Bloedgroep

Bloedgroeptypering op DNA
Barbera Veldhuisen
Immunohematologie Experimenteel (IHE)
Immunohematologie Diagnostiek (IHD)
Sanquin Amsterdam
March 4, 2012 | 1
Typeren van bloedgroepen
Van belang bij:
• Transfusies
- patiënten
- donoren
voorkomen van transfusiereacties
• Prenatale diagnostiek
voorkomen van hemolytische ziekte
- zwangeren
van de foetus en pasgeborene (HZFP)
Bloedgroeptypering
Typering op erytrocyten
serologisch typering
rode bloedcellen
+
antistoffen tegen
bepaald antigeen
Typering op DNA
moleculaire typering
witte bloedcellen
voor
DNA isolatie
voorspelling van
fenotype
op rode bloedcellen
Bloedgroepen: verschillen in DNA
direct
Bloedgroep
antigenen
eiwit
mRNA
transcriptie
translatie
enzym
DNA
mRNA
Bloedgroep
antigenen
indirect
Genotypering
Serologie
Bloedgroep - polymorfismes
A
• Single nucleotide polymorphisms (SNP)
aminozuur verandering eiwit (b.v. Jka/Jkb)
B
• Verschillende haplotypes
verschil in functie van eiwit/enzym (b.v. ABO)
RHD
RHCE
RHD
• Genuitwisselingen (b.v. RH)
r’s allel ( (C)ces ) (3.6%)
• Gendeleties of nulmutaties (b.v. RHDneg of Fya/Fyb negatief)
gata
Fya/Fyb
RH bloedgroepsysteem
RHD gen
1
RHCE gen
10
10
1
chromosoom 1
D-negatief
RHD gen deletie
r’s allel - (C)cdes
RHD pseudogen - RHDΨ
International Society of Blood Transfusion (ISBT)
30 verschillende bloedgroepsystemen
MN
S
LU
LW
XG
GE
IN
KN
OK
SC
Lan
Jr(a)
CH/RG:
binding aan RBC
RH
JK
CO
XK
DI
GIL
RAPH
FY
RHAG
KEL
N
CROM
YT
DO
JMH
N
P1
C
N
C
Sanquin
GPI
N
ABO
H
LE
I
GLOB
C
Vel
At(a)
Emm
AnWj
Sd(a)
Pel
ABTI
MAM
DNA isolatie uit volbloed
• Centrifugeren van volbloed
Bloedplasma:
moederlijk en foetaal celvrij DNA
Buffy coat:
genomisch DNA
Rode bloedcellen:
serologische typering
Wanneer moleculair typeren (genotyperen)?
• Geen erytrocyten beschikbaar
– na transfusie
– na beenmerg- of stamceltransplantatie
– foetus
– positieve DAT
– sterke auto-agglutinatie
• Geen testreagentia
– b.v. Doa / Jsa
• Bij (zeldzame) varianten
– RHD varianten
– ABO varianten
– FY varianten
• Bij grote series
– b.v. bloeddonoren
Allelische discriminatie test
Genotypering d.m.v. allelische discriminatie (real-time PCR test)
DARC gen chromosoom 1
5'
3'
3'
5'
Fya
SNP
Fya/Fyb
Fyb
Real-time PCR test
Sample Name
Ct: C-test
Ct: c-test
CC controle
28,81
Und
CC controle
28,75
Und
cc controle
Und
26,75
cc controle
Und
26,70
Cc controle
29,18
27,25
Cc controle
28,95
27,36
NTC
Und
Und
NTC
Und
Und
Sample1
Und
26,90
Und
26,88
29,81
27,74
29,84
27,78
Sample1
cc
Sample2
Sample2
Cc
Wanneer moleculair typeren (genotyperen)?
• Geen erytrocyten beschikbaar
– na transfusie
– na beenmerg- of stamceltransplantatie
– foetus
– positieve DAT
– sterke auto-agglutinatie
• Geen testreagentia
– b.v. Doa / Jsa
• Bij grote series
– b.v. bloeddonoren
• Bij zeldzame varianten
– RHD varianten
– ABO varianten
– FY varianten
Casus: typeren zeldzame antigenen
• Vrouw
• Antistoffen tegen: Doa, Fya en K
• Anti-Doa: mogelijke afbraak erytrocyten
• Donor die Doa en Fya en K negatief is
• Serologische typering Fya en K van donoren mogelijk
• Geen commercieel anti-Doa reagens
→ genotyperen van donoren (SNP in ART4 gen chr12)
d.m.v. allelische discriminatie test
Casus: typeren van zeldzame antigenen
• Genotypering donoren: selectie compatibele donoren mogelijk
• Inmiddels groot aantal donoren getypeerd voor Doa en Dob
• Vergelijkbare situatie voor Jsa
• Genotypering i.p.v. fenotypering i.v.m. ontbreken reagens
Wanneer moleculair typeren (genotyperen)?
• Geen erytrocyten beschikbaar
– na transfusie
– na beenmerg- of stamceltransplantatie
– foetus
– positieve DAT
– sterke auto-agglutinatie
• Geen testreagentia
– b.v. Doa / Jsa
• Bij grote series
– b.v. bloeddonoren
• Bij zeldzame varianten
– RHD varianten
– ABO varianten
– FY varianten
Grootschalige genotypering
• Grootschalige genotypering voor grote series:
- Veel monsters; veel bloedgroepantigenen in 1 test typeren
- Per test voor elk monster veel antigenen tegelijkertijd
B.v. Bloodchip (IDCore+) Progenika
BLOOD
GROUP
RhCE
Kell
Kidd
Duffy
MNS
Diego
Dombrock
Colton
Cartwright
GENOTYPES
Cx, Cw, C, c, E, e, r´´s, ceAR
K, k, KPA, KPB, Kmod-1, JSA, JSB
JKA, JKB, Jknull(IVS5-1G>A), Jknull
(871T>C)
FYA, FYB, FyGATA, Fyx
M, N, S, s, GYPB del, GYPB(230C>T),
GYPB(IVS5+1G>A),
GYPB(IVS5+5G>T), GpMur
DIA, DIB
PHENOTYPES
Cx, Cw, C, c, E, e, VS
K, k, Kpa, Kpb, Kmod-1, Jsa,
Jsb
Jka, Jkb
Fya, Fyb
M, N, S, s, U, Mia
Dia, Dib
DOA, DOB, HY, JO
Doa, Dob, Hy, Joa
COA, COB
Coa, Cob
YTA, YTB
Yta, Ytb
Van DNA tot uitslag 5-6 uur
IDcore+ results
genotype
fenotype
Grootschalige bloedgroepgenotypering
Anti- SNPs Duur
genen
MNS, RHCE
24
18
96 samples in
LU, KEL, FY, JK, DI,
5 uur
DO, CO, SC, LW
Platform
Bedrijf
Array
Beadchip
BioArray
Solutions,
USA
Beads
BLOODchip
IDCore+
Progenika
Biopharma
Spain
Glass
Beads
ABO, MNS, RHD,
RHCE KEL, FY, JK,
DI, DO, CO
47
34
>200
20 samples/10 uur Avent et al.
96 samples/5 uur 2007
GenomeLab
SNPstream
19
12
384 samples in
36 uur
GenomeLab
SNPstream
Beckman
384 wells MNS, RHD, RHCE,
Coulter, USA plate
KEL, FY, JK, DI
HPA1
Beckman
384 wells MNS, RHCE, KEL,
Coulter, USA plate
FY, JK, HPA1,2 en 5
22
12
600,000 genotypes Montpetit et al.
per dag
2006
Luminex
xMAP
Luminex
Corp., USA
16
8
2 x 96 samples in 1 Karpasitou et al.
dag per bloedgroep 2008
Beads
Bloedgroepen
MNS, KEL, FY, JK,
CO, LU
Referentie
Hashmi et al.
2005, 2007
Denomme et al.
2005
Wanneer moleculair typeren (genotyperen)?
• Geen erytrocyten beschikbaar
– na transfusie
– na beenmerg- of stamceltransplantatie
– foetus
– positieve DAT
– sterke auto-agglutinatie
• Geen testreagentia
– b.v. Doa / Jsa
• Bij grote series
– b.v. bloeddonoren
• Bij (zeldzame) varianten
– RHD varianten
– ABO varianten
– FY varianten
Casus: typeren van RHD variant
• Vrouw, 27 weken zwanger
• Serologisch: RHD negatief
• Foetale RhD typering positief
(celvrij DNA plasma)
• Ct exon 5: 34 / 35 / 34
• Ct exon 7: 28 / 28/ 29
• Real-time PCR moeder (buffy coat)
• positief voor exon 7
• negatief voor exon 5
• Heeft deze zwangere een RhD variant?
→ Genotyperen voor definitieve RhD bepaling
MLPA
Multiplex ligation-dependent probe amplification
mutatie 1
genomisch
DNA
PCR primer
paren
mutatie 2
A
G
T
T
mutatie-specifieke probes
mutatie 1
hybridisatie
probes
stuffer sequentie
variabele lengte
mutatie 2
ligatie
genomisch
DNA
amplificatie met
fluorescent gelabelde
PCR primer paren
Totale tijd 20 uur:
16 uur hybridisatie
2 uur hands-on time
MLPA RHD / RHCE gen
D
C
C
D
C
D
D
C
C
C
D
C
C C
DC
C
D
C
D
C
D D
C
C
D
C
C
CC
C
D
C
C
CC
D/CE
DC
C
c controle
probes
CE C
D
D
D
D D
CC
C
CC
CC
D/CE
RhD/CE
specifieke
probes
D negatief
RHD gen
afwezig
Casus: typeren van RHD variant
MLPA results
Sample:
676C: 0 copies
676G: 2 copies
C:
0 copies
514A: 0 copies
M609A: 1 copy
ee
cc
pseudogene
pseudogene
Control sample: Dd cc Ee
pseudo
gene
C
pseudo
gene
ee
MLPA: RHD zygotiebepaling
cc DD EE
Oranje: controle monster (Dd)
Blauw: test monster
1x
controle pieken
2x
D
C
C
D
D
D
D
C
C
CE
Test monster heeft 2 RHD genen
RhD pieken
geen mutatie
pieken
Voor- en nadelen genotypering
• Typering uit te voeren als er geen erytrocyten beschikbaar zijn
• Typeringen mogelijk bij tekort aan serologische reagentia
• Typering van varianten mogelijk
• Typering van grote aantallen mogelijk
• Prenatale typering mogelijk
• Genotype is voorspelling van het fenotype:
• Het missen van nulmutaties geeft een foutieve typering
• Geen probleem voor donoren, wel voor ontvangers
• Duur???
Ideaal: combinatie serologie en genotypering
Wat is er nu mogelijk?
• D
• CcEe
• D zygotie
•
•
•
•
•
K1K2
FYAB + GATA-box
JKAB
MN
Ss
• DOAB
• JSAB
•
•
•
•
•
•
•
•
•
HPA 1
HPA 2
HPA 3 / 9
HPA 4 / 16
HPA 5
HPA 6 / 7
HPA 12
HPA 13
HPA 15
•
•
•
•
HNA 1
HNA 3
HNA 4
HNA 5
Hoe snel kan het???
• Meeste typeringen kunnen in 1 werkdag!
• Spoed: gestreefd naar 1 werkdag.
• Geen spoed: binnen een week schriftelijke uitslag
Acknowledgements
Sanquin IHD:
Goedele Cheroutre
Peter Ligthart
Bernadette Bossers
Johan Koster
Remco Jonkers
Sacha Jansen
Sonja de Jong
Ahmed Tissoudali
Esther Ormskerk-Mochtar
Roos Schreuder
Tony van Beijeren
Margriet Vredeveld
Peter Kooyman
Mirjam Liberman
Heleen Woortmeijer
Masja de Haas
Sanquin IHE
Lonneke Wigman
Peter Scheffer
Ellen van der Schoot
MRC-Holland (MLPA)
Martin Loden
March 4, 2012 | 28