Western blot principe

Borreliose.nl - Informatie over de ziekte van Lyme en andere tekeninfecties
Western blot principe
Laatst geupdate Thursday 12 January 2006
We weten dat er verschillende sloten op de bacteriecel kunnen voorkomen en zodoende passen er ook verschillende
sleutels op. Nu zijn er precisiesloten en sloten die minder nauwkeurig zijn. Net als thuis zijn er sloten waar wél een
andere sleutel inpast, hoewel men deze niet kan omdraaien en de betere sloten waarin slechts de juiste sleutel past.
In de Western blot is het nu de bedoeling de verschillende antigenen naar hun grootte te bepalen. Dit wordt als volgt
gedaan. Op een plaat van polyacrylamide brengt men onderaan een bacteriesuspensie aan van de B. burgdorferi stam
en sluit daar een elektrische stroom op aan. De antigenen worden nu gescheiden door middel van electroforese, een
elektrische scheidingsmethode om eiwitten van elkaar te scheiden naar hun grootte. De verschillende antigenen hebben
een verschillende molecuulmassa MM. De techniek noemt men SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide
Gel Electroforese)
Stel dat men een groep kinderen ieder een ballon geeft, maar deze zijn allemaal verschillend van grootte. Ze worden
allemaal te gelijkertijd opgelaten. Als men na een bepaalde tijd een foto maakt dan ziet men de ballonnen op
verschillende hoogte, maar sommige die bijna even groot zijn zijn nog op dezelfde hoogte. Om het verschil goed te
kunnen zien moeten we nog wat wachten, echter als we te lang wachten, dan zijn de verschillen wel goed te zien, maar
de hele grootte ballonnen zijn dan al uit het gezicht verdwenen en zijn op de foto niet meer zichtbaar. Dus we maken een
foto als we de grootste net nog kunnen zien, hierdoor zullen sommige kleinere misschien moeilijk in grootte van elkaar te
onderscheiden zijn. Door de electroforese wordt het mengsel van eiwitten uit elkaar getrokken en na en bepaalde tijd
krijgt men de toestand vergelijkbaar met de ballonnen, het eiwit met de grootste MM boven en die met de kleinste MM
onderaan.
De door de electroforese gescheiden antigenen, die nu netjes op een rijtje liggen volgens hun grootte, worden nu
overgebracht (blotting) op een nitrocellulose membraan en gefixeerd. Dit overbrengen van de PAGE op de nitrocellulose
plaat gaat met electroforese en noemt men dotblotting. Hierna wordt deze strip in contact gebracht met het verdunde
serum waarin de antilichamen zich bevinden. Deze hechten zich vervolgens aan de antigenen op de blotstrip en de niet
gebonden antigenen wast men weg, waarna een secondair antilichaam met enzym wordt toegevoegd en vervolgens een
kleurstofbehandeling die de complexen (slot-sleutel-label) zichtbaar maken. Deze verschijnen als een band op de plaat
en door gelijkertijd een monster met bekende monoklonale antilichamen mee te laten lopen weet men wat de banden
voorstellen. De duidelijkheid van de banden in een bepaalde verdunning geven een beperkt inzicht in de onderlinge
concentraties van de antilichamen aanwezig in het monster. De antigenen hebben verschillende namen zoals, OspA,
OspB, OspC, flagellin enz. De daarbij horende antilichamen (sleutels) duidt men aan met de letter "p" van proteïne en
een cijfer wat de MM aangeeft in kiloDalton kD. Zo is het antilichaam van OspA p31, het antilichaam van OspB is p34,
het antilichaam van OspC is p23 en het antilichaam van flagellin is p41. Nu is flagellin een slot waar misschien ook wel
een andere sleutel inpast, maar die men dan vervolgens niet kan omdraaien, dus een valse sleutel. Dit flagellin is niet
een specifiek antigeen en het kan voorkomen dat antilichamen aangemaakt voor andere infecties hiermee een
verbinding aangaan b.v. de antilichamen van EBV of CMV. Dit noemt men dan een kruisreactie. Echter de antilichamen
p18, p22-23(OspC), p31(OspA) en p34(OspB), p39 en p83/93 kunnen uitsluitend aan Borrelia-antigenen gekoppeld
worden en zijn dus zeer specifiek. Schematische voorstelling van een Western blot. Verschillende Borrelia antigenen
gefixeerd op een plaat, waaraan verdund serum wordt toegevoegd. De antilichamen hechten zich aan de antigenen.
Niet-gebonden antigenen worden weggewassen.
Toevoegen van het secondaire antilichaam met enzym.
Hiet-gebonden complexen worden weggewassen en kleurbehandeld.
Positieve banden worden zichtbaar.
Voorbeeld van een Western blot
Voorbeeld van een immunoblot (IgG) van het serum van een patiënt met ACA, score is hoofdzakelijk tegen B.afzelii.
B.b.ss. = B. burgdorferi sensu stricto VS215;
B.a. = B. afzelii VS461;
B.g. = B. garinii VS102;
B.v. = B. valaisiana VS116.
http://www.borreliose.nl
_PDF_POWERED
_PDF_GENERATED 18 July, 2017, 21:47
Borreliose.nl - Informatie over de ziekte van Lyme en andere tekeninfecties
Animatie van een electroforese.
http://www.borreliose.nl
_PDF_POWERED
_PDF_GENERATED 18 July, 2017, 21:47