SUMMARY Wei Qing Pseudomonas aeruginosa is a versatile

SUMMARY
Wei Qing
Pseudomonas aeruginosa is a versatile Gram-negative bacterium that can be found in
diverse environmental niches such as soils, marshes and coastal marine habitats as well as the
causative agent of infections of humans, animals and plants. During the last century, as a
recognized major opportunistic human pathogen, P. aeruginosa has received intense interest,
mainly due to its resistance to antibiotics due to the formation of drug-resistant biofilms or to the
emergence of phenotypic variants resistant to disinfectants that eliminate other environmental
bacteria. The release of the entire 6.3-million-base-pair of nucleotide sequence of the genome of
P. aeruginosa strain PAO1 shed for the first time light on the relationship between genome size,
genetic complexity and ecological versatility in bacteria as well as it provided insight into its role
as a pathogen. In this study, we use P. aeruginosa strain PAO1 as a model to delineate two major
issues: the mechanism underlying the emergence of antibiotics-resistant small colony variants
(SCV), and the mode of action of the oxidative stress response regulator OxyR.
Small colony variants (SCVs) are slow-growing bacteria, which often show increased
resistance to antibiotics and cause latent or recurrent infections. It is therefore important to
understand the mechanisms at the basis of this phenotypic switch. One SCV (termed PAO-SCV)
was isolated, showing high resistance to gentamicin and to the cephalosporine cefotaxime. PAOSCV was prone to reversion as evidenced by emergence of large colonies with a frequency of 10-5
on media without antibiotics (pseudo-revertants, termed REVs) while it was stably maintained in
presence of gentamicin. PAO-SCV showed a delayed growth, defective motility, and strongly
reduced levels of the quorum sensing Pseudomonas quinolone signal (PQS). Whole genome
expression analysis further suggested a multi-layered antibiotic resistance mechanism, including
simultaneous over-expression of two drug efflux pumps (MexAB-OprM, MexXY-OprM), the
LPS modification operon arnBCADTEF, and the PhoP-PhoQ two-component system.
Conversely, the genes for the synthesis of PQS were strongly down-regulated in PAO-SCV.
Finally, genomic analysis revealed the presence of mutations in phoP and phoQ genes as well as
in the mexZ gene encoding a repressor of the mexXY genes. Only one mutation occurred only in
the pseudo-revertant REV, localized at nucleotide 1020 of the tufA gene, a paralog of tufB, both
encoding the elongation factor Tu, causing a change of the rarely used aspartic acid codon GAU
to the more common GAC, possibly causing an increase of tufA mRNA translation. High
expression of phoP and phoQ was confirmed for the SCV variant while the REV showed
expression levels reduced to wild-type levels. By combining data coming from phenotypic, gene
expression, and proteome analysis, we could demonstrate that resistance to aminoglycosides in
one SCV mutant is multifactorial, including the overexpression of efflux mechanisms, LPS
modification and is accompanied by a drastic down-regulation of the Pseudomonas quinolone
signal (PQS) quorum sensing system.
The LysR-type transcriptional regulator (LTTR) OxyR orchestrates the defence of the
opportunistic pathogen P. aeruginosa against reactive oxygen species (ROS). In our previous
work, we demonstrated that OxyR is needed for the utilization of the ferrisiderophore pyoverdine,
stressing the importance of this regulator. In this work, we show that an oxyR mutant is unable to
swarm on agar plates, probably as a consequence of absence of production of rhamnolipids
surfactant molecules. Another obvious phenotypic change was the increased production of the
phenazine redox molecule pyocyanin in the oxyR mutant. As already described, the oxyR mutant
could not grow in LB medium, unless high numbers of cells (>108 ml-1) were inoculated.
However, growth in Pseudomonas P agar (King’s A), a medium inducing pyocyanin production
was like wild type, suggesting a protective action of this redox phenazine compound. This was
confirmed by the restoration of the capacity to grow in LB medium upon addition of pure
pyocyanin.
Next, we used comprehensive microarray analyses to determine the OxyR regulons in
diverse conditions to better understand the mechanisms of protection via pyocyanin and the
additional functions of OxyR in P. aeruginosa. In this work, we uncovered the OxyR regulons
under three conditions (King’s A medium [Pseudomonas medium or PM], Luria Broth (LB), and
LB when oxyR is overexpressed), to investigate its roles in different cellular aspects that are
independent of the classical oxidative stress response, in the absence of H2O2. Interestingly, when
grown in LB, OxyR was found to regulate many genes involved in the process of inter-cellular
communication known as quorum sensing (QS). In contrast, when grown in PM, OxyR regulates
the expression of a newly identified CSS (cell-surface signaling) system in an OxyR-dependent
fashion. In addition, the results from oxyR overexpression further confirmed that OxyR was
linked to regulation of QS and Type 3 Secretion (T3SS) in addition to the regulation of
antioxidative genes. Taken together, our results show that, apart from its dominant role in defense
against oxidative stress in P. aeruginosa, OxyR acts as a global regulator that provides a link
between the regulation of oxidative stress response, QS and virulence.
Furthermore, we adopted a state-of-the-art technique named ChIP-chip (chromatin
immunoprecipitation in combination with whole genome tiling array analyses) to identify the
direct targets of OxyR. In P. aeruginosa, OxyR was previously described to positively regulate
the expression of the oxidative stress response genes katA, katB, ahpB, and ahpCF. To further
unravel additional targets of OxyR, we performed ChIP-chip experiments. We detected 56 genes,
including all the previously identified defensive genes and a battery of novel direct targets of
OxyR. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) for selected newly identified targets
indicated that ~70% of those were bound by purified and oxidized OxyR in vitro and their
regulation was further confirmed by qRT-PCR. Furthermore, a thioredoxin system was identified
to enzymatically reduce OxyR under oxidative stress. Functional classification analysis showed
that OxyR could control a core regulon, composed of oxidative stress defensive genes, and a
variable regulon including genes involved in transcriptional regulation of iron homeostasis
(pvdS), quorum-sensing (rsaL), pathogenesis (pf4 prophage), transport (PA1541), protein
synthesis (rpsL), and oxidative phosphorylation (cyoA and snr1). Taken together, our results
suggest that by direct binding, OxyR fulfills its core function in oxidative stress defense by
detoxification and acts as a global regulator in diverse aspects of cellular metabolism and
development to aptly render cells more resistant to endogenous or exogenous stresses.
SAMENVATTING
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is een veelzijdige gram-negatieve bacterie die
kan teruggevonden worden in diverse niches zoals de bodem, moerassen en mariene habitatten,
maar kan verder ook infecties veroorzaken bij mensen, dieren en planten. Gedurende de laatste
eeuw heeft P. aeruginosa, als een belangrijk erkende opportunistische menselijke pathogeen,
veelvuldige interesse genoten, voornamelijk omwille van zijn resistentie tegen antibiotica, door
de vorming van antibiotica-resistente biofilms en het opduiken van fenotypische varianten die
resistent zijn tegen disinfectanten die andere omgevingsbacteriën kunnen elimineren. Het
vrijgeven van de volledige 6.3 miljoen basenparen nucleotide sequentie van het genoom van de P.
aeruginosa stam PAOI heeft voor het eerst duidelijkheid gebracht over de relatie tussen
genoomgrootte, genencomplexiteit en ecologische veelzijdigheid in bacteriën, maar verder ook
inzicht gegeven in zijn rol als pathogeen. In deze studie gebruiken we de P. aeruginosa stam
PAOI als een model om twee belangrijke onderwerpen uiteen te zetten: het onderliggende
mechanisme van het opduiken van antibiotica resistente small colony variants (SCV’s) en het
werkingsmechanisme van de oxidatieve respons regulator OxyR.
Small colony variants zijn traag-groeiende bacteriën, welke een toegenomen resistentie
aan antibiotica vertonen en latente of terugkerende infecties veroorzaken. Het is daarom
belangrijk om de mechanismen die aan de basis van deze fenotypische omschakeling liggen, te
begrijpen. Eén SCV (genaamd PAO-SCV) werd geïsoleerd en vertoonde een verhoogde
resistentie tegen gentamicine en het cephalosporine cefotaxime. PAO-SCV was gevoelig aan
reversie, hetgeen werd aangetoond door het voorkomen van grote kolonies met een frequentie van
10-5 op media zonder antibiotica (pseudo-revertanten, genaamd REVs), terwijl het fenotype
behouden bleef in de aanwezigheid van gentamicine. PAO-SCV vertoonde een vertraagde groei,
een defecte motiliteit en sterk verminderde niveaus van het quorum sensing Pseudomonas
quinolone signaal PQS. Genoom-brede genexpressiebepaling suggereerde een meergelaagd
antibioticaresistentie mechanisme, met daarbij de simultane over-expressie van twee drug efflux
pompen (MexAB-OprM, MexXY-OprM), het LPS modificatie operon arnBCADTEF, en het
PhoP-PhoQ twee-componenten systeem. Anderzijds werden de genen voor de synthese van PQS
sterk down-gereguleerd in PAO-SCV. Tenslotte, onthulde genomische analyse de aanwezigheid
van mutaties in de PhoP en PhoQ genen, net als in het mexZ gen, dat codeert voor een repressor
van de mexXY genen. Slechts één mutatie deed zich voor in de pseudo-revertant REV,
gelokaliseerd op nucleotide 1020 van het tufA gen, een paraloog van tuf, ook coderend voor de
elongatiefactor Tu, daarbij een verandering veroorzakend van het zeldzaam gebruikte
aspartaatzuur codon GAU naar het meer gebruikelijke codon GAC, wat mogelijk zorgt voor een
toename van de tufA mRNA translatie. De hoge expressie van PhoP en PhoQ werd bevestigd
voor de SCV variant, terwijl de REV expressieniveaus vertoonde die gereduceerd waren tot wildtype niveaus. Door data komende van fenotypische-, genexpressie- en proteoom analyse te
combineren, konden we aantonen dat resistentie tegen aminoglycosiden in één SCV mutant
multifactorieel is, waarbij de overexpressie van efflux mechanismen, LPS modificatie en een
drastische down-regulatie van het Pseudomonas quinolone signaal quorum sensing (PQS)
systeem een rol spelen.
De LysR-type transcriptionele regulator (LTTR) OxyR orkestreert de verdediging van de
opportunistische pathogeen P. aeruginosa tegen reactieve zuurstofverbindingen (reactive oxygen
species, ROS). In ons eerder werk hebben we aangetoond dat OxyR noodzakelijk is voor het
gebruik van het ferrisiderofoor pyoverdine, hetgeen het belang van deze regulator benadrukt. In
dit werk tonen we aan dat een oxyR mutant niet kan doen aan swarming op agarplaten, mogelijk
als gevolg van de afwezigheid van de productie van rhamnolipide surfactant moleculen. Een
andere duidelijke fenotypische verandering was de toegenomen productie van het phenazine
redoxmolecule pyocyanine door de oxyR mutant. Zoals reeds beschreven, was de oxyR mutant
niet in staat om te groeien in LB medium, tenzij hoge aantallen cellen (>108 ml-1) geïnoculeerd
werden. In tegenstelling tot dit, was de groei van deze mutant in Pseudomonas P agar (King’s A),
een medium dat pyocyanine productie stimuleert, vergelijkbaar met deze van het wild-type, wat
mogelijk wijst op een beschermende
actie van dit redox phenazine bestanddeel. Dit werd
bevestigd door het herstellen van de capaciteit om in LB medium te groeien na de toevoeging van
puur pyocyanine.
Vervolgens gebruikten we uitvoerige microarray analyses om de OxyR regulons in
diverse condities te bepalen zodat een beter beeld van de beschermingsmechanismen via
pyocyanine en de additionele functies van OxyR in P. aeruginosa kan verkregen worden. In dit
werk, onthulden we de OxyR regulons onder drie condities (King’s A medium [Pseudomonas
medium of PM], Luria Broth (LB) en LB, wanneer oxyR tot overexpressie is gebracht), om hun
rollen te onderzoeken in verschillende cellulaire aspecten die onafhankelijk zijn van de klassieke
oxidatieve stress respons, d.w.z. in afwezigheid van H2O2. Een interessante bevinding is dat
wanneer opgegroeid in LB, OxyR meerdere genen die betrokken zijn in het proces van
intercellulaire communicatie, beter gekend als quorum sensing (QS), opreguleert. In tegenstelling
tot dit, reguleert OxyR de expressie van een nieuw geïdentificeerd cel oppervlakte signalisatie
systeem (cell-surface signaling, CSS) op een OxyR-afhankelijke manier. Bovendien bevestigden
de resultaten van de oxyR overexpressie dat OxyR gelinkt was aan de regulatie van QS en Type 3
Secretie (T3SS) naast de regulatie van anti-oxidatieve genen. Samengevat, tonen onze resultaten
dat, verschillend van zijn dominante rol in de verdediging tegen oxidatieve stress in P.
aeruginosa, OxyR ageert als een globale regulator die een link vormt tussen de regulatie van de
oxidatieve stress respons, QS en virulentie.
Verder, pasten we een state-of-the-art techniek, genaamd ChIP-chip (chromatine
immunoprecipitatie) toe, in combinatie met genoom-brede tiling array analyses, om de
onmiddelijke doelwitten van OxyR te identificeren. Eerder werd beschreven dat in P. aeruginosa,
OxyR de expressie van de oxidatieve stress respons genen katA, katB, ahpB en ahpCF positief
reguleert. Om bijkomende doelwitten van OxyR te ontdekken, voerden we ChIP-chip
experimenten uit. We detecteerden 56 genen, waaronder alle voorheen geïdentificeerde
verdedigingsgenen en een batterij aan nieuwe onmiddellijke doelwitten van OxyR.
Electrophoretic mobility shift assays (EMSA), die werden gebruikt voor de geselecteerde nieuw
geïdentificeerde doelwitten, gaven aan dat ~70% van deze doelwitgenen werden gebonden door
gezuiverd en geoxideerd OxyR in vitro en hun regulatie werd verder bevestigd via qRT-PCR.
Verder bleek een thioredoxine systeem OxyR enzymatisch te reduceren onder oxidatieve stress.
Functionele classificatie analyse toonde aan dat OxyR een kernregulon zou kunnen controleren,
bestaande uit oxidatieve stress verdedigingsgenen en een variabel regulon dat deze genen bevat
die betrokken zijn in de transcriptionele regulatie van ijzer homeostase (pvdS), quorum-sensing
(rsaL), pathogenese (pf4 profaag), transport (PA1541), eiwitsynthese (rpsL) en oxidatieve
fosforylatie (cyoA and snr1). Samengevat, suggereren onze resultaten dat OxyR door directe
binding zijn kernfunctie in oxidatieve stressverdediging vervult via detoxificatie en ageert als een
globale regulator in verscheidene aspecten van cellulair metabolisme en ontwikkeling om
vervolgens cellen meer resistent te maken aan endogene en exogene stressen.