University of Groningen Pompe disease Geel, Tessa Marieke

University of Groningen
Pompe disease
Geel, Tessa Marieke
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2010
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Geel, T. M. (2010). Pompe disease: towards gene correction using targeted nucleases Groningen: s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Chapter 10
Nederlandse samenvatting
133
Chapter 10
De ziekte van Pompe is een erfelijke stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door stapeling
van glycogeen in de lysosomen. Lysosomen zijn kleine organellen in een cel die met behulp van
eiwitten (enzymen) verantwoordelijk zijn voor de afbraak en hergebruik van verschillende stoffen
in de cel. Als één van die enzymen ontbreekt of niet goed functioneert dan vindt er stapeling plaats
van (afval) stoffen. In geval van de ziekte van Pompe functioneert het enzym zure α-glucosidase
slecht of helemaal niet. Het enzym zure α-glucosidase is normaal gesproken verantwoordelijk voor
de afbraak van glycogeen, een vorm waarin suikers worden opgeslagen in de spieren en lever.
Echter, door een tekort aan het zure α-glucosidase kan glycogeen niet worden afgebroken en vormt
zich een ophoping van glycogeen in de lysosomen (zie Figuur 1). Deze stapeling vindt met name
plaats in de spiercellen waardoor spierzwakte ontstaat. Het tekort aan zure α-glucosidase wordt
veroorzaakt door een mutatie in het gen dat codeert voor het zure α-glucosidase. De positie van
de mutatie bepaalt hoeveel enzymactiviteit er over is (ook wel ‘restactiviteit’ genoemd) en bepaalt
in grote lijnen de klinische presentatie. De patiënten kunnen dan ook onderling grote verschillen
vertonen. De eerste symptomen kunnen al direct na de geboorte tot uiting komen, terwijl er ook
patiënten zijn die op latere leeftijd ( >60 jaar) klachten krijgen. Uiteindelijk resulteert deze ziekte
in de voortijdige dood van de patiënt. De ziekte van Pompe komt naar schatting 1 keer per 40.000
geboorten voor en wordt gezien als een zeldzame ziekte.
A
B
C
Enzymvervangings
therapie
X
Lysosoom
Lysosoom
Normale
situaƟe
Lysosoom
Ziekte van Pompe
Ziekte van Pompe
onbehandeld
behandeld
Geen GAA producƟe
Geen GAA producƟe
X
Kern
X
Kern
ER
Golgi
M6P receptor
Zure ɲ-glucosidase
Kern
Glycogeen
Glucose
Recombinant zure ɲ-glucosidase
X MutaƟe in het gen coderend voor zure ɲ-glucosidase
Figure 1. A. In a normale situatie wordt het zure α-glucosidase geproduceerd en getransporteerd naar de
lysosomen in de cel. In de lysosoom is het zure α-glucosidase verantwoordelijk voor de afbraak van glycogeen
tot glucose. Een portie van het zure α-glucosidase wordt uitgescheiden en kan weer opgenomen worden
door een andere cel met behulp van een mannose-6-fosfaat receptor. B. In een patiënt met de ziekte van
Pompe is er een tekort aan het zure α-glucosidase door een mutatie in het gen dat codeert voor het zure
α-glucosidase. Door dit tekort aan het enzym ontstaat er een opeenhoping van glycogeen in de lysosomen. C.
Enzymvervangingstherapie is op dit moment de enige therapie die beschikbaar is voor patiënten met de ziekte
van Pompe. Via injecties wordt het recombinant zure α-glucosidase in het bloed gebracht.
(zie voor kleuren figuur blz. 159)
134
Nederlandse samenvatting
Onderzoek heeft er toe geleidt dat er een biotechnologische variant van het menselijk zure
α-glucosidase (recombinant GAA) geproduceerd kan worden. Bij toediening zorgt deze variant voor
de afbraak van glycogeen. Deze therapie, ook wel enzymvervangingstherapie genoemd, wordt
sinds 2006 toegepast in de kliniek en zorgt er niet alleen voor dat de spierfuncties verbeteren in de
loop van de tijd, ook de overlevingstijd van de patiënten neemt toe. Hoewel deze therapie de enige
optie is voor de tot dusverre ongeneeslijke ziekte, zijn er een aantal nadelen die het succes ernstig
belemmeren zoals hoge productie kosten, inefficiënte opname van het enzym en de noodzaak van
levenslange behandeling. Hoofdstuk 2 geeft een gedetailleerd overzicht van de ziekte van Pompe,
de behandelmethode als ook de mogelijke toekomstige behandelmethodes.
Om de nadelige effecten van de enzymvervangingstherapie te omzeilen, worden verschillende
nieuwe behandelmethodes onderzocht. In dit proefschrift worden twee mogelijke strategieën voor
de behandeling van de ziekte van Pompe beschreven:
1.
Verbetering van de huidige enzymvervangingstherapie
2.
Correctie van de mutatie in het gen dat codeert voor het zure α-glucosidase.
Het is algemeen bekend dat de opname van recombinant GAA in het menselijk lichaam zeer inefficiënt
is omdat een groot gedeelte van het enzym wordt uitgescheiden in de urine. Dit noodzaakt de arts
om de patiënten een hoge dosering toe te dienen om het gewenste effect te bereiken. Echter, zulke
hoge doseringen kunnen leiden tot inductie van het afweerrespons in het lichaam. Bij patiënten,
die helemaal geen zure α glucosidase aanmaken, kan het lichaam zelfs zeer heftig reageren op de
toediening van recombinant GAA: Het lichaam ziet het recombinante GAA als lichaamsvreemd en
zal daardoor antilichamen produceren om het recombinante GAA op te ruimen. Het is daarom van
groot belang om 1) minder recombinant GAA en 2) verpakt/afgeschermd toe te kunnen dienen en
toch het gewenste effect in de cel te bewerkstelligen. In het eerste gedeelte van dit proefschrift
vroegen wij ons af of aflevering van recombinant GAA met behulp van positief geladen vetachtige
moleculen, genaamd SAINT, kan leiden tot een verbeterde opname van recombinant GAA. Onze
groep heeft eerder al beschreven dat moleculen zoals SAINT spontaan een interactie kunnen
aangaan met DNA en RNA maar ook met eiwitten. SAINT kan hierdoor de aflevering van eiwitten,
DNA of RNA in de cel bespoedigen. In de hoofdstukken 3 – 5 is deze strategie, eiwit aflevering in de
cel met behulp van SAINT, verder onderzocht voor GAA en restrictie enzymen.
In hoofdstuk 3 beschrijven we de opname van lysosomale enzymen met behulp van SAINT in
huidcellen van patiënten met een lysosomale stapelingsziekte. Deze huidcellen worden doorgaans
afgenomen bij de patiënt om de ziekte van Pompe of een andere lysosomale stapelingsziekte vast
te stellen. Voor deze studie werden drie verschillende lysosomale enzymen gebruikt (betrokken
bij drie verschillende lysosomale stapelingsziekten) om zo de mogelijke toepassing van SAINT
voor deze aandoeningen te onderzoeken. Een belangrijke bevinding was dat alle enzymen
functioneel afgeleverd konden worden in de huidcellen: In de loop van de tijd werd een verhoogde
enzymactiviteit waargenomen, met name bij aflevering van recombinant GAA.
In hoofdstuk 4 beschrijven we de aflevering van eiwitten, antilichamen en restrictie enzymen
135
10
Chapter 10
met behulp van SAINT in humane niercellen en muizen huidcellen. De experimenten toonden
aan dat zowel het eiwit β-galactosidase als het antilichaam IgG efficiënt afgeleverd kon worden in
niercellen. We vervolgden ons onderzoek met de aflevering van restrictie enzymen in muizen huid
cellen. Van restrictie enzymen is bekend dat zij een bepaalde korte sequentie kunnen herkennen
in het DNA en daar een knip kunnen veroorzaken in het DNA. Er zijn meestal veel herkenningssites
aanwezig in het DNA, waardoor restrictie enzymen het DNA in meerdere stukken kunnen knippen
(DNA fragmentatie). In deze studie laten we zien dat aflevering van een restrictie enzym in
complex met SAINT leidt tot DNA fragmentatie in muizen huid cellen. Deze studie bevestigd de
brede toepasbaarheid van SAINT om eiwitten, antilichamen en restrictie enzymen af te leveren in
verschillende celtypen.
Om SAINT te kunnen gebruiken voor zowel verbetering van de huidige enzymvervangingstherapie
als ook voor gen correctie in de ziekte van Pompe is het wenselijk om GAA producerende cellen te
kunnen bereiken. In hoofdstuk 5 hebben we de aflevering en biodistributie van SAINT onderzocht
in een diermodel. In dit hoofdstuk beschrijven wij de aflevering van klein interfererend RNA (siRNA)
in GAA-producerende cellen. In deze studie hebben wij siRNAs ontwikkeld tegen het GAA gen.
SiRNA bestaat uit 20 tot 25 nucleotiden lang RNA dat bindt aan het mRNA. Het mRNA wordt door
het siRNA afgebroken en zorgt er zo voor dat er geen eiwit meer wordt aangemaakt wat resulteert
in verlaging van GAA activiteit in de cel. Het tekort van GAA eiwit zorgt er voor dat er in de cel
minder GAA eiwit uitgescheiden wordt in het plasma. Verlaging van GAA kan vastgesteld worden
op zowel enzymactiviteit niveau als ook op mRNA niveau. Uit de experimenten kwam naar voren
dat toediening van siRNA in complex met SAINT leidt tot een verlaging van GAA activiteit in het
bloed. Dit resultaat werd waargenomen 14 dagen na de eerste toediening van siRNA in complex
met SAINT. Om vast te kunnen stellen welke cellen verantwoordelijk waren voor de GAA verlaging
werd nader onderzoek gedaan. Biodistributie studies met radioactief gelabeld SAINT toonden aan
dat het grootste deel van SAINT moleculen werd opgenomen in de lever. We waren echter niet in
staat om vast te stellen welke subtype cellen in de lever de GAA producerende cellen zijn. Omdat
SAINT in staat was om siRNA af te leveren in GAA-producerende cellen in een in vivo setting, lijkt
SAINT een goede kandidaat voor verbetering van de huidige enzymvervangingstherapie voor de
ziekte van Pompe. Hoewel deze strategie veelbelovend is als behandeling, tot een genezing van de
ziekte van Pompe zal het niet komen. Daarom hebben we in het tweede gedeelte van dit proefschrift
onderzocht of gencorrectie een mogelijk toekomstige strategie kan zijn voor de ziekte van Pompe.
Gencorrectie heeft als doel het gemuteerde DNA permanent te veranderen via homologe
recombinatie. Homologe recombinatie is een proces waarbij één DNA segment wordt uitgewisseld
met een zeer homoloog gebied van ander DNA molecuul. Omdat normaal gesproken de frequentie
van homologe recombinatie in een cel erg laag is, is het maken van een dubbelstrengs breuk in
het DNA een manier om de frequentie te verhogen. Bij het ontstaan van een dubbelstrengs
breuk wordt er in de cel een signaal afgegeven om de breuk snel te herstellen via homologe
recombinatie om blijvende schade te voorkomen. Dubbelstrengs breuken kunnen onder andere
136
Nederlandse samenvatting
gemaakt worden door restrictie enzymen die een korte sequentie herkennen in het DNA. Omdat
zulke herkenningssites veelvuldig voorkomen in het genoom, kunnen restrictie enzymen meerdere
dubbelstrengs breuken veroorzaken in het DNA wat kan leiden tot geprogrammeerde celdood
als de breuken niet meer op de juiste wijze kunnen worden hersteld. In hoofdstuk 6 beschrijven
we de aflevering van verschillende restrictie enzymen met SAINT in ovarium kankercellen en
bestuderen we de geprogrammeerde celdood van deze cellen. De experimenten toonden aan dat
drie verschillende typen restrictie enzymen in staat zijn om meerdere breuken te veroorzaken in
het DNA. Één restrictie enzym had echter de grootste potentie om geprogrammeerde celdood
te veroorzaken in twee verschillende ovarium kankercel lijnen. De resultaten beschreven in
hoofdstuk 6 laten zien dat efficiënte en functionele aflevering van restrictie enzymen in de kern
van levende cellen met behulp van SAINT mogelijk is. Verder geeft deze studie aan dat SAINT een
goede kandidaat kan zijn om als toekomstige therapie te dienen voor het elimineren van kanker
cellen. Het is daarbij van belang om alleen de kankercellen te bereiken en niet de gezonde cellen.
Dit kan door SAINT specifieke eiwitten te laten herkennen op de doelcellen. Onze onderzoeksgroep
heeft aangetoond dat EpCAM, een eiwit dat verhoogd op het celoppervlak van verschillende typen
kankercellen voorkomt, een goede target kan zijn. Koppeling van een antilichaam gericht tegen
EpCAM aan SAINT kan er dus voor zorgen dat de restrictie enzymen alleen in kankercellen worden
afgeleverd.
Voor gen correctie is het niet zozeer van belang om cel specifiek te zijn maar het is juist van
belang om gen specifiek te zijn. Om de specificiteit van restrictie enzymen te verhogen voor
gencorrectie is het noodzakelijk om de enzymen bijvoorbeeld te koppelen aan een DNA bindend
domein dat aan slechts één positie in het DNA kan binden. Een voorbeeld van een DNA bindend
domein is een Triple Helix vormende Oligonucleotide (TFO) of een Zinkvinger Proteïne (ZFP). Deze
TFO of ZFP kan een specifiek stuk DNA herkennen en op die plaats het restrictie enzym een DNA
dubbelstrengs breuk laten maken. Middels deze zogenaamde “targeted nucleasen” kan een mutatie
in het gen coderend voor het zure α-glucosidase vervangen worden door een correct stuk DNA via
homologe recombinatie (zie Figuur 2).
In dit proefschrift, hebben we ons geconcentreerd op het gebruik van een TFO als DNA bindend
domein en hebben we onderzocht of TFO-nucleasen in staat zijn om homologe recombinatie
te bewerkstelligen. In hoofdstuk 7 hebben we TFO’s ontwikkeld voor zowel de humane als ook
de muizen zure α-glucosidase, het gen dat gemuteerd is in de ziekte van Pompe. Vervolgens zijn
de TFO’s gekoppeld aan camptothecin, een compound die DNA schade veroorzaakt, of aan het
restrictie enzym MunI. Deze werden vervolgens geanalyseerd voor hun binding aan het DNA, voor
het aanbrengen van DNA schade en voor het bewerkstelligen van homologe recombinatie. Omdat
bekend is dat in de kern van een cel het DNA in een zeer compacte structuur is gevouwen, is het
lastig voor een TFO om te binden aan het DNA. In deze studie hebben we in eerste instantie ervoor
gekozen om het homologe recombinatie proces te onderzoeken in een model systeem waarbij
137
10
Chapter 10
Restrictie enzym
Restrictie enzym
2.
1.
- 3’
Zinc Finger
TFO
Correcte DNA sequence
+
Homologe recombinae
Gecorrigeerd gen
Figuur 2. Gencorrectie strategie voor de ziekte van Pompe. Het gebruik van een TFO of Zincvinger gefuseerd
aan een restrictie enzym zorgt ervoor dat het restrictie enzym alleen bij de mutatie een specifieke dubbelstrengs
breuk aanbrengt. De dubbelstrengs breuk wordt hersteld door middel van het proces homologe recombinatie
wanneer er een correct stuk DNA wordt aangeboden. Aangepast van A. Pingoud en G. Silva, Nature Biotechnology
2007. (zie voor kleuren figuur blz. 159)
plasmiden worden gebruikt. De experimenten laten zien dat de ontwikkelde humane TFO’s kunnen
binden aan hun specifieke DNA sequentie en na aflevering in de cel met behulp van SAINT kunnen
de TFO-fusies schade aanbrengen in het DNA. Verder is er een aanwijzing de TFO-fusies in staat
zijn om homologe recombinatie te bewerkstelligen op plasmide niveau. Deze resultaten geven de
potentie weer van “targeted nucleasen” en hun mogelijkheid om gen correctie toe te passen voor
de ziekte van Pompe. Het onderzoek beschreven in hoofdstuk 7 opent nieuwe deuren voor de
toekomst van de ziekte van Pompe.
CONCLUSIE
Voor de ziekte van Pompe is het van groot belang dat er nieuwe behandelmethodes ontwikkeld
worden. De huidige enzymvervangingstherapie geeft weliswaar een verbeterd leven van de
patiënt, de behandeling per patiënt wordt echter overschaduwd door de hoge kosten en doordat
er te weinig rhGAA op de markt is. Daarnaast leidt het niet tot een echte genezing van de ziekte.
138
Nederlandse samenvatting
De resultaten beschreven in dit proefschrift laten zien dat er nieuwe behandelmethodes mogelijk
zijn voor de ziekte van Pompe. Enerzijds is verbetering van de huidige therapie middels SAINT een
goed alternatief, anderzijds kan gen correctie met behulp van “targeted nucleasen” een nieuwe
strategie zijn om de ziekte daadwerkelijk te genezen. Het is noodzakelijk om de twee strategieën
verder te ontwikkelen en toekomstig onderzoek moet uitwijzen of de strategieën toepasbaar zijn
in een klinische setting.
10
139
140