globaal rapport externe kwaliteitsevaluatie voor analysen klinische

ISSN
0778-8363
WIV
J. Wytsmanstraat, 14
B-1050 BRUSSEL
FEDERALE OVERHEIDSDIENST, VOLKSGEZONDHEID, VEILIGHEID VAN DE
VOEDSELKETEN EN LEEFMILIEU
COMMISSIE VOOR KLINISCHE BIOLOGIE
DIENST VOOR LABORATORIA VAN KLINISCHE BIOLOGIE
COMITE VAN DESKUNDIGEN
GLOBAAL RAPPORT
EXTERNE KWALITEITSEVALUATIE
VOOR ANALYSEN KLINISCHE BIOLOGIE
NIET INFECTIEUZE SEROLOGIE
ENQUETE 01/2007
WIV/07/01 /niet infectieuze serologie. 03
Dit rapport mag uitsluitend worden gereproduceerd, gepubliceerd of gedistribueerd met toestemming
van het WIV.
COMITE VAN EXPERTEN
WIV
Secretariaat
:
tel.
02/642.55.22
fax
02/642.56.45
Dr. Van Campenhout : Coördinator Niet-infectieuze serologie
Dr. BOSSUYT X.
Dr. HUMBEL R.
Dr. MEWIS A.
Dr. SERVAIS G.
Dr. TOMASI J-P.
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
02/642.53.95
02/642.56.45
e-mail : [email protected]
016/34.70.09
016/34.70.42
e-mail : [email protected]
00352/488.288.380
00352/488.288.385
e-mail : [email protected]
011/30.97.42
011/30.97.50
e-mail : [email protected]
02/477.25.07
02/477.21.63
e-mail : [email protected]
02/764.68.80
02/764.94.28
e-mail : [email protected]
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
2/13
OPSPOREN EN IDENTIFICATIE VAN ANA
Staalmateriaal
Er werd één monster (S/7677) rondgestuurd afkomstig van een plasmaferese bij
een patiënt met het CREST syndroom.
Wij danken Dr. Tomasi (UCL - St Luc) voor het bezorgen van dit monster en het
verstrekken van de nodige klinische inlichtingen.
Deelname
134 Belgische en 3 Luxemburgse laboratoria hebben deelgenomen aan deze
enquête.
Resultaten
Bij een patiënt met diagnose CREST, wordt op Hep-2(000) cellen een
kernfluorescentie met typisch anti-centromeer patroon verwacht en
antistoffen tegen het centromeer-proteïne B.
Indirecte immunofluorescentie (IIF) op HEp-2(000) cellen
De 3 deelnemende Luxemburgse laboratoria vermelden een centromeer patroon,
met een titerrange van 1/1280 – 1/5120.
Van de 134 Belgische laboratoria heeft 1 laboratorium geen resultaat voor ANA
gerapporteerd en heeft 1 laboratorium enkel een titer vermeld zonder specificatie
voor het kern- of cytoplasma. Aldus werden 132 resultaten verwerkt voor wat
betreft het opsporen en titreren van ANA m.b.v. indirecte immunofluorescentie
op HEp-2(000) cellen. 3 laboratoria hebben enkel een patroon vermeld en geen
titer, 2 laboratoria hebben enkel cytoplasmatische fluorescentie vermeld.
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
3/13
De volgende tabellen vermelden de patronen voor kern en cytoplasma bekomen
met indirecte immunofluorescentie op HEp-2(000) cellen:
PATROON KERN
AANTAL
WAARNEMINGEN
Centromeer
Centromeer + (fijn) gespikkeld
Centromeer + kernmembraan
Centromeer of discreet gespikkeld
Centromeer + granulair
Grof gespikkeld centromeer
Gespikkeld*
Gespikkeld + chromosomen gespikkeld
Mitose fijn granulair / interfase fijn
granulair
Nucleolair dots (centromeer)
109
5
3
1
1
2
2+1*
1
1
Positief (geen kernpatroon vermeld)
Negatief *
PATROON CYTOPLASMA
Negatief
Centromeer*
Gespikkeld
1 (?)
1
2*
AANTAL
WAARNEMINGEN
83
3*
1
(*) centromeer foutief als cytoplasmatische fluorescentie geïnterpreteerd
7 laboratoria (5%) hebben een onvolledige of foutieve interpretatie gedaan van
het immunofluorescentiepatroon:
-
centromeer patroon verkeerd geïnterpreteerd (niet herkend) : N=5
geen beschrijving van het patroon (enkel een positieve interpretatie voor
kernfluorescentie : N=1
gespikkelde cytoplasmatische fluorescentie zonder vermelding van de
aanwezigheid van kernfluorescentie: N=1
3 laboratoria hebben het anti-centromeer herkend, doch foutief beschouwd als
een cytoplasmatische fluorescentie.
Het immunofluorescentiepatroon voor ANA werd aldus door 95% van de
deelnemers op een aanvaardbare wijze geïnterpreteerd waarvan 93% volledig
correct.
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
4/13
Onderstaande tabel vermeldt de patronen bekomen op Hep-2(000) cellen van de
verschillende fabrikanten:
Fabrikant
HEp-2 cellen
Alphadia (101)
Euroimmun (102)
TOTAAL
14
20
Patroon
KERN
Centromeer
Centromeer+grof gespikkeld
Gespikkeld
Centromeer
Centromeer +
kernmembraan
Centromeer +
fijn gestippeld
Mitose fijn granulair /
interfase fijn granulair
Negatief
Patroon
CYTOPLASMA
Centromeer
Gespikkeld
N
11
1
1
1
13
2
1
1
Centromeer
Nucleolair dots (centromeer)
2
1
1
Immunoconcepts (103)
1
Centromeer
Immunoconcepts HEp 2000
(104)
43
Centromeer
Centromeer + (fijn) gespikk.
Centromeer of discreet
gespikkeld
Centromeer+kernmembraan
Gespikkeld
Gespikk.+chromos. gespikk.
35
3
Centromeer
Centromeer (grof) gespikkeld
34
2
Inova (105)
36
1
1
2
1
Kallestad (106)
9
Centromeer
Centromeer + granulair
8
1
Medica (108)
2
Centromeer
2
Zeus (110)
1
Centromeer
1
Diasorin (111)
2
Centromeer
2
Niet gespecifieerd
3
Centromeer
Positief
2
1
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
5/13
Onderstaande grafiek geeft de globale verdeling weer van de gerapporteerde ANA
titers voor wat betreft de kernfluorescentie:
GLOBALE TITERVERDELING ANA
Kernfluorescentie
45
40
Aantallen
35
30
25
20
15
10
5
0
2
1/40 3
1/80 4 1/160 5 1/320 6 1/640 7 1/1280 7 1/2560 81/5120 9
1/1024010
11
TITERS
Voor de verwerking van de titers werden de rapporteringen met titers “>” niet in
de grafieken en berekeningen opgenomen.
Aantallen
Titers Kernfluorescentie
niet in de grafieken en berekeningen
opgenomen
1
1
1
5
2
4
2
>1/5120
>1/3200
>1/2560
>1/1280
>1/1000*
>1/640*
>1/80*
* Bij hoge titers dient een verdere verdunning tot ten minste 1/1000 – 1/1280 te
alle tijde te worden uitgevoerd.
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
6/13
Onderstaande tabel geeft de medianen van de titers weer voor ANA,
(kernfluorescentie) op Hep-2(000) cellen, waarvoor minstens 4 gebruikers een
titer hebben vermeld:
Cellen
HEp-2
Fabrikant
Alphadia
Euroimmun
Inova
Kallestad
HEp-2000
Immunoconcepts
Alle titers (Kernfluorescentie):
Aantal
Mediaan
Range (min-max)
12
1/640
1/80 – 1/1280
19
1/1280
1/80 – 1/10240
35
1/1280
1/160 - 1/10240
9
1/2560
1/1280 -1/5120
40
1/2560
1/320 - 1/10240
122
1/1280
1/80 – 1/10240
De medianen bekomen voor de substraten van de verschillende producenten zijn
niet echt gelijklopend; de spreiding binnen de methodes daarentegen is
andermaal breed! De kleinste spreiding binnen één systeem wordt bekomen voor
de cellen van Kallestad. Rekening houdend met de medianen per methode en de
globale mediaan voor alle systemen samen (1/1280), is een resultaat bekomen
binnen de range van 1/640 - 1/5120 aanvaardbaar. Laboratoria die titers in het
lage gebied gevonden hebben, in vergelijking met de andere deelnemers uit hun
groep, kunnen zich vragen stellen i.v.m. de afstelling van de microscoop, de
aangemaakte verdunningen (juistheid van de pipetten of diluters) of de kwaliteit
van het conjugaat. Anti-centromeer patronen gaan zeer dikwijls samen met zeer
hoge titers op HEp-2(000) cellen.
Onderstaande grafieken geven de verdeling weer van de ANA titers
(cytoplasmatische fluorescentie) op Hep-2(000) cellen, waarvoor er minstens 4
gebruikers een titer voor kern fluorescentie hebben vermeld:
TITERVERDELING “ALPHADIA”
5
Aantallen
4
3
2
1
0
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280 1/2560 1/5120 1/10240
TITERS
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
7/13
TITERVERDELING “EUROIMMUN”
7
6
Aantallen
5
4
3
2
1
0
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240
TITERS
TITERVERDELING “IMMUNOCONCEPTS HEP 2000”
16
14
Aantallen
12
10
8
6
4
2
0
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240
TITERS
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
8/13
TITERVERDELING “INOVA”
12
10
Aantallen
8
6
4
2
0
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240
titer_code
TITERS
TITERVERDELING “KALLESTAD”
6
Aantallen
5
4
3
2
1
0
1/40
1/80
1/160
1/320 1/640 1/1280 1/2560
1/5120 1/10240
TITERS
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
9/13
Opsporen van anti-nDNA/anti-dsDNA antistoffen
42 laboratoria (31%) hebben geen anti-nDNA/dsDNA antistoffen opgespoord.
92 laboratoria spoorden de aanwezigheid van anti-nDNA/anti-dsDNA antistoffen
op, waarvan 8 met 2 technieken. 2 van deze laboratoria hebben geen resultaat
vermeld, enkel een techniek. Met uitzondering van 1 laboratorium, werden der
door geen enkele deelnemer anti-nDNA/dsDNA antistoffen aangetoond.
•
35 laboratoria maakten gebruik van indirecte immunofluorescentie op
Crithidia luciliae; 34 deelnemers bekwamen een negatief resultaat.
1 laboratorium bekwam een positief resultaat.
•
1 laboratorium maakte gebruik van een RIA techniek en bekwam een
negatief resultaat
•
51 laboratoria maakten gebruik van een ELISA/EIA/FEIA techniek; 2
laboratoria hebben geen resultaat vermeld, de overige 49 bekwamen een
negatief resultaat
•
14 laboratoria maakten gebruik van een immunodot/blot techniek; alle
laboratoria bekwamen een negatief resultaat.
Crithidia l. (IIF)
Anti-nDNA
RIA
Anti-dsDNA
ELISA/EIA/FEIA
Anti-dsDNA
IMMUNODOT
Anti-dsDNA
POSITIEF
1
0
0
0
NEGATIEF
34
1
49*
14
*51 laboratoria maakten gebruik van een ELISA/EIA/FEIA techniek ; 2 laboratoria hebben
geen resultaat vermeld
Gezien de klinische gegevens van de patiënte worden er in dit monster
geen anti-nDNA/dsDNA antistoffen verwacht.
Aantonen en identificeren van ANA / anti-ENA antistoffen; geen IIF
121 laboratoria (90%) spoorden de aanwezigheid van anti-ENA/ANA
antilichamen op of hebben getracht deze ANA met één of meerdere methoden te
identificeren. 37 van deze laboratoria (30%) hebben een ANA/ENA screeningtest
toegepast al dan niet in combinatie met een ANA /anti ENA identificatietest.
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
10/13
Volgende tabel geeft een overzicht van de gebruikte methoden en de bekomen
resultaten:
Methode
RID1
(3010)
Dot/Blot
(3030)
N
Fabrikant
N
Resultaat
N
4
Immunoconcepts
4
Negatief
4
67 Alphadia
16
Centromeer
Negatief
11
5
BMD
3
18
Euroimmun
27
3
3
Positief
Centromeer
Negatief
Centromeer
Zwak SSB-Sm
Negatief
Positief
Negatief
Centromeer
Centromeer
3
16
2
21
1
5
1
1
3
3
2
Centromeer
Screening
Screening
Innogenetics
Orgentec
ELISA/EI
A
(3050)
42 Alphadia
BioRad
2
1
Diasorin/Liaison
Screening
Euroimmun
Inova
1
4
2
11
Screening 10
Innogenetics
4
Pharmacia/Phadia/ 17
Unicap/ IC 250
Screening 14
Andere
1RID:
4
Pharmacia Varelisa
4
Screening
1
The Binding Site
Quanta Lite
Inova
Diasorin Etimax
Screening
1
1
1
1
3*
2
Negatief (CEN niet
aanwezig)
Positief (geen different.)
Positief
Centromeer
Centromeer
Negatief
Negatief
Centromeer
Centromeer
Positief (geen different.)
Positief
Negatief
Centromeer
Positief (geen different.)
Positief
Negatief
Positief (geen different.)
Negatief
Centromeer
Negatief
BioRad (2*) – Immunoconcepts (1*)
Radiale Immunodiffusie
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
11/13
1
1
4
2
1
10
10
4
15
2
13
1
3
1
1
1
1
1
1
3
Er werden 154 resultaten voor ANA/anti-ENA gerapporteerd. Een aantal
laboratoria blijkt problemen te hebben bij het identificeren van het gebruikte
systeem voor ANA/ENA “screen of identificatie”.
Eveneens hebben niet alle deelnemers aangegeven of het gebruikte systeem voor
ANA/ENA screening of identificatie van autoantistoffen, anti-centromeer
antistoffen kan aantonen wat het interpreteren van de resultaten bemoeilijkt.
OVERZICHT VAN DE RESULTATEN MET AANDACHTSPUNTEN:
•
1 laboratorium heeft geen ANA m.b.v. indirecte immunofluorescentie opgespoord,
maar enkel een ANA/ENA screen test uitgevoerd en bekwamen een positief
resultaat. Verdere identificatie werd echter niet uitgevoerd Î onvoldoende.
•
3 laboratoria hebben het centromeer patroon verkeerdelijk beschreven als
cytoplasmatisch patroon, doch allen hebben de anti-centromeer antilichamen
m.b.v. andere technieken geïdentificeerd.
•
1 laboratorium heeft enkel een eindtiter vermeld zonder verdere specificatie van
het patroon voor kern of cytoplasma en heeft negatief gerapporteerd voor de
verdere identificatie voor ANA/ENA Î antwoord is niet correct wat betreft
immunofluorescentie en identificatie.
•
4 laboratoria die een ANA
patroon hebben beschreven doch zonder de
vermelding van het centromeer patroon (wel nucleolair dots, gespikkeld,….)
hebben allen de anti-centromeer antistoffen aangetoond d.m.v. ANA/ENA
identificatie Î antwoord is onvolledig naar immunofluorescentie toe.
•
1 laboratorium vermeldt enkel een titer voor kernfluorescentie maar geen
patroon; wel werden de anti-centromeer antistoffen d.m.v. een ANA/ENA
identificatietest
aangetoond
Î
antwoord
is
onvolledig
naar
immunofluorescentie toe.
Het herkennen van een anti-centromeer patroon m.b.v. indirecte
immunofluorescentie op HEp2(000) cellen is van cruciaal belang in het kader
van de diagnostiek naar auto-immune aandoeningen. Het is het enige
immunofluorescentiepatroon op HEp2(000) cellen waarop men zich met
voldoende zekerheid kan baseren om te besluiten dat anti-centromeer
antistoffen aanwezig zijn. Het toepassen van andere technieken (vb. EIA) ter
bevestiging van het immunofluorescentieprofiel kan een bijdrage leveren, doch
de klinisch bioloog dient op de hoogte te zijn van de aanwezige antigenen in
zowel de ANA/ENA identificatietesten als de screeningtesten. Uit de negatieve
resultaten bekomen voor ANA/ENA identificatie (N=44) blijkt duidelijk dat een
groot deel van deze systemen de geschikte antigenen voor het aantonen van deze
anti centromeer antistoffen niet bevatten. Laboratoria die deze testsystemen in
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
12/13
gebruik hebben dienen zich er van te vergewissen dat het aantonen van ANA
m.b.v. indirecte immunofluorescentie de eerste keuze is.
43 laboratoria die in deze enquête een dergelijk systeem hebben toegepast,
hebben allen correct de anti centromeer antistoffen aangetoond m.b.v. indirecte
immunofluorescentie op HEp2(000) cellen.
Voor de ganse enquête heeft slechts 1 laboratorium de aanwezigheid van anticentromeer antistoffen met geen enkele techniek aangetoond.
ANTI-CENTROMEER – klinisch
Wanneer aangetoond door indirecte immuunfluorescentie zijn anti-centromeer
antistoffen specifiek voor scleroderma. Bij patiënten met het fenomeen van
Raynaud kunnen anti-centromeer antistoffen de klinische presentatie van
scleroderma voorafgaan. Klassiek worden anti-centromeer antistoffen
geassocieerd met het CREST-syndroom (Calcinosis, Raynaud’s phenomenom,
Esophageal dysmotility, Sclerodactyly, Telangiectasia). Ze zijn aanwezig bij 70%
van deze patiënten.
Algemeen kan men stellen dat scleroderma patiënten met anti-centromeer
antistoffen een betere prognose hebben dan patiënten met andere sclerodermageassocieerde antistoffen. Anti-centromeer antistoffen worden vooral
aangetroffen bij patiënten met gelimiteerde cutane aantasting. In deze
patiëntengroep komt interstitiële pulmonaire fibrose minder frequent voor.
Prof. X. Bossuyt (Laboratoriumgeneeskunde UZ - KU Leuven)
ANTI-CENTROMEER – het laboratorium
Anti-centromere antibodies (ACA) were first reported in 1980. They are usually
measured by indirect immunofluorescence assay (IFA) using HEp-2 cells as
substrate. ACA target the centromere regions of the chromosome which interact
with the mitotic spindles. They produce a fine speckled pattern of staining (40 to
60 discrete dots), becoming aligned along the equator of the cell as mitosis
approaches. The major antigen recognized is an 80kDa DNA binding protein
termed CENP-B which is a member of the centromere proteins (= the CENP
family). Other centromeric autoantigens include CENP-A (17 kDa), CENP-C (140
kDa) and CENP-E (312-kd)
Owing to the fact that most sera containing ACA react with CENP-B, many
laboratories have adopted ELISA using human recombinant CENP-B as antigen.
Compared with immunofluorescence, the CENP-B ELISA sensitivity is 94% and
the specificity is 93%. Adjunction of a CENP-A ELISA to the CENP-B ELISA has
been proposed as an improvement. Currently, the method of choice remains
indirect IFA on a HEp-2 cell substrate.
Prof. J-P Tomasi (Labo Biologie Clinique, Cliniques Universitaires St Luc - UCL)
Globaal rapport niet infectieuze serologie 2007/1 Datum: 26-09-2007
13/13