Hematologie 2016 College #1 Dinsdag 12-04

Hematologie 2016
College #1
Introductie in stamcellen
Dinsdag 12-04-2016
Embryonale stamcel (ESC)
De embryonale stamcel is waar het allemaal begint. Je vindt ze in de blastocyst van het embryo. De
twee eigenschapen van ECs zijn:
1. Self-renewal – De mogelijkheid om ongelimiteerd te blijven repliceren.
2. Pluripotent – Deze cellen kunnen nog alle celtypes vormen die je kunt vinden in het
volwassen lichaam.
Asymmetrie
De stamcel deelt altijd asymmetrisch waarbij één cel een exacte kopie is van het
origineel (Self-Renewal) en de ander heel veel gaat delen en differentiëren tot
nieuwe celtypes.
Hoe de asymmetrie tot stand komt in de delen is nog niet duidelijk. Wel is
inmiddels bekend dat de lang gedachte immortal strand hypothesis niet op gaat.
Deze hypothese ging er vanuit dat de kopie van de stamcel altijd de originele
DNA strands behield, waardoor er minder kans was op mutaties. Dit laat echter
ook geen ruimte open voor evolutie. Voor nu lijkt het random te zijn of het
nieuwe of oude DNA van een chromosoom in de nieuwe stamcel terecht komt. Er
kunnen intrinsieke en extrinsieke factoren zijn die ook een rol spelen.
De embryonale stamcel komt alleen voor in het embryo en vormt adulte stamcellen (ASC). Hiermee
verandert de stamcel van pluripotent  multipotent. De cel kan niet meer alle celtypes vormen,
alleen binnen een bepaald type. Er zijn heel veel verschillende ASCs. Een paar voorbeelden zijn:
 Hepatic stem cell
 Pancreatic stem cell
 Neural stem cell
En de hematopoietische stamcel (HSC) waar het hier voornamelijk over zal gaan. Het is de voorloper
van al onze bloedcellen.
Kweken van stamcellen
Het kweken van stamcellen is interessant voor onderzoek en therapeutische mogelijkheden. Het is
moeilij kom ASCs te kweken, maar ESCs kunnen we tegenwoordig wel kweken met verschillende
methoden.
1. Uit de blastocyst halen.
Wanneer de embryo zich ontwikkeld komt er het stadium van de blastocyst. Er zijn dan tussen de 64100 cellen en er is een inner cell mass gevormd. Embryonale stamcellen bevinden zich hier en
kunnen in dit stadium uit het embryo geïsoleerd worden.
Nadelen zijn de ethische bezwaren. Ook is het niet patiënt specifiek en zal er snel afstoting
plaatsvinden.
2. Nucleaire transfer.
Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) is het proces waarbij de nucleus van een somatische cel van de
patiënt wordt geïsoleerd en vervolgens wordt ingebracht in een eicel. Vervolgens kunnen de ESCs
worden geïsoleerd en deze zijn wél patiënt specifiek.
3. induced Pluripotent Stem Cell
iPS is een nieuwe techniek waarbij er 3/4 transcriptie factoren worden
toegevoegd aan een gewone somatische cel/ASC en vervolgens gaat de cel
‘terug’ naar het stadium van een pluripotente stamcel, dus hetzelfde level
als embryonale stamcellen. Dit biedt veel kansen voor het creëren van
nieuwe weefsels, gen therapie maar ook als onderzoeksmiddel voor ziektes
en medicijnen.
Het probleem is echter dat het terugplaatsen moeilijk gaat.
Hematopoietische stamcel
Het isoleren van de HSC zelf, in plaats van het creëeren van nieuwe, is ook een goede optie voor
onderzoek en therapie. Je vindt deze HSCs op 3 plekken:
- Het beenmerg
- Gemobiliseerd in het bloed
(na toediening van groeifactor, G-CSF)
- Navelstreng bloed
Omdat het moeilijk is om genoeg cellen te verkrijgen moeten ze na isolaties geamplificeerd worden.
Het is echter moeilijk om ze te tellen. Dit kan op twee manieren gedaan worden>
In vivo; Je brengt de cellen in in een xenograft muis (zonder immuunsysteem) en laat de cellen
ontwikkelen. Vervolgens breng je antilichamen in die de menselijke (stam)cellen kunnen kleuren
waardoor je ze kunt onderscheiden van de muizencellen. Nu kun je zien hoeveel cellen er gevormd
zijn en daaraan afleiden hoeveel stamcellen er in je mix zitten.
In vitro; Je brengt alle cellen in een medium waarin alleen stamcellen kolonies kunnen vormen. Je
laat het 5 weken groeien. Vervolgens breng je dit mengsel over in 96-well plates en laat je er
berekeningen op los die je vertellen hoeveel stamcellen er dan in je mengsel zitten.
Het kweken van de HSC lukt niet goed omdat de natuurlijke omgeving niet goed is na te bootsen.
Ontwikkeling van de HSC
Niche
De HSC is te vinden in het beenmerg. De niche hier is erg belangrijk voor het stimuleren van deling en
het sturen van de differentiatie. Er liggen ook ‘supporting cells’ die het delen van de stamcel mogelijk
maken. Er zijn ook heel veel receptoren en cytokines die een rol spelen in deze niche. Het is van
belang om hier meer over te weten om optimale groeicondities na te kunnen bootsen in vitro.
iPS naar HSC
Dus de beste mogelijkheid momenteel lijkt het creëren van nieuwe bloedcellen vanuit de iPS. Er zijn
drie hoofdmanieren om de stamcel te laten differentiëren tot hematopoietische cellen.
1. Embryoid body (EB) formation
Dit is de manier van ‘hanging drops’. Je pipeteert druppels op de deksel van een petrischaaltje en
voegt de iPS cellen hier aan toe. Samen met de juiste groeifactoren kunnen de cellen nu groeien in de
druppel en differentiëren.
2. Coculture
Het uitplaten van ESCs en stromacellen die hematopoietische differentatie stimuleren.
3. Colony formation in medium
De cellen toevoegen aan een medium (methylcellulose) met de juiste cytokines en deze laten groeien
en later uitplaten.
Het creëren van HSCs is dus mogelijk, helaas werken ze in vivo niet. Bij terugplaatsing zijn ze niet
functioneel. Dit wordt geprobeerd te stimuleren met bepaalde transcriptie factoren, maar dit is geen
natuurlijke situatie en voor therapie doeleinden dus nogsteeds ongeschikt.
Embryonale ontwikkeling
In de embryonale ontwikkeling begint het voor de HSC allemaal in de aorta. Daarna migreren deze
cellen naar de lever. Pas vlak voor de geboorte nestelen ze in het beenmerg waar ze blijven voor de
rest van hun leven. Dit process doet denken dat er een soort rijping door verschillende plekken nodig
is en dit kunnen factoren zijn die van belang zijn in het kweken van functionele HSCs.
Teratoom
Een andere manier om functionele HSCs te verkrijgen is via een teratoom – een tumor die bestaat uit
verschillende soorten weefsels, omdat deze ontstaan is uit een stamcel. Als je een stamcel op een
verkeerde plek inbrengt dan vormt zich daar een tumor. De stamcel vormt allerlei weefsels die zich
verzamelen in zo’n tumor, van epitheel tot tand. Als je uit al deze type weefsels de HSCs isoleert en
opnieuw inbrengt dan zijn deze HSCs wél functioneel. Dit is echter niet een geschikte manier om in
mensen toe tepassen.
Epigenetica
Iets wat ook van belang is, is de epigenetica. Dit is vooral nog problematisch bij de iPS cellen. Deze
worden gecreeërd vanuit type weefsels zoals spier, huid, long weefsel. Vervolgens worden zij terug
gevormd naar stamcellen. Toch als je deze cellen beter gaat bekijken hebben zij nog de epigenetische
markers van de originele cel waar ze uit ontwikkeld zijn. Er is dus meer dan alleen gentranscriptie
aanpassen met transcriptie factoren nodig.
De tumor stamcel
Leukemie is een kanker waarbij er tekort is aan uitgerijpte functionele bloedcellen. Het idee is dat er
in de leukemie situatie ook een hyrarchie heerst, net als in de normale situatie. Met een leukemische
(tumor) stamcel die aan self-renewal doet. Deze kan vervolgens snel delende dochtercellen
produceren. Het probleem bij leukemie is dat de ziekte vaak terugkeert na enkele jaren, en deze
leukemische stamcel is mogelijk de oorzaak. Chemotherapie pakt de sneldelende cellen aan
waardoor de tumor verdwijnt. Deze langzaam delende stamcellen worden echter dan vaak niet
aangetast en het proces kan zich opnieuw ontwikkelen.
Asymmetrie in SC deling
Er wordt naar verklaringen gezocht voor de asymmetrische deling van een stamcel en er meerdere
mogelijkheden.
Het kan mogelijk te maken hebben met het mRNA dat in een cel wordt geproduceerd. Wellicht is een
van de twee dochtercellen van een stamcel beter in staat dit mRNA te transleren tot eiwitten.
Hierdoor zou de cel geschikter kunnen zijn om te differentiëren en delen. De andere cel blijft dan
stamcel.
Een andere optie is de niche. De niche van de HSC is in het beenmerg en hier heersen hele andere
condities dan op andere plekken. Een belangrijk punt is dat er bijna geen 02 en dus ook weinig ROS is
op deze plek. Dit kan de stamcel sterk beïnvloeden en dus ook het delingsproces. Er zijn nog veel
meer omgevingsfactoren, zoals transcriptie factoren en cytokines die er worden afgegeven.
Ook een goede mogelijkheid is de asymmetrische deling die beïnvloed wat er met de dochtercel
gebeurt. Wanneer de cel deelt kan de richting sterk van belang zijn. De drie voorbeelden hieronder
geven aan hoe dit kan. Door in verbinding te staan met de niche blijft een cel een stamcel. Als de cel
naar de zijkant deelt creërt dit twee stamcellen. Deelt hij recht omhoog blijft een stamcel de andere
wordt een dochtercel. Ook bij een schuine deling kunnen er twee dochtercellen ontstaan.
Receptoren in de niche kunnen de cel dan zo beïnvloeden dat de centrosomen zich verplaatsen naar
een bepaalde plek in de cel. Vanuit de centrosomen worden de chromatiden uitelkaar getrokken en
dus wordt de richting van celdeling bepaald.
College #2
Hematopoiesis & leukemie ontwikkeling
woensdag 13 April.
Hematopoiesis – Het vormen van nieuwe bloedcellen in een levend organisme.
In een normale toestand wordt er in de mens wel zo’n 1011 nieuwe bloedcellen per dag gevormd. Het
begint allemaal bij de hemapoietische stamcel. Deze deelt en vormt een multi-potente voorloper cel
(MPP).
De MPP is net zo potent als de HSC, maar deze kan niet aan self-renewal doen en leeft dus maar ~2
weken, in tegenstelling tot de HSC. Deze MPP differentieert zich tot twee verschillende cellen;
 CLP – Comitted Lymphoid Progenitor. Deze zal alle lymphoide cellen vormen
 CMP – Commited Myeloid Progenitor. Deze vormt alle myeloide cellen.
Niche
De cellen worden allemaal geproduceerd in het beenmerg, dit is hun niche. In deze niche liggen de
niche cellen die communiceren welk type bloedcel op dat moment (extra) moet worden
aangemaakt. De regulatie van aanmaak  ontwikkeling  apoptose moet zeer nauwkeurig gedaan
worden, anders kan er leukemie ontstaan.
Hematopoiesis
We hebben zo’n 20.000 HSCs, toch blijkt het dat er hiervan maar ~1000 HSCs bijdragen aan de
hematopoiese. De overige 19.000 doen alleen aan self-renewal. De manier waarop de 1000 HSCs alle
nieuwe cellen is nog niet bekend. Er zijn verschillende opties mogelijk.
a. De HSCs maken omstebeurt een lading aan nieuwe cellen aan
b. De HSCs maken tegelijkertijd een stabiele lading aan cellen aan.
c. Er zijn pieken in bepaalde HSCs die dan meer cellen gaan produceren en deze pieken volgen
elkaar op.
d. Het is totaal random wanneer welke HSC nieuwe cellen aanmaakt.
Differentiatie
Het proces van differentiatie hangt af van verschillende
factoren. Er zijn stofjes die het proces beïnvloeden en welke
cellen er ontstaan hangt dan af van de levels van deze stoffen.
Het is een random proces dus, waarbij een hoeveelheid stof
bepaalt wat voor cel er wordt gemaakt. Toch is er controle want
de omgeving wordt gestimuleerd door bepaalde factoren en
reageert daar op met cytokines die nodig zijn voor de juiste
differentiatie.
Leukemie
Als het mis gaat met de regulatie kan er leukemie ontstaan. Dit wordt in verschillende groepen
ingedeeld. Leukemie kan Acuut of Chronisch zijn. Daarnaast maken we onderscheid tussen
lymphoide en myeloide leukemie. Zo krijg je bijvoorbeeld; Acute lymphoide leukemie (ALL) of
Chronische myeloide leukemie (CML).
Een of meerdere bloedcel types worden in het geval van leukemie niet meer (correct) geproduceerd.
Je hebt dan een ophoping van infunctionele cellen en tekort aan functionele cellen.
Leukemische stamcel
Er wordt gedacht dat er in de situatie van leukemie net zo’n hyrarchie heerst als in de functionele
hematopoiesis. Er is dus wellicht een leukemische stamcel die aan self-renewal doet en oneindig kan
delen. Deze produceert dan een voorloper cel die leukemische blasten produceert.
Leukemie is een ziekte die vaak terugkeert en dit kan verklaard worden met de stamcel.
Chemotherapie pakt namelijk alleen sneldelende cellen aan, en deze leukemische stamcel kan de
therapie dus overleven. Na enkele jaren kan deze dan weer nieuwe kankercellen produceren.
Er zijn verschillen en overeenkomsten tussen de HSC en LSC.
Zo ondergaan beide self-renewal en delen ze niet vaak/langzaam, het verschil zit hem waarschijnlijk
in de regulatie van het proces. De LSC is ongevoelig voor chemotherapie en dit is mogelijk door
verhoogde MDR expressie. Daarnaast zijn er verschillende markers die alleen op de LSC tot expressie
komen of juist op beide. Uiteindelijk komt het er op neer dat het proces van differentiatie anders
loopt in de LSC dan in de HSC.
Mutaties
Er wordt gedacht dat de ontwikkeling van leukemie ontstaat door ‘multiple hits’. Dus er is een
opstapeling van mutaties nodig om tot leukemie te komen. Deze mutaties moeten belangrijke
eigenschappen van de cel veranderen, namelijk de self-renewal, overleving en proliferatie van de
gewone cel moeten veranderd worden.
Er wordt onderscheid gemaakt in twee soorten mutaties:
Driver mutations – Mutaties die (samen) de ziekte werkelijk veroorzaken door dingen in een cel te
veranderen die bijdragen aan het ziekteproces.
Passenger mutations – Mutaties die optreden, maar de ziekte en het ziekteproces verder niet
beïnvloeden.
Er is meer bekend over mutaties die veel voorkomen, maar er moet wel geconcludeerd worden dat
dit ook driver mutations zijn. Veel voorkomend in AML zijn mutaties in FLT2, NPM1 of DNMT3A.
Als een mutatie in een bepaald gen werkelijk een driver mutatie is dan zijn er nog twee opties.
Een Required mutation – Een mutatie die bijdraagt aan het ontstaan van leukemie. Het kan ook een
Sufficient mutation – Deze mutatie is op zichzelf voldoende om de ziekte (leukemie) te veroorzaken.
Onderzoeks modellen
Een belangrijk deel van nieuwe kennis verkrijgen over iets, is het kiezen van de jusite modellen. Iets
wat in leukemie veel gedaan wordt is in vitro assays. Het uitplaten van cellen uit een monster op
stromale cellen van het beenmerg. Tussen deze cellen kunnen leukemische stamcellen en gewone
stamcellen zitten die hier kunnen groeien. Je laat dit zo’n 5-7 weken staan en vervolgens kun je kijken
naar wat is gegroeid. Met een microscoop kun je type cellen van elkaar onderscheiden.
Ook in vivo kunnen er onderzoeken gedaan worden in muis of mens. Je kunt ook menselijk materiaal
transplanteren in een muis (xenograft) zonder immuunsysteem. Het is altijd belangrijk dat je goed
kijk naar wat voor controels je kiest.
Een belangrijk onderzoeks model is het vormen van knock-out of knock-in modellen. Hierbij kun je
dus een gen uitzetten, of juist extra toevoegen, om vervolgens de effecten te bekijken. Een nieuwe
en veelbelovende manier om dit te doen is CRISP/Cas9. Dit is een methode waarbij er in het DNA
wordt geknipt in jouw gewenste gen. Er onstaat een dubbelstrands breuk en deze moet opgelost
worden. Bij het repareren kan er een mutatie ontstaan en dit leidt vaak tot een vervroegd stopcodon
in het eiwit waardoor het gen niet meer functioneel is.
Er kan zelfs een extra stuk DNA aan toegevoegd worden die werkt als template voor homologe
recombinatie en op deze manier kan er met CRISP/Cas9 iets worden ingebouwd.
Een andere methode is RNAi – RNA interference. Hierbij produceer je kleine stukjes RNA, siRNA die
complementair zijn aan jouw gewenste mRNA. Het zorgt voor blokkering van translatie van mRNA 
eiwit. Hiermee creeër je niet een knock-out maar een knock-down muis met verminderde expressie
van jouw gen van interesse.
PU.1
PU.1 is een gen wat van belang is voor de differentatie van de bloedcellen. Voornamelijk voor het
produceren van B-cellen en macrofagen.
Onderzoek hier naar met:
YFP – Yellow Fluorescent Protein. Dit werd achter het PU.1 gen geplakt en al het geproduceerde PU.1
kleurde daarom geel. Je kan dan bekijken waar in de cel PU.1. tot expressie komt.
Knock-Out produceren. Een muis is echter niet levensvatbaar als PU.1 vanaf het begin wordt
uitgeknockt. Daarom kun je gebruik maken van LoxP en Cre. LoxP sites zitten om je gen van interesse
heen en recombinase Cre knipt precies op deze sites, zodat je gen in het midden er uitgehaald wordt.
Je kan deze twee dingen zelfs combineren waardoor je kan volgen wat er waar in de cel gebeurt
wanner er wel en niet wordt uitgeknocked.
Hieruit bleek dat totale deletie van PU.1 niet to leukemie leidt, maar gedeeltelijke knock-down van
het gen wél AML veroorzaakt. Het komt er op neer dat er een goede balans moet zijn tussen alle TFs
die diffferentiatie beïnvloeden, omdat er anders leukemie kan ontstaan.
We have discussed:
Concepts
HSCs vs. LSCs
Self-renewal vs. differentiation
Clonal hematopoiesis and aging
Models to use in studying hematopiesis
in vitro vs. in vivo assays
human vs. mouse
Required vs. sufficient
Molecular techniques
Overexpression vs. knockout vs. knockdown
Constitutive vs. inducible systems
Highlighted research examples
College #3
Chronische myeloïde leukemie
Donderdag 14 April
Er zijn twee hoofdtypes leukemie die we onderscheiden, met elk daarin hun eigen subtypes.
1. Acute leukemie
o Acute myeloïde leukemie (AML)
o Acute lymfatische leukemie (ALL)
2. Chrnoische leukemie
o Chronische lymfatische leukemie (CLL)
o Chronische myeloïde leukemie (CML)
o Hairy cel leukemie (HCL)
o Lymfatische/myeloïde/monocytaire leukemieën (zeldzaam)
Het verschil hierin is dat bij acute leukemie er onrijpe cellen zijn en deze zijn dus niet functioneel. Bij
chronische leukemie is er een te veel aan cellen, maar deze cellen kunnen nog best functioneel zijn.
In beide gevallen is de normale ontwikkeling van bloedcellen verstoort.
Chronische leukemie
In chronische leukemie is er sprake van extreme deling van de voorloper bloedcellen. Deze cellen
kunnen nog wel differentiëren en uitrijpeen, maar door de hoeveelheid is er een vergroot aantal
witte bloedcellen. Dit kan als gevolg hebben;
 Leukocytose
 Hypercellulair beenmerg
 Vergrote milt
Symptomen
De symptomen van CML betreffen:
 Vermoeidheid door de te weinig goed functionerende rode bloedcellen. Ook gaat er heel
veel energie naar de aanmaak van al die extra cellen.
 Buikpijn door de sterk vergrote milt. Ook leidt dit tot druk tegen de lever  druk tegen de
maag  minder eetlust  afvallen.
 Bloedingsneiging
 Stroperigbloed, wat leid tot bloedpropjes.
Ziektebeeld
Het is een ziekte die veel voorkomt op middelbare leeftijd. Er is (vaak) sprake van veel te veel witte
bloedcellen in het bloed. Ook kunnen voorloper cellen ineens in het bloed voorkomen, waar ze niet
horen.
Het verloop van de ziekte is als volgt.
Chronische Fase
In deze fase is er een teveel aan uitgerijpte (witte) bloedcellen.
Geacceleerde fase
Vervolgens kan er veel meer gedeeld worden in het beenmerg.
Er is een opstapeling aan fouten.
Blastencrisis
Door deze fouten ontstaan er blasten (niet functionele cellen) ipv
De rijpe cellen. Dit is de blastencrisis.
2e Chronische fase
Blasten crisis
Dood
Oorzaak
Een translocatie tussen chromosoom 9 en chromosoom 22 t(9;22) is een zeer karakteristieke
cytogenetische afwijking in CML. Er is dan een verkleind chromosoom 22, ook wel bekend als het
philadelphia chromosoom. En het BCR-ABL gen wordt hier gevormd. Daardoor ontstaat er een fusie
eiwit met tyrosine kinase activiteit. Dit verandert de functie in de stamcel en leidt tot de
ontwikkeling van CML.
Therapie
Het doel van behandeling van CML is het behandelen van de symptomen, het uitroeien van CML
cellen bij de bron. Hiermee wil je natuurlijk de patiënt genezen. Je test de hematologische respons –
na behandeling alle bloedwaardes weer normaal.
Fusie eiwit
Het fusie eiwit zorgt dus voor verhoogde tyrosine-kinase activiteit. Normaal zijn er signaal moleculen
die binden aan de tyrosine kinase receptoren. Vervolgens kunnen de interne tyrosine domeinen
gefosforyleerd raken  Dit geeft het signaal door en eiwitten worden geactiveerd  De cel reageert
en er worden meer rode- of juist witte bloedcellen geproduceerd.
In CML is er sprake van verhoogde witte bloedcel levels en een nieuwe therapie zou wellicht geschikt
zijn als deze hier kan ingrijpen, op receptor niveau.
Dat kan met Imatinib. Dit is een blokker die gaat zitten op de ATP bindingsite. Hierdoor is er geen
fosforylatie mogelijk en wordt het proces dus afgeremd. Om te kijken of imatinib werkt in CML
patiënten moet er onderzoek gedaan worden in veel stappen.
1. In vitro
Imatinib kan getest worden op cellijnen. Hieruit blijkt dat toediening van Imatinib celdeling remt
in cellijnen die positief zijn voor Bcr-Abl. Het werkt niet in de Bcr-Abl negatieve cellen, maar dat is
ook niet wat wordt verwacht.
2. In vivo
Het zou getest moeten worden op dieren eerst. Helaas is dit (nog) niet mogelijk want er is geen
geschikt profdiermodel.
3. Patiënten
Dan moet er getest worden op patiënten en dat gaat in 3 fases.
Fase I: Patiënten in hun eindfase met CML
Fase II: Het moet dan blijken dat het effect heeft op de ziekte en ook niet toxisch is voor de patiënt.
Fase III: De patiënten worden ingedeeld in twee groepen en de best mogelijke behandeling op dit
moment vergeleken met de nieuwe therapie met imatinib.
Er wordt dan onder andere gekeken naar de cytogenetische respons – De chromosomenkaart moet
normaal zijn.
Hier uit bleek dat imatinib een geschikt medicijn met weinig toxiciteit en betere resultaten dan met
de oude goldenstandard IFN-alfa.
Sinds de bekendmaking van imatinib is er een sterke afname in stamcel transplantaties. De eerste
presentatie was in 1999. Sindsdien zijn er nogsteeds ontwikkelingen geweest. Zo zijn er opvolgers,
worden patiënten goed in de gaten te houden om te kijken naar resistentie. Het gaat beter, maar kan
altijd nóg beter.
College #4
Prognotische subgroepen binnen de ALL
Donderdag 14 april
ALL is het falen van het beenmerg. Het komt voornamelijk bij kinderen voor tussen 0-14. Toch komt
het ook in volwassen wel voor. De oorzaak is nog onbekend. Het kan de oorsprong hebben in Bcellen (25%) of in de T-cellen (75%).
T-ALL
T-ALL is een type met slechte prognose. Binnen dit type zijn er twee moleculaire subtypen:
- Type A:
In dit type wordt de T-cel differentiatie geblokkeerd. Dit kan bereikt worden door activatie
van proto-oncogenen of een deletie van gene suppressors.
- Type B:
In dit type is er sprake van een gain-of-function door mutaties in signaling pathways.
Hierdoor is de cel in staat tot self-renewal.
Type A
Er zijn verschillende oncogenen die geactiveerd kunnen worden. Dit kan ontdekt worden door naar
genexpressie niveaus van een patiënt te kijken. Afhankelijk van het oncogen verschilt de
overlevingskans. Er zitten verschillen tussen volwassene en kind.
Mutaties die vaak zijn opgetreden in deze variant zijn in de volgende genen:
 HOX11
 MLL
 LYL1
 TAL1
Type B
Er zijn 4 genen die vaak gemuteerd zijn in dit type T-ALL:
 NOTCH1
(activerend)
 FBXW7
(deletie)
 RAS
(activatie)
 PTEN
(deletie)
60% van de gevallen gaat het om een activerende mutatie in het NOTCH1 gen. Dit gen is belangrijk
bij differentiatie. Het is een receptor met een extra- en intracellulair domein.
Notch ligand bindt extracellulair  Transmembrane Notch1 wordt gecleaved  intracellulaire
gedeelte werkt als Transcriptie Factor.
Bij mutatie is het mogelijk voor Notch1 om
geactiveerd te raken zonder dat zijn Notch ligand
activeert. Hierdoor is er dus ongeremde activiteit.
Een deletie/mutatie in het FBXW7 gen heeft te maken met deze zelfde
pathway. FBxW7 gaat de interactie aan met het PEST domein van NOTCH1.
Door dit PEST domein te fosforyleren wordt het intracellulaire domein van
NOTCH1 gelabeld voor ubiquinatie.
FBXW7  Fosforylatie PEST domein intracellulair NOTCH1  Ubiqinatie van
Intracellulair NOTCH1.
Bij deletie/mutatie van FBXW7 is deze niet meer in staat te fosforyleren.
Hierdoor blijft het intracellulair NOTCH1 domein (langer) actief en is er dus
sprake van te veel activatie.
Patiënten die een van deze mutaties hebben reageren wel beter op de huidige
therapie en hebben daarom een betere overlevingskans. Toch is het recidief – De ziekte keert terug
in 33% van de gevallen.
Een mutatie in een van de andere twee genen, RAS en PTEN staat echter voor een slechtere
overlevingskans.
Elke mutatie heeft zijn eigen type behandeling:
 Notch1
 G-secretase remmers
 FBXW7
 Proteasome remmers (btrz?)
 RAS
 Ras/Raf/MEK/ERK remmers
 PTEN
 PI3K/PTEN/Akt/mTOR remmers
ETP
De T-cel ontstaat in het beenmerg, maar voor uitrijping verhuist deze naar de thymus. Dit is een
Earlly T-cell precursor (ETP). Deze kan vervolgens in de thymus uitrijpen tot ene normale
gedifferentieerde T-cel. Als er in deze pathway iets mis gaat, kan er een ophoping ontstaan van ETPs.
Het bijzondere aan deze lymfocyt ETP, is dat hij (soms) ook myeloide markers bevat!
In de ETP is de JAK-STAT pathway van belang voor goede ontwikkeling. In ALL kan het voorkomen dat
hier mutaties zijn opgetreden, waardoor deze pathway actief blijft. Een therapie is dus JAK-STAT
remmers als extra behandeling.
B-ALL
B-ALL
Er zijn verschillende genetische groepen van B-ALL afhankelijk van wat voor genetische problemen er
optreden.
Hypodiploid ALL – Dit is ALL die ontstaat omdat er een tekort aan chromosomen is. Er zijn dus <46
chromosomen in de cellen aanwezig.
Een bekende mutatie is fusie van chromsoom 9 en 22, het philadelphia chromosoom. Dit
veroorzaakt het Bcr-abl1 fusie eiwit.
Behandelingen
Nieuwe behandelingen voor deze ziektes wordt naar gezocht. Vaak gaat het om remmers van de
betrokken pathways die zijn overgestimuleerd.
Een nieuwe kant is therapie met antistoffen. Dit kan met;
- Monospecifieke antistoffen
- Bispecifieke antistoffen
- C.A.R.
Monospecifiek
Het gaat dan om antistoffen die op bepaalde biomarkers kunnen aangrijpen. Als deze monospecifiek
zijn grijpen ze op één type biomarker aan.
Bispecifiek
De bispecifieke antistoffen hebben variabele regio’s waardoor ze op twee biomarkers kunnen
aangrijpen. Zo kunnen ze bijvoorbeeld op B-cellen én T-cellen aangrijpen. Dit gaat via de T-cel. Dus
de T-cel wordt geactiveerd door het antilichaam en die kan dan vervolgens de B-cellen aanvallen die
hetzelfde antilichaam hebben gebonden.
C.A.R.
Chimeric Antigen Receptor (CAR). Dit is een vage method waarbij je T-cellen neemt en met een virus
zo aanpast dat hij B-cel receptoren tot expressive kan brengen. Het idee is dan dat deze T-cellen de
(zieke) B-cellen kan aanvallen.
College #5
B-cell lymphomas
vrijdag 15 april.
Immuunsysteem
Het immuunsysteem is opgedeeld in twee delen:
- Aangeboren
Dit deel bestaat uit neutrofielen + Fagocyten + complementen + NK cellen + de epitheel cellen als
barrière.
- Adaptief
Dit bestaat uit de B en T lymfocyten. Waarin
B-cellen: antistoffen maken tegen een infectie.
T-cellen: Direct (geïnfecteerde) cellen doden.
Lymfatisch systeem
In het immuunsysteem speelt het lymfatische systeem een belangrijke rol voor transport. Het
vervuld eigenlijk 3 belangrijke rollen in het lichaam.
1. Terugvoeren van overtollige eiwitten en vloeistoffen
2. Heeft een rol in absorptie en transport van vetten.
3. Speelt een rol in het immuunsysteem.
Deze laatste rol wordt vervuld omdat door de lymfeklieren. Er is circulatie van immuuncellen door
het systeem en het verwijderen van bacteriën.
Ontwikkeling
T-cel: De T-cell gaat vanuit het
beenmerg naar de thymus (homing)
 Affiniteits selectie  circulatie
door het bloed als naieve T-cel 
Tegenkomen van pathogeen  Klier
 Effector T-cel
B-cel: Vanuit beenmerg naar het
bloed  klieren, hier bacteriën tegen
komen  ontwikkelen tot plasma Bcel door de migratie door
mantelzones in de klier  plasma Bcel.
Hodgekins
Dit is een variant van leukemie die de B- & T-lymfocyten betreft.
B-cel lymfomen
De B-cel is vatbaar voor maligniteiten vanwege zijn normale functioneren; het produceren van
immuunglobulines. Als een B-cel wordt geactiveerd dan moet er een bepaald type immuunglobuline
gemaakt worden en hiervoor moet de B-cel class-switch ondergaan.
De B-cel produceert een algemeen immuunglobuline, IgM. Door activatie van de B-cel receptor
wordt er gekozen om een ander soort te produceren. Hiervoor wordt er in het chromosoom geknipt.
Dan worden bepaalde stukken random aan elkaar geplakt. Hierdoor kunnen heel veel verschillende
specifieke immuunglobulines geproduceerd worden.
Knipwerk gebeurt met behulp van RAG/AID. Dit kan echter fout gaan en dan kunnen er mutaties
ontstaan op het chromosoom 14.
Afhankelijk van in welke fase het misgaat onderscheiden we verschillende type B-cel lymfomen.
- Mantle Cell Lymphoma
 Wanneer de B-cel in de mantelzone is
- Marginal Zone lymphoma
 Wanneer de B-cel in de marginale zone is
- Burkit lymphoma (en anderen)
 Wanneer de B-cel in Germinal Center is.
Lymfomen is maar 10% T-cel en de overige 90% is B-cel oorsprong. In de laatste categorie
onderscheiden we twee belangrijke types:
- Hodgekin lymfoom
- Non-Hodgkin’s lymfoom
Diagnose
Diagnose stellen gaat met behulp van een PET-CT scan. Hierop kan gekeken worden naar de
suikeropname in het lichaam van een patiënt. Kankercellen hebben veel energie nodig en gebruiken
daarvoor heel veel suiker, dus zo kun je de kankercellen visualiseren.
Je vervolgens met een patiënt aan staging. Het bepalen van de risico’s en de beste behandeling aan
de hand van; type kanker, waar het zich bevind, patiënt etc.
Hodgkin lymfoom
Het is de gunstigste kanker om te hebben. Het aantal tumorcellen bedraagt maar 1% van het totaal.
Het komt veel voor bij jong volwassenen of hele oude mensen (70+). Er is wel een erfelijkheidsfactor,
als familieleden het hebben dan heb je wel 1000x meer kans om het te krijgen. Dit heeft te maken
met HLA genen.
EBV
Het EBV virus kan een veroorzaker zijn van hodgkin lymfoom. Door de virusinfectie
raakt de B-cel beschadigd. De B-cel wil zich normaal gaan delen en is hier ook helemaal
klaar voor. Echter in de laatste fase, het afsnoeren, gaat er iets mis. Dit lukt niet en
hierdoor krijg je eigenlijk twee cellen in een grote cel.
Deze cel brengt het PD1 ligand verhoogd tot expressie en beïnvloed hiermee zijn microomgeving.
Symptomen
De symptomen van de ziekte kunnen opgezwollen lymfeknopen zijn. Ook B-symptomen en jeuk
komen voor. Het kan geconstateerd worden (opzettelijk of toevallig) met een foto van de borstkas, of
weer met de scan om te kijken naar suikeropname. Op de foto zou je vergrote hartklieren, net zo als
alle klieren in het lichaam.
Stadia
Er zijn verschillende stadia van de ziekte. Van alleen klieren in boven het diafragma (Stadia I&II). Tot
ook onder het diafragma en grote infiltraties van lever/bot (Stadia III&IV).
De prognoses zijn redelijk goed, maar in stadium III of IV is er sprake van meer kans op terugkeer van
de ziekte. Het grootste probleem is de 5-10% die niet reageren op de chemo.
Van invloed op de prognose zijn bijvoorbeeld het stadium en de leeftijd van de patiënt.
Behandeling
De behandeling van de ziekte hangt ook af van het stadium.
Stadium Iⅈ wordt behandeld met 3-4 ABVD kuren. Dit is een combinatie van verschillende
chemotypes. Dit wordt gegeven samen met bestraling.
Het doel van de ABVD kuur is het beschadigen van het DNA van de kankercellen, dit met behulp van
de 4 stoffen in de ABVD kuur. Dit gaat natuurlijk niet zonder bijwerkingen. Door het doden van witte
bloedcellen gaat je afweer erg achteruit. Ook heeft een van de stoffen, Adriamycine, een hoge
affiniteit voor de hartspier en daardoor kunnen er op de lange termijn hartproblemen ontstaan.
Stadium III&IV; wordt behandeld met BEACOPP en meer rondes van ABVD. Dit eerste is een mengsel
van nog meer stoffen. Dit werk sterker dus dat is gunstig in deze late stadia, echter de BEACOPP
maakt ook nog veel meer schade. Veel sterfgevallen zijn dan ook de oorzaak van de toxiciteit meer
dan de kanker.
Nieuwe strategie
Het zou dus beter zijn om minder schade aan de patiënt toe te dienen, maar uit onderzoek is
gebleven dat zonder ook radiotherapie er te veel terugval is. Er moet gezocht worden naar chemo
die minder toxisch is.
Een nieuwe methode zou kunnen zijn anti CD30. Dit is een oppervlakte eiwit dat tot expressie komt
op geactiveerde B- en T-cellen. Dit kan gebruikt worden om het chemo in de cel te krijgen in plaats
van in het lichaam, waar het ook andere cellen schade aandoet.
Cytotoxica, brentuximab vedotin (BV), vastmaken aan anti CD30  Dit grijpt aan op het
celoppervlak eiwit  Het wordt opgenomen door de cel  Het complex wordt gelyseerd, hierbij
komt de toxine vrij in de cel  cel gaat dood.
Het nadeel is dat de cel na dood ook wordt afgebroken en dus de toxische stof alsnog wel in het
lichaam terecht komt.
Een andere strategie is het activeren van het immuunsysteem, zodat het de tumorcellen gaan
aanvallen. Dit kan met behulp van anti PD-1. Dit zorgt er namelijk voor de dat T-cell de tumorcellen
niet kunnen stimuleren, en omdat ze hem niet goed herkennen gaan ze cytokines uitscheiden om de
cel te doden.
Non-Hodgkin lymfoom
BCL – B-Cel Lymfoom  Oude mensen ziekte. Het kan een zeer maligne variant zijn, of een
aanmodderende variant.
Er zijn heel veel verschillende varianten, afhankelijk van waar het zich opdoet. Een hele agressieve
versie is de DLBCL.
De symptomen verschillen dus ook heel erg afhankelijk van het type.
Diagnose
Diagnose kan met behulp van Immuunhistochemie. Er wordt dan aangekleurd met behulp van de
CD20 marker. Het kan ook door te kijken naar de chromosomen met FISH. Je kunt verschillende
immuungelablede probes laten aangrijpen op stukken van het chromsoom. Je kunt nu kijken of er
een translocatie of fusie heeft plaatsgevonden in de cellen. Er zijn heel veel verschillende soorten
mutaties die de oorzaak kunnen zijn.
Mutaties
Het is van belang op welke belangrijke pathways de mutaties invloed hebben. Zo kun je naar een
therapei zoeken. Heel veel verlopen via NF-kB. Deze transcriptiefactor kan invloed hebben op de
genexpressie. Dit kun je beoordelen door te kijken naar genexpressie profielen.
Medicatie moet op veel verschillende manieren het DNA beschadigen.
College #6
Maligniteiten van het myeloïde systeem.
Bloed
In het bloed onderscheiden we de:
- Leukocyten
 Witte bloedcellen
- Erytrocyten
 Rode bloedcellen
- Trombocyten
 Bloedplaatjes
Maandag 18 april
De witte bloedcellen kennen 5 verschillende typen, onderverdeeld in twee klassen
Granulocyten
- Neutrofielen
- Eosinofielen
- Basofielen
A-granulocyten
- Monocyten
- Lymfocyten; T-cellen, B-cellen, NK-cellen.
Deze cellen ontwikkelen zich in het beenmerg, hier liggen de jonge cellen. Daarna migreren ze, als
rijpe cellen, naar het bloed. Normaal beenmerg ziet er dan ook heel gevarieerd uit. Wanneer er in
het beenmerg sprake is van heel veel cellen van de zelfde soort, dus een monotoon beeld, is dit
slecht! Dan kan er namelijk sprake zijn van bloedkanker.
Bloedkanker
Bloedkanker kan onderscheiden worden in twee verschillende cellijnen. De lymphoide bloedkanker
en de myeloide bloedkanker.
Het betreft een acute vorm wanneer er iets mis gaat al vroeg in het differentiatie proces. Wanneer
het later in de ontwikkeling mis gaat is het een chronische vorm.
Diagnostiek
Wanneer er mogelijk sprake is van een acute leukemie moet de patiënt direct opgenomen worden.
Met behulp van een beenmergonderzoek wordt er een diagnose gesteld. Er wordt naar verschillende
aspecten gekeken.
Eerst moet het beenmerg verkregen worden. Dit kan met een
 Beenmerg aspiraat; een dunne naald wordt achter in de bekken geplaatst en daarmee
worden cellen opgenomen.
 Beenmergbiopt; wordt uitgevoerd met een dikke holle naald en deze neemt een heel stukje
bot weg.
Vervolgens wordt het beenmerg geanalyseerd. Dit wordt gedaan door te kijken naar de
cytogenetica. De chromosomen worden bekeken, om te checken of het er 46 zijn. Dit kan alleen
gebeuren met cellen die in de metaphase zitten, want dan zijn de chromosomen goed zichtbaar.
Daarna kan er gekeken worden naar de immunofenotypering. Dus welke cel-markers zijn aanwezig,
en beterft het lymphoid of myeloide cellen. Dit kan met behulp van de flowcytometer. Deze kan ook
kijken of er nog tumorcellen gedetecteerd worden na een behandeling.
Ook wordt er moleculair onderzoek gedaan. Er wordt dus gekeken naar de staat van de genen,
mutaties. Als er bijvoorbeeld een mutatie is opgetreden in FLT3, is de pathway waar deze receptor
op aangrijpt altijd aan, zelfs als er geen signaal molecuul is. Dit kan aangetoont worden met een
westernblot.
AML
Myeloide leukemie is door de WHO in vier klassen opgedeeld. Een hier van is Acute Myeloide
Leukemie (AML). Dit moet gediagnosticeerd worden. Als een patiënt bij de dokter komt en er is
sprake van verminderde waardes van alle drie de bloedlijnen (leukocyten/trombocyten/erytrocyten)
dan lijkt het er inderdaad op dat er vroeg in het differentiatie proces iets mis gaat, en daarom is
acute leukemie een goede mogelijkheid.
Vervolgens moet er bepaald worden of dit om een lymfatische of myeloide
leukemie gaat. Daarvoor wordt er altijd eerst gekeken naar histologie. Zie je
een monotoon beeld van het beenmerg, dan is er goede kans dat het om
leukemie gaat. Een belangrijk kenmerk voor de myeloide leukemie is de
aanwezigheid van auer’s staven.  Voornamelijk bij APL zie je dit.
AML is echt een volwassen ziekte van leukemie en komt weinig voor in
kinderen. Voor ALL is dat precies omgekeerd.
Kenmerken van een (AM)leukemische cel
 Verminderde differentiatie
 Verhoogde cel overleving
 Genomisch instabiel
 Verhooogd self-renewal
 Verhoogde proliferatie
Bepaalde genen hebben invloed op deze punten waardoor de leukemische cel een groeivoordeel
heeft over de gewone cel, zo kan deze cel het overnemen.
Behandeling
Hoe een patiënt wordt behandeld hangt af van verschillende factoren die betrekking hebben op de
patiënt zelf en factoren die afhangen van het type ziekte. Hierop wordt de behandeling ook
aangepast. De behandeling mag namelijk ook niet zo intensief zijn dat de patiënt deze niet overleeft.
De patiënt kan uiteindelijk alleen genezen door een (allogene) transplantatie.
De chemo die een patiënt ondergaat is heel intensief. 7 Dagen achter elkaar. Ook krijgen de
patiënten bloedtransfusies, antibiotica, speciale voeding en worden ze zo fit mogelijk gehouden met
fysiotherapie en sporten etc. Ze moeten voor dit hele proces 4 weken lang in het ziekenhuis liggen.
Deze behandeling kan nog een keer gedaan worden en als dan de kankercellen dood zijn kan er een
transplantatie worden ingezet.
Transplantatie
Transplantaties worden alleen uitgevoerd bij patiënten uit de intermediate/poor risk categorie.
Autoloog – Eigen cellen transplantatie
Allogeen – Cellen van een ander
 Dit kan van verwanten en niet-verwanten.
Bij orgaan transplantaties vaak last van afstoting. Bij beenmergtransplantaties is dit niet veel
voorkomend. Hier is er vaak sprake van GVH – Graft Versus Host reactie. De nieuwe HS cellen vallen
de host zijn eigen cellen aan. Hierin onderscheiden we twee types:
1. Acute GVH  Organen zoals lever/darm/huid raken beschadigd.
2. Chronische GVH  Lichte klachten aan slijmvliezen/huid etc.
Je wilt wel GVT – Graft Versus Tumor reactie, zodat de tumorcellen worden uitgeroeid. Je wilt dat de
cellen vaan 100% patiënt  100% donor. Hoe sneller de verschuiving plaatsvindt hoe beter.
Donoren
Voor een donor moeten de HLA types op elkaar afgestemd worden. We onderscheiden verschillende
types donoren:
- Matched familie
 Zelfde HLA type
- Mis-matched familie
 Familie maar toch geen match, niet geburikelijk.
- Matched niet-verwante donor
 HLA type match met niet-verwante donor
- Mis-matched niet-verwante donor
 9/10 HLA types komen overeen
- Cord blood

- Haplo-identieke donoren
1 vd ouders met HLA match van 5/10.
Het lichaam kan iets onbekends aanvallen. Vandaar dat het ongustiger is om van een vrouw  man
te transplanteren. De cellen van de vrouw kunnen het ‘Y-chromosoom’ als onbekend en niet-eigen
beschouwen en het dan aanvallen.
Zelfs gematchte HLA types zijn niet 100% hetzelfde, omdat er mutaties in kunnen zitten. Hierdoor
wordt er al GVH uitgelokt. Je wilt wel een beetje GVH, want de donor cellen moeten goed werken
zodat ze als immuunsysteem kunnen werken maar niet onze eigen organen aanvallen.
Nieuwe therapiën
Een therapie in opkomst is de NK cel therapie. De NK cellen uit de navelstreng worden geïsoleerd en
zo gekweekt dat ze de leukemie moeten aanvallen.
Een andere therapie is C.A.R.  De T-cel CD3+ marker wordt gekoppeld aan een (single-chain) antilichaam. Nu is deze T-cel in staat om de kankercellen aan te vallen.
APL
Acute promyelocyte leukemie (APL) is een vorm van AML. Wordt vaak veroorzaakt door fusie van
PML-RARalfa, veroorzaakt door een t(15;17) translocatie.
College #8
MicroRNA
B-cel maturatie
De B-cel ondergaat verschillende stappen voordat het een volwassen B-cel is. De naïeve B-cel wordt
door beenmerg uitgescheiden in het bloed. Als deze wordt geactiveerd doordat zijn B-cel receptor
passend is verhuist hij naar een lymfeknoop en ondergaat de Germinal Center reaction (GCR) 
vanuit hier ontstaan volwassen B-cellen (plasma & geheugen).
Als dit proces mis gaat, vooral de GCR, dan kunnen er leukemiën ontstaan. Bijvoorbeeld
- CLL
- Hodgkin
- Burkitt
Een hele agressieve vorm die vnl voorkomt bij kinderen. Ontstaat door een Myc translocatie
(8;14). Hierdoor komt het gen voor myc achter het gen voor immuunglobulines (IGH) te
liggen. Dit IGH gen staat natuurlijk veel aan in Plasma B-cellen en vandaar verhoogde Myc
activiteit.
MicroRNA (miRNA)
MicroRNA zijn kleine stukjes RNA van ~22 nt lang. Ze ontstaan door:
Afschrijving van DNA  pri-miRNA  Staarten worden er af geknipt  pre-miRNA  loop er
afgehaald  1 vd 2 strands voegt zich samen met RISC  miRNA.
Het miRNA in het RISC kan vervolgens aan mRNA binden om de translatie hiervan te remmen. De
miRNA’s binden het mRNA met hun ‘seed sequence’.
miRNA’s kunnen geïdentificeerd worden met 3 stappen.
Eerst in sillico; op basis van verwachting met behulp van speciale programmas.
Daarna in-vitro voor een speciek gen; Je gaat het checken in cellijnen. Dit kan met een westernblot
om te zien wat er tot expressie komt, maar dit is veel werk. Nieuwer is de reporter assay – Je zet
lucifirase achter een vermoedelijke miRNA bindingssite. Vervolgens kijk je naar de expressie van
luciferase in een cel mét en zonder de miRNA. Bindt het miRNA aan de verwachte site, dan zie je
minder luciferase expressie.
Als laatste ga je het genoom breed testen in-vitro: Je labeled Ago2 met immunofluorescentie. Dit is
een belangrijk onderdeel van het RISC complex. Dit doe je van jouw miRNA. Vervolgens ga je kijken
waar en hoeveel in de cel dit tot expressiekomt en vergelijkt dit met de gehele hoeveelheid.
Let op; miRNA’s die tot expressie komen verschillen per celtype !
ceRNET – Competing endogenous RNA networks. Dit duidt op het feit dat verschillende miRNA’s
competeren om bindingsplekken. Het komt er op neer dat de expressielevels van verschillende
miRNA’s samen van belang zijn voor goede regulatie.
Je hebt ook circulaire RNAs in cellen, het wordt gedacht dat deze als ‘spons’ kunnen werken voor
miRNA’s omdat hier heel veel miRNA’s aan kunnen binden en het ciRNA kan niet zo goed worden
afgebroken.
Voorbeeld van ceRNET:
VAPA & CNOT mRNA kunnen gebonden worden door dezelfde miRNA’s als PTEN. Hierdoor is er een
extra vorm van transcriptie regulatie van het PTEN gen. (??)
Leukemie
Het blijkt dat miRNAs veranderd zijn in de tumor B-cellen. De miRNA’s kunnen op oncogenen en
Tumor Suppressor Genen aangrijpen.
↓↓ miRNA  ↑↑ gen expressie  CLL
= Tumor suppressor miRNA
↑↑ miRNA  CLL
= Oncogenic miRNA
Sommige miRNA’s kunnen tumor suppressor en oncogene functies hebben op verschillende target
mRNA’s. Dit kan leiden tot groeivoordeel van B-cellen en daardoor tot B-cel lymfomen.
Aanpassen van de miRNA levels in muizen kan tot lymfomen leiden. De miRNA’s zijn daarom een
mogelijke therapeutische target voor behandeling van (B-cel) lymfomen.
College #9
Long non-coding RNAs (lncRNAs)
G-value paradox – De complexiteit van organismen lijkt in verband te staan met de hoeveelheid niet
coderend DNA het organisme bevat.
Long non-coding RNAs (lncRNAs) zijn >200 nt en coderen niet voor een eiwit. Over het
algemeen is de sequentie niet sterk geconserveerd  heeft alsnog belangrijke functies.
lncRNAs zijn op heel veel verschillende niveaus actief. Niet zoals miRNA alleen op
translatie level. Het meeste lncRNA komt in de kern voor.
Daar kan het aangrijpen op chromosomen. Hierbij onderscheiden we;
Cis – Effect op hetzelfde chromosoom als waar het vanaf geschreven is.
Trans – Effect op een ander chromosoom dan waar het vanaf geschreven is.
Voorbeel Cis
Xist  een lncRNA dat chromatin remodelling complex naar het X-chromosoom
toehaalt  hierdoor wordt het X-Chromosoom gesilenced. Dit is van nut in vrouwen (XX), omdat er
maar één X-gen expressie moet leveren. In mannen (XY) is dit niet aan de orde.
Voorbeeld Trans
HOTAIR  Remt de transcriptie van HOXD op een ander chromosoom.
Het kan ook aan transcriptiefactoren binden. Hierdoor kan het transcriptie proces geremd worden.
Cytoplasma
De lncRNAs in het cytoplasma kunnen samenwerken met miRNA op 3 manieren.
1. lncRNA remt miRNA
2. miRNA remt lncRNA
3. miRNA & lncRNA competeren om plek op mRNA
Dus wat doen lncRNAs:
- Beïnvloedt chromatine en DNA modifying compelxes
- Interacties met RNAs, eiwitten en DNA
- Het zorgt voor extra regulatie in alle stappen van DNA tot het Eiwit.
Knock-out van lncRNAs laat zien dat ze echt nodig zijn, want het kan lethaal zijn of ernstige gevolgen
hebben, zoals groei deficiëntie.
B-lymfoom
lncRNA spelen ook een rol in lymfomen. Er zijn lncRNA levels die verschillen tussen de gewone B-cel
en de tumor B-cel dus dit duidt op een rol in de kanker.
Een voorbeeld is de lncRNA CRNDE – ColoRectal Neoplasia Differentially Expressed. Dit ontstaat
door MYC en komt sterk tot overexpressie in kankers. Dit blijkt gereguleerd via de IGF pathway.
Conclusie
lncRNAs zijn
 Weefselspecifiek
 Slecht geconserveerd
 Maar wel belangrijke en veel verschillende functies
In hematopoiesis zijn ze van belang in
 HSC self-renewal
 Differentiatie
 Celgroei
Vooral omdat lncRNAs weefselspecifiek zijn  mogelijk goede target voor behandeling.
College #9
Epigenetica
De studie van erfelijke veranderingen in genfunctie zonder dat er veranderingen zijn in DNA
sequentie.
Elke cel heeft hetzelfde genotype, maar toch andere fenotypes  dit komt door epigenetica.
Al het DNA ligt ingewikkeld om histonen - ‘beads on a string’. Dit is belangrijk voor regulatie van
gentranscriptie. Dit wordt voornamelijk gedaan door modificatie van de N-terminale histon staarten.
Op deze manier wordt geregeld of het DNA ‘open’ is voor transcriptie of ‘gesloten.
Vier belangrijke mechanismen van histon modificaties:
Acetylatie
 Opent chromatine.
Methylatie (lys)
Methylatie kan mono-, di- of tri- en heeft verschillende
Methylatie (arg)
uitwerkingen hoe gemethyleerd het is.
Phosphorylatie
Dit gebeurt doormiddel van;
 Writers  De transferases, kinases en ubiquitin ligases die de staarten markeren.
 Readers  De eiwitten die de markeringen lezen en hier op kunnen reageren
 Erasers  Demethylases/acetylases/phosphotases die de markeringen weer verwijderen.
Er zijn verschillende modificaties tegelijk op histonen. Er is ook
cross-talk tussen deze modificaties. Verschillende combinaties
hebben dan ook verschillende uitwerkingen.
ChIP
Het meten van histonmodificaties kan gedaan worden met
ChIP – Chromatin Immuune Precipitation.
Met deze techniek cross-link je de cellen  Breek je het DNA in stukjes  Met antilichamen pak je
de stukjes DNA vast die gebonden zijn door eiwitten  Deze DNA stukjes kun je sequencen.
Zo kun je kijken welke genen worden beïnvloeden.
DNA methylatie
DNA wordt gemethyleerd door DNMT – DNA Methyl Transferases. In de mens hebben we hiervan 3
vormen. 3A & 3B zijn voor ‘de novo’ methylatie, dus voor DNA gebieden die voor het eerst worden
gemethyleerd.
DNMT1  Onderhouds methyl transferase, van belang om de tweede strand te methyleren bij DNA
replicaties.
Het tegenovergesteelde, demethylatie, wordt bereikt met TET eiwitten.
Het gaat van C5mC door Dnmt. Gedemethyleerd met Tet zorgt voor 5mC  5hmC. Door het
toevoegen van de –OH groep kan de methylatie niet meer herkend worden en overgezet worden
naar een nieuwe strand, hierdoor verdwijnt de methylatie. Dit is 5mhC  C op passieve manier.
Het kan echter ook actief met behulp van TET. Dit loopt van 5hmC  5fC  5caC het is alleen nog
onbekend of de stap  C ook mogelijk is.
Nucleus
In de nucleus liggen de chromosomen georganiseerd. De 3D structuur is van belang
omdat het DNA met elkaar communiceert. Enhancer + promotor kunnen goed met
elkaar communiceren  looping vormen ze dan. Dit kan je in de cel aankleuren met
FISH. Als je wilt kijken waar deze liggen kun je met de 3C – Chromatin Conformation
Capture techniek de sequentie van enhancer en promotor purificeren. Dit gaat als
volgt:
Chromsomen bij elkaar door interactie  cross-linken  in stukjes knippen  eindjes aan elkaar
ligeren  DNA purificeren  Sequencen.
TAD
Het DNA is ingedeeld in domeinen Topologically associated domain –
TAD. De 3D structuur van het DNA is namelijk van belang voor regulatie.
Cohesins zijn ringvormige structuren die om het DNA binden, met twee
belangrijke functies:
- Actief en inactief DNA van elkaar scheiden
- Enhancer-promotor interacties en daarmee gentranscritptie
reguleren.
Epigenetica in leukemie
Leukemie kan epigenetisch beïnvloed worden op twee manieren:
1. Overexpressie van modificators
2. Mutaties in de genen van modificators
Voorbeelden
1. Overexpressie van modificator
BMI is van belang voor self-renewal van stamcellen. Dus ook in de
leukemische stamcel. Het BMI gen codeert voor de Polycombmediated repressor (PCR) eiwitten. Hiervan zijn er twee
PCR2  Modificeert DNA
= writer
PCR1  Leest de modificatie van PCR2  modificeert met ubiquinase.
Vervolgens beïnvloed dit het ARF gen dat proliferatie/apoptosis regelt.
Door overexpressie van BMI  overexpressie van PRC eiwitten  verhoogde ARF activatie 
Verhoogde cel proliferatie. = groeivoordeel voor kankercel.
2. Mutaties in de genen van modifcators
Mutaties in genen die coderen voor modifcators.
Denk aan TET2, IDH, cohesin.
Zoals in de TET2 eiwitten. Deze kunnen dan niet goed hun werk doen en daardoor veel meer
gemethyleerd DNA dan de bedoeling. Voor demethylatie is TET nodig, samen met α-KG.
Isocitraat  α-KG met behulp van IDH.
Een mutatie in IDH leid niet tot α-KG maar een ander product. Dit gemuteerde product kan ook aan
TET binden, maar vervolgens wordt er niet functioneel ge demethyleerd.  Meer gemethyleerde en
dus meer gesilencede genen.
Ook zorgt een mutatie in IDH voor verminderde histon demethylatie los van TET.
TET2 en IDH mutaties komen nooit tegelijk voor. Dit doet denken dat het proces van 5mC  5mhC
heel belangrijk is voor de kanker ontwikkeling. Dit wordt namelijk beide geremd door een mutatie in
TET2 en IDH. De verminderde histon demethylatie lijkt dus minder belangrijk, want met een mutatie
in TET alleen wordt dit niet geremd.
Cohesin bestaat uit 4 verschillende componenten.
- SMC3
- SMC1
- RAD21
- STAG2
De 4 genen die hiervoor coderen zijn vaak gemuteerd. Er is dan ook (bijna) altijd maar sprake van 1
mutatie in deze 4, geen combinaties. Dit is ook niet nuttig voor de kankercel, als de cohesin zijn werk
al niet meer kan doen hoeft dat niet extra te gebeuren met meer mutaties.
Cohesin werkt schijnbaar als tumorsuppressor. Knock-out voor cohesin zorgt voor ongeremde
deling!
Cohesin is maar een 1st hit mutatie  De mutatie op zich zorgt niet voor leukemie en er is nog een
functionele mutatie nodig om leukemie te veroorzaken.
! Gemuteerde cohesins kunnen de 3D structuur van DNA niet goed behouden en daardoor is de
regulatie verstoord en TADs verdwijnen !
College #11
College #12
College #13