Genenbank Landbouwhuisdieren

DE GENENBANK VOOR
LANDBOUWHUISDIEREN DE
GENENBANK VOOR
LANDBOUWHUISDIEREN
Betekenis
voor de Kip
Henk Sulkers en Kees Zuidberg
Nijverdal
17-5-2011
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Programma van mijn verhaal:









Genenbank algemeen
Principe invriezen spermacellen/embryos
Keuze zeldzame dieren
Cryogeen onderzoek en proeven/resultaten
Procedures eigenaren en hanen
Spermaproductie hanen
Sperma vangen van hanen/microscoop
Videofilmpje hanen spermaproductie
Spermaproductie duiven
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Genenbank houdt zich bezig met
• Populaties
• Rassen
• DNA
• Sperma
• Embryos
• Somatische
cellen
Variation between and within
breeds
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Wageningen UR (University & Research centre)
“gezonde voeding en leefomgeving”
12.000 studenten
5500 medewerkers
700 miljoen omzet
30 locaties
•
•
Animal Breeding and
Genomics Centre
CGN taak: agrobiodiversiteit
landbouw en bosbouw
Centrum voor Genetische Bronnen, Nederland
(CGN)



Plant Genetic Resources
Forest Genetic Resources
Animal Genetic Resources






Landbouwhuisdieren, inclusief paarden
Genetische variatie tussen én binnen rassen
Commercieel en/of cultuurhistorisch belang
Wettelijke Onderzoeks Taken voor EL&I
5-jarig programma
www.cgn.wur.nl
Waarom een genenbank ?

1/3 van locale rassen ‘at risk’ (FAO statistieken)

Klein aantal internationale rassen zijn dominant en locale
rassen worden vervangen

Genetische variatie binnen rassen is vaak beperkt
 Verzekering voor de toekomst ?
Historie Genenbank in vogelvlucht








Directeur IVO neemt initiatief tot genenbank in 1970s
1976 – Oprichting Stichting Zeldzame Huisdierrassen
1993 – Oprichting Stichting Genenbank Landbouwhuisdieren
door NRS, HG, SZH, ondersteund door IVO en IKC
1993 tot 2003 – Start met rundvee, daarna paard, varken (en
schaap)
2004 – heden – Mandaat CGN uitgebreid naar
landbouwhuisdieren
2005  SGL collecties overgedragen aan CGN
MKZ, Varkenspest, Aviaire Influenza hebben belang van
Genenbank onderstreept
2010  Collecties van vrijwel alle Nederlandse runder-,
varkens-, schapen-, geiten-, kippen- en paarderassen in de
genenbank. Vooral sperma en ook embryo’s
Genenbank doelstelling CGN



Alle zeldzame rassen van landbouwhuisdieren
veiligstellen in de genenbank
Zoveel mogelijk genetische diversiteit binnen de soort en
binnen het ras vastleggen
(ook commerciële rassen/lijnen)
Korte termijn gebruik van genenbankmateriaal ter ondersteuning van bedreigde rassen
Welke diersoorten en rassen in genenbank ?
CGN - Genenbank collecties in 2010
Diersoort
Aantal rassen
Aantal mannelijke
dieren/donoren
per ras
Aantal
rietjes
Rund
9
7 - 4095
181753
Hond
2
3–7
162
Geit
2
6 – 25
3820
Paard
5
8 – 20
18200
Varken
16
7 – 47
69981
Kip
20
5 – 19
18827
7
12 – 68
22147
Schaap
Hond en kat
Eend en Gans
Duif
Genenbank kippen start 2003

Invriezen van genetisch materiaal

Onderzoek invriesmethode

Ander soort gevogelte
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Doelstelling

Veiligstellen van zeldzame Nederlandse
kippenrassen

Tegelijkertijd zoveel mogelijk genetische diversiteit
van kippen opslaan
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Wat voor genetisch materiaal invriezen




Spermacellen
Eicellen
Embryo‟s
Somatische cellen
Haalbaarheid
Praktisch
Kosten
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Kunnen we sperma
invriezen?
Onderzoek
Spermacel
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Wat gebeurt er tijdens het invriezen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Onderzoek invriesmethode






Beperkte literatuur
Algemene opinie: hanensperma moeilijk invriesbaar
Enkele successen in literatuur beschreven
Successen niet allemaal praktisch toepasbaar
Fase 1: invriesprotocol vastgesteld op basis van
literatuur en beperkt onderzoek (2003)
Fase 2: aanvullend onderzoek (optimalisatie, 2004)
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Insemination of laying hens with frozen-thawed semen
• Welsumer cocks, frozen in 2003.
• Ten hens were inseminated on day 0 and 3 with 2.7 billion sperm
• Eggs collected on days 2,3,4,5,6,7,8
% motile
sperm
% live
sperm
Fertilized
eggs
foetus/
embryo
25
43
18/64 (28%)
13/64 (20%)
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Improvement of freezing method





An existing French method seemed to give very good results
The method uses DMA as cryoprotective agent (CPA). This is a
good alternative for glycerol, as glycerol in the hen is
contraceptive.
In the French method, semen is frozen in „pellets‟ directly in liquid
nitrogen.
For the gene bank straw freezing is required, because of hygiene
and sample identification.
Therefore, one goal was to achieve the good results with „pellet
freezing‟ but in straws.
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Improvement of freezing method





A large number of cryoprotective agents (CPAs) have been tried
(glycerol, DMSO, EG, DMA)
Combinations of permeant (glycerol) with non-permeant CPAs
(glucose, sucrose) have been tried
A number of media have been compared
A new medium was composed that combines the advantages of
different media
The interaction between cooling rate and CPA concentration was
studied
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
• Extra fast cooling programme gave best results
• A strong interaction between cooling rate and CPA concentration
• Therefore, at high cooling rate a lower CPA concentration was sufficient
Lake A, DMA
Lake A, DMA
60
40
20
Xfast
faster
fast
0
A+ DMA 0.6
slow
A+ DMA 1.0
A+ DMA 1.5
% live sperm
% motile sperm
100
80
60
40
Xfast
20
faster
fast
0
A+ DMA 0.6
slow
A+ DMA 1.0
A+ DMA 1.5
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Improvement of freezing method

Post thaw motility (52%) and live sperm (74%) was now much higher
than in the semen frozen in 2003

Post thaw motility was even a bit higher in Lake A medium (54 and
80%, respectively), but in our „new‟ medium the type of movement
seemed more normal, and the longevity was better
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Freezing method and insemination test
Using our freezing method and „new‟ medium, an insemination trial was
done with frozen semen





Fresh semen in „new‟ medium
frozen semen in straws, „new‟ medium
Frozen semen in straws, Lake A medium
Frozen semen in pellets, Lake A medium
Inseminations twice per week with 0.3 billion sperm/hen
96 hens, 2500 eggs
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
All (2500) eggs were opened and embryo
develoment was rated
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Not frozen, new medium
100
Dev embr.
90
Underdev
embryos
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
In
3
4
2
In
3
4
5
2
In
3
4
2
In
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Frozen in straws, new medium
100
90
Dev. embryos
80
Underdeveloped
70
embryos
60
50
40
30
20
10
0
2
In
3
4
2
In
3
4
5
2
In
3
4
2 3 for
4 5Genetic
6 7 8Resources,
9 10 11 12the
13 Netherlands
14 15 16 17 18
Centre
In
Conclusion (1)

Percentage bevruchte eieren met diepgevroren
sperma komt dicht bij die van vers sperma (86%)

Slechts een inseminatie per week met 0.3 miljard
spermacellen zal voldoende zijn

Onze nieuwe verdunner lijkt beter dan de tot nu toe
bestaande Lake A

Resultaten in rietjes zijn zeker zo goed als de
bestaande pilletjesmethode
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Conclusion (2)



Resultaten onderzoek worden gepubliceerd in
Cryobiology
Goede perspectieven (effectiviteit en efficiency) voor
nieuwe invriesacties pluimvee (2005,2007 en 2009)
Medium ook bruikbaar voor Traghopannen, duiven,
kraanvogels, eenden,ganzen en kalkoenen (?)
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Protocol invriezen sperma




Opslag in rietjes ipv pilletjes
Keuze medium
Keuze invriessnelheid (per fase)
Invriezen en opslag in vloeibare stikstof
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Nederlandse pluimveerassen
Landenrapport Nederland AnGR (LNV, 2002):

32 zeldzame Nederlandse pluimveerassen




1 critical
27 bedreigd
4 kwetsbaar
Met welke rassen starten?
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Selectie rassen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Selectie rassen en aantallen op basis van:

Risicostatus ras
Uniciteit van het ras
Genetische variatie binnen het ras
Beschikbaar budget

Beslissing op basis van advies van:



 Deskundigen
Stichting Zeldzame Huisdierrassen
 Genetici van CGN/ASG
Centre for Genetic Resources, the Netherlands





Vier invriesrondes totaal, te weten in:
2003
2005
2007
2009
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Geselecteerde kippenrassen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Hoe gaat een en ander in z‟n werk ?








1. Selectie pluimveerassen en donoren
2. Overleg/afspraken met belangenorganisaties en eigenaren
3. Aanvoer hanen op centrale locatie
4. Veterinaire controle
5. Gewenning- en trainingsperiode
6. Sperma winning, sperma conservering en opslag
7. Afvoer hanen
8. Documentatie
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Welsumer
haan
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Nederlandse
Uilenbaard
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Drentse
hoenen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Overleg/afspraken met betrokkenen
•Eigenaren
van hanen, contract voor gebruik haan
•Dierfaciliteiten van ASG
•Deskundigen Stichting Zeldzame Huisdierrassen
•Genetici van CGN/ASG
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Aanvoer donoren
•Routeplanning
•Stalinrichting:
klimaatregeling, 18 gr.C
16 uren met 60 % licht
Individuele kooien(100x40x60)
•Numerieke volgorde hanen
•Identificatie per haan, ringnummer
•Vel met stickers voor spermaproductie
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Klinische controle en gezondheid
•Eigenaren
bieden gezonde dieren aan
•Klinische controle bij aankomst in Lelystad
•Controle op verenkleed
•Meeste dieren geënt tegen NCD
•Attent zijn op luis bij de dieren/behandelen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Collectie sperma
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
In de stal:
•“Melken”
van 10.00 tot 12.00 uur
•Identificatie spermamonsters
•Monstername voor concentratiemeting
•Eerste verdunning ( 1:1 )
•Monsters in koeling
•Vervoer lab
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Buisje met
sperma
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Monster
voor
Concentratie
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Koeling
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Op het laboratorium
•Volume
bepaling middels wegen
•Gegevens inbrengen in “dagstaat”
•Berekenen eindvolume en aantal rietjes
•Rietjes bedrukken
•Rietjes vullen
•Invriezen en opslaan
•Kwaliteitscontrole (steekproefsgewijs)
•Administratie in “Cryo-Web”
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Nog te
verwerken
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Rietjes
printen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Sperma
verpakt in
rietjes in
vloeibare
stikstoftank
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Administratie in Cryo-web:
•Unieke
code per dier
•Fokker/eigenaar
•Afstamming: foklijn
kleur en tekening
•Opslag spermarietjes: aantal doses
cellen per doses
kleur rietje
opslagplaats
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Afvoer donoren
1: “Verkoopdonoren”, niet terug naar eigenaar
(opruimen of evt afzet in particulier circuit)
2: “Leendonoren” terug naar eigenaar
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Spermaafname duiven
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Spermawinning duiven

Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Sperma wordt van de cloaca opgezogen
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Centre for Genetic Resources, the Netherlands
Dank voor uw aandacht
Henk Sulkers en Kees Zuidberg
Centre for Genetic Resources, the Netherlands