Zwak- of variant-RhD-antigeen: eenvoudig serologisch te bepalen in
advertisement
o v e r z i c h t s a r t i k e l e n Zwak- of variant-RhD-antigeen: eenvoudig serologisch te bepalen in eigen laboratorium Auteurs J. Nigten, D.S. Orij-Westerhof, C.H. Noordzij en M.H. Herruer Trefwoorden zwak-RhD-antigeen, RhD-variant, RhD-epitopenkit Samenvatting Wanneer in het bloedtransfusielaboratorium van Medial bij de bepaling van het RhD-antigeen een reactiesterkte van 2+ of minder of een mixedfieldreactie wordt gezien, kan het zijn dat de patiënt een zwak RhD-antigeen of een RhD-variant heeft, of recentelijk getransfundeerd is. Het is belangrijk dat dit wordt uitgezocht aangezien patiënten met een RhD-variant, in tegenstelling tot mensen met een zwak RhD-antigeen, in staat zijn alloanti-RhD-antistoffen te vormen tijdens de zwangerschap en/of door een transfusie met RhD-positieve donorerytrocyten. Het onderscheid tussen een RhD-variant en een zwak RhD-antigeen kan op genetisch niveau worden vastgesteld. Echter, er zijn inmiddels ook RhD-epitopenkits op de markt waarmee serologisch kan worden vastgesteld of er sprake is van een zwak RhD-anti- Inleiding Normale RhD-positieve erytrocyten hebben een antigeendichtheid van tussen de 15.000 en 33.000 RhD-antigenen per cel.1 Wanneer in het bloedtransfusielaboratorium van Medial het RhD-antigeen van dergelijke erytrocyten wordt bepaald met een monoklonaal anti-RhD-reagens (automatische bepaling op de AutoVue Innova van Ortho Clinical Diagnostics) uit dit zich in een sterke reactie (een zogenoemde 3+- tot 4+-reactie) (zie Figuur 1B, op pagina 128). Wanneer erytrocyten veel minder antigenen op hun celmembraan tot expressie brengen, wordt gesproken van een zwak-RhD-antigeen.1 Bij bepaling van het RhD-antigeen uit dit zich doordat de reactie met monoklonaal anti-RhD-reagens zwakker is, dat wil zeggen niet meer dan een 2+-reactiesterkte, dan wel doordat er een mixed-fieldreactie wordt waargenomen. Mixed-fieldreacties worden gezien als er zowel RhD-negatieve als positieve ery- t i j d s c h r i f t v o o r b l o e d t r a n s f u s i e geen dan wel van een RhD-variant antigeen. In het bloedtransfusielaboratorium van Medial werden 2 RhD-epitopenkits van verschillende firma’s gevalideerd, waarmee onderscheid gemaakt kan worden tussen een zwak RhD-antigeen en een RhD-variant antigeen. Een aantal verschillende RhD-varianten kunnen zelfs worden gespecificeerd. De door Medial verkregen resultaten werden vergeleken met de resultaten van het serologischen genetisch onderzoek zoals verricht door het referentielaboratorium Erytrocytenserologie van Sanquin Diagnostiek. De uitkomst van bovengenoemde validatie is dat elk bloedtransfusielaboratorium met behulp van een RhD-epitopenkit onderscheid kan maken tussen een zwak RhDantigeen en een RhD-variant. De bepaling is eenvoudig, snel en goedkoper dan genetisch onderzoek. (Tijdschr Bloedtransfusie 2011;4:127-31) trocyten aanwezig zijn. Bij een verminderde expressie (zwak RhD) wordt in kolomtechnieken echter een vergelijkbaar patroon gezien. Het is niet duidelijk waardoor dit veroorzaakt wordt (zie Figuur 1C en 1D, op pagina 128). Het RhD-antigeen op erytrocyten met een verminderde expressie is niet anders dan het RhD-antigeen op erytrocyten met een normale expressie. Patiënten mogen in geval van bloedtransfusie of zwangerschap als RhD-positief beschouwd worden, aangezien er geen vorming van alloanti-RhD-antistoffen zal plaatsvinden.2,3 Wanneer het RhD-antigeen wel afwijkend is, dat wil zeggen wanneer het RhD-antigeen 1 of meer epitopen mist, spreken we van een RhD-variant.1 Net als bij een zwak RhD-antigeen kan dit zich, bij de bepaling van het RhD-antigeen, uiten in een zwakkeof mixed-fieldreactie. Er zijn echter uitzonderingen. De monoklonale anti-RhD-antistoffen die gebruikt worden voor de bepaling van het RhD-antigeen zijn vol. 4 nr. 4 - 2 0 11 127 o v e r z i c h t s a r t i k e l e n A B C D Figuur 1. Bepaling van het RhD-antigeen op erytrocyten met monoklonale anti-RhD-antistoffen met behulp van de AutoVue + Innova van Ortho Clinical Diagnostics. A) negatieve reactie, B) 4 -reactie, C) zwakke reactie, D) mixed-fieldreactie. bijvoorbeeld niet reactief met RhD-variant type DVI. Hierdoor worden patiënten met deze variant van het RhD-antigeen als RhD-negatief beschouwd (zie Tabel 1, monster 5).3 Het gebruik van dergelijke anti-RhD-antistoffen wordt aanbevolen in de CBOrichtlijn Bloedtransfusie.4 RhD-variant DVI wordt beschouwd als de belangrijkste RhD-variant, omdat deze variant vaker voorkomt dan andere RhDvarianten en mensen met deze RhD-variant relatief vaak alloanti-RhD-antistoffen vormen tegen de epitopen die bij henzelf ontbreken.3 Alle gebruikelijke commerciële anti-RhD-reagentia zijn daarom zodanig vervaardigd dat ze niet reactief zijn met RhDvariant type DVI. Naast bovengenoemde uitzondering is het ook zo dat andere RhD-varianten door de gebruikelijke commerciële anti-RhD-reagentia als RhD-positief kunnen worden aangetoond met een sterke (3+ tot 4+) reactie. De consequentie hiervan is dat deze patiënten niet herkend worden als RhDvariant en in geval van transfusie RhD-positieve donorerytrocyten ontvangen waarop zij mogelijk antiRhD-antistoffen gaan vormen. Het is niet mogelijk om met de gebruikelijke anti-RhD-reagentia alle patiënten met een RhD-variant als zodanig te herkennen. Hoewel de prevalentie niet hoog is, namelijk ongeveer 0,17% van de bevolking in een Canadees onderzoek, is er sprake van een niet onbelangrijk risico op het vormen van antistoffen met name als het gaat om vrouwen jonger dan 45 jaar.4 Zoals hierboven geschetst kan, in tegenstelling tot een patiënt met een zwak RhD-antigeen, een patiënt met een RhD-variant dus wel alloanti-RhD-antistoffen maken. De anti-RhD-antistoffen die gevormd kunnen worden zijn gericht tegen die epitopen die niet op de celmembraan van de erytrocyten van de patiënt zelf tot expressie worden gebracht. Om alloanti-RhD- 128 vol. 4 nr. 4 - 2 0 11 antistofvorming te voorkomen moeten patiënten bij wie de aanwezigheid van een RhD-variant wordt vastgesteld beschouwd worden als zijnde RhD-negatief. Dit geldt zowel in geval van bloedtransfusie als in geval van zwangerschap in verband met de toediening van anti-RhD-immunoglobuline. De bepaling van het RhD-antigeen bij pasgeborenen vormt een uitzondering. Voorkomen dient te worden dat pasgeborenen met een RhD-variant niet als zodanig herkend worden, in verband met het toedienen van anti-RhD-immunoglobuline aan RhDnegatieve moeders. De bepaling voor het vaststellen van het RhD-antigeen bij pasgeborenen wijkt daarom ook af van de bepaling voor het vaststellen van het RhD-antigeen bij andere patiënten.2-4 Doel van het onderzoek Aangezien een zwakke- of mixed-fieldreactie bij de bepaling van het RhD-antigeen, geen uitsluitsel geeft over een zwak RhD-antigeen of een RhD-variant is het raadzaam deze patiënten als zij een bloedtransfusie gaan ontvangen, te beschouwen als RhD-negatief, mits er recentelijk geen RhD-negatief bloed getransfundeerd is. Ook moet, ter preventie van RhD-immunisatie, een zwangere met een zwakke- of mixedfieldreactie bij de bepaling van het RhD-antigeen altijd beschouwd worden als zijnde RhD-negatief. Dit betekent echter dat indien zwakke reacties als negatief beschouwd worden er onnodig RhD-negatieve donorerytrocyten worden getransfundeerd en dat onnodig anti-RhD-immunoglobuline wordt toegediend, als de foetus RhD-positief wordt bevonden. De patiënt of de zwangere zal hier geen nadelige gevolgen van ondervinden, maar het spreekt voor zich dat het de voorkeur heeft om indien mogelijk in de eigen bloedgroep te transfunderen om het oneigenlijk gebruik van RhD- t i j d s c h r i f t v o o r b l o e d t r a n s f u s i e Tabel 1. In de tabel staan weergegeven de sterkte van de reacties van de RhD-bepalingen uitgevoerd met behulp van de AutoVue Innova van Ortho Clinical Diagnostics, de conclusie van de onderzoeken uitgevoerd door het referentielaboratorium Erytrocytenserologie van Sanquin Diagnostiek, en de resultaten zoals bepaald door Medial met behulp van de RhD-epitopenkit van Alba Bioscience en van DiaMed. Monster nr. Reactiesterkte AutoVue Sanquin Diagnostiek Alba Bioscience DiaMed 1 mixed-field zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD 2 mixed-field zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD 3 3+ DFR DFR DFR (meest waarschijnlijk) of DCS 4 2+ zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD 5 neg DVI DVI DVI 6 4+ DIV DIV DIV 7 mixed-field zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD 8 2+ DAR DOL DV, DFR of zwakke RhD 9 mixed-field DAR-E DAR-E DAR-E 10 4+ DAR DAR DAR 11 4+ DCM DOL DOL (meest waarschijnlijk) of DFR 12 4+ DVII DVII DVII 13 4+ DAR DAR DV of zwakke RhD 14 mixed-field zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD 15 mixed-field zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD 16 mixed-field zwakke RhD zwakke RhD zwakke RhD negatieve bloedproducten en anti-RhD-immunoglobuline zoveel mogelijk te beperken. Het bloedtransfusielaboratorium moet dan ook in staat zijn om, in geval van zwakke- of mixed-fieldreacties bij de bepaling van het RhD-antigeen of in geval van alloantiRhD-antistofvorming bij een RhD-positieve patiënt, uit te zoeken wat de oorzaak hiervan is. Natuurlijk wordt in eerste instantie bekeken of er geen sprake is van een RhD-positieve patiënt welke recentelijk getransfundeerd is met RhD-negatieve donorerytrocyten. Dit zou namelijk ook een verklaring kunnen zijn voor het vinden van een mixed-fieldreactie in de RhD-antigeenbepaling. Indien dit niet het geval is, is het wenselijk om een verschil te maken tussen RhDvarianten en zwakke RhD-antigenen. In dit artikel wordt de validatie van 2 RhD-epitopenkits beschreven die gebruikt kunnen worden voor dit onderzoek. Om in de praktijk de uitgifte van bloedproducten niet te vertragen worden RhD-negatieve bloedproducten getransfundeerd totdat de uitslag van het RhD-antigeenonderzoek bekend is. Validatie RhD-epitopenkits Materiaal en methode De RhD-epitopenkits van 2 verschillende firma’s, Alba Bioscience en DiaMed (Bio-Rad reagentia), t i j d s c h r i f t v o o r b l o e d t r a n s f u s i e werden gevalideerd. Met de kits werden 16 bloedmonsters getest. Deze monsters waren gedeeltelijk van onszelf; van Sanquin ontvingen we enkele monsters met een sterkere reactie zodat we de kits volledig konden valideren. Van de 16 monsters was de RhDtypering, i.e. zwak RhD-antigeen of RhD-variant antigeen, reeds bekend. De betreffende typeringen waren bij het referentielaboratorium Erytrocytenserologie van Sanquin Diagnostiek vastgesteld door serologisch onderzoek met een ‘in-house’ epitopenkit in combinatie met genetisch onderzoek (zie Tabel 1). Het verschil tussen de RhD-epitopenkit van Alba Bioscience en DiaMed zit in de methode. DiaMed levert de RhD-epitopenkit als een indirecte antiglobulinetest in een kolomtechniek, terwijl de RhD-epitopenkit van Alba Bioscience een indirecte antiglobulinetest in de buisjesmethode is. Beide firma’s hebben in hun RhD-epitopenkit 12 verschillende anti-RhDantistoffen die geproduceerd zijn door verschillende monoklonale anti-RhD-cellijnen. DiaMed geeft aan gebruik te maken van antistoffen die zijn geproduceerd met behulp van cellijnen afkomstig van Alba Bioscience.5,6 Resultaten Van de 16 geteste bloedmonsters is bij 7 monsters vol. 4 nr. 4 - 2 0 11 129 o v e r z i c h t s a r t i k e l e n Tabel 2. In de tabel staan de resultaten van een positieve en een negatieve RhD-controle. De sterkte van de reacties van de RhD-bepalingen uitgevoerd met behulp van de AutoVue Innova van Ortho Clinical Diagnostics en de resultaten zoals bepaald door Medial met behulp van de RhD-epitopenkit van Alba Bioscience en van DiaMed staan weergegeven. Controle Reactiesterkte AutoVue Alba Bioscience DiaMed neg (ccdee; rr) neg RhD-negatief RhD-negatief pos (CcDee; R1r) 4+ RhD-positief RhD-positief een zwak RhD-antigeen en bij 9 monsters een RhDvariant vastgesteld door het referentielaboratorium Erytrocytenserologie van Sanquin Diagnostiek. De volgende typen RhD-variantantigenen zijn vastgesteld: 3x DAR, 1x DAR-E, 1x DFR, 1x DIV, 1x DVI, 1x DVII en 1x DCM. Tabel 1 op pagina 129 geeft de resultaten weer zoals door Medial bepaald met de 2 verschillende RhD-epitopen-kits in vergelijking met de resultaten van het referentielaboratorium Erytrocytenserologie van Sanquin Diagnostiek. Alle monsters met een zwak RhD-antigeen konden met behulp van de RhD-epitopenkit van beide firma’s correct herkend worden als zwakke RhD-antigenen. Twee keer kon met de RhD-epitopenkit van DiaMed niet worden aangetoond welke RhD-variant het betrof en 2 keer kon niet worden vastgesteld of het een zwak- dan wel variant-RhD-antigeen betrof. Twee keer werd met de RhD-epitopenkit van Alba Bioscience een andere RhD-variant bepaald dan door het referentielaboratorium Erytrocytenserologie van Sanquin Diagnostiek. Om aan te tonen dat normale RhD-positieve en negatieve erytrocyten ook als zodanig worden bepaald met behulp van beide RhD-epitopen kits hebben we een positieve en negatieve controle toegevoegd aan deze validatie (zie Tabel 2). Discussie Met de RhD-epitopenkit van DiaMed kon voor 2 van de 9 RhD-varianten geen duidelijke conclusie worden getrokken of het een RhD-variant of een zwak-RhD-antigeen betrof. Echter, volgens het huidige beleid in ons laboratorium, waar bij reacties van 2+ of minder of mixed-fieldreacties nader onderzoek wordt ingezet, zou bij 1 van deze 2 monsters de oorspronkelijke RhD-bepaling geen aanleiding hebben gegeven om verder onderzoek uit te voeren aangezien er sprake was van een 4+-reactie. Dit monster zou dan als RhD-positief gerapporteerd worden. Mocht het RhD-antigeen verder uitgetypeerd zijn in verband met alloanti-RhD-antistofvorming bij een RhD-positieve patiënt, dan zou de aanwezigheid van een zwak-RhD-antigeen onwaarschijnlijk 130 vol. 4 nr. 4 - 2 0 11 zijn. Dit betekent dat met de RhD-epitopenkit van DiaMed bij 1 monster geen definitieve conclusie gerapporteerd kon worden. Aangezien de uitslag van de epitopenkit niet eenduidig was, zou het monster naar een referentielaboratorium verstuurd moeten worden voor nader onderzoek, eventueel ook met genetisch onderzoek. In 2 andere monsters kon met de RhD-epitopenkit van DiaMed niet de juiste variant worden vastgesteld. Eén keer kon een DFR niet met zekerheid worden benoemd en 1 keer kon een DCM niet juist benoemd worden. Met de RhD-epitopenkit van Alba Bioscience werd 2 keer een RhD-variant verkeerd benoemd. Eén keer werd een DAR benoemd als DOL en 1 keer werd een DCM benoemd als DOL. De DCM-variant is een nieuwe RhD-variant die op dit moment nog niet met de geteste RhD-epitopenkits correct herkend kan worden (persoonlijke communicatie met P.C. Ligthart, referentielaboratorium Erytrocytenserologie Sanquin Amsterdam). In de bijsluiters van beide RhD-epitopenkits staat beschreven dat, in tegenstelling tot een heterozygote RhD-variant DAR, bij een homozygote RhD-variant DAR 3 extra positieve reacties gevonden kunnen worden. Dit maakt het moeilijker om met deze epitopenkits in geval van een homozygote DAR het juiste type variant vast te stellen, zoals bij monster 8 het geval was. Alhoewel de 12 verschillende anti-RhD-antistoffen in de RhD-epitopenkits van de 2 verschillende firma’s afkomstig zijn van dezelfde 12 cellijnen, is het resultaat van de testen van de 2 verschillende firma’s niet hetzelfde.5,6 Blijkbaar is de gebruikte techniek, kolomtechniek of buisjesmethode, de verdunning van de antistoffen en het oplosmiddel van invloed op de reactiviteit van de monoklonale antistoffen. In feite is het voor een transfusiebehoeftige patiënt of een zwangere vrouw niet noodzakelijk om vast te stellen welk type variant het betreft. Als alleen gekeken wordt óf de RhD-epitopenkit onderscheid kan maken tussen een zwak-RhD-antigeen en een RhDvariant dan kunnen we concluderen dat, in tegenstelling tot de RhD-epitopenkit van DiaMed, de RhDepitopenkit van Alba Bioscience in alle gevallen het t i j d s c h r i f t v o o r b l o e d t r a n s f u s i e Aanwijzingen voor de praktijk 1. Het is belangrijk om vast te stellen of bij een patiënt sprake is van een zwak- dan wel variant-RhDantigeen in verband met de kans op alloanti-RhD-antistofvorming bij patiënten met een RhD-variant. 2. Het onderscheiden van een zwak-RhD-antigeen en een RhD-variant kan eenvoudig en goedkoop door elk bloedtransfusielaboratorium gedaan worden met behulp van een RhD-epitopenkit. 3. Door onderscheid te maken tussen een zwak-RhD-antigeen en een RhD-variant zal niet onnodig RhDnegatief bloed getransfundeerd worden of onnodig anti-RhD-immunoglobuline toegediend worden. juiste resultaat oplevert. Bovendien is de kit van Alba Bioscience goedkoper dan de kit van DiaMed. Feit blijft wel dat het niet mogelijk is om alle patiënten met een RhD-variant te herkennen aangezien RhD-varianten door de gebruikelijke commerciële anti-RhD-reagentia ook als RhD-positief kunnen worden aangetoond met een sterke (3+ tot 4+) reactie. In dergelijke gevallen zal door ons laboratorium geen nader onderzoek worden ingezet met behulp van een RhD-epitopenkit. Die varianten worden slechts aangetoond na onderzoek bij alloantistoffen anti-RhD. Het opsporen van alle RhD-varianten is in de praktijk een veel te dure aangelegenheid. Door middel van deze validatie zijn wij echter nu wel in staat om met behulp van eenvoudige serologische testen in plaats van dure genetische testen nader onderzoek uit te voeren in geval van vermoeden op de aanwezigheid van een zwak- dan wel variant-RhD-antigeen. Conclusie Als er aanwijzingen zijn voor een zwak-RhD-antigeen of voor een RhD-variant, dan is het belangrijk om dit uit te zoeken. Ten eerste om de kans op alloantiRhD-antistofvorming te voorkomen, bij RhD-varianten die als ‘mixed field’ reageren en ten onrechte RhD-positief genoemd worden. Ten tweede om niet onnodig RhD-negatief bloed te transfunderen en ten derde om niet onnodig anti-RhD-immunoglobuline toe te dienen, indien een zwakke RhD als negatief wordt bepaald. Door middel van bovengenoemde validatie laten wij zien dat elk regulier bloedtransfusielaboratorium met behulp van een RhD-epitopenkit onderscheid kan maken tussen een zwak-RhD-antigeen en een RhD-variant. De bepaling is eenvoudig en snel te verrichten en relatief goedkoop. Medial dankt het referentielaboratorium Erytrocytenserologie Sanquin Amsterdam voor het beschikbaar stellen van bloedmonsters. t i j d s c h r i f t v o o r b l o e d t r a n s f u s i e Referenties 1. Daniels G. Human Blood Groups, 2th ed. 2002;195-274. 2. De Wolf JT, Eindhoven GB. Transfusiegeneeskunde: Een praktische handleiding, 2007;44-46. 3. Overbeeke MA, Vreeswijk NJ, Ligthart PC, Meulenbroek AJ. Erytrocytenserologie, 3th ed. 2009; hfst 3 1-16. 4. Denomme GA, Wagner FF, Fernandes BJ, Li W, Flegel WA. Partial D. weak D types, and novel RHD alleles among 33,864 multiethnic patients: implications for anti-D alloimmunization and prevention. Transfusion 2005;45:1554. 5. Richtlijn Bloedtransfusie, 2011; 73-75. 6. Bijsluiter Alba Bioscience. Albaclone® Advanced partial RhD typing kit, 2007, Z293PI/04. 7. Bijsluiter DiaMed. DiaMed-ID Extended partial RhD typing set, B001461 ver. 05.10 en B001462 ver. 10.10. Ontvangen 7 september 2011, geaccepteerd 27 oktober 2011. Correspondentieadres Mw. dr. J. Nigten, klinisch chemicus i.o. Mw. D.S. Orij-Westerhof, operator bloedtransfusie laboratorium Mw. C.H. Noordzij, hoofd bloedtransfusielaboratorium Dhr. dr. M.H. Herruer, klinisch chemicus Medial diagnostische centra Postbus 231 2130 AE Hoofddorp Tel.: 023 545 63 22 E-mailadres: [email protected] Correspondentie graag richten aan Mw. D.S. Orij-Westerhof. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. vol. 4 nr. 4 - 2 0 11 131
