [32]. Deze interpretatie samen met de FITC-fluorescentieintensiteit metingen toonden aan dat ook binnen deze studie de FITCgelabelde fagen de groene stippen voorstelden (Tabel 7). De FITC-gelabelde fagen werden gefagocyteerd na 90 min (Fig. 14; Fig. 16). Dit werd ondersteund door de studie van Kazmierczak et al. (2014) die aanduidde dat GFP-gelabelde fagen na 40 min werden opgenomen in de murine macrofagen [63]. De overlap tussen de FITC-gelabelde fagen en de DAPI gekleurde PBMC-kernen leverde een indicatie van faag-fagocytose, maar vormt op zich geen echt bewijs omdat fagen die aan de buitenkant van de fagocyt kleven ook zullen colokaliseren met de DAPI-gekleurde fagocytkern. De studie van Hodyra-Stefaniak et al. (2015) toonde wel aan dat de GFP-gelabelde fagen gefagocyteerd werden door de splenocyten, doordat het fluorescentie-spectrum verschoof van groen naar rood wanneer de fagen werden gedegradeerd [32]. Dit werd echter nog niet bevestigd door andere studies. Om co-localisatie van faag en PBMC ten gevolge van loutere adherentie uit te sluiten werd binnen deze masterproef geopteerd om gebruik te maken van de pHrodo labelling. pHrodo is een fluorogeen die naarmate de omgeving verzuurt, toeneemt in fluorescentie. Wanneer de pHrodo gelabelde fagen werden gefagocyteerd, werden ze door versmelting met de lysosomen blootgesteld aan een pH reductie voor degradatie van de faag en werd de pHrodo fluorescentie gedetecteerd. Dit werd eveneens aangeduid door de toenemende fluorescentieintensiteit bij blootstelling aan zure buffers tot een pH 4 (Tabel 8). Wat aanduidt dat de toegepaste P. aeruginosa faag PNM en de S. aureus faag ISP effectief gelabeld waren met de pHrodo probe en bij faag-fagocytose dus rood zullen aankleuren onder de CLSM. De fluorescentie-intensiteit van de pHrodo gelabelde P. aeruginosa faag PNM was hoger dan bij de pHrodo gelabelde S. aureus faag ISP (Tabel 8). Dit is in tegenstelling met de fluorescentieintensiteit die gemeten werd voor de FITC-gelabelde fagen, waar de S. aureus faag ISP het sterkst gelabeld werd met FITC (Tabel 7). De resultaten van de FITC- fluorescentie intensiteit kan gewijd worden aan de grootte van de fagen. Zo is de S. aureus faag ISP groter dan de P. aeruginosa faag PNM, waardoor verwacht zou worden dat ze over meer primaire amines beschikken om FITC te binden [28,62]. pHrodo bindt op alle amines waardoor verwacht werd dat dit hetzelfde resultaat zou opleveren. Waarom dit niet het geval is, is niet bekend. 46 Er werd nagegaan of de labelling een effect had op de infectiviteit van de fagen, omdat bij de labelling ook DMSO wordt gebruikt. Wanneer de fagen enkel werden behandeld met DMSO was er bij beide fagen een reductie in infectiviteit waar te nemen, die overeenkwam met de reductie van de faag-infectiviteit na proteïne labelling (Fig. 13; Tabel 6) [64]. Op basis van de pHrodo labelling konden we besluiten dat de S. aureus faag ISP na 10 min werd gefagocyteerd. Maar na 90 min kon geen pHrodo meer gedetecteerd worden. Dit kan verklaard worden door de beperkte labelling van de S. aureus faag ISP, waardoor de pHrodo sneller binnen de lysosomen gedegradeerd werd. Toegenomen fluorescentie, zoals bij de pHrodo gemerkte S. aureus faag ISP, kon niet worden waargenomen voor de P. aeruginosa faag PNM. Als extra aanduiding van faag-fagocytose werd getracht de endosomen, die de gefagocyteerde fagen omvatten, te visualiseren met een EEA1-labelling. Early endosome autoantigen 1 (EEA1) is een proteïne dat zich bevindt ter hoogte van het endosoommembraan (1.5.2.2.2.) en bij effectieve faag-fagocytose de faag zou moeten omgeven [49]. Deze omlijning werd verkregen na een stimulatie van 90 min bij de FITC-gemerkte P. aeruginosa faag PNM en de FITC-gemerkte S. aureus faag ISP (Fig. 16). Hieruit kan dus geconcludeerd worden dat faagfagocytose effectief plaatsgrijpt en gevisualiseerd kan worden na een stimulatieperiode van 90 min. Zo is er een duidelijke correlatie waar te nemen tussen de FITC-gelabelde fagen die colokaliseerden met de celkernen en de EEA1-labelling, die de FITC-gelabelde fagen omgeven. 4.3. Relatie tussen faag-fagocytose visualisatie en kwantificatie Faagtitratie en qPCR toonden aan dat de P. aeruginosa faag PNM reeds na 2 min wordt gefagocyteerd, maar dit werd niet bevestigd door de microscopische visualisatie. Zo is directe visualisatie van faag-fagocytose voor zowel de FITC-gelabelde P. aeruginosa faag PNM als voor de FITC-gelabelde S. aureus faag ISP pas mogelijk na 90 min (Fig. 14; Fig. 16). Dit tijdsverschil kan verklaard worden door de nood aan een sterkere celadherentie aan het dekglas vooraleer faag-fagocytose gevisualiseerd kan worden. Een uitzondering hierop is de visualisatie van de pHrodo-gemerkte S. aureus faag ISP die reeds na 10 min kon worden gevisualiseerd. Het gebrek aan visualisatie van de pHrodo gelabelde S. aureus faag ISP na een incubatie van 90 min kan het gevolg zijn van de snelle degradatie van pHrodo, die bij een verzuring lager dan pH 3 reeds aan fluorescentie-intensiteit verliest (Tabel 8). S. aureus faag ISP werd volgens de resultaten van de qPCR en de faag-titratie, in tegenstelling met de 47 microscopische visualisatie, niet gefagocyteerd. Op basis van de kwantitatieve en de visuele resultaten kan geconcludeerd worden dat fagocytose faag specifiek is en plaatsgrijpt voor de P. aeruginosa faag PNM. En er zijn reeds visuele indicaties dat de S. aureus faag ISP wordt gefagocyteerd. 4.4. Flow cytometrie detectie van de fagocyt verantwoordelijk voor faag-fagocytose De experimenten op basis van kwantificatie met qPCR en faagtitratie en op basis van visualisatie met FITC, DAPI, pHrodo en EEA1 kleuringen wijzen erop dat faag-fagocytose van de P. aeruginosa faag PNM door PBMCs wel degelijk plaatsvindt. De vraag blijft welke immuuncel verantwoordelijk is voor de fagocytose. De studies van Srivastava et al. (2004) en Uchiyama et al. (2009) weerlegden recent dat macrofagen en neutrofielen fagen fagocyteerden [40,55]. Om dit te ondersteunen of te weerleggen werd flow cytometrie toegepast (2.12). Deze benadering leverde geen eenduidig antwoord op. Zo werden de FITCgelabelde fagen niet teruggevonden in de CD4+ en CD14+ cellen. Het CD4 antigen is voornamelijk terug te vinden op helper T-lymfocyten en wordt toegepast om de lymfocyten te scheiden van de CD14+ cellen, bestaande uit monocyten en macrofagen [56]. Het is mogelijk dat de fagen niet sterk genoeg geclusterd waren binnenin de cel om voldoende FITCintensiteit te genereren. De positieve controle, namelijk de microbeads (0.01 µM), werden in de publicatie van Gu et al. reeds gebruikt om fagocytose na te gaan binnen monocyten [56]. Binnen deze studie werden deze beads echter opgenomen door CD4+ cellen, die niet fagocyteren. Verdere optimalisatie is dus aangeraden. 5. Algemeen besluit Samenvattend werd in deze studie kwantitatief aangetoond dat de P. aeruginosa faag PNM gefagocyteerd werd, terwijl dit niet het geval was voor de S. aureus faag ISP na een incubatie van 90 min. Dit laatste was echter in tegenstrijd met de visualisatie van de co-lokalisatie van de FITC- en pHrodo-gelabelde fagen met de DAPI-gekleurde kernen en de EEA1 labelling, die aantoonde dat faag-fagocytose voor beide fagen zeker plaatsgreep na 90 min. Het gebruik van de proteïne labels voor faag visualisatie werd voor de eerste maal toegepast en zal toekomstig onderzoek versnellen. De fagocyt verantwoordelijk voor faag-fagocytose kon niet achterhaald worden met behulp van flow cytometrie. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen of de bevindingen bevestigd kunnen worden in andere PBMC-donoren. Tevens zal aan de hand van verder onderzoek ook moeten bepaald worden in welke mate LPS contaminatie de resultaten kunnen beïnvloeden en welke celtypes verantwoordelijk zijn voor de fagocytose. 48 6. Referenties [1] Ahmed K. et al. (2012). Bacteriophage therapy revisited. Afr. J. Microbiol. Res. 6: 3366 - 3379. [2] Chan B. et al. (2013). Phage cocktails and the future of phage therapy. Future Microbiol. 8: 769 - 783. [3] Mills S. et al. (2013). Movers and shakers: Influence of bacteriophages in shaping the mammalian gut microbiota. Gut Microbes 4: 4 - 16. [4] Ackermann H. et al. (2012). Prokaryote viruses studied by electron microscopy. Arch. Virol. 157: 1843 1849. [5] Garcia-Doval C. et al. (2013). Bacteriophage receptor recognition and nucleic acid transfer. Subcell. Biochem. 68: 489 - 517. [6] Kirsch group. (2006) Diversity, evolution, ecology and genome structure of the T4 superfamily of bacteriophages (Online). https://www.lmgm.biotoul.fr/uk/equipes/grpkrisch/. (Read 12/12/2015). [7] Sulakvelidze A. et al. (2001). Bacteriophage therapy. Am. Soc. Microbiol. 45: 649 - 659. [8] Abedon S. et al. (2011). Phage treatment of human infections. Bacteriophage 1: 66 - 85. [9] Pincus N. et al. (2015). Strain specific phage treatment for Staphylococcus aureus infection is influenced by host immunity and site of infection. PLoS ONE 4: 1 - 16. [10] Levin B. et al. (2004). Population and evolutionary dynamics of phage therapy. Nature 2: 166 - 173. [11] Budynek P. et al. (2010). Bacteriophages and cancer. Arch. Microbiol. 192: 315 - 320. [12] Dabrowska K. et al. (2005). Bacteriophage penetration in vertebrates. J. Appl. Microbiol. 98: 7 - 13. [13] Oppenheim A. et al. (2005). Switches in bacteriophage Lambda development. Annu. Rev. Genet. 39: 409 429. [14] De Paepe M. et al. (2014). Bacteriophages: an underestimated role in human and animal health? Front. Cell. Infect. Microbiol. 4: 1 - 11. [15] Chaturongakul S. et al. (2014). Phage-host interplay: examples from tailed phages and Gram-negative bacterial pathogens. Front. Microbiol. 5: 1 - 8. [16] Leavitt J. et al. (2013). The tip of the tail needle affects the rate of DNA delivery by Bacteriophage P22. PLoS ONE 8: 1 - 13. [17] Andres D. et al. (2010). Tailspîke interactions with lipopolysaccharide effect DNA ejection from phage P22 particles in vitro. J. Biol. Chem. 285: 36768 - 36775. [18] Yap M. et al. (2014). Structure of the 3.3 MDa, in vitro assembled, hubless bacteriophage T4 baseplate. J. Struct. Biol. 187: 95 - 102. [19] Groth A. et al. (2004). Phage Integrases: Biology and Applications. J. Mol. Biol. 335: 667 - 678. [20] Young R. et al. (2000). Phages will out: strategies of host cell lysis. Trends Microbiol. 8: 120 - 128. [21] Young R. (2014). Phage lysis: three steps, three choices, one outcome. J. Microbiol. 52: 243 - 258. [22] Oliveira H. et al. (2013). Molecular aspects and comparatice genomics of bacteriophage endolysins. J. Virol. 87: 4558 - 4570. [23] Berry J. et al. (2012). The spanin complex is essential for Lambda lysis. J. Bacteriol. 194: 5667 - 5674. [24] Summer E. et al. (2007) Rz/Rz1 lysis gene equivalents in phage of Gram-negative hosts. J. Mol. Biol. 373: 1096 - 1112. [25] Young R. (2002). Bacteriophage Holins: Deadly Diversity. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4: 21 - 36. [26] Kurzepa A. et al. (2009). Bacteriophage interactions with phagocytes and their potential significance in experimental therapy. Clin. Exp. Med. 9: 93 - 100. [27] Kutateladze M. et al. (2010). Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or supplement antibiotics. Trends Biotech. 28: 591 - 595. [28] Merabishvili M. et al. (2009). Quality-controlled small-scale production of well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS ONE 4: 1 - 10. [29] Levin B. et al. (1996). Phage therapy revisited: the population biology of a bacterial infection and its treatment with bacteriophage and antibiotics. Am. Nat. 147: 882 - 898. [30] Kasman L. et al. (2002). Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy. J. Virol. 76: 5557 - 5564. [31] Cairns B. et al . (2009). Quantitative models of In vitro bactreriophage-host dynamics and their application to phage therapy. PLoS Pathog. 5: 1 - 10. [32] Hodrya-Stefaniak K. et al. (2015). Mammalian host-versus-phage immune response determines phage fate in vivo. Sci. Rep. 5: 1 - 13. [33] Gorski A. et al. (2012). Chapter 2: phage as a modulator of immune responses: practical implications for phage therapy. Adv. Virus Res. 83: 41 - 71. [34] Dabrowska K. et al. (2014). Immunogenicity studies of proteins forming the T4 phage head surface. J. Virol. 88: 12551 - 12557. 49 [35] Underhill D. et al. (2012). Information processing during phagocytosis. Nature 12: 492 - 502. [36] Mogensen T. (2009). Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses. Clin. Microbiol. Rev. 22: 240 - 273. [37] Warrington R. et al. (2011). An introduction to immunology and immunopathology. Allergy Asthma Clin. Immunol. 7: 1 - 8. [38] Majewska J. et al. (2015). Oral application of T4 phage induces weak antibody production in the gut and in the blood. Viruses 7: 4783 - 4799. [39] Bearden C. et al. (2005). Rituximab inhibits the in vivo primary and secondary antibody response to a neoantigen, bacteriophage X174. Am. J. Transplant. 5: 50 - 87. [40] Srivastava A. et al. (2004). Immunological factors that affect the in vivo fate of T7 phage in the mouse. J. Virol. Methods 115: 99 - 104. [41] Barr J. et al. (2013). Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. PNAS 110: 10711 - 10776. [42] Barr J. et al. (2015). Subdiffusive motion of bacteriophage in mucosal surfaces increases the frequency of bacterial encounters. PNAS 112: 13675 - 13680. [43] Aderem A. et al. (1999). Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Ann. Rev. Immunol. 17: 593 - 623. [44] Niedergang F. et al. (2004). Signaling and membrane dynamics during phagocytosis: many roads lead to the phagos(R)ome . Curr. Opin. Cell Biol. 16: 422 - 428. [45] Groves E. et al. (2008). Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cell. Mol. Life Sci. 65: 1957 - 1976. [46] Greenberg S. et al. (2002). Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14: 136 - 145. [47] Przerwa A. et al. (2006). Effects of bacteriophages on free radical production and phagocytic functions. Med. Microbiol Immunol. 195: 143 - 150. [48] Qiagen. (2013). Fc-GammaR-mediated phagocytosis in macrophages. (Online). https://www.qiagen.com/be/shop/genes-and-pathways/pathway-details/?pwid=179. (Read: 13/12/2015). [49] Gillooly D. et al. (2001). Phosphoinositides and phagocytosis. J. Cell Biol. 155: 15 - 17. [50] Gorski A. et al. (2006). Bacteriophage translocation. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 46: 313 - 319. [51] Weber-Dabrowska B. et al. (2002). Effect of phage therapy on the turnover and function of peripheral neutrophils. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 34: 135 - 138. [52] Nelstrop A. et al. (1967). Studies on phagocytosis: II in vitro phagocytosis by macrophages. Immunol. 14: 339 - 346. [53] Inchley C. (1969). The activity of mouse kupffer cells following intravenous injection of T4 bacteriophage. Clin. Exp. Immunol. 5: 173 - 187. [54] Aronow R. et al. (1964). Electron microscopy of in vitro endocytosis of T2 phage by cells from rabbit peritoneal exudate. J. Exp. Med. 120: 943 - 954. [55] Uchiyama J. et al. (2009). Blood kinetics of four intraperitoneally administered therapeutic candidate bacteriophages in healthy and neutropenic mice. Microbiol. Immunol. 53: 301 - 304. [56] Gu B. et al. (2014). A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes usin real-time flow cytometry. Cytometry A 85: 313 - 321. [57] Nordenfelt P. et al. (2011). Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J. Leukoc. Biol. 90: 271 - 284. [58] Anderson B. et al. (2011). Enumeration of Bacteriophage particles. Bacteriophage 1: 86 - 93. [59] Edelman D. et al. (2003). Real-time PCR provides improved detection and titer determination of bacteriophage. BioTechn. 35: 368 - 375. [60] Demeke T. et al. (2010). Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits. Anal. Bioanal. Chem. 396: 1977 - 1990. [61] Zhi N. et al. (2014). Reply to Naccache et al. : Viral sequences of NIH-CQV virus, a contamination of DNA extraction method. PNAS 111: 977. [62] Ceyssens P. et al. (2011). Phenotypic and genotypic variation within a single bacteriophage species. Virol. J. 8: 134 - 138 [63] Kazmierczak Z. et al. (2014). Molecular imaging of T4 phage in mammalian tisues and cells. Bacteriophage 4: 1 - 6. [64] Barbosa I. et al. (2003). Acute and chronic toxicity of dimethylsulfoxide to Daphnia magna. Bull.Environ. Contam. Toxicol. 70: 1264 - 1268. 50 7. Addendum 7.1. Ondersteuning van Materialen en Methoden Fig. 17: Webbing door de Pseudomonas aeruginosa faag PNM. Webbing kan verkregen worden wanneer de faag-oplossing zodanig verdund is dat er maximale lyse van de gastheercultuur plaatsgrijpt, waarbij nog individuele plaques waar te nemen zijn. Wanneer een nieuwe faagstock geproduceerd wordt, zal er steeds vertrokken worden van de faag-concentratie die webbing veroorzaakte, omdat dit een duidelijke aanduiding is dat fagen aanwezig zijn in een zeer hoge concentratie. Wanneer de fagen nog sterker zorgen voor de lyse van de bacteriële gastheer is de volledige petrischaal doorzichtig en kan de bacteriële gastheer niet meer worden gedetecteerd. In dat geval kan er echter niet met zekerheid gezegd worden of er effectief fagen aanwezig zijn en er niet slechts sprake is van een lege solid agar plaat. Verkregen van Drs. Jonas Van Belleghem. i 7.2.Ondersteuning van de resultaten 7.2.1. Optimalisatie van P. aeruginosa faag PNM kwantificatie Tabel 11: Vergelijking van verschillende DNA extractiemethoden voor P. aeruginosa faag PNM kwantificatie. Staal Fenol/Chloroform 1/10 verdunde EasyMAG extractie DNA extractie Fenol/Chloroform extractie Norgen faag-DNA isolatiekit Log(theoretische concentratie o.b.v. titer) Log(berekende concentratie o.b.v Cq verkregen met qPCR) (pfu/ml) (pfu/ml) PNM_1 10.30 GA GA NT NT PNM_2 9.30 NT NT 10.69 11.70 PNM_3 8.30 GA GA 9.60 8.58 PNM_4 7.30 NT NT 8.57 6.85 PNM_5 6.30 GA GA 7.35 6.64 PNM_6 5.30 GA 8.38 6.77 8.04 PNM_7 4.30 GA 7.38 6.57 7.71 PNM_8 3.30 GA 6.38 5.78 7.68 PNM_9 2.30 GA 5.38 5.68 7.29 PNM_10 1.30 NT NT 5.65 8.36 PNM_11 0.30 NT NT 6.21 7.69 PNM_12 0 NT NT 5.80 7.38 PW* 0 NT NT GA 6.59 PW 0 NT NT 4.62 5.66 Legende: PNM : P. aeruginosa faag PNM; 1→ 12: P. aeruginosa faag PNM – verdunningen; PW: Fysiologisch water (n = 2); PW*: Fysiologisch water behandeld met DNase I (1 mg/ml), RNase A (12.5 mg/ml), SDS (20 %), Proteinase K (10 mg/ml) (n = 3); NT: niet getest; GA: geen amplificatie/geen detectie van faag-DNA met qPCR. ii Tabel 12: P. aeruginosa faag PNM (log(concentratie (pfu/ml)) gedetecteerd in mogelijke contaminanten bij de faag-DNA extractie met de easyMAG en de Norgen faag-DNA isolatie kit Extractie wijze Norgen faag-DNA isolati kit EasyMAG extractie Geen voorbehandeling Type staal Kolom Voorbehandeling en kolom (2.5 µl toegevoegd staal) Geen voorbehandeling Silica toevoeging Voorbehandeling en silica toevoeging (2.5 µl toegevoegd staal) Voorbehandeling (proteinase K, DNase I, RNase A, SDS) Gedistilleerd water* 5.13 6.03 GA NT 5.66 8.60 GA Fysiologisch water* 4.32 5.67 7.67 NT 4.62 GA GA HPLC-water* 5.17 6.47 8.54 NT 6.58 6.02 GA HPLC-water met zout* GA 7.05 7.84 NT 8.38 9.05 GA Elutiebuffer 5.03 5.51 GA NT 8.26 GA GA Lyse buffer GA GA 6.57 NT 6.01 8.39 GA Wasoplossing A (Norgen kit) NT 5.58 GA Niet in kit Niet in kit Niet in kit NT Faag PNM GA 8.50 11.98 11.96 11.60 11.65 GA (2.1010pfu/ml) Legende: GA: geen amplificatie; NT: niet getest; *: geautoclaveerd; Niet in kit: Product wordt niet toegepast in DNA extractie; Geen voorbehandeling: 2.5 µl van de zuivere stalen werden toegevoegd aan 7.5 µl mastermix iii 7.2.2. Optimalisatie voor S. aureus faag ISP kwantificatie Fig. 18: Agarose gelelektroforese na gradiënt PCR voor bepaling hybrisatietemperatuur voor primer ISP. Legende: L = DNA ladder (moleculair gewicht: 100 bp), Temperatuur = hybridisatietemperatuur, X = aanduiding voor de combinatie tussen primerpaar met toegepaste hybridisatietemperatuur gedurende PCR, rode kaders = meest intense band voor primerpaar ISP1 en ISP2. iv Fig. 19:Agarose gelelektroforese na qPCR voor bepaling van efficiëntste primerpaar. Legende: L= DNA ladder (moleculair gewicht:100 bp), S = staal van standaardverdunningsreeks, N= Norgen DNA extractie stalen uit faag-verdunningsreeks. S1→ S8 = verdunning van de oorspronkelijk faag ISP-DNA stock, N1 → N12 = faag-DNA verkregen uit de faag-verdunning v Fig. 20: De vorming van primer-dimeren bij primerparen ISP-1 en ISP-2 aan een concentratie van 0.5 µM en 0.2 µM. Hoe hoger de primer concentratie in de mastermix, hoe groter het risico op de vorming van primer-dimeren, die voorgesteld worden als de minder dense curves, hier aangeduidt met een rode pijl. vi Tabel 13: Vergelijking van de efficiëntie van de Norgen faag DNA isolatie kit en de easyMAG DNA-extractie voor de verschillende concentratie van S. aureus faag ISP Faag ISP verdunning Log (theoretische concentratie o.b.v. titer) (pfu/ml) ISP_1 ISP_2 ISP_3 ISP_4 ISP_5 ISP_6 PW** 9.48 8.48 6.48 4.48 2.48 0.48 0.00 Log (berekende concentratie o.b.v. de Cq-waarde verkregen met qPCR) (pfu/ml) Norgen faag DNA easyMAG isolatie kit extractie 4.34 9.28 Ntb 8.17 5.34 6.12 Ntb 4.34 Ntb Ntb Ntb Ntb Ntb Ntb Legende: ISP: S.aureus faag ISP; 1 → 6: faag ISP – verdunningen; PW**: geautoclaveerd fysiologisch water (n=2); GA: geen amplificatie; Ntb: niet te berekenen vanwege gebrek aan amplificatie/geen detectie van faag-DNA met qPCR; rood = resultaten waarbij de grootteorde van de log waarde van de theoretische faag concentratie overenstemt met de grootteorde van de log waarden van de faag concentratie verkregen met de qPCR. vii 7.3.Visualisatie van faag-fagocytose 7.3.1. Bepaling intensiteit van de proteïne gelabelde fagen Tabel 14: Reductie in infectiviteit van de gelabelde fagen ten gevolge van de labelling met FITC (in DMSO) Type faag Faag PNM Faag ISP FITC-concentratie (mg/ml) 1 1x10-1 1x10-2 1x10-3 1x10-4 1 1x10-1 1x10-2 1x10-3 1x10-4 Log(Oorspronkelijke faagstock (pfu/ml)) 11.59 11.49 Log(concentratie na behandeling (pfu/ml)) 9.07 9.23 10.04 9.00 8.95 6.47 6.75 6.42 6.77 5.91 Gemiddelde(log (concentratie na behandeling (pfu/ml))) SD* 9.26 0.45 6.46 0.35 Log(verschil (pfu/ml)) 2.41 2.25 1.44 2.48 2.53 5.01 4.73 5.06 4.71 5.57 Gemiddelde(log(verschil)) (pfu/ml) 2.22 5.02 Faag PNM Geen FITC 11.59 9.52 9.52 NTB 2.07 2.07 Faag ISP Geen FITC 11.49 6.21 6.21 NTB 5.28 5.28 DMSO FITC kleuringstock + DMSO Behandeling Legende: SD* = standaarddeviatie van de log(concentratie na behandeling (pfu/ml)); Log(Verschil(pfu/ml)) = Log(oorspronkelijke faagstock (pfu/ml)) – Log(concentratie na behandeling (pfu/ml)); Geen FITC = de FITC kleuringstock werd niet toegevoegd; Faag PNM = P. aeruginosa faag PNM; Faag ISP = S. aureus faag ISP. viii 7.4. Determinatie verantwoordelijke fagocyt voor faag-fagocytose (A) Flow cytometrische analyse (CD4+ vs C14+) van de fagocytose van de FITC-gelabelde faag PNM (B) Flow cytometrische analyse (CD4+ vs C14+) van de fagocytose van de FITC-gelabelde faag ISP ix (C) Flow cytometrische analyse (CD4+ vs C14+) van de fagocytose van de FITC-gelabelde microbeads (0.01 µm) Fig. 21: Bepaling van de verantwoordelijke fagocyt voor faag-fagcytose. (A) P. aeruginosa faag PNM; (B) S. aureus faag ISP, Rood: PBMC, donker groen: FITC- CD4+ cellen, grijs: FITC- CD14+ cellen. (C) Positieve controle: Microbeads (0.01 µM), Licht groen: FITC+ PBMC, Licht blauw: FITC- PBMC, oranje: FITC+ CD4+ cellen, paars: FITC+ CD14+ cellen. SSC: Side scatter, FSC: Forward scatter, FITC-A : FITC intensiteit x 7.5. Ondersteuning van de bespreking Tabel 15: Samenvattende tabel : Kwantificatie van de mate van fagocytose van fagen PNM en ISP door PBMCs op basis van qPCR en faagtitratie (plaque assay). Supernatans Celpellet Faagtitratie qPCR SD(qPCR) Faagtitratie SD(faagtitratie) qPCR SD(qPCR) Faagtitratie Type stimulans StimulatieLog(toegevoegde faagLog(faag-concentratie na stimulatie) duur (min) concentratie) (pfu/ml) (pfu/ml) P. aeruginosa 2,5,10 9.72 8.52 0.27 8.00 0.16 8.02 0.30 GM faag PNM en 90* S. aureus 10 9.52 9.37 2.88 10.31 1.54 8.76 3.35 GM faag ISP 90 6.30 6.41 11.00 3.36 9.05 3.28 GM S. aureus 10 9.52 5.87 0.35 11.53 0.22 3.93 0.35 GM faag ISP + 10 µl LPS Legende: GM: geen meting, omdat de niet-infectieuze fagen aanwezig in de celpellet niet gekwantificeerd konden worden met behulp van faagtitratie; * Na fagocytose van de Pseudomonas aeruginosa faag PNM werd na elke stimulatieperiode evenveel fagen in het supernatans als in de celpellet gedetecteerd (Fig. 10; Tabel 5). xi xii
