Practicum bacteriologie

Practicum bacteriologie
1. Wat is een reincultuur?
Een cultuur bestaande uit 1 afzonderlijke kiem
Het afzonderen van een reincultuur gebeurt dr het afnemen van een afzonderlijk liggende kolonie
uit een mengcultuur en uitgestreken op een voedingsbodem. Dikwijls gebeurt het ook dr kweek op
een selectieve voedingsbodem.
2. Waarom is een reincultuur van belang bij de identificatie van een micro-organisme?
Een klinisch monster bevat verschillende soorten micro-organismen, dit levert problemen bij de
identificatie.
Als de identificatie gebeurt aan de hand van biochemische eigenschappen, leidt het samengaan van
verschillende eigenschappen tot de bepaling van het mogelijk organisme. Indien die biochem eig
veroorzaakt worden door verschillende organisme in het monster is een identificatie onmogelijk.
3. Wat is een bloedagar en waarvoor kan deze gebruikt worden?
Een bloedagar is een rijke voedingsbodem (TSA) aangerijkt met 5% gedefribrineerd paarde- of
schapebloed. Deze voedingsbodem is geschikt voor het kweken van allerlei kiemen.
Deze bodem is rood met een nt-doorzichtige bodem.
Aan de hand van deze bodem kunnen de hemolytische eigenschappen van de micro-organismen
(universele bodem) bepaald worden.
Alfa
groen: gedeeltelijke hemolyse
Beta
heldere halo: volledige hemolyse
Gamma
gn hemolyse
Catalase-vorming kan nagegaan worden door een druppel H2O2 oplossing aan te brengen op de
groei. Een duidelijke en onmiddellijke opbruising van O2 wijst op een positieve reactie.
Deze platen knn aëroob of anaëroob geïncubeerd worden.
In het practicum is deze voedingsbodem gebruikt voor het nagaan van microbiële contaminatie op
vingers.
4. Waarvoor wordt agar gebruikt?
Agar is een stollingsagens. Door aan een voedingsbodem agar toe te voegen, verkrijgt men een
vaste voedingsvodem. Dit is noodzakelijk voor de isolatie van een specifieke kiem.
Agar wordt niet afgebroken dr medisch belangrijke kiemen.
Het heeft merkwaardige thermische eigenschappen van surfusie.
Smelt slechts bij t°> 95°
Blijft vloeibaar tot +/- 40°
 het is mogelijk bacteriën in de gesmolten bodem te mengen vooraleer deze uit te gieten
 men kan deze als vaste gel incuberen bij hogere temperaturen (thermofiele bact)
5. Waarom is agar een interessant stollingsagens?
Agar wordt niet afgebroken dr medisch belangrijke kiemen.
Het heeft merkwaardige thermische eigenschappen van surfusie.
Smelt slechts bij t°> 95°
Blijft vloeibaar tot +/- 40°
 het is mogelijk bacteriën in de gesmolten bodem te mengen vooraleer deze uit te gieten
 men kan deze als vaste gel incuberen bij hogere temperaturen (thermofiele bact)
Het is commercieel verkrijgbaar in poedervorm.
6. Welk algemeen schema dient men te volgen voor bacteriologisch onderzoek van een
klinisch staal?
1 staalname
2 transport
3 ontvangst
4 testen
A rechtstreeks aantonen vd causale kiem
1 Een eerste microscopisch onderzoek
- kiemen alsook andere elementen visualiseren
- voorlopige diagnose te stellen
- microbiologische diagnose te oriënteren & te evalueren
2 kweek: isolatie ve kiem
 identificatie
macroscopisch onderzoek
microscopisch onderzoek
biochemische identificatie
serologische of immunologische identificatie
3 antigeendetectie (gn kweek nodig)
4 moleculair-biologische technieken
DNA hybridisatietechnieken
PCR
B onrechtstreeks aantonen causale kiem met serologische kiemen (AB opsporen)
7. Wat is een selectieve voedingsbodem? Geef enkele voorbeelden.
Een selectieve voedingsbodem is een bodem die selectief werd gemaakt dr het toevoegen van
selectieve inhibitoren (vb antibiotica & galzouten)
 hierdoor zullen slechts 1 of enkele welbepaalde soorten microörganismen op deze
voedingsbodem groeien
MacConkey agar (Mc)  selectief voor gram –, aerobe staafjes (= meest voorkomende urinaire
pathogenen)
W rood bij lactose fermentatie (dr aanw lactose en pH indicator)
Lactose-neg kolonies zijn kleurloos
 bevat galzouten en kristalviolet
 coprocultuur
MSA = mannitol salt agar: rode doorzichtige bodem
 selectief voor stafylokokken dr hoge zoutconcentratie
 mannitol met fenolrood als indicator
Vergisting mannitol: pH daalt  geel
Gn mannitol vergisting:  roze
Lowensteïn bodem
 mycobacteriën
Differentiatie tss M tuberculosis & atypische mycobacteriën
8. Wat is een differentiële voedingsbodem? Geef een voorbeeld.
9. Waarvoor wordt een MSA bodem gebruikt?
MSA = mannitol salt agar: rode doorzichtige bodem
 selectief voor stafylokokken dr hoge zoutconcentratie
 mannitol met fenolrood als indicator
Vergisting mannitol: pH daalt  geel S aureus
Gn mannitol vergisting:  roze
S epidermis
10. Wat is een pseudomycelium?
Sommige fungi nemen een pseudo-hyphae structuur aan. Wanneer deze in een massa bijeenliggen
krijg je een pseudomycelium.
In feite zijn dit geëlongeerde cellen als gevolg van een extreme vorm van budding.
Een voorbeeld hiervan is Candida Albicans.
11. Hoe kan men beweeglijke bacteriën herkennen?
 microscopisch onderzoek van een vers preparaat
actieve beweging onderscheidt zich van passieve beweging omdat de levende cellen
in alle richtingen bewegingen
 flagella-kleuring omgeeft de flagellen zodanig met kleurstof dat ze binnen het oplossend
vermogen van de lichtmicroscoop vallen
 flagellen zijn zichtbaar onder EM
 indol-mobiliteits bodem
diffuse groei (dus nt enkel steeklijn): licht troebel in gans de bodem: beweeglijk
12. Wat is een differentiatiekleuring? Geef een voorbeeld.
Differentiatie bacteriën naargelang hun reactie op kleuring

gram-kleuring

o paars: gram+
o rood: gramonderscheiden dikwandige (veel peptidoglycaan) van dunwandige bacteriën
Ziehl-Neelsen kleuring
o Rood: zuurvaste bacterie
o Blauw: nt-zuurvaste cellen (geassocieerde flora & ontstekingscellen)
13. Waarvoor wordt de Ziehl–kleuring gebruikt?
Gebruikt om zuurvaste cellen van nt-zuurvaste te onderscheiden
Zuurvast:
- mycobacteriën
M tuberculosis
M leprae
- Nocardia
- sommige corynebacteriën
14. Hoe kan men Gram–positieve bacteriën onderscheiden van Gram–negatieve?
 gram kleuring
1 uitstrijken inoculum in druppeltje water
2 drogen en fiweren
3 kleuring
1 kristalviolet 1min
2 spoel met water
3 lugol 1min
4 spoel met water
5 ontkleur met ethanol (10tal s)
6 spoel onmiddellijk met water
7 eosine 30s
8 spoel met water
9 droog
4 onderzoek met microscoop
Immersie-olie
paars +
rood  groei op MacConcey agar (enkel gram-)
15. Hoe kan men sporulatie nagaan?
Opsporen keratine-achtige proteïne laag?
maar bacteriën in omstandigheden brengen die tot sporulatie leiden (arme voedingsbodem)
daarna een bactericiede behandeling doorvoeren die nt sporocide werkt
en je 'sporen' dan terug in een gunstige omgeving brengen en kijken of je terug kolonie'tjes krijgt?
16. Hoe kan men Mycobacterium tuberculosis onderscheiden van andere Mycobacteriën?
Door groei op Lowensteïnbodem
M tuberculosis
atypische mycobacteriën
Groeisnelheid
10-14 dagen
soms op enkele dagen
Pigment
ivoor-kleurig
soms oranje-geel
Microscopisch uitzicht koord-vorming
onregelmatig geordenende staafjes
17. Staphylococcus aureus is te onderscheiden van Staphylococcus epidermis. Hoe?
Bloedplaat:
S aureus:
goudgele kolonies
beta hemolyse op bloedagar
S epidermis: porceleinwitte kolonies
MSA:
S aureus:
vergist mannitol
gele bodem
S epidermis: vergist mannitol nt
roze bodem
DNA-plaat:
S aureus:
+ HCl: heldere halo rond bact: bezit DNase
S epidermis: + HCl: volledig troebel: gn DNase
Tube-test:
Plasma + stafylococcen cultuur: incubatie
S aureus:
verstijving plasma dr aanw coagulase
S epidermis: gn verstijving
Slide test: coagulase bepaling
Dr FW op draagglas; hierin groei van cultuur
 meng een entoog met plasma in de suspensie
S aureus:
klompvorming (<30s)
S epidermis: gn klompvorming: CNS
18. Wat is coagulase? Welke bacterie kan men met behulp van deze test identificeren?
Identificatie stafylococcys aureus: onderscheiden pathogene en nt-pathogene (CNS) stafylococcen
 enzyme dat zorgt voor verstijving plasma
Tube-test:
Plasma + stafylococcen cultuur: incubatie
S aureus:
verstijving plasma dr aanw coagulase
S epidermis: gn verstijving
Slide test: coagulase bepaling clumping test
Dr FW op draagglas; hierin groei van cultuur
 meng een entoog met plasma in de suspensie
S aureus:
klompvorming (<30s)
S epidermis: gn klompvorming: CNS
19. Noem een snelle test om Stafylococcen te onderscheiden van Streptococcen.
 microscopie
Voorkomen als keten of als tros
20. Welk gas wordt er gevormd wanneer men waterstofperoxide in contact brengt met
catalase?
2H2O2  2H2O + O2
zuurstof
21. Wat is een MIC? Op welke wijze kan deze worden bepaald?
Minimale inhiberende concentratie
Bepaling aan de hand van een antibiogram (vgl diffusie of vgl dilutiemethode): laatste buisje dat
gn groei meer vertoont
22. Wat is een titer? Hoe wordt deze bepaald?
Titer bepaald ahv complement fixatie reactie (nt gedaan bij pract bact)
AB + AG  vormt complex
Op dit complex kan complement binden
1
2
3
4
5
6
serum verwarmen zodat eigen complement geïnactiveerd w
serum + antigeen
toevoegen gekende hoeveelheid complement
op laten gaan reactie met Ag & fixatie complement
toevoegen hemolytische systeem (SRBC + hemolysine/anti-rbc-IgG)
hemolyse:
nog ongebonden complement aanw: gn CF AB
gn hemolyse: alle complement op: aanw CF AB
Laatste conc met volledige inhibitie hemagglutinatie = titer
23. Volgens welke twee methoden kan men de gevoeligheid testen van een bacterie voor
antibiotica?
Uitvoering antibiogram volgens diffusie methode
Diffusie antibioticum vanaf schijfjes
Conc > MIC: heldere halo
Conc = MIC: rand halo
Conc < MIC: volgroeid
Uitvoering antibiogram volgens dilutie methode
Glc bouillon met fenolindicator & dalende hoeveelheden antibioticum
MIC = laatste buisje z groei & verzuring
24. Hoe ontstaat een inhibitiezone? Hoe interpreteert men deze?
De inhibitiezone is de zone rond het antibioticum plaatje waar gn bact gegroeid zijn.
Zijn doormeter geeft samen met het gebruikte antibioticum ahv regressiecurve een idee van de
gevoeligheid van de bact voor het antibioticum
MIC < GPC:
gevoelig
GPC < MIC < HPC:
intermediair
HPC < MIC:
resistent
25. Wat is een serologische identificatie? Waarom kan deze belangrijk zijn?
Identificatie ahv specifieke antistoffen tegen antigenen van bact. Dergelijke antistoffen w gebruikt
om binnen een zelfde soort “serotypes” te onderscheiden.
Vb identificatie E coli serotype dr agglutinatie met gekende antistoggen
Meeste enterobacteriaceae knn onderscheiden w in verschillende serotypen.. (belangrijke
antigenen: O, B/K, H)  bep serotypen speciale pathogene eigenschappen:
Belang antigenische analyse
26. Geef enkele voorbeelden van biochemische identificatiemethoden.
1 Glucose-fenolrood bouillon
Geel
glucose vergist
Rood glucose nt vergist
Gasbel in Durhambuisje
vergist met gasvorming
2 Lactose-fenolrood-bouillon
Geel
glucose vergist
Rood glucose nt vergist
3 Ureum-fenolrood bouillon
Paars urease pos
Geel
urease neg
4 Fenylalanine-malonaat-bouillon
A malonaat-assimilatie
Malonaat als E bron: pH stijgt: broomthymolblauw: groen  blauw
B fenylalanine-deaminatie
Deaminatie fenylala  vorming fenylpyrodruivenzuur
Fenylpyrodruivenzuur + ferri-ionen in zuur midden: groene verkleuring
Diepgroen
pos
Geel
neg
5 Indol-mobiliteitsbodem
A H2S: zwarte verkleuring loodacetaat papier
B mobiliteit
C indol-productie vanaf tryptofaan
Indol + Kovacs  Resindol
Rood pos
Geel
neg
6 Kligler-bodem
A stomp geel  glc vergisting
B gasproductie: gasbellen of barsten
C helling geel  lactose vergisting
D zwarte neerslag: H2S productie
27. Bij de identificatie van welke bacteriën wordt een Kligler–bodem gebruikt? Welke
biochemische eigenschappen kan met deze bodem nagaan?
* glucose vergisting
* gasproductie (CO2)
* lactose vergisting
* H2S
 differentiatie enterobacteriën
28. Wat is een enteropathogene coli–bacil? Hoe wordt deze geïdentificeerd?
EPEC = enteropathogene escherichia coli
 epidemische diarree bij zuigelingen in ziekenhuizen
 ontwikkelingslanden belangrijke oorzaak van mortaliteit
Serologische identificatie
 agglutinatie bij toevoeging anti-E coli van bepaald serotype
29. Wat is een Durham–buis?
Buisje in bodem glucose-fenolrood-bouillon voor aantonen gasproductie)
30. Hoe stelt men de laboratoriumdiagnose voor buiktyfus?
Widal reactie  nt adequaat
Coprocultuur, hemocultuur & urinecultuur
 titerbepaling AB tegen S typhi
Verdunningsreeks serum + gekende hoeveelheid antigeen: kijk nr agglutinatie
Tegen O-antigeen (sterke binding):
fijnkorrelig
Tegen H-antigeen:
grofvlokkig
31. Waarvoor wordt de Widal–reactie gebruikt? Hoe moet men deze interpreteren?
Widal reactie  nt adequaat
Coprocultuur, hemocultuur & urinecultuur
 titerbepaling AB tegen S typhi
Verdunningsreeks serum + gekende hoeveelheid antigeen: kijk nr agglutinatie
Tegen O-antigeen (sterke binding):
fijnkorrelig
Tegen H-antigeen:
grofvlokkig
Titer: laatste serumverdeling met nog een zichtbare agglutinatie
O antistoffen: groter diagnostisch belang, volgen beter klinisch verloop ziekte
H antistoffen: blijven langer aantoonbaar

Widal reactie moet tweemaal uitgevoerd w met 7à10d tss
32. Hoe wordt de Dnase en coagulasetest uitgevoerd?
COAGULASE
 enzyme dat zorgt voor verstijving plasma
Tube-test:
Plasma + stafylococcen cultuur: incubatie
Coagulase+
verstijving
Coagulase-:
gn verstijving
Slide test: coagulase bepaling clumping test
Dr FW op draagglas; hierin groei van cultuur
 meng een entoog met plasma in de suspensie
Coagulase+
klompvorming (<30s)
Coagulase-:
gn klompvorming
DNA-ASE
DNA-plaat: overnacht bact op gegroei
Bact met DNase breek aanw DNA in bodem af (depolymeriseert)  gn neerslag DNA meer mog
DNase+:
+ HCl: heldere halo rond bact gn DNA neerslag
DNase-:
+ HCl: volledig troebel
DNA neerslag
33. Door een eenvoudige enting kan men aërobe bacteriën onderscheiden. Verklaar.
Enting in vloeibare thioglycolaat bodem
Bovenaan: rose zone (resazurine) O2 aanw
Eronder: gn O2 aanw
Thioglycolaatmedium bevat thioglycollaat als reducerende stof
O2 verwijder dr opkoken
Terugdiffusie O2 vermeden dr viscositeit medium (agar O,5%)
Lokatie groei bacterie vertelt zijn verhouding met O2
Enkel bovenaan:
aëroob
Overal:
facultatief anaëroob
Enkel onderaan:
anaëroob
34. Waarvoor wordt de Coombs–test aangewend? Geef het principe van deze test.
= directe antiglobuline test
Opsporen incomplete antistoffen
1 meng in hemolysebuisje 2druppels antiglobulineserum met 1dr ve driemaal gewassen
erythrocytensuspensie
2 centrifugeer 1min
3 macroscopische aflezing dr lostikken sediment

Rhesus factor
35. Hoe kan de aanwezigheid van antistoffen in een serum worden nagegaan door een
complement–fixatie reactie?
AB + AG  vormt complex
Op dit complex kan complement binden
1
2
3
4
5
6
serum verwarmen zodat eigen complement geïnactiveerd w
serum + antigeen
toevoegen gekende hoeveelheid complement
op laten gaan reactie met Ag & fixatie complement
toevoegen hemolytische systeem (SRBC + hemolysine/anti-rbc-IgG)
hemolyse:
nog ongebonden complement aanw: gn CF AB
gn hemolyse: alle complement op: aanw CF AB
36. Waaruit bestaat een hemolytisch systeem bij de complementfixatiereactie?
Schapen RBC en hemolysine (anti-rbc-IgG) (complement ontbreekt)
37. Wat betekent de inactivatie van een serum? Wat is het belang hiervan bij de
complement–fixatie reactie?
 30min aan 56° (dacht ik)
38. Hoe kweekt men anaërobe bacteriën?
enten op bloedagar
 in anaërobe container
 + O2 verwijderend systeem (Gaspak (Becton Dickinson))
Voldoende water bij
Natriumborohydride + H2O  H2
2H2 + O2  2H20 (palladium katalysator)
 onmiddellijk sluiten container
Controle: methyleenblauw indicatorstrip