17 – Recombinatie en transpositie

17 – Recombinatie en transpositie
17.1 Homologe recombinatie
houdt in: een uitwisseling van DNA segmenten die identiek zijn in hun sequentie.
Eigenlijk dus gewoon crossing over, tijdens mitose of meiose I, bij:
Sister chromatid exchange (SCE), resulteert NIET in een nieuwe combinatie van allelen.
Genetic recombination, wanneer crossing over is tussen homologe chromosomen, en er een nieuwe
combinatie van allelen ontstaat.
Bacteriën ook homologe recombinatie ondergaan.
The Holliday Model
Genetische uitwisseling tussen homologe chromosomen.
Gene convertion: een allel is veranderd in het allel op het homologe chromosoom.
Twee homologe chromatiden liggen op één lijn -> een breuk(=nick) ontstaat op de zelfde plek in één
van de strands van beide homologe paren -> de strands basen paren met de tegenover gelegen helix
via een covalent linkage(= holliday junction) -> verplaats zich naar de zijkant -> een DNA strand in de
ene helix wordt omgewisseld met een DNA strand in de andere helix(=branch migration) -> een
heteroduplex: een regio in het dubbel strengs DNA dat base pair mismachtes bevat -> resolution: het
losbreken van de strand en hervorming van twee aparte chromosomen.
Double –strand break model
Een breuk ontstaat in beide strengen van één van de homologe chromosomen -> een klein stuk naast
de breuk wordt afgebroken -> een enkel strengs stuk DNA(van de homologe chromosoom) dringt
binnen in het gat -> creëert een displacement-loop(=D-loop) -> twee regio’s hebben een gat in het
DNA -> DNA synthese(=DNA gap repair synthesis) -> Holliday junctions ontstaan -> recombinant of
non-recombinante chromosomen met een heteroduplex.
Het Recombinant proces bestaat uit veel eiwitten met een eigen functie:
- Eiwitcomplex RecBCD; initieert recombinatie, herkent een double-stranded break, katalyseert DNA
ontwinding en DNA afbraak. Het producedert enkel strengs DNA dat mee doet in strand invation en
exchange.
Ook kan het breuken maken in bepaalde sites van het DNA9= chi sequences.
REcBCD loopt langs het DNA -> vindt een chi sequence -> maakt een breuk bij de 3’ -> één nick ->
initiatie van homologe recombinatie.
- Eiwit RecA; promoot strand invasion. Het bindt aan enkel strengs DNA gemaakt door RecBCD ->
vorming van een filament -> het filament maakt contact met het niet-gebroken chromosoom(bij niethomologe regio’s) -> glijdt over het DNA totdat hij er wel een tegen komt -> katalyseert de
displacement van een DNA strand -> de invated DNa strand vormt snel een nieuwe helix met de
andere strand -> D-loop.
- Eiwit RuvABC; bindt aan Holliday junctions. RuvAB promoot branch migration. RuvC is een
endonuclease die aan het eind weer twee chromosomen maakt.
- RecG; is een helicase die ook branch migration katalyseert.
17.2 Site-specific recombination
DNA fragmenten kunnen recombineren tot nieuwe combinaties. De recombination sites zijn relatief
korte DNS sequneces met een speciale locatie. Het breken en aanhechting gebeuren op deze
plaatsten.
Virale genomen
Bacteriofagen kunnen hun virale DNA in bacterieel DNA stoppen -> prophage. Deze kan lang in de
lysogenic state blijven staan.
Integratie van λ DNA behoeft een bepaalde sequence(= attachment sites).
Integrase wordt gemaakt door een gen in het λ DNA. Integrase moleculen herkennen de core
sequences en brengen hen bij elkaar -> integrase maakt knipt de attachment sites -> de strands
worden uitgewisseld -> de einden worden geliseerd.
Anti lichamen
Antilichamen(= immunoglobulins(Igs)) zijn eiwitten geproduceerd door het immuunsysteem.
Herkennen niet-lichaamseigen producten en maakt ze doelwit voor vernietiging.
Ze herkennen antigenen.
Elke B cel produceer één bepaald type antilichaam. Antilichamen met verschillende sequences
worden gegenereerd door een mechanisme waarbij DNA wordt geknipt en herverbonden door sitespecific recombination -> maar een paar antilichaam genen zijn nodig voor het produceren van
miljoenen verschillende antilichamen!
Antilichamen zijn tetrameric proteins, bestaande uit twee ‘heavy chains’ en twee ‘light chains’.
- Light chains:
Precursor gen heeft ongeveer 300 regio’s bekend als variable (V) sequences, 4 verschillende joining
(J) sequences en 1 constant (C) sequence. Elk codeert een verschillende aminozuur volgorde.
Aan het eind van elke V domain en elk begin van een J domain is een ‘recombination signal
sequence’, een herkenningspunt voor site-specific recombination tussen V en J. Het proces wordt
geinitieerd door RAG1 en RAG2, ze herkennen de signal sequences en maken twee dubbel-strengs
breuken; een aan het eind van V, en een aan het begin van J.
De connectiefase van dit proces wordt gekatalyseerd door ‘non-homologous end-joining(NHEJ)
proteins.
De gefuseerde VJ regio zit in een pre-mRNA, en wordt dan gesliced om de C en J regio’s aan elkaar te
voegen.
- Heavy chains:
Deze worden gemaakt door eenzelfde systeem. Heavy chain gen codeert voor enkele diversity (d)
domains, te vinden tussen de J en J domains. Eerst wordt dan de D aan de J gekoppeld en dan de V
aan de DJ(= V(D)J recombination)
17.3 Transpositie
Het integreren van segmenten in een ander chromosoom, Transposable elements(TEs)/’jumping
genes. 3 verschillende typen:
1) Simple/ cinservative transposition; de TE wordt geknipt en op en andere plek geplakt.
2) Replicative transposition; de TE wordt gekopieerd en de kopie wordt ergens ingebouwd, terwijl
het origineel op zijn plek blijft. (Dit is zeldzaam en komt louter voor in bacteriën).
3) Retrotransposition; het element is vertaald in RNA, die vervolgens wordt gebuikt als template om
een DNA te maken die daarna wordt ingebouwd.
1) en 2) zijn ‘transposons’, verplaatsen als DNA. 3) is ‘retrotransposons’, verplaatsen met RNA.
DNA sequences in TEs zijn geörganiseerd op verschillende manieren. TEs zijn geflankeerd door ‘direct
reapeats’(DRs); identieke nucleotide sequences die in dezelfde richting lopen.
- Insertion sequence; de simpelste TE. Beide einden hebben ‘inverted repeats’(IRs), identieke
sequences die in tegenovergestelde richting lopen. IRs kunnen sequences hebben voor transpotase.
- Composite transposons; hebben extra genen die niet per se nodig zijn voor transposition. Ze zijn er
vaak zodat een organisme een voordeel heeft onder bepaalde omstandigheden.
- Replicative transposons; hebben een extra resolvase enzym.
- LTR retrotranspons; hebben de mogelijkheid zichzelf te verplaatsen binnen het genoom. Ze
produceren geen volwasse virale deeltjes. Ze hebben aan beide einden ‘long terminal reapeats’(LTRs)
- non-LTR retrotranspons; zijn minder retrovirusachtig. Hebben een gen dat codeert voor een eiwit
met zowel transcriptase en endonuclease.
Transposible elements kunnen compleet(= autonomous elements) zijn, hebben dan alle benodigde
informatie voor trasposition. OF
zijn incpompleet(=nonautonomous elements), missen informatie.
Simple transposition
Transpotase zorgt voor het knippen en plakken van een gen. Transpotase bindt aan de IRs aan de
einden -> brengt ze naar elkaar toe -> ze laten los -> wordt getransporteerd naar een nieuwe plek ->
plakt ze door binding met recognicion sites.
Dit gebeurd tijdens replicatie. Waardoor het genetische materiaal vermeerderd kan worden.
Replicative transposition
Transpotase maakt één knip aan elk eind van de TE en twee knippen in het target DNA -> Beide
hebben een gat -> gap repair synthesis kopieert beide gaten -> twee kopieën van de TE in één groot
circulair molecuul(=cointegrand) -> resolvase zorgt ervoor dat de cointegrand weer twee losse
moleculen wordt.
Retrotransposons
LTR transposons: heeft 2 enzymen nodig, transcriptase en integrase.
Een bepaald gen wordt getranscripteerd in RNA ->Reverse transcriptase gebruikt deze RNA als
template voor een dubbel strengs DNA molecuul -> de einden van deze DNA worden herkent door de
integrase -> katalyseert de insertie van het DNA in het bepaalde chromosomale DNA.
Non-LTR tranposons: methode hiermee heet ‘target site primed reverse transcription (TPRT).
Een retrotransposon wordt gekopieerd in een RNA met polyA staart -> het target DNA site wordt
herkent door een endonucelase(nl 5’-TTTTA-3’) -> knipt één van de DNA strands -> polyA staart bind
aan deze nicked site -> reverse transcriptase maakt een DNA copy van het RNA -> endonuclease
maakt een knip in de andere strand -> retrotransposon DNA is ligated in de target site in het
chromosoom.
In sommige gevallen komen de repetitive sequences door de verspreiding van TEs. Voorbeeld:
- LINEs(long interspersed elements) ; representeert bijna 17% van het humane DNA.
- SINEs(short interspersed elements) ; representeert ongeveer 10% van het humane DNA.
Ze blijven zicht verspreiden, maar niet veel.
De relatieve overvloed van TEs verschilt per soort.
Selfish DNA hypothesis: TEs bestaan omdat ze de eigenschap bezitten zichzelf te vermeerderen
binnen een chromosomale DNA. Ze kunnen zich vermeerderen zolang ze het organisme maar niet
negatief beïnvloeden. Hun voordelen:
- TEs zorgen voor een grotere genetische variëteit.
- TEs dragen vaak een (antibiotica)resistentie
- TEs zouden mogelijk een rol spelen in de verplaatsing van exonen -> een gen met een nieuwe
functie(=
exon shuffling).
Transposible elements hebben verschillende effecten op chromosoom structuur en gen expressie.
Veel van deze uitkomsten zijn schadelijk, transposition in namelijk een hoog gereguleerd fenomeen.
Transposon tagging: een methode waarbij onderzoekers transposons gebruiken om genen te klonen.