GarciaPinoNed

Regulatie van gen transcriptie is het mechanisme dat cellen toelaat zich aan te passen aan snel
veranderende omstandigheden in de omgeving. In prokaryoten zijn genen typisch geclusterd in operons en
wordt het operon als een geheel gereguleerd. Toxine-antitoxine (TA) modules, die een rol spelen in stress
fysiologie, zijn voorbeelden van zulke operons. TA modules komen veelvuldig voor op bacteriële
chromosomen en worden in verband gebracht met de vorming van persisters en het fenomeen van
multidrug resistentie.
In de regulatie van het phd/doc toxine-antitoxine operon van bacteriofaag P1 treedt het toxine Doc op als
zowel co-repressor of derepressor van de transcriptieregulator en antitoxine Phd en is de activiteit van Doc
afhankelijk van zijn verhouding met Phd. Dit fenomeen, hetwelk tot nu toe niet kon worden verklaard op
moleculair niveau, heet `'conditionele co-operativiteit`'.Binding van Doc op het intrinsiek ontvouwen Cterminale uiteinde van Phd structureert het DNA-bindingsdomein van Phd, wat dit tot het eerste
experimenteel geverifiëerde voorbeeld maakt van allosterische koppeling tussen twee (partieel)
ontvouwen domeinen.
In dit werk bepaalde ik de moleculaire basis van de inhibitie van het toxine Doc door het toxine Phd. Dit
neutralisatieproces gebeurt via de binding van Phd in een groef op het oppervlak van Doc. Tijdens deze
binding structureert het C-terminale domain van Phd zich in een gebogen -helix. deze -helix
complementeert de FIC fold van Doc. Op basis van een combinatie van X-straal kristallografie en SAXS
experimenten kan een model worden voorgesteld dat transcriptie-regulatie van het phd/doc operon via
conditionele co-operativiteit verklaart. De transcriptie regulator Phd van de phd/doc TA module komt
voor in een evenwicht tussen twee toestanden: n waar het N-terminale DNA bindingsdomein volledig
gevouwen en actief is en waar dit domein gedeeltelijk ontvouwen is en de DNA bindingsplaats niet
gevormd. Het C-terminale gedeelte waar Doc bindt is in beide toestanden intrinsiek ontvouwen.
Binding van Phd op Doc of op operator DNA leidt tot een gelijkaardige structurering van het N-terminale
domein van Phd zoals werd geobserveerd via DSC en CD metingen alsook in de kristalstructuur van het
Phd/Doc complex. EMSA en ITC experimenten werden gebruikt om aan te tonen dat Doc de affiniteit van
wild-type Phd verhoogt voor diens operator DNA, maar dat dit niet gebeurt voor een aantal mutanten die
nochtans even goed Doc herkennen als wild-type Phd. Deze mutanten ontkoppelen dus Doc binding en
regulatie van de DNA bindende activiteit van Phd.
Het intrinsiek ontvouwen C-terminale segment van Phd bindt in de kristalstructuur van het Phd/Doc
complex op twee afzonderlijke en structureel niet verwante sites, en neemt hierbij twee verschillende
conformaties aan. Via deze interacties wordt een Phd2-Doc-Phd2 sandwich gevormd die leidt tot cooperativiteit tussen de twee Phd bindingsplaatsen op het operator DNA. Beide bindingssites vertonen een
verschil van een factor 100 in affiniteit, en competitie tussen deze twee sites kan het fenomeen van
conditionele co-operativiteit verklaren in termen van een uitwisselingsmechanisme.
Dit mechanisme is wordt verder ondersteund door in vivo en in vitro experimenten die gebruik maken van
punt mutanten van Doc. Deze experimenten toonden aan dat beide sites noodzakelijk zijn voor transcriptie
regulatie maar dat slechts één van de twee sites nodig is om de ribosoominhibitie door Doc te
neutraliseren. Ik toonde voor de eerste maal aan hoe de binding van een co-represor op een intrinsiek
ongestructureerd segment van een transcriptieregulator een (her)structurering kan induceren in een
verschillend domein van deze regulator. Het gaat hier dus om een nieuw transcriptioneel
regulatiemechanisme dat waarschijnlijk algemeen van toepassing is op alle toxine-antitoxine modules.