Leerlingenhandleiding

Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
1
Colofon
Documenttitel:
Leerlinghandleiding Practicum “Vaccinatie tegen Hepatitis B”
Auteurs:
Bastiaan Kikkert, biologie docent Veenlanden College
Edwin Tijhaar, Leerstoelgroep Celbiologie en Immunologie Wageningen University
Met input van:
Huub Savelkoul, Leerstoelgroep Celbiologie en Immunologie Wageningen University
Jonna Koper, Kristian Zadelhof en Jeroen Sijbers, Wageningen University
Agnes Legierse, EUSO Nederland
Deelnemers van het DOT biologie 2013/2014 van Bètasteunpunt Wageningen
Redactie en vormgeving:
Bètasteunpunt Wageningen
©2015. Versie 1.1
Deze module vormt de basis voor het gebruik van de ELISA-kit in de klas. Het auteursrecht
op de module berust bij Wageningen University. Wageningen University is derhalve de
rechthebbende zoals bedoeld in de hieronder vermelde Creative Commons licentie. De
auteurs hebben bij de ontwikkeling van de module gebruik gemaakt van materiaal van
derden en daarvoor toestemming verkregen. Bij het achterhalen en voldoen van de rechten
op teksten, illustraties, enz. is de grootst mogelijke zorgvuldigheid betracht. Verantwoording
van de figuren is in de docentenhandleiding te vinden. Mochten er desondanks personen of
instanties zijn die rechten menen te kunnen doen gelden op tekstgedeeltes, illustraties enz.
van een module, dan worden zij verzocht contact op te nemen met Wageningen University.
De module en ELISA-kit is met zorg samengesteld en getest. Wageningen University en
Bètasteunpunt Wageningen aanvaarden geen enkele aansprakelijkheid voor onjuistheden
en/of onvolledigheden in de module. Ook aanvaarden Wageningen University en
Bètasteunpunt Wageningen geen enkele aansprakelijkheid voor enige schade, voortkomend
uit het gebruik van deze module en het gebruik van de ELISA-kit. Het gebruik van de ELISAkit is op eigen risico.
Dit werk is gelicenseerd onder een Creative Commons
Naamsvermelding-NietCommercieel-GelijkDelen 3.0 Nederland
licentie.
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
2
Introductie
In dit practicum zal je de werking van het immuunsysteem (=afweersysteem) van de mens
leren kennen. Je gaat namelijk de ontwikkeling van specifieke antistoffen meten na
vaccinatie tegen het Hepatitis B virus.
De test die je straks gaat uitvoeren heet een ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Deze techniek wordt gebruikt voor het kwantificeren van antigenen en antistoffen. De ELISAtechniek is een uitermate gevoelige techniek en heeft zeer veel toepassingen. In de ELISA
wordt de binding tussen antigeen en antistof aangetoond met een enzymatische reactie.
Tijdens dit practicum ga je een ELISA uitvoeren om aan te tonen dat vaccinatie van een
individu tegen het Hepatitis B virus effectief is geweest.
Hepatitis B
Hepatitis B virus (HBV) is een virus van de familie Hepadnaviridae en kan worden
overgebracht door bloed-bloedcontact of via seksueel contact met iemand die het virus bij
zich draagt. De meest voorkomende symptomen zijn vermoeidheid, misselijkheid, geelzucht
en uiteindelijk leverfalen of leverkanker. Het HBV komt met name voor in Afrika, Azië, OostEuropa en Latijns-Amerika.
Bescherming: Actieve immunisatie
Sinds 1981 is het HBV vaccin in gebruikt. Het vaccin is een recombinant vaccin,
geproduceerd in gistcellen die zo veranderd dat ze het “Hepatitis B surface antigeen”
(HBsAg) namaken. Het HBsAg is een eiwit op het oppervlakte van het Hepatitis B virus dat
door binding aan levercellen zorgt dat het virus deze cellen kan infecteren. Antistoffen tegen
HBsAg kunnen HBV infectie blokkeren. Het HBsAg gezuiverd uit de gistcellen vormt daarom
de basis van het HBV vaccin. Om bescherming tegen HBV te verkrijgen zijn er ten minste 2
vaccinaties nodig, waarvan de 2de vaccinatie 1 – 2 maanden na de eerste gegeven wordt. In
Nederland wordt het vaccin met name gebruikt voor mensen die op reis gaan naar
risicolanden en mensen die werken in de gezondheidssector.
De immuunrespons
Wanneer een ziekteverwekker het lichaam binnendringt, zal het afweersysteem hierop
reageren door antistoffen te produceren tegen de ziekteverwekker (bijvoorbeeld het
Hepatitis B virus). De delen van de ziekteverwekker waartegen het afweersysteem specifieke
antistoffen maakt (bijvoorbeeld het HBsAg) worden de antigenen genoemd. Je lichaam volgt
een vast patroon wanneer het reageert op een antigeen. De specifieke B cellen die voor de
eerste keer aan het antigeen binden reageren hier op door het uitscheiden van specifieke
antistoffen van het immunoglobine M (IgM) type. Deze specifieke IgM antistoffen kunnen al
binnen een week voor het eerst in je bloed worden aangetoond en bereiken hun hoogste
niveau na ca. 2 weken. Door hulp van T cellen aan de antigeen specifieke B cellen gaan
deze een ander type antistoffen maken, immunoglobuline G (IgG), dat ongeveer een week
na de IgM piek het hoogste niveau bereikt. Wanneer je hierna niet meer in aanraking komt
met dit specifieke antigeen, zullen de concentraties specifiek IgM en IgG weer snel dalen
(primaire immuunrespons).
Wanneer je voor de tweede keer aan hetzelfde antigeen wordt blootgesteld, zal je
afweersysteem sterker en sneller reageren dan de eerste keer (secundaire
immuunrespons). Dit komt doordat het afweersysteem een soort “geheugen” heeft: een
deel van de specifiek IgG producerende B cellen uit de primaire immuunrespons ontwikkeld
zich namelijk tot “geheugen-cellen” die na hernieuwd contact met het antigeen weer
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
3
antistoffen van het IgG type gaan maken. Er zijn daardoor al veel meer antigeen specifieke B
cellen aanwezig dan voor het eerste contact met dit antigeen. Bovendien kunnen deze
geheugen-cellen veel sneller antistoffen gaan maken dan B cellen die voor het eerst met het
antigeen in aanraking komen. Vaccinatie tegen een bepaalde ziekteverwekker is ook op dit
principe gebaseerd. Door iemand eerst te vaccineren met een onschadelijke ziekteverwekker
(bijvoorbeeld een geïnactiveerd of verzwakt virus of een gezuiverd viruseiwit, zoals HBsAg)
zal je afweersysteem veel sneller en sterker reageren als je daarna met het echte virus in
aanraking komt. Hierdoor kan de ziekteverwekker uitgeschakeld worden voordat deze de
kans krijgt je ziek te maken.
De ELISA test
We maken in dit practicum gebruik van een ELISAtest. Een voorbeeld van een veel
gehanteerde ELISA is het aantonen van specifieke antistoffen in bloed. Jullie gaan met een
ELISA de ontwikkeling van HBsAg-specifieke antistoffen na vaccinatie met een HBV vaccin
onderzoeken. Men heeft iemand gevaccineerd met het HBV vaccin en op verschillende
dagen bloed afgenomen. Het bloed is gecentrifugeerd om de rode en witte bloedcellen te
verwijderen en het bovenstaande heldere serum met antistoffen is verzameld. Door de
HBsAg-specifieke antistoffen in deze sera met een ELISA te meten ga je bepalen of
vaccinatie tegen het Hepatitis B virus effectief is geweest.
De ELISA bestaat uit een aantal stappen (zie afbeelding 1):
Stap 1 (Coaten met antigeen): Een aantal putjes (vaak “welletjes” genoemd) van een
microtiterplaat (96 putjes: 8 rijen van 12 putjes) wordt gevuld met antigenen (het HBsAg). De
eiwitten hechten zich spontaan zeer sterk aan het plastic van deze platen.
Stap 2 (Blokken): Eventuele overgebleven bindingsplaatsen op het plastic waar nog geen
antigeen aan gebonden zit, worden geblokkeerd met een overmaat van een irrelevant eiwit
waartegen gewoonlijk geen antistoffen in je bloed zitten (vaak wordt hiervoor boviene
(=runder) serum albumine, BSA, gebruikt). Hiermee wordt voorkomen dat de antistoffen uit
de sera (stap 3) rechtstreeks aan nog onbezette plaatsen op het plastic binden. Antistoffen
zijn immers όόk eiwitten en kunnen dus ook goed hechten aan het plastic. Nadat de eiwitten
gehecht zijn worden de putjes gewassen om alle niet gebonden eiwitten te verwijderen.
Stap 3 (Binding antigeen specifieke antistoffen): Vervolgens wordt een verdunning van de te
onderzoeken sera in de putjes gedaan zodat de specifieke antistoffen de kans krijgen aan
het antigeen (HBsAg) en dus de plaat te binden.
Stap 4 (Secundaire antistoffen): Daarna worden antistoffen specifiek voor humaan IgM of
humaan IgG toegevoegd. Deze “secundaire” antistoffen zijn gekoppeld aan een enzym
waarmee in de volgende stap binding van de antistoffen aangetoond kan worden. Meestal
wordt hier het “Horseradish” Peroxidase (HRP) voor gebruikt. Na enige tijd worden de putjes
goed gewassen om alle niet gebonden antistoffen te verwijderen.
Stap 5 (Kleurreactie): Ten slotte wordt het aan de plaat gebonden peroxidase aangetoond
door een kleurreagens (substraat) voor dit enzym toe te voegen. Het kleurreagens (ABTS) is
vrijwel kleurloos, maar wordt door het peroxidase in een blauwgroen gekleurd reactieproduct
omgezet. De kleuring is evenredig met de hoeveelheid peroxidase, dus met de hoeveelheid
gebonden antistof tegen humaan IgM of IgG en dus met de hoeveelheid specifiek IgM of IgG
tegen het HBsAg in de serummonsters.
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
4
Afbeelding 1
kleurloos
blauwgroen
Secundaire antistof
(anti-IgM of antiIgG met HRP)
Primaire antistof
(serummonsters)
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
5
Materialenlijst
Elke werkplek biedt materialen voor twee leerlingen.
Item
☐ Micro-reageerbuisjes (epjes) 1 t/m 12
☐
☐
☐
☐
☐
☐
☐
☐
☐
Microtiterplaat (96-wells); gecoat; geblocked
Epje Anti-IgM-HRP
Epje Anti-IgG-HRP
Reageerbuis ABTS reagens
50 μL fixed-volume pipetten of 20-200 μL
micropipetten
Doosje gele pipetpuntjes
Wasbuffer in bekerglas
Plastic wegwerppipetten
Keukenpapier
Omschrijving
Aantal
Sera van 0 t/m 11 weken na
vaccinatie
12
Anti-IgM-HRP
Anti-IgG-HRP
ABTS Kleurreagens
1
1
1
1
1
PBS / 0.05% Tween-20
1
1
2
Het protocol
Je ontvangt sera van een met Hepatitis B-vaccin geïmmuniseerd individu. Deze sera zijn
verzameld gedurende 11 weken na de start van het vaccinatieschema (zie tabel 2). Direct
voorafgaande aan de eerste vaccinatie is ook nog een serummonster (=monster 1)
genomen. De tweede vaccinatie werd 6 weken na de eerste immunisatie gegeven.
Tabel 2
Serummonster
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
Weken na 1e immunisatie
0 (1e immunisatie)
1
2
3
4
5
6 (2e immunisatie, booster)
7
8
9
10
11
6
Stappenplan ELISA
1.
Vul alle welletjes (putjes) van rij A en B van de microtiterplaat met de wasbuffer (LET
OP: ALLEEN RIJ A EN B ZIJN MET VIRUSEIWIT GECOAT! Alleen hierop zal de ELISA
werken. Let er dus op dat je plaat goed ligt: rij A bovenaan!). Gooi de plaat vervolgens
leeg in de wasbak en sla de plaat dan een paar keer droog op een stapel tissues. Voer
deze handeling 3 maal uit.
Gebruik hiervoor een wegwerp pipet of giet de wasbuffer rechtstreeks vanuit het
bekerglas.
wasbuffer
2. Pipetteer 50 μL serum van monster 1 in welletje A1 en B1, 50 μL serum van monster
2 in welletje A2 en B2, enz. Gebruik hiervoor de fixed-volume pipet of de 20-200
micropipet.
serum
3. Pipetteer direct 50 μL anti-IgG-HRP in elk welletje van rij A en 50 μL anti-IgM-HRP
in elke well van rij B (voeg dit toe aan de 50 μL serum die al in de welletjes aanwezig
is). Zorg ervoor dat er geen contaminatie optreedt, gebruik dus voor rij A en rij B elk
een ander geel puntje.
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
7
anti-Ig-HRP
4.
Laat gedurende 15 minuten staan bij kamertemperatuur (incuberen).
Beantwoord intussen de vragen op de pagina 9.
5.
Was de microtiterplaat 4x met de wasbuffer uit het bekerglas zoals bij stap 1.
wasbuffer
6.
Pipetteer 100 μL van het ABTS kleurreagens (substraat) in elke well van rij A en rij B en
incubeer gedurende 10-20 minuten bij kamertemperatuur. Bekijk de kleurontwikkeling
(groen) en maak een foto met je Smartphone na precies 10 en 20 minuten. Ga verder
met je vragen als je deze nog niet af hebt en beantwoord de vragen op pagina 10, 11 en
12.
ABTS reagens
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
8
Vragen te beantwoorden TIJDENS de incubatie van stap 4 en 6
1)
Wat wordt in dit experiment als negatieve controle gebruikt?
2)
Maak een schets van de verwachte IgM- en de IgG-respons bij deze vaccinatie. Laat in
deze schets zien wanneer je pieken voor IgM en IgG verwacht.
3)
Wat wil men immunologisch gezien bereiken met vaccinatie?
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
9
Vragen te beantwoorden NA voltooien van de ELISA
4) Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de eerste immunisatie (van
week 0 t/m week 6) en geef hier een verklaring voor.
Beschrijf het verschil tussen de IgM en de IgG respons na de tweede immunisatie (van
week 6 t/m week 11) in vergelijking met deze responsen na de eerste immunisatie en
geef hier een verklaring voor de gevonden verschillen.
6)
De ELISA is eerder uitgevoerd waarna de kleuring (=OD405-waarde) gemeten is. Van
de onderstaande grafieken geeft 1 grafiek deze kleuring precies weer.
Kleuring
Kleuring
5)
Weken na 1e
immunisatie
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
Weken na 1e
immunisatie
10
a) Welke lijn (X of Y) in de bovenstaande grafieken geeft de IgG reactie weer en welke
de IgM respons? Gebruik hiervoor de resultaten van je eigen experiment en licht je
antwoord toe.
b) Welke van de bovenstaande grafieken (A, B, C of D) geeft het best het resultaat van
jullie ELISA weer? Beargumenteer je antwoord.
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
11
Verdiepingsvragen:
7) Worden bij een vaccinatie antistoffen ingespoten of antigenen?
8)
Wat wordt bedoeld met een primaire immuunrespons, wat met een secundaire?
9)
Waarom denk je dat het immuunsysteem zoveel verschillende B cellen maakt die
allemaal hun eigen unieke (antigeen specifieke) B cel receptor hebben?
10) Het “Human Immunodeficiency Virus” (HIV) dat AIDS veroorzaakt kan heel snel
muteren (veranderen). Binnen een geïnfecteerd individu ontstaan daardoor voortdurend
nieuwe virusvarianten. Wat betekent dit voor de afweer tegen dit virus? Licht je antwoord
toe.
Leerlingenhandleiding Vaccinatie practicum, 2015
12