GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T
advertisement
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2008 - 2009 GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T-CELLEN Willem STAELS Promotor: Prof. Dr. Bart Vandekerckhove Scriptie voorgedragen in de 2de Proef in het kader van de opleiding tot ARTS FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2008 - 2009 GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T-CELLEN Willem STAELS Promotor: Prof. Dr. Bart Vandekerckhove Scriptie voorgedragen in de 2de Proef in het kader van de opleiding tot ARTS “De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.” Datum (handtekening student (en)) (handtekening promotor) (Naam student) (Naam promotor) Ik wil graag een woord van dank richten aan: Prof. Dr. Vandekerckhove, voor de geboden mogelijkheid, voor het enthousiasme en de vriendelijkheid. Stefanie Van Coppernole, voor de begeleiding, de uitleg, de tips, de vele verbeteringen van mijn voorlopige versies, voor het geven van moed en opbouwende kritiek. Imke Velghe, Frank Timmermans, Tessa Kerre en alle andere vriendelijke mensen op het labo. Mijn ouders, aan wie ik meer te danken heb dan aan wie ook. Liesbeth Micholt, die een deel van mezelf geworden is. Niké Vanderpoorten, steun en toeverlaat, vriendin voor het leven. De jongens van Meerbeke en Jan-Willem vanzelfsprekend ook. Mijn vrienden en familie. Dankjewel! Inhoudstafel ABSTRACT........................................................................................................................................................... 1 INLEIDING........................................................................................................................................................... 2 1. 2. 3. 4. T-CEL ONTWIKKELING BIJ DE MENS ........................................................................................................... 2 1.1. De specificiteit van een T-cel wordt bepaald door zijn TCR........................................................... 2 1.2. T-cel ontwikkeling bij de mens ........................................................................................................ 3 T-CEL ONTWIKKELING: IN VITRO EN IN VIVO STUDIEMODELLEN ................................................................ 5 2.1. Het SCID-hu Thy/Liv injectie muismodel........................................................................................ 6 2.2. SCID-hu Thy/Liv hanging drop model ............................................................................................ 6 2.3. Het OP9-DL1 cultuursysteem ......................................................................................................... 7 HET IMMUUNSTELSEL, TUMOREN EN IMMUNOTHERAPIE ........................................................................... 7 3.1. Het immuunstelsel en tumoren ........................................................................................................ 7 3.2. Immunotherapie .............................................................................................................................. 9 PROJECTBESCHRIJVING EN KADER ........................................................................................................... 11 4.1. Kader............................................................................................................................................. 11 4.2. Doelstelling ................................................................................................................................... 11 4.3. Bijdrage van de verschillende betrokkenen................................................................................... 12 METHODOLOGIE ............................................................................................................................................ 14 1. 2. GENEREREN VAN MELANA SPECIFIEKE T-CELLEN .................................................................................. 14 1.1. Constructie van retrovirale vectoren ............................................................................................ 14 1.2. Transductie van HSC .................................................................................................................... 16 SCID-HU THY/LIV INJECTIE MODEL ........................................................................................................ 16 2.1. Maken van het studiemodel ........................................................................................................... 16 2.2. Verzamelen van geproduceerde cellen.......................................................................................... 16 3. SCID-HU THY/LIV HANGING DROP MODEL.............................................................................................. 17 4. FLOWCYTOMETRISCHE ANALYSE ............................................................................................................ 17 4.1. Monoklonale antilichamen en tetrameren..................................................................................... 17 4.2. Buffers, labeling en flowcytometers .............................................................................................. 18 5. NEGATIEVE ISOLATIE MET BEHULP VAN MAGNETISCHE BEADS............................................................... 18 6. BUFFY COATS EN MONONUCLEAIRE CELLEN ............................................................................................ 19 7. CMV KLOON ........................................................................................................................................... 19 8. CELAANTALLEN BEPALEN VIA EEN BÜRKER TELKAMER.......................................................................... 20 RESULTATEN ................................................................................................................................................... 21 1. GENEREREN VAN MELANA SPECIFIEKE T-CELLEN .................................................................................. 21 1.1. 2. Constructie van retrovirale vectoren ............................................................................................ 22 VOORBEREIDING ANALYSE GEGENEREERDE T-CELLEN ........................................................................... 23 2.1. Optimalisatie van tetrameerkleuring door bepalen van ideale buffer voor kleuring .................... 23 Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen i 2.2. 3. Testen van de tetrameerkleuring op T-cel klonen ......................................................................... 26 ANALYSE VAN GEGENEREERDE T-CELLEN .............................................................................................. 26 3.1. SCID-hu Thy/Liv injectie model .................................................................................................... 26 3.2. SCID-hu hanging drop model ....................................................................................................... 35 DISCUSSIE ......................................................................................................................................................... 38 1. RESULTATEN VAN HET ONDERZOEK ........................................................................................................ 38 2. RISICO’S VAN GETRANSDUCEERDE T-CELLEN ......................................................................................... 40 3. VOORUITZICHTEN EN IMMUNOTHERAPIE IN BREDER PERSPECTIEF........................................................... 41 REFERENTIELIJST.......................................................................................................................................... 44 Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen ii Abstract Immunotherapie kent in huidig toegepaste vormen slechts matig klinisch succes. Een verklaring ligt mogelijks in de negatieve selectie van autologe hoog-affiene tumorspecifieke T-cellen in de thymus. Om de correctheid van deze hypothese te toetsen en om oplossingen voor de hiermee gepaard gaande therapeutische moeilijkheden te vinden, werden voor deze thesis studiemodellen gecreëerd om tumorspecifieke T-cellen te genereren. Om de T-cel specificiteit te richten werden hematopoiëtische stamcellen (HSC) getransduceerd met de genen coderend voor de TCRα en TCRβ keten van een antigeenspecifieke T-cel receptor (TCR) via retrovirale vectoren. Cytomegalovirus (CMV), HA2 en MelanA specifieke TCR werden gebruikt in de experimenten. Om getransduceerde HSC te laten uitrijpen tot T-cellen werden ze ingebracht in SCID-hu Thy/Liv injectie modellen en SCID-hu Thy/Liv hanging drop modellen met verschillende HLA achtergronden om positieve en negatieve selectie te bestuderen. De transductiestatus van de verkregen T-cellen werd geanalyseerd via flowcytometrie. Vervolgens werd de specificiteit van de T-cellen uit de experimenten met efficiënte transductie flowcytometrisch geanalyseerd met behulp van tetrameerkleuringen. Uit onze resultaten bleken onverwachte hindernissen in de productie van antigeenspecifieke Tcellen. T-cellen getransduceerd met de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR bleken in onze modellen deze TCRβ keten maar in de helft van de gevallen te gebruiken voor de assemblage van hun TCR. Cellen die zowel met de TCRα als de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR getransduceerd waren, bleken niet steeds deze antigeenspecificiteit te bezitten. In 4 van de 34 muizen uit het SCID-hu Thy/Liv model was transductie erg geslaagd. Op deze muizen werden tetrameerkleuringen gedaan om de specificiteit van de genereerde Tcellen na te gaan. Dit leverde gemiddeld 14,68% tetrameer positieve, dus antigeenspecifieke, T-cellen op binnen de TCRαβ getransduceerde cellen. Deze successen wijzen op het potentieel van de techniek, maar de overstap naar het therapeutisch gebruik van de gegenereerde tumorspecifieke T-cellen is nog niet voor de nabije toekomst gezien de vrij inefficiënte productie. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 1 Inleiding 1. T-cel ontwikkeling bij de mens Het menselijk lichaam wordt voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Ons lichaam beschikt over een aantal verdedigingsmechanismen om infecties door die micro-organismen te voorkomen en tegen te gaan. Het eerste verdedigingsmechanisme is de barrière gevormd door de mechanische, chemische en microbiële eigenschappen van huid en slijmvliezen. Het tweede verdedigingsmechanisme wordt gevormd door het immuunsysteem. Binnen het immuunsysteem kan een onderscheid gemaakt worden tussen een aangeboren (aspecifieke) en een verworven (specifieke) component. De aangeboren immuniteit vormt de frontlinie tegen pathogenen die erin geslaagd zijn door huid of slijmvliezen heen te dringen. Zij heeft de eigenschap snel te kunnen ageren, maar herkent enkel frequent voorkomende pathogenen en dit op een aspecifieke manier. De verworven immuniteit daarentegen wordt gekenmerkt door een trage, maar specifieke immuunrespons. Bovendien wordt er een geheugen gevormd, waardoor bij een tweede contact met eenzelfde pathogeen de immuunrespons sneller optreedt. De hoofdrolspelers binnen de verworven immuniteit zijn de B- en de T-cellen. Het feit dat deze een uiterst specifiek antwoord kunnen geven op quasi elke vreemde entiteit is een kenmerk dat wordt toegeschreven aan hun antigeenreceptoren, respectievelijk de immunoglobulines en de T-cel receptoren (TCR). Naast haar rol in de afweer tegen pathogenen speelt de verworven immuniteit ook een rol bij het herkennen en opruimen van ‘afwijkende’ cellen (viraal geïnfecteerd, allogeen, tumoraal) (Janeway et al., 2005). T-cellen spelen in het bijzonder een belangrijke rol in het herkennen en bestrijden van tumoren. Het is op dit aspect van de immunologie dat deze thesis zich focust. 1.1. De specificiteit van een T-cel wordt bepaald door zijn TCR Een T-cel kan antigenen slechts herkennen wanneer deze op een celoppervlak gepresenteerd worden in de vorm van een MHC : peptide complex. De major histocompatibility complex (MHC) moleculen zijn glycoproteïnen gespecialiseerd in het presenteren van lichaamsvreemde of lichaamseigen peptiden op het celoppervlak. Iedere TCR heeft een specificiteit die bepaald wordt door de combinatie van een antigen (peptide) en een MHC type. De enorme diversiteit aan specificiteit die gegenereerd kan worden binnen het TCR repertoire, ontstaat door een ingenieus systeem van genherschikking. Er zijn 4 TCR loci met 4 gelijknamige polypeptide producten (α, β, γ en δ) die 2 types heterodimeren (α:β en γ:δ) Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 2 kunnen vormen. Elke TCR locus heeft V (variable), J (joining) en C (constant) segmenten en de β en δ locus hebben ook D (diversity) segmenten. Specifieke V, D (bij β en δ) en J segmenten worden samengevoegd tijdens het herschikkingsproces en vormen zo een volledig V-coderend domein met een nabijgelegen C domein. Bovendien zorgt de willekeurige additie van nucleotiden tussen de V, D en J segmenten (N region addition) voor extra diversiteit. Voor de αβ TCR zijn zo’n 10^15 combinaties mogelijk, voor de γδ TCR zo’n 10^18 (Davis and Bjorkman, 1988). 1.2. T-cel ontwikkeling bij de mens T-cellen ontstaan, net zoals alle cellulaire elementen van het bloed, uit hematopoiëtische stamcellen (HSC) (Blom and Spits, 2006). De self-renewal van HSC en de differentiatie in erythroïde, myelomonocytaire en B-lymfoïde cellijnen wordt gedreven door stromale cellen in het beenmerg. Deze zijn echter niet in staat om T-cel differentiatie te ondersteunen (Spangrude et al., 1988). Vanuit het beenmerg migreren CD34+ HSC naar de thymus. In de thymus herschikken deze hun TCR genen en worden ze CD1+ en CD4+, dit is het stadium van de CD4+ immature single-positive (CD4ISP) cellen. In dit stadium hebben ze nog de mogelijkheid te differentiëren tot αβ T-cellen of γδ T-cellen. De volgende stap is de opregulatie van één van de twee CD8 ketens, namelijk CD8α, de cellen worden early double positive (EDP). Nadien gaan ze ook CD8β opreguleren en worden ze double positive (DP). Cellen die er in slagen eerst TCRγδ te herschikken zullen verder differentiëren tot γδ T-cellen. Cellen die eerst TCRβ kunnen herschikken ondergaan β-selectie, d.w.z. dat de cellen die een TCRβ keten hebben die kan associëren met een pre-TCRα (pTα) keten uitgeselecteerd worden voor verdere differentiatie tot αβ T-cellen. Ze krijgen een signaal om TCRβ, TCRγ en TCRδ genherschikking te stoppen, gaan sterk prolifereren en na proliferatie gaan ze TCRα herschikken. Volgens Spits (2002) begint β-selectie reeds in het CD4ISP stadium en loopt het door tot in het DP stadium en is het als dusdanig niet absoluut geassocieerd met CD4 of CD8 expressie. Na succesvolle TCRα herschikking, associeert de TCRα keten met de TCRβ keten en ondergaan de cellen positieve selectie. Cellen die in staat zijn te interageren met selfpeptides gepresenteerd in een MHC op thymus epitheel cellen (TEC) zullen verder differentiëren tot CD4+ single positive cellen (CD4SP) of CD8+ single positive cellen (CD8SP). Indien deze interactie niet lukt gaan ze verder met herschikkingen op de TCRα locus, heeft dit niet tijdig een functionele TCR tot gevolg dan zullen de cellen sterven. Tot in dit stadium speelt het proces zich af in de cortex van de thymus. Vanaf het CD4SP, CD8SP stadium zullen de cellen migreren naar de medulla. Hier zullen cellen die met een hoge Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 3 affiniteit binden op self-peptide : MHC complexen negatief geselecteerd worden. Deze laatste interactie speelt zich vermoedelijk af op antigen presenterende cellen (APC) in de thymus, al is hier discussie over (Spits, 2002). Uiteindelijk komen de T-cellen in de periferie waar ze geactiveerd kunnen worden na het herkennen van een peptide : MHC complex op professionele APC. Professionele APC verzamelen antigenen in beschadigde weefsels. Deze eiwitten worden d.m.v. proteasomen afgebroken tot korte peptiden die gepresenteerd worden in MHC moleculen. Deze worden dan herkend door CD4SP T-helpercellen (indien gepresenteerd op MHC klasse II) of cytotoxische CD8SP T-cellen (indien gepresenteerd op MHC klasse I). De APC migreren naar de dichtstbijzijnde lymfeklier en presenteren daar de peptide : MHC complexen in combinatie met de juiste alarmsignalen aan de T-cel. Pas als een T-cel ‘zijn’ antigeen herkent in combinatie met de juiste alarmsignalen wordt ze geactiveerd (Janeway et al., 2005). Grofweg zijn 2 types reactie mogelijk: CD8SP cytotoxische T-cellen zullen de ‘afwijkende’ cel na herkenning doden, CD4SP T-helpercellen zullen stoffen uitscheiden die de immuunrespons van andere onderdelen van het immuunstelsel aansturen (Janeway et al., 2005) (figuur 1). De meeste informatie over de hematopoiëse bij de mens is afkomstig uit in vitro studies (Blom and Spits, 2006). Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 4 Figuur 1. T-cel ontwikkeling bij de mens. Zelfhernieuwende HSC zitten in het beenmerg. Deze stamcellen differentiëren tot precursoren, waarvan enkelen migreren naar de thymus. Daar genereren deze naast NK cellen en γδ T-cellen voornamelijk αβ T-cellen. De αβ T-cellen worden gegenereerd vanuit immature cellen die hun TCRβ genen herschikken, β-selectie ondergaan, TCRα herschikken, positieve en negatieve selectie ondergaan en uiteindelijk differentiëren tot mature thymocyten. Deze thymocyten verlaten de thymus als naïeve T-cellen en gaan naar de periferie. HSC = hematopoiëtische stamcellen, PP = pluripotente precursor, MP = myeloïde precursor, CLP = common lymphoid progenitor, NK = natural killer cell, B = B-cel, T/NK = T-cel/NK-cel precursor, preT = T-cel precursor, ISP4+ = immature single positive CD4+ cell, EDP = early double positive cell, DP = double positive CD4+CD8+ cell, SP4+ = mature single positive CD4+ cell, SP8+ = mature single positive CD8+ cell, γδ = γδ T-cel (figuur gebaseerd op Plum, 2000). 2. T-cel ontwikkeling: in vitro en in vivo studiemodellen Er zijn een aantal experimentele modellen beschreven voor het in vitro en in vivo genereren van mature humane T-cellen uitgaande van hematopoiëtische precursorcellen afkomstig uit foetale lever, navelstrengbloed, kinderthymus of beenmerg. Drie gebruikte modellen worden besproken: het Severe Combined Immune Deficiency-human fetal Thymus / fetal Liver (SCIDhu Thy/Liv) injectie muismodel, het SCID-hu hanging drop model en het OP9-Delta Ligand 1 (DL1) cultuursysteem. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 5 2.1. Het SCID-hu Thy/Liv injectie muismodel De Severe Combined Immune Deficiency-human (SCID-hu) muis is geconstrueerd als preklinisch in vivo model voor de analyse van humane fysiologie en pathofysiologie (McCune et al., 1988). Het SCID-hu fetal Thymus / fetal Liver (Thy/Liv) injectie model reproduceert de differentiatie en functie van humane hematopoiëtische precursorcellen in de humane thymus. Bij deze in vivo benadering worden kleine fragmenten van humane foetale lever en humane foetale thymus samen geïmplanteerd onder het nierkapsel van een SCID muis. De zware immuundeficiëntie van deze SCID muis zorgt ervoor dat een dergelijke greffe niet wordt afgestoten. De HSC die aanwezig zijn in het foetale leverfragmentje gaan migreren naar het foetale thymusfragmentje en na 8 weken aanleiding geven tot de uitgroei van een humaan thymusorgaantje. Dit orgaantje vormt een gespecialiseerde micro-omgeving om humane T-cel differentiatie te bestuderen (McCune, 1996 ; Namikawa et al., 1990). De muizen kunnen in dit stadium bestraald worden om de aanwezige HSC uit te schakelen en zo plaats te maken voor HSC van e.g. een ander haplotype, of in het geval van deze thesis met HSC die getransduceerd zijn met een bepaald gen (e.g. een TCR keten), waarvan men T-cel ontwikkeling wil bestuderen (Verhasselt et al., 1999). 2.2. SCID-hu Thy/Liv hanging drop model Het SCID-hu Thy/Liv hanging drop model is een nieuw model ontwikkeld om getransduceerde HSC te laten uitrijpen tot T-cellen. In essentie is het model een adaptatie van het Fetal Thymus Organ Culture (FTOC) model. Het FTOC model is het oudste in vitro studiemodel voor T-cel differentiatie (Kingston et al., 1985 ; Jenkinson et al., 1982). Het is ontwikkeld vanuit de idee dat voor T-cel maturatie de driedimensionale structuur van het thymusweefsel onontbeerlijk was (Kingston et al., 1985). In ons gemodificeerd model werden humane foetale lever CD34+ cellen getransduceerd met de genen coderend voor een TCR. Deze cellen werden in hanging drop gebracht met humane foetale thymus. Een hanging drop cultuur of ‘hangende druppel cultuur’ is een cultuur waarin het te kweken materiaal geïnoculeerd wordt in een druppel vocht die hangt aan een omgedraaide holte. De humane foetale thymi werden geïncubeerd met de getransduceerde humane foetale lever CD34+ cellen in een hanging drop cultuur en de hieruit verkregen orgaantjes werden dan getransplanteerd onder het nierkapsel van een SCID muis. Het voordeel van dit model t.o.v. het SCID-hu Thy/Liv injectie model is de belangrijke tijdswinst die het oplevert. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 6 2.3. Het OP9-DL1 cultuursysteem In de zoektocht naar essentiële moleculaire interacties in de generatie van T-cellen werden de Notch receptor en zijn liganden ontdekt. Er is een belangrijke rol voor Notch aangetoond in verschillende stadia van T-cel ontwikkeling (Maillard et al., 2005). Notch receptor stimulatie in precursorcellen met zowel B-cel als T-cel potentieel leidt tot het induceren van T-cel differentiatie en het inhiberen van B-cel differentiatie. De OP9 stromale cellijn is afkomstig van het beenmerg van macrophage colony stimulating factor (M-CSF) - deficiënte osteopetrosis muizen (op/op). Na transductie van deze cellijn met het Notch ligand Delta-like 1 (DL1), krijgt de cellijn de capaciteit volledige T-cel differentiatie te ondersteunen en verliest ze de capaciteit B-cel differentiatie te ondersteunen (Schmitt and Zúñiga-Pflücker, 2002 ; Schmitt and Zúñiga-Pflücker, 2006). 3. Het immuunstelsel, tumoren en immunotherapie 3.1. Het immuunstelsel en tumoren Naast haar rol in de afweer tegen micro-organismen speelt de verworven immuniteit en vooral het T-cel compartiment ook een rol bij het herkennen en opruimen van ‘afwijkende’ cellen zoals tumorcellen. T-cellen kunnen hiervoor 2 types antigenen herkennen: tumor-specific antigens (moleculen uniek voor tumorcellen) of tumor-associated antigens (moleculen die zowel op tumorcellen als op niet-levensnoodszakelijke ‘normale’ cellen tot expressie komen en moleculen die discrepant met het ontwikkelingsstadium van de patiënt tot expressie komen op tumorcellen). Wanneer het immuunstelsel in contact komt met een tumor zijn 3 uitkomsten mogelijk: eliminatie van de tumor, evenwichtssituatie met de tumor of tumor escape (de groei van tumorvarianten die immunologische destructie weerstaan of systemische / lokale onderdrukking van de immuniteit door de tumor) (Finn, 2008 ; Janeway et al., 2005). De rol van het immuunstelsel in de controle over tumoren wordt duidelijk aan de hand van volgende bevindingen : - Enerzijds zijn gevallen van spontane tumorregressie beschreven bij immuuncompetente patiënten. Anderzijds wordt een toegenomen incidentie van tumoren gevonden bij immuungecompromiteerde patiënten (Blattman and Greenberg, 2004). De voornaamste tumoren die we in de immuungecompromiteerde populatie Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 7 zien, zijn non-Hodgkin lymfomen bij HIV geïnfecteerde patiënten, bij transplantatie patiënten en bij mensen met primaire immuundeficiënties; Kaposi sarcoma bij HIV geïnfecteerde patiënten en non-melanoma huidkanker bij transplantatie patiënten (Mueller, 1999). - Tumor-immuniteit kan worden aangetoond in proefdiermodellen. Muizen met bepaalde immuunstoornissen vertonen een toegenomen vatbaarheid voor spontane en geïnduceerde tumoren, terwijl veel van deze tumoren worden afgestoten wanneer ze getransplanteerd worden naar immuuncompetente muizen (Shankaran et al., 2001 ; Dunn et al., 2004). - Een accumulatie van immuuncellen op de tumor site is geassocieerd met een betere prognose (Zhang et al., 2003). Met weefsel microarrays is aangetoond dat een hoge densiteit van CD8+ effector memory T-cellen in het tumorparenchym geassocieerd is met een betere overleving (Pages et al., 2005). - Bij meer dan 300 patiënten met hepatocellulair carcinoom is aangetoond dat de ziektevrije en algemene overleving beter is bij tumoren met een lager aantal regulator T-cellen (Gao et al., 2007). Regulator T-cellen zijn een subset van CD4+ T-cellen die de ontwikkeling van een specifieke immuunrespons tegen self-antigens, in het bijzonder self-tumor-antigens, tegenwerken via de secretie van immunosuppressieve cytokines als IL-10 of via directe inhibitie van APC (Zou, 2006). De rol van het immuunstelsel in de controle over tumoren werd bevestigd door de therapeutische successen van behandelingen die het immuunstelsel betrekken in hun werkingsmechanisme: - In patiënten met relaps van hematologische maligniteiten na allogene stamceltransplantatie zijn donor lymfocyt infusies standaardtherapie geworden, resulterend in duurzame en volledige remissie bij vele patiënten (Dazzi et al., 2000 ; Lokhorst et al., 2000). - Stamceltransplantatie zonder dat de T-cellen verwijderd zijn uit de stamcelpopulatie geeft soms een betere prognose, ondanks een hogere kans op Graft-versus-Host Disease (Asai et al., 1998). De ultieme bevestiging van de rol van het immuunstelsel in de controle over tumoren werd gegeven door het succes van verschillende vormen van immunotherapie. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 8 3.2. Immunotherapie Immunotherapie bij kanker tracht gebruik te maken van de uitzonderlijke kracht en specificiteit van het immuunstelsel voor de behandeling van maligniteiten. Er zijn reeds vele tumor antigenen beschreven en het is dus belangrijk om een aantal criteria voorop te stellen waaraan tumor antigenen moeten voldoen vooraleer zij als doel voor klinisch onderzoek kunnen gebruikt worden. Algemeen kunnen de interessante peptiden geïdentificeerd worden via hun capaciteit tumorspecifieke T-cellen in vitro te expanderen (Finn, 2008). Als eerste criterium moet een immuunrespons tegen het tumor antigen een tumordodende capaciteit hebben zonder normale, levensnoodzakelijke cellen aan te vallen. Het tweede criterium betreft de status van het antigen in de tumor en de vatbaarheid ervan voor mutatie en dus tumor escape. Derde criterium, een brede toepasbaarheid van de therapie gericht op het antigen d.w.z. dat meerdere tumoren van een bepaald type of verschillende types tumoren doelwit kunnen zijn van dezelfde therapie (Finn, 2008). Er zijn verschillende strategieën beschreven binnen de immunotherapie. Men maakt een onderscheid tussen passieve en actieve immunotherapie. Bij passieve immunotherapie worden de effectorantilichamen / effectorcellen zelf geïnjecteerd in de patiënt. De opties hierbij zijn het toedienen van monoklonale antilichamen gericht tegen tumor antigenen (e.g. Trastuzumab voor de therapie van HER2+ mammacarcinoom, Retuximab bij B-cel lymfoom) en het toedienen van in vitro gekweekte of geëxpandeerde autologe T-cellen. Treffende toepassingen van dit laatste zijn beschreven in fase 1 studies door Yee et al. (2002) en Mackensen et al. (2006). Yee et al. (2002) slaagden erin bij 8 op 10 patiënten met metastatisch melanoom een regressie van de metastasen te bekomen na injectie met CD8SP T-cellen specifiek voor de melanoma antigenen MelanA en glycoproteïne100. Deze antigeenspecifieke CD8SP T-cellen werden bekomen door perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) te verzamelen uit iedere patiënt. Via stimulatie met MelanA of glycoproteïne100 beladen dendritische cellen werden binnen de PBMC selectief de antigeenspecifieke T-cellen geëxpandeerd. De klonen die specifieke lyse toonden werden geselecteerd, geëxpandeerd en gebruikt voor de studie. Mackensen et al. (2006) toonden binnen een populatie van 11 melanoma patiënten 1 volledige en 1 partiële regressie na therapie met MelanA specifieke T-cellen. Deze cellen werden verkregen door in vitro stimulatie van CD8SP perifeer bloed lymfocyten met autologe dendritische cellen waarop een HLA-A2 bindend MelanA peptide werd aangeboden. Ex vivo- Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 9 geëxpandeerde melanoominfiltrerende lymfocyten die samen met IL-2 werden toegediend na cytoreductieve therapie leidden tot klinische respons in tot 50% van de geëvalueerde patiënten (Dudley et al., 2002 ; Robbins et al., 2004). De meest recente toepassing is het transduceren van autologe perifeer bloed T-cellen met een MelanA-specifieke TCR afkomstig uit sterk reactieve tumor infiltrating lymfocyten. Morgan et al. (2006) bereikten hiermee regressie van lever en longhilus metastasen bij 2 op 16 patiënten met gemetastaseerd melanoom. Deze twee patiënten waren 2 jaar later ziekte-vrij (Rosenberg et al., 2008). Recent zijn TCR met een veel hogere affiniteit geïdentificeerd en deze worden momenteel geëvalueerd in klinische trials (Rosenberg et al., 2008). De resultaten van deze studies zijn echter beperkt en de kosten en moeite die met gepersonaliseerde cellulaire therapie gepaard gaan kunnen gezondheidseconomisch onverantwoord lijken. Hierbij een belangrijke kanttekening : dit zijn fase 1 studies, bij patiënten met progressieve, therapieresistente ziekte. Onder deze ongunstige omstandigheden zijn zelfs marginale resultaten belangrijk (Finn, 2008). Naast de passieve immunotherapie is er ook actieve immunotherapie. Hierbij stimuleert men het immuunsysteem van de patiënt in zijn reactie tegen de tumor d.m.v. kankervaccins (Gattinoni et al., 2006). De meest gebruikte technieken zijn: vaccins met peptiden afkomstig van tumor antigenen, vaccins met dendritische cellen gepulseerd met tumor antigenen, vaccins met autologe tumorcellen en tumorlysaat, vaccins met allogene tumorcellen en tumorlysaat, vaccins met genetisch gemodificeerde tumorcellen en vaccins met heat shock proteins (Disis et al., 2009). Het nadeel van passieve immunotherapie is dat tumorspecifieke cellen reeds aanwezig moeten zijn in de patiënt voor de aanvang van de therapie. Als er geen cellen zijn om te stimuleren, kan deze therapie niet lukken. Tot slot is er de integratie van immunotherapie in huidige standaardtherapieën. Dit is, in het bijzonder voor de kankervaccins (actieve immunotherapie), een uitdaging omwille van de immunosuppressieve effecten van de meeste standaardtherapieën (Finn, 2008). Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 10 4. Projectbeschrijving en kader 4.1. Kader Dit project kadert binnen onderzoek naar het verder ontrafelen van de humane T-cel ontwikkeling en het gebruiken van verworven en bestaande inzichten voor klinische toepassingen. Het laboratorium onder leiding van Prof. Dr. J. Plum van het Departement voor Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie van het Universitair Ziekenhuis Gent heeft mij de mogelijkheid geboden een bijdrage te leveren aan hun ononderbroken zoektocht naar verheldering van de fysiologie en pathofysiologie van het immuunsysteem en de toepassing hiervan in medische hulpverlening. 4.2. Doelstelling Prof. Dr. B. Vandekerckhove heeft mij binnen eigen onderzoek een project aangeboden waarin ik kennis kon maken met diverse laboratoriumtechnieken en dat als doel had het genereren van hoog-affiene tumorspecifieke T-cellen vanuit HSC. De doelstelling van dit onderzoek is een verklaring vinden voor het beperkte succes van immunotherapie in huidig bestaande toepassingsvormen. Naast het door Finn (2008) aangehaalde probleem dat studies enkel gebeuren bij patiënten met progressieve, therapieresistente ziekte willen we zoeken naar bijkomende verklaringen. Het is mogelijk dat de aanwezigheid van tumor antigenen in de thymus via negatieve selectie zorgt voor de deletie van T-cellen met een hoge affiniteit voor deze tumorantigenen en dat hierdoor de reactiviteit tegen deze antigenen zo zwak is. Daarom is het belangrijk dat we de ontwikkeling van tumorspecifieke T-cellen nader gaan bestuderen en met deze kennis verder op zoek gaan naar nieuwe en betere vormen van immunotherapie. De antigeenspecificiteit van T-cellen wordt louter bepaald door de TCR. T-cel specificiteit kan gericht worden door HSC te transduceren met de genen coderend voor de TCRα en TCRβ ketens van een TCR met gekende specificiteit (Kessels, 2001). De genen coderend voor de TCR ketens van een MelanA, een HA2 en een Cytomegalovirus (CMV) specifieke TCR werden aangewend om antigeenspecifieke T-cellen te genereren. Deze genen werden via retrovirale vectoren getransduceerd in humane foetale lever CD34+ cellen, deze kunnen beschouwd worden als HSC. Na transductie werden de HSC overgebracht in twee studiemodellen: het SCID-hu Thy/Liv injectie model en het SCID-hu Thy/Liv hanging drop Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 11 model. In toekomstig onderzoek wordt gepland ook het OP9-DL1 cultuursysteem te gebruiken. Deze systemen laten toe dat HSC uitgroeien tot T-cellen (De Smedt et al., 2004). In de twee eerstgenoemde studiemodellen konden de HSC uitgroeien tot T-cellen waarvan op verschillende tijdstippen de transductiestatus bepaald werd. In geval van geslaagde transductie werd de specificiteit voor het antigen doelwit van de geïntroduceerde TCR bepaald m.b.v. tetrameerkleuringen. Vier verschillende celgroepen konden per experiment bestudeerd worden: de TCRα only, de TCRβ only, de TCRαβ getransduceerde cellen en de niet-getransduceerde cellen. De TCRαβ getransduceerde T-cellen, die verwacht werden de complete MelanA of CMV specifieke TCR tot expressie te brengen, zouden een vaste affiniteit moeten hebben voor het betreffend antigen (Hughes et al., 2005). Bij de TCRα only en TCRβ only getransduceerde T-cel precursoren verwachten we endogene herschikking van de complementaire TCR keten met als gevolg een spectrum van TCR met variërende specificiteit en affiniteit (Zehn and Bevan, 2006). De doelstelling was op deze wijze een beter inzicht te krijgen in de bijdrage van de TCRα en TCRβ keten aan de specificiteit en affiniteit van de TCR. Verwacht werd dat de TCRαβ getransduceerde cellen de grootste fractie antigeenspecifieke T-cellen zouden bevatten, gevolgd door de TCRα only getransduceerde cellen. Dietrich et al. (2003) gaven namelijk evidentie voor de dominantie van de TCRα keten in de herkenning van het MelanA : HLA-A2 complex. Om de specificiteit van getransduceerde T-cellen optimaal te kunnen beoordelen was de bepaling van een geschikte labelingsbuffer voor tetrameerkleuringen noodzakelijk alsook de bepaling van de werkzaamheid van de tetrameerkleuringen t.o.v. een negatieve controle. Onverwachte hindernissen werden ontmoet waarmee dankzij dit onderzoek rekening gehouden kan worden in verdere pogingen tot de generatie van tumorspecifieke T-cellen. Dit project kan gezien worden als een zijtraject binnen het doctoraat ‘Manipulatie van het MelanA/MART-1 specifieke T-cel repertoire in experimentele systemen van T-cel differentiatie’ van Ph.D. studente S. Van Coppernole (afgestudeerd in de Biomedische Wetenschappen). 4.3. Bijdrage van de verschillende betrokkenen In het onderzoek zijn S. Van Coppernole en ikzelf er in geslaagd de TCRα en TCRβ keten van een MelanA specifieke TCR (ons ter beschikking gesteld door T. Schumacher, NKI, Amsterdam) over te brengen in 2 LZRS vectoren. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 12 De TCRα en TCRβ keten van een HA2 en een CMV specifieke TCR (ons ter beschikking gesteld door M. Heemskerk, Universiteit Leiden) zijn door S. Van Coppernole ingebracht in HSC en deze zijn door haar overgebracht in een SCID-hu Thy/Liv injectie model en in een SCID-hu hanging drop model. In deze modellen zijn de HSC uitgegroeid tot T-cellen. Het verzamelen van de cellen en de analyse van transductiestatus en specificiteit is een gedeeld werk geweest van S. Van Coppernole, I. Velghe en mezelf. De eruit verkregen resultaten heb ik verzameld in deze thesis. Voor optimaal gebruik van de tetrameerkleuring werd afgegaan op een bestaand protocol ter beschikking gesteld door P. Coulie (Université catholique de Louvain) en mijn analyse naar de meest geschikte buffer voor de tetrameerkleuringen. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 13 Methodologie 1. Genereren van MelanA specifieke T-cellen 1.1. Constructie van retrovirale vectoren Uitgangspositie was een MelanA specifieke TCR waarvan de TCRα en de TCRβ keten onder het merkergen enhanced green fluorescent protein (eGFP) in een pmXs vector zaten. De sequenties van de MelanA-specifieke TCR ketens werden gekloneerd in een LZRS vector tussen Not1 en BamH1 restrictie-enzym knipplaatsen. De TCRα keten werd onder het merkergen enhanced green fluorescent protein (eGFP) gebracht, de TCRβ keten onder Nerve Growth Factor Receptor (NGFR). Hiervoor werd per keten 2µg LZRS vector overnacht geknipt bij 37°C met Not1 en BamH1 restrictie-enzymen (New England Biolabs) en 2µg pmXs vector (overnacht, bij 37°C) met dezelfde restrictie-enzymen. De enzymactiviteit werd gestopt door 15min incubatie bij 65°C. De digesten werden op een 1% Agarose MP gel (BD Biosciences) gelaten en een elektrisch veld van 150V en 100mA werd aangelegd. Na 30min werden de fragmenten die we nodig hadden met behulp van gel-extractie (Qiaquick gel extraction kit, Qiagen) geïsoleerd. De concentratie nucleïnezuur werd bepaald met een spectrofotometer (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific). De geknipte vectoren werden gedefosforyleerd door 250ng vector samen met 5µl Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) gedurende 15 – 30min te incuberen achtereenvolgens bij 37°C, 65°C en 4°C. Tot slot werd het insert in de vector ingebouwd door insert en vector in een verhouding van 3:1 samen te incuberen gedurende 30min bij 16°C. Op deze wijze werd een LZRS vector bekomen die de TCRα keten bevat onder het merkergen eGFP en een LZRS vector die de TCRβ keten bevat onder NGFR. Voor elk werd een negatieve controle (insert-vector verhouding 0:1) meegenomen, een LZRS vector met het merkergen eGFP zonder TCR en een LZRS vector met NGFR zonder TCR keten (figuur 2). Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 14 Figuur 2. Constructie van retrovirale vectoren. Vertrekkende van 2 pmXs vectoren, de AIG en de BIG vector, werden de TCRα en TCRβ keten van een MelanA specifieke TCR vanuit deze vectoren overgebracht naar LZRS vectoren waar de TCRα en TCRβ keten onder een verschillend merkergen zitten, respectievelijk eGFP en NGFR, in respectievelijk de LIE en de LIN vector. Hiervoor werd het gensegment coderend voor de TCR keten geknipt uit de pmXs vectoren en geplakt in de LZRS vectoren tussen de restrictie-enzym knipplaatsen voor Not1 en BamH1. (AIG = α-IRES-eGFP, BIG = β-IRES-eGFP, LIE = LZRS-IRES-eGFP, LIN = LZRS-IRES-NGFR, eGFP = enhanced green fluorescent protein, NGFR = nerve growthfactor receptor, LTR = long terminal repeat, IRES = internal ribosomal entry site, ψ = verpakkingssignaal) De verkregen vectoren werden vervolgens geamplificeerd door competente Escherichia coli DH5α bacteriën met de vectoren te transformeren en de bacteriën overnacht bij 37°C te laten groeien eerst in vloeibaar LB medium bouillon, nadien op LB-Amp (0,1% ampicilline) platen. De LZRS vector bevatte een resistentiegen voor ampicilline en op deze wijze konden getransformeerde cellen uitgeselecteerd worden. De gevormde kolonies op de LB-Amp platen werden geteld en opgezuiverd, eerst via Miniprep, vervolgens via Maxiprep (NucleoBond plasmid purification, Macherey-Nagel). De plasmide opbrengst werd bepaald met UV spectrofotometrie en de plasmide integriteit werd bevestigd met agarose gel-elektroforese. Om de lengte van de verkregen ligatiebandjes te bepalen werd een 1kb DNA ladder (GeneRuler 1kb DNA ladder, Fermentas) gebruikt. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 15 1.2. Transductie van HSC Dit deel van het onderzoek werd uitgevoerd door doctoraatstudente S. Van Coppernole. Het principe van dit onderdeel: de verkregen TCRα en TCRβ bevattende vectoren worden ingebracht in een retrovirus door middel van de amfotrope verpakkingscellijn Phoenix (Nolan Lab, Stanford University). De unieke eigenschap van deze cellijn is dat ze gemakkelijk transfecteerbaar is, o.a. via calciumfosfaat gemedieerde transfectie. Phoenix cellen worden uitgezaaid op petrischaaltjes, de TCRα en TCRβ bevattende vectoren worden erin gebracht via calciumfosfaat gemedieerde transfectie en de Phoenix cellijn zal deze vectoren verpakken met virale verpakkingseiwitten. Het resultaat is een verzameling retrovirussen die de TCRα of TCRβ keten van een MelanA specifieke TCR bevatten. Deze retrovirussen worden gebruikt voor stabiele transductie van humane HSC. In het DNA van de HSC bouwen we op deze manier een deel in coderend voor één of beide TCR ketens van een specifieke TCR. We hebben gekozen voor dubbele transductie met aparte TCRα en TCRβ bevattende vectoren om de differentiële uitkomst van celpopulaties die één, geen of beide TCR ketens verkregen te kunnen bestuderen. 2. SCID-hu Thy/Liv injectie model 2.1. Maken van het studiemodel Dit deel van het onderzoek werd uitgevoerd door doctoraatstudente S. Van Coppernolle. De SCID muizen waren afkomstig uit de kweekfaciliteit van het laboratorium voor Immunologie UZ Gent. Deze muizen werden getransplanteerd met fragmenten van humane foetale thymus en humane foetale lever onder het linker nierkapsel. Na 8 tot 16 weken werden deze muizen bestraald met 200Gy door de dienst Radiotherapie UZ Gent, in bijzondere samenwerking met Dr. T. Boterberg. De muizen werden vervolgens geïnjecteerd met humane HSC afkomstig van foetale lever. De dieren werden behandeld volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie Dierproeven van het UZ Gent. 2.2. Verzamelen van geproduceerde cellen Het verzamelen van de in het Thy/Liv orgaantje geproduceerde cellen is een gedeelde taak geweest van S. Van Coppernole, I. Velghe en mezelf. De vroegste analyses zijn gebeurd 27 dagen na injectie van de HSC, de laatste analyses 97 dagen na injectie. Op de dag van analyse werden de muizen gedood door cervicale dislocatie. Het Thy/Liv orgaantje werd opgezocht Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 16 onder het kapsel van de linker nier en vrij gedissecteerd. Het orgaantje werd in een petrischaaltje met 2ml Tris-buffer geplaatst. Vervolgens werd het orgaantje en de 2ml Tris buffer overgebracht in een proefbuis waarin het orgaantje met behulp van een pletter mechanisch werd beschadigd. De inhoud van de proefbuis, inclusief de restanten van het orgaantje, werden via een 70µm filter overgebracht in een tweede proefbuis. Het orgaantje, tegengehouden door de filter, werd teruggebracht in de eerste proefbuis. In die eerste proefbuis werd opnieuw 2ml Tris buffer gedaan, het orgaantje werd opnieuw mechanische beschadigd en de inhoud werd opnieuw via de 70µm filter overgebracht in de tweede proefbuis. De verkregen celsuspensie in de tweede proefbuis werd bewaard bij 4°C (op ijs). 3. SCID-hu Thy/Liv hanging drop model Getransduceerde humane foetale lever CD34+ cellen werden geïncubeerd met humane foetale thymus lobi in een hanging drop cultuur. De hieruit verkregen orgaantjes werden getransplanteerd onder het nierkapsel van SCID muizen. Zowel het maken van het studiemodel als de flowcytometrische analyse van de eruit verkregen cellen zijn gedaan door S. Van Coppernole. 4. Flowcytometrische analyse 4.1. Monoklonale antilichamen en tetrameren De volgende muis-anti-humane monoklonale antilichamen (Mab) werden gebruikt: CD1a, CD3, CD4, CD7, CD8, CD34, CD45, TCRαβ en TCRγδ (BD Biosciences), Vβ2, Vβ5, Vβ7, Vβ8, Vβ12, Vβ13, Vβ17 en Vβ22 (Beckman Coulter), HLA-A2 (American Type Culture Collection). Deze waren gelabeld met pacific blue (PB), fluoresceïne isothyocyanaat (FITC), phycoërythrine (PE), phycoërythrine-cy 7 (PE-Cy7), allophycocyanine-cy 7 (APC-Cy7) of allophycocyanine (APC). Anders gelabelde anti-humane Mab waren: HLA-ABC biotine (BD Biosciences), Nerve Growth Factor Receptor (NGFR) biotine (Myltenyi Biotech). Deze bevatten geen fluorochroom, maar kunnen in een tweede stap gevisualiseerd worden met streptavidine (SA) PerCP-Cy55 of SA APC-Cy7 (eBioscience). De volgende tetrameren werden gebruikt: CMV tetrameer PE en HA2 tetrameer PE (ons ter beschikking gesteld door M. Heemskerk, Universiteit Leiden), MelanA tetrameer PE gericht tegen het ELAGIGILTV peptide HLA-A2 gerestricteerd en EBV BHLF1.A*0201 APC Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 17 tetrameer gericht tegen het peptide GLCTLVAHL (ons ter beschikking gesteld door P. Coulie, Université catholique de Louvain). 4.2. Buffers, labeling en flowcytometers De buffers gebruikt om de stalen te labelen waren: Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Lonza) 1% Foetaal Kalf Serum (FKS), Phosphate Buffered Saline (PBS) (Lonza) 1% FKS en klassieke labelingsbuffer van het labo (PBS, 1% Bovine Serum Albumine, 0.1% NaN3, 275285 mOsm, pH 7.2 - 7.3). Klassieke labeling gebeurde door toevoeging van Mab (benodigd volume afhankelijk van het merk, de concentratie en het type, zie individuele verpakkingen) aan een celsuspensie en incubatie gedurende 30min, op ijs, in het donker. Tetrameerkleuringen gebeurden in het donker bij 37°C, gedurende 15min. Bij tweestapslabelingen werden de cellen tussen de 2 stappen 2 maal gewassen (centrifugeren aan 1500rpm op zelfde temperatuur als kleuring) doorgaans met PBS 1% FKS (behalve in ‘Optimalisatie van tetrameerkleuring door bepalen van ideale buffer voor kleuring (2.1)’ waar de 3 verschillende te testen buffers gebruikt werden). Labeling werd steeds afgesloten door de celsuspensie te wassen met de voor het experiment gebruikte buffer en door het supernatans af te gieten. Cellen werden geanalyseerd met een BD FACSCalibur flowcytometer (BD Immunocytometry Systems) of met een BD LSR II flowcytometer (BD Immunocytometry Systems) afhankelijk van het aantal gebruikte fluorescente labels. Dode cellen werden uitgeselecteerd d.m.v. propidium iodide exclusie (PI) (Life Technologies). 5. Negatieve isolatie met behulp van magnetische beads Magnetische beads op schaap-anti-muis Mab (Dynal Biotech) werden gebruikt om celsuspensies aan te rijken voor cellen die niet gebonden werden door muis Mab. De negatief te selecteren cellen werden gemerkt via de klassieke labelingsmethode met Mab beschreven in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’. Vervolgens werden schaap-anti-muis Mab gelabeld met magnetische beads toegevoegd. Na 30min incubatie op ijs werd het geheel gedurende 1min in een magneet geplaatst. De cellen die niet door de Mab gebonden werden, dus niet gelabeld werden met magnetische beads en dus niet aan de magneet kleefden, werden met een pasteurpipet overgebracht naar een nieuwe proefbuis. De initiële proefbuis werd uit de magneet gehaald, nogmaals gespoeld met de respectievelijke buffer, teruggeplaatst in de Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 18 magneet voor 1min en de niet-gebonden cellen werden opnieuw afgenomen en overgebracht. Op deze indirecte manier werd een aanrijking bekomen van de cellen die niet gebonden waren met de gebruikte Mab. 6. Buffy coats en mononucleaire cellen Het bloedtransfusie centrum, Rode Kruis Vlaanderen, Gent stelde buffy coats te beschikking voor het onderzoek. De buffy coat is de witte bloedcellen en bloedplaatjes bevattende fractie van geanticoaguleerd bloed. Na centrifugatie bevindt deze fractie zich tussen de rode bloedcellen en het plasma. Uit de buffy coats werd de mononucleaire fractie (monocyten en lymfocyten) geïsoleerd via Lymfoprep (Axis-Shield) scheiding op basis van het densiteitsgradiënt. Buffy coat eenheden werden 1 over 5 verdund in PBS, waarna ze verdeeld werden aan 30ml per 50ml buis. Bij iedere 50ml buis werd 15ml Lymfoprep onder het bloed gebracht. De buizen werden gecentrifugeerd (2310rpm, 15min, 22°C), waarna de mononucleaire celfractie opgevangen werd met een pasteurpipet (figuur 3). Figuur 3. Scheiding van bloed- componenten op basis van densiteit met behulp van Lymfoprep. Onder de Buffy coat (vnl. monocyten en bloedplaatjes) wordt Lymfoprep gebracht. Het geheel wordt gecentrifugeerd aan 2310rpm, gedurende 15min bij 22°C. De bekomen densiteitfracties kunnen op het zicht van elkaar worden gescheiden. Met een pasteurpipet kan de fractie monocyten en lymfocyten uit het geheel gehaald worden. 7. CMV kloon Deze cellijn bestaat uit T-cellen die een CMV specifieke TCR tot expressie brengen. Ze werd gebruikt als positieve controle in de CMV tetrameerkleuringen. De kloon werd ter beschikking gesteld door M. Heemskerk (Universiteit Leiden). Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 19 8. Celaantallen bepalen via een Bürker telkamer Om celaantallen te bepalen werden 10µl celsuspensie en 10µl tripaan blauw (Life Technologies) gemengd. De suspensie werd op de Bürker telkamer aangebracht en 25 hokjes werden geteld. Het totale celaantal kon dan bepaald worden doordat 25 hokjes overeenkomen met een volume van 5x10-8l. Via een eenvoudige formule kon het totaal aantal cellen berekend worden (figuur 4). Tripaan blauw is erg geschikt om het onderscheid tussen levende en dode cellen te zien. De getelde niet-gekleurde cellen zijn de levende cellen. totaal celaantal (cellen/ml) = geteld aantal (in 25 hokjes) x 2 (verdunningsfactor) x 104 x totaal volume (ml) Figuur 4. Formule voor het berekenen van het totaal aantal cellen in een oplossing met behulp van een Bürker telkamer en tripaan blauw. Een alternatieve methode is tellen met TÜRK (Merck), de verhouding is dan 10µl celsuspensie en 90µl TÜRK. Hier geldt een andere formule om het totaal celaantal te berekenen (figuur 5). TÜRK lyseert de rode bloedcellen en is dus zeer geschikt om specifiek de mononucleaire cellen te tellen. totaal celaantal (cellen/ml) = geteld aantal (in 25 hokjes) x 10 (verdunningsfactor) x 104 x totaal volume (ml) Figuur 5. Formule voor het berekenen van het totaal aantal cellen in een oplossing met behulp van een Bürker telkamer en TÜRK. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 20 Resultaten 1. Genereren van MelanA specifieke T-cellen Het proces kon worden onderverdeeld in 4 stappen. We zijn vertrokken vanuit een situatie waarin de genen coderend voor de TCRα en de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR in twee afzonderlijke pmXs vectoren (plasmiden) zaten. Deze plasmiden transfecteerden we na amplificatie in Escherichia coli DHα naar de amfotrope verpakkingscellijn Phoenix. Deze verpakkingscellijn heeft retrovirussen geproduceerd waarin de coderende sequentie van één van de TCR ketens zat. Met de verkregen virussen hebben we HSC afkomstig uit foetale lever besmet en op deze wijze werden de TCR keten genen ingebouwd in het DNA van de HSC. Er ontstonden 4 groepen HSC: niet-getransduceerde, TCRα only getransduceerde, TCRβ only getransduceerde en TCRαβ getransduceerde. De finale stap was het laten uitdifferentiëren van de HSC tot T-cellen in een studiemodel. Hiervoor zijn zowel het SCID-hu Thy/Liv injectie model als het SCID-hu hanging drop model gebruikt. De getransduceerde T-cellen brachten een TCR tot expressie die één of beide TCR ketens van de tumorspecifieke TCR kon dragen. De specificiteit van de TCR van de verkregen T-cellen werd ten slotte nagegaan d.m.v. flowcytometrische analyse met tetrameerkleuring (figuur 6). Figuur 6. Genereren van tumorspecifieke T-cellen. Het proces kon worden onderverdeeld in 4 stappen. De genen coderend voor de TCRα en de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR zaten in twee afzonderlijke plasmiden. Deze plasmiden hebben we getransfecteerd naar een verpakkingscellijn, deze heeft retrovirussen geproduceerd waarin de coderende sequentie van één van de TCR ketens zat. Met de verkregen virussen hebben we HSC besmet en op deze wijze werden de TCR keten genen ingebouwd in het DNA van de HSC. De finale stap was het laten uitdifferentiëren van de HSC tot T-cellen in een studiemodel. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 21 1.1. Constructie van retrovirale vectoren De TCRα en TCRβ ketens van een MelanA specifieke TCR werden overgebracht vanuit 2 pmXs vectoren, beide met eGFP als merkergen, naar respectievelijk de LZRS-IRES-eGFP (LIE) en de LZRS-IRES-NGFR (LIN) vectoren volgens het protocol beschreven in methodologie ‘Constructie van retrovirale vectoren (1.1)’. Zo kwam de TCRα keten onder het merkergen eGFP (LIE+TCRα) en de TCRβ keten onder het merkergen NGFR (LIN+TCRβ) terecht (figuur 2). De vectoren werden geamplificeerd in Escherichia coli DH5α. Het slagen van het kloneringsproces werd geëvalueerd door de vectoren te knippen met de restrictieenzymen Not1 en BamH1 en vervolgens het verknippingsproduct te evalueren m.b.v. gelelektroforese. De gel-elektroforese toonde inderdaad zowel voor de LIE+TCRα als voor de LIN+TCRβ ligatiebandjes aan van de verwachte lengte (de TCRα keten was 800bp, de TCRβ keten 900bp) en dus konden we besluiten dat de klonering geslaagd was en de vectoren gebruikt konden worden voor virusproductie (figuur 7). Figuur Gel-elektroforese 7. verknipping van de na LIE+TCRα en bp LIN+TCRβ ligatieproducten. Het eerste en 10000 het tiende laantje bevatten een 1kb DNA ladder. Het derde laantje bevatte 2000 1500 LIN+TCRβ, het vierde LIE+TCRα. Het 1000 zevende en achtste laantje waren de 750 respectievelijke 500 negatieve controles. Andere laantjes waren niet relevant voor deze thesis. In laantje 3 en 4 waren twee 250 stukken te onderscheiden waarvan het onderste (kortste) de TCR keten was. Deze nieuw geconstrueerde vectoren boden het voordeel dat na transductie het onderscheid gemaakt kon worden tussen de TCRα only, de TCRβ only en de TCRαβ getransduceerde cellen doordat beide TCR ketens onder een verschillend merkergen gebracht waren. Het merkergen eGFP van de TCRα keten fluoresceerde in het FITC kanaal bij flowcytometrische analyse, NGFR van de TCRβ keten kon via een biotine-streptavidine tweestapslabeling gevisualiseerd worden in een kanaal naar keuze. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 22 2. Voorbereiding analyse gegenereerde T-cellen 2.1. Optimalisatie van tetrameerkleuring door bepalen van ideale buffer voor kleuring In een klassieke kleuring worden met fluorochroom gelabelde Mab toegevoegd aan een celsuspensie. Klassieke Mab kleuringen kunnen echter niet gebruikt worden om de antigeenspecificiteit van T-cellen aan te tonen. De meest directe manier om antigeenspecifieke T-cellen aan te tonen is m.b.v. tetrameerkleuringen. Een tetrameerkleuring bestaat uit 4 peptide : MHC complexen die centraal verbonden zijn met een streptavidine molecule via biotine. T-cellen met een TCR die bindt op een specifiek peptide : MHC complex zullen zo via flowcytometrische analyse gevisualiseerd kunnen worden. Het structureel verschil van de tetrameerkleuring met de Mab brengt fysicochemische verschillen mee en protocollen voor kleuring met Mab kunnen niet blind overgenomen worden. Het labo van P. Coulie (Université catholique de Louvain), dat ons het MelanA tetrameer PE en het EBV BHLF1.A*0201 APC tetrameer ter beschikking gesteld heeft, gebruikt volgende condities voor haar tetrameerkleuringen: 15min bij kamertemperatuur in HCF 1% FKS. Deze buffer was echter niet beschikbaar op ons labo en vandaar dat we op zoek gegaan zijn naar een alternatief. Drie verschillende buffers zijn getest: een HBSS 1% FKS, een PBS 1% FKS en wasbuffer (WB) 1% FKS wat de klassieke labelingsbuffer is die gebruikt wordt op het labo voor de Mab kleuringen. In de 3 verschillende buffers werden PBMC, verkregen na Lymfoprep scheiding (‘Buffy Coats en mononucleaire cellen (6)’) van buffy coats, gekleurd met CD4 (T-helpercel merker), CD19 (B-cel merker) en glycophorine A (erythrocyt merker) muis-anti-humaan Mab volgens het Mab labelingsprotocol beschreven in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’. Volgens hetzelfde protocol (4.2) werden vervolgens schaap anti-muis Mab gelabeld met magnetische beads toegevoegd. Volgens het protocol ‘Negatieve isolatie met behulp van magnetische beads (5)’ werd een aanrijking voor CD8+ T-cellen, die CD4-, CD19- en glycophorine Azijn, bekomen. In een tweede stap werden de 3 stalen (in de 3 verschillende buffers) gekleurd met MelanA tetrameer PE en met een controle tetrameer (EBV BHLF1.A*0201 APC) volgens het tetrameer labelingsprotocol beschreven in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’ . Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 23 In een laatste stap werden de stalen met een muis anti-humaan anti-CD8 Mab gekleurd volgens het Mab labelingsprotocol (4.2) om de CD8SP en eventuele overblijvende DP Tcellen te kunnen bestuderen. Iedere buffy coat werd in een aparte kleuring gecontroleerd op zijn HLA-A2 status via een labeling met HLA-A2 FITC Mab volgens het Mab labelingsprotocol (4.2). De MelanA tetrameren presenteren het ELAGIGILTV peptide in de groeve van MHC klasse 1, HLA-A2. Vandaar dat we enkel tetrameeraankleuring verwachtten bij HLA-A2+ buffy coats. Dit experiment werd gedaan om eventuele grote verschillen in labeling op te sporen tussen de 3 verschillende buffers. Wanneer één buffer opvallend minder achtergrondkleuring zou geven met het MelanA tetrameer, dan zou deze verkozen worden. Slechts 2 van de 7 personen waren HLA-A2+ en konden bijgevolg MelanA specifieke T-cellen hebben in hun T-celpopulatie. Het uit de literatuur gekende percentage van 0,01% MelanA specifieke T-cellen binnen het CD8+ T-cel repertoire van HLA-A2+ individuen kon niet aangetoond worden. Steeds werd een hoger percentage bekomen wat kan wijzen op een aspecifieke aankleuring. Het controle tetrameer EBV BHLF1.A*0201, HLA-A2 specifiek, werd gebruikt om die aspecifieke kleuring uit te schakelen. Positieve aankleuring voor beide tetrameren is immers onmogelijk tenzij ze aspecifiek is. Het hoogste percentage aankleuring voor zowel het MelanA tetrameer als het controle tetrameer werd steeds gezien in WB 1% FKS. Tussen PBS 1% FKS en HBSS 1% FKS zijn echter geen significante verschillen gezien (figuur 8). Deze resultaten leren ons dat WB 1% FKS de minst geschikte van de 3 geteste buffers is. Zowel PBS 1% FKS als HBSS 1% FKS gaven beiden weinig achtergrondkleuring met de tetrameren. In alle volgende experimenten werd de PBS 1% FKS buffer gebruikt bij tetrameerkleuringen. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 24 Figuur 8. Tetrameerkleuring op CD8+ aangerijkte perifeer bloed lymfocyten afkomstig van buffy coats in 3 verschillende buffers: HBSS 1% FKS (linker kolom), PBS 1% FKS (middenkolom) en WB 1% FKS (rechter kolom). De aankleuring met het MelanA tetrameer PE en een irrelevant (controle) EBV tetrameer APC wordt hier getoond binnen de CD8+ lymfocyten populatie van 3 donoren. Van de 7 geteste stalen zijn hier 3 stalen weergegeven waaronder de twee HLA-A2+ stalen. Het MelanA model en de gecreëerde vectoren (zie ‘Constructie van retrovirale vectoren (1.1)’), die de TCRα en TCRβ keten van de MelanA specifieke TCR bevatten, zullen gebruikt worden in toekomstig onderzoek op het labo. De verdere analyses die aan bod komen in deze thesis zijn gebeurt op analoge CMV en HA2 modellen die in de toekomst als positieve controle zullen dienen voor het MelanA model. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 25 2.2. Testen van de tetrameerkleuring op T-cel klonen Om na te gaan of de CMV tetrameerkleuring een duidelijk en specifiek signaal geeft, werd de CMV tetrameerkleuring getest op een CMV specifieke T-cel lijn, een CMV T-cel kloon. De CMV kloon werd gekleurd met het CMV tetrameer en met een HA2 tetrameer als negatieve controle volgens het tetrameer labelingsprotocol (4.2). De aankleuring was duidelijk positief met het CMV tetrameer en negatief met het HA2 tetrameer. Op deze manier werd aangetoond dat het CMV tetrameer een duidelijke en specifieke binding geeft (figuur 9). Figuur 9. Tetrameerkleuringen op CMV T-cel kloon. Een CMV T-cel kloon werd gelabeld met respectievelijk het CMV tetrameer PE (links) en een HA2 tetrameer PE (midden). Rechts wordt het PE signaal weergegeven wanneer geen PE label toegevoegd werd. 3. Analyse van gegenereerde T-cellen 3.1. SCID-hu Thy/Liv injectie model 3.1.1. Transductiestatus De geproduceerde T-cellen werden verzameld uit het Thy/Liv orgaantje gegroeid onder het nierkapsel van SCID-hu muizen. Deze procedure is beschreven in ‘Verzamelen van geproduceerde cellen (2.2)’. De cellen werden bewaard en getransporteerd op ijs. De kleuring gebeurde in 4 stappen: (1) NGFR biotine kleuring, (2) Streptavidine APC-Cy7 kleuring (om biotine gelabelde cellen te visualiseren), (3) CMV tetrameer PE kleuring en tot slot (4) kleuring voor CD3 (PE-Cy7) en CD8 (APC). Gebruikte protocollen zijn beschreven in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 26 Het gemiddelde percentage getransduceerde cellen lag het hoogst op 27 dagen na injectie voor de TCRαβ transductie (1,7%) (figuur 10, A), op 94 dagen na injectie voor de TCRα transductie (25,8%) (figuur 11, A) en op 53 dagen na injectie voor de TCRβ transductie (20,35%) (figuur 12, A). Het gemiddelde percentage TCRα getransduceerde cellen op 94 dagen was echter gebaseerd op het gemiddelde van 2 erg uiteenlopende waarden waarvan de maximale waarde 49% was. Deze uitschietende waarde leek verdacht, het op één na hoogste gemiddelde percentage werd gemeten op 27 dagen na injectie en kwam met 19,26% in de buurt van het hoogste gemiddelde percentage (figuur 11, A). In absolute aantallen lag het gemiddelde voor de TCRαβ transductie (577,5.10^3) het hoogst op 32 dagen na injectie (figuur 10, B), op 70 dagen na injectie voor de TCRα transductie (2977.10^3) (figuur 11, B) en op 53 dagen na injectie voor de TCRβ transductie (6880,5.10^3) (figuur 12, B). De absolute aantallen en de percentages voor de TCRαβ en TCRβ transductiestatus waren in de tijd erg gelijklopend wat betreft de gemiddelde opbrengst. Dit gold ook voor de TCRα transductiestatus indien we geen rekening hielden met de analyses op dag 94, wat te verdedigen viel o.b.v. het grote verschil tussen de twee gemeten waarden die dag. Figuur 10. Evolutie van de TCRαβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval, minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Acht muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 27 postinjectie, 2 op dag 32, 2 op dag 45, 2 op dag 53, 3 op dag 70, 4 op dag 63, 9 op dag 82, 2 op dag 94 en 2 op dag 95. In totaal zijn 34 muizen geanalyseerd. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 27 Figuur 11. Evolutie van de TCRα transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval, minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Acht muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 27 postinjectie, 2 op dag 32, 2 op dag 45, 2 op dag 53, 3 op dag 70, 4 op dag 63, 9 op dag 82, 2 op dag 94 en 2 op dag 95. In totaal zijn 34 muizen geanalyseerd. Figuur 12. Evolutie van de TCRβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval, minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Acht muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 27 postinjectie, 2 op dag 32, 2 op dag 45, 2 op dag 53, 3 op dag 70, 4 op dag 63, 9 op dag 82, 2 op dag 94 en 2 op dag 95. In totaal zijn 34 muizen geanalyseerd. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 28 Uit bovenstaande gegevens werd duidelijk dat de transductiestatus geen constante was in de tijd. Dankzij deze data kan de verdere evaluatie van de verschillende getransduceerde populaties in het SCID-hu Thy/Liv model in de toekomst beter gepland worden in de tijd. Wat betreft TCRαβ transductie leverden vooral de analyses op 32 dagen en op 70 dagen na injectie hoge percentages en absolute aantallen op, vanaf 73 dagen waren de percentages en absolute aantallen TCRαβ getransduceerde cellen erg laag (figuur 10). De TCRα transductie was in percentages erg hoog op 27, 70 en 94 dagen, in absolute aantallen op 53, 70 en 94 dagen. Vooral de analyse op 70 dagen was erg overtuigend. De percentages en absolute aantallen TCRα getransduceerde cellen waren laag op 45, 73, 82 en 95 dagen, wat wil zeggen dat met uitzondering van de uitschieter op 94 dagen er ook weinig TCRα getransduceerde cellen gevonden werden vanaf 73 dagen (figuur 11). Voor TCRβ werden de hoogste percentages en absolute aantallen gezien op 27, 53 en 70 dagen, vooral de analyse op dag 53 leek hier overtuigend. In de lijn van de resultaten voor TCRαβ en TCRα getransduceerde cellen, werden vanaf 73 dagen na injectie weinig TCRβ cellen teruggevonden (figuur 12). In totaal werden 34 muizen uit het SCID-hu Thy/Liv injectie model geanalyseerd, hun individuele transductiestatus is terug te vinden in ‘Transductiestatus SCID-hu Thy/Liv injectie model (bijlage 1)’. De vrij lage waarden vanaf 73 dagen deden vermoeden dat het dan te laat was om naar getransduceerde cellen te kijken. Analyse zou zich moeten concentreren op de periode die ervoor ligt, de eerste 70 dagen na transductie. Binnen die 70 dagen is het moeilijk om één optimaal tijdstip voor zowel TCRαβ, TCRα als TCRβ getransduceerde cellen te vinden, analyse tussen 53 dagen en 70 dagen na injectie lijkt ideaal. 3.1.2. Nagaan van Vβ13 status De TCRβ keten van de gebruikte CMV-specifieke TCR bevat een Vβ13 domein. Dit domein kan gedetecteerd worden m.b.v. een Mab wanneer deze TCRβ keten gebruikt wordt in de TCR van de getransduceerde T-cellen. Van de NGFR+ en dus TCRβ getransduceerde cellen werd theoretisch verwacht dat 100% Vβ13+ zou zijn. Verbazend genoeg was dit slechts 52,0% (figuur 13). Ondanks het feit dat de cellen reeds over een volledig herschikte TCRβ keten beschikten, hebben er zich waarschijnlijk nog endogene TCRβ genherschikkingen voorgedaan. Uit deze resultaten leren we dat wanneer T-cellen een getransduceerde TCRβ keten bezitten, dit niet betekent dat ze deze sowieso gebruiken voor de assemblage van hun TCR. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 29 Figuur 13. Vβ13 labeling in getransduceerde en niet-getransduceerde T-cellen. Cellen werden gelabeld met NGFR-biotine / SA APC-Cy7, CD3 APC en Vβ13 PE Mab. De linkse figuur toont de gating strategie, de middenste en rechtse toont Vβ13 aankleuring van respectievelijk NGFR+ en NGFR- cellen. Analyse dag 28 post-injectie. 3.1.3. Nagaan Vβ-repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-cellen. Om na te gaan welke Vβ domeinen gebruikt werden naast Vβ13 in de TCR van de geanalyseerde T-cellen werden een aantal extra kleuringen met Mab uitgevoerd. De aanwezigheid van Vβ2, Vβ5, Vβ7, Vβ8, Vβ12, Vβ17 en Vβ22 werd nagegaan naast Vβ13 en TCRγδ. Om de resultaten van deze kleuringen te bestuderen, werden de cellen opgesplitst in een NGFR positieve en een NGFR negatieve populatie. Slechts 0,10% van de NGFR positieve populatie was TCRγδ+ en slechts 0,50% van de NGFR negatieve populatie. Dit bewijst dat de bestudeerde cellen (die dezelfde zijn als in ‘Nagaan van Vβ13 status (0)’) voornamelijk bestonden uit bonafide TCRαβ T-cellen. Er zijn immers T-cellen bekend die op hun membraan naast TCRαβ ook TCRγδ tot expressie kunnen brengen (Sim et al., 1995). De NGFR positieve populatie bevat een beduidend hoger percentage Vβ13+ cellen en lagere percentages van de overige geteste Vβ domeinen in vergelijking met de NGFR negatieve populatie (Tabel 1). Binnen de NGFR+ cellen kwamen voor de eGFP+ en de eGFP- cellen de percentages van het gebruik van Vβ domeinen sterk overeen, hetzelfde gold binnen de NGFRcellen wanneer opnieuw eGPF- met eGFP+ werd vergeleken (bijlage 2). Deze resultaten leren ons dat de introductie van een TCRβ keten in T-cellen zorgt voor een lagere prevalentie van andere TCRβ ketens in die getransduceerde T-cellen vergeleken met niet-getransduceerde Tcellen. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 30 % TCRγδ Vβ13 Vβ2 Vβ5 Vβ7 Vβ8 Vβ12 Vβ17 Vβ22 totaal (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) NGFR+ 4,05 0,50 43,98 0,15 0,75 1,55 1,30 1,50 2,25 0,35 NGFR- 45,95 0,10 2,50 4,80 1,65 2,20 2,55 2,00 4,45 2,00 Tabel 1. Nagaan Vβ-repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-cellen binnen CMV-specifieke TCR getransduceerde cellen gegenereerd in een SCID-hu Thy/Liv injectie model (analyse dag 28 post-injectie). De weergegeven cijfers zijn percentages van het totaal aantal levende lymfocyten, de eerste kolom (%totaal) geeft aan wat de verhouding NGFR+ en NGFR- cellen is binnen die populatie, de andere kolommen geven aan in welk percentage van de cellen het onderzochte Vβ domein (of de TCRγδ) teruggevonden werd. De cijfers in de kolommen %totaal en Vβ13(%) zijn het gemiddelde van 2 metingen (die zeer goed overeenkomen), de cijfers in de andere kolommen zijn afkomstig uit een eenmalige meting. De 3.1.4. De specificiteit van de getransduceerde cellen specificiteit van T-cellen werd nagekeken m.b.v. tetrameerkleuringen. Een tetrameerkleuring bestaat uit 4 peptide : MHC complexen die centraal verbonden zijn met een streptavidine molecule via biotine. T-cellen met een TCR die bindt op een specifiek peptide : MHC complex kunnen zo via flowcytometrische analyse gevisualiseerd kunnen worden. De eerste voorwaarde voor resultaten in dit onderdeel was dat voldoende getransduceerde cellen aanwezig zijn. Vandaar dat de specificiteit van de getransduceerde cellen niet voor alle muizen bepaald werd. Op dag 25 post-injectie zijn 3 muizen geanalyseerd waarbij de transductie erg succesvol was. Op deze 3 muizen zijn dan ook tetrameerkleuringen gedaan volgens het protocol beschreven in ‘4.2’. In elk van deze muizen was de tetrameerkleuring positief. Twee van deze muizen waren geïnjecteerd geweest met CMV TCR getransduceerde HSC, deze muizen hadden binnen hun TCRαβ getransduceerde populatie respectievelijk 31,0% (figuur 14, A) en 11,6% (figuur 14, B) CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. Binnen de niet-getransduceerde cellen was in beide muizen 0,0% CMV tetrameer+ (figuur 14, A en B). Binnen de TCRα getransduceerde cellen zaten respectievelijk 0,6% (figuur 14, A) en 0,9% (figuur 14, B) CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. De TCRβ getransduceerde cellen hadden 0,0% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. De derde muis, ditmaal een met HA2 TCR getransduceerde HSC geïnjecteerde, bevatte binnen haar TCRαβ getransduceerde populatie 4,8% HA2 tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. In de niet-getransduceerde populatie was dit slechts 0,1%. Haar TCRα getransduceerde cellen bevatten 0,3% HA2 tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen, haar TCRβ getransduceerde cellen 0,1% (figuur 14, C). De TCRαβ Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 31 getransduceerde cellen hadden dus steeds het hoogste percentage tetrameer+ CD3+ CD8α+ Tcellen. Het percentage was al behoorlijk lager voor de TCRα only getransduceerde cellen en in de TCRβ only en de niet-getransduceerde T-cellen waren er zo goed als geen tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. Verwacht werd dat enkel CD8α+ T-cellen tetrameer+ zouden zijn, aangezien de tetrameerkleuring een zwakke affiniteit heeft in vergelijking met de klassieke Mab kleuringen en de CD8 co-receptor binding tussen T-cellen en MHC type 1 moleculen versterkt (Janeway, 2005). CD8α- T-cellen kleurden echter ook aan voor de tetrameerkleuring, zij het in mindere mate dan CD8α+ T-cellen. De ratio tetrameer+ CD8α+ T-cellen over tetrameer+ CD8α- Tcellen binnen de TCRαβ getransduceerde populatie was gemiddeld 3,1. Hieruit bleek inderdaad een preferentiële tetrameeraankleuring van de TCRαβ getransduceerde CD3+ CD8α+ T-cellen, zoals theoretisch verwacht werd. In dit experiment kon het fenotype van de tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen niet verder gespecificeerd worden, de populatie was CD8SP of DP. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 32 Figuur 14. Transductiestatus en tetrameerkleuring van getransduceerde CD3+ T-cellen bij analyse op dag 25 van 3 muizen (A, B en C). De linker grafiek toont telkens de transductiestatus en de gating strategie, de 4 grafieken er rechts van tonen de aankleuring voor tetrameer (in A en B: CMV tetrameer PE, in C: HA2 tetrameer PE) en de CD8α status van de cellen. Rechtsboven staat de situatie voor de TCRαβ getransduceerde T-cellen afgebeeld, linksboven voor de TCRα only getransduceerde T-cellen, rechtsonder voor de TCRβ only getransduceerde T-cellen en linksonder voor de niet-getransduceerde T-cellen. Gebruikte labels: CD3 PE-Cy7, NGFR-biotine / SA APC-Cy7, CMV tetrameer PE, HA2 tetrameer PE, CD8a APC. Studiemodel: SCID-hu Thy/Liv injectie. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 33 Op dag 32 na injectie werd opnieuw een muis gevonden die veel CMV TCR getransduceerde cellen bezat. De verzamelde cellen uit deze muis bevatten 5,3% TCRαβ getransduceerde Tcellen. Van de TCRαβ getransduceerde T-cellen was 11,9% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+. De TCRα getransduceerde T-cellen bevatten 0,8% CMV tetrameer+ CD8α+ T-cellen. De TCRβ getransduceerde T-cellen bevatten 2,7% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen en de niet-getransduceerde T-cellen bevatten 0,0% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. Wanneer gekeken werd naar het ontwikkelingsstadium van de CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ cellen bleek dat de bulk hiervan (97,5% - 100%) zich in het CD4+CD8+ DP stadium bevond met 0,0% tot 2,5% van de cellen in het CD8SP, mature stadium (figuur 15). Figuur 15. Transductiestatus en gating strategie van getransduceerde CD3+ T-cellen (A). Tetrameerkleuring van getransduceerde CD3+ T-cellen (B). Fenotype karakterisatie van tetrameer+ cellen (C). In B en C staat rechtsboven telkens de situatie voor de TCRαβ getransduceerde T-cellen afgebeeld, rechtsonder voor de TCRα only getransduceerde T-cellen, linksboven voor de TCRβ only getransduceerde T-cellen en linksonder voor de niet-getransduceerde T-cellen. Gebruikte labels: CD3 APC-Cy7, NGFR-biotine / SA PerCP-Cy55, CMV tetrameer PE, CD8a APC, CD4 PE-Cy7. Studiemodel: SCID-hu Thy/Liv injectie. Uit deze resultaten leren we dat niet alle TCRαβ getransduceerde T-cellen antigeenspecifiek zijn. In onze experimenten was gemiddeld slechts 14,68% van de TCRαβ getransduceerde Tcellen antigeenspecifiek. TCRα only en TCRβ only getransduceerde T-cellen bezaten zeer weinig tot geen antigeenspecifieke T-cellen, een toestand vergelijkbaar met nietgetransduceerde T-cellen. Tetrameerpositieve T-cellen waren meestal CD8α+, maar ook CD8α- antigeenspecifieke T-cellen werden gevonden, ondanks de zwakke affiniteit van de tetrameerkleuringen. Het merendeel van de tetrameerpositieve T-cellen was CD4+ CD8+ DP. De aanwezigheid van enkele CD8SP T-cellen wees op de aanwezigheid van negatieve selectie in het SCID-hu Thy/Liv injectie model en dus op ondersteuning van volledige T-cel differentiatie. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 34 3.2. SCID-hu hanging drop model 3.2.1. Transductiestatus Het verzamelen en kleuren van de in dit model geproduceerde T-cellen werd gedaan door S. Van Coppernole. Het gemiddelde percentage getransduceerde cellen lag het hoogst op 35 dagen na injectie voor de TCRαβ transductie (2,66%) (figuur 16, A), op 35 dagen na transplantatie voor de TCRα transductie (13,3%) (figuur 17, A) en op 35 dagen na transplantatie voor de TCRβ transductie (5,46%) (figuur 18, A). In absolute aantallen lag het gemiddelde voor de TCRαβ transductie (89.10^3) het hoogst op 35 dagen na transplantatie (figuur 16, B), op 64 dagen na transplantatie voor de TCRα transductie (799,31.10^3) (figuur 17, B) en op 73 dagen na transplantatie voor de TCRβ transductie (103,62.10^3) (figuur 18, B). Opvallend in vergelijking met het SCID-hu Thy/Liv injectie model was dat de procentuele TCRβ transductie het veel lager lag (hoogste gemiddelde 5,46% versus 20,35% in het SCID-hu Thy/Liv model). De gemiddelde absolute celaantallen gegenereerd met het SCID-hu hanging drop model lagen veel lager dan bij het SCID-hu Thy/Liv injectie model (hoogste gemiddelde TCRαβ 6,5 keer lager, TCRα 3,7 keer lager en TCRβ 66,4 keer lager). Figuur 16. Evolutie van de TCRαβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval, minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Vijf muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 35 posttransplantatie, 13 op dag 64, 7 op dag 72 en 6 op dag 73. In totaal zijn 31 muizen geanalyseerd. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 35 Figuur 17. Evolutie van de TCRα transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval, minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Vijf muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 35 posttransplantatie, 13 op dag 64, 7 op dag 72 en 6 op dag 73. In totaal zijn 31 muizen geanalyseerd. Figuur 18. Evolutie van de TCRβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval, minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Vijf muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 35 posttransplantatie, 13 op dag 64, 7 op dag 72 en 6 op dag 73. In totaal zijn 31 muizen geanalyseerd. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 36 Wanneer gekeken wordt naar de gemiddelden van de percentages en absolute aantallen getransduceerde cellen op een bepaald analysetijdstip zien we dat wat betreft TCRαβ transductie de analyses op 35 dagen na transplantatie de hoogste percentages en absolute aantallen opleverden. In het algemeen lagen de percentages en absolute aantallen erg laag (figuur 16). De TCRα transductie was zowel in percentage als in absolute aantallen hoog op 35 en 64 dagen. De percentages en absolute aantallen TCRα getransduceerde cellen waren opvallend lager vanaf 65 dagen (figuur 17). Voor TCRβ werden de hoogste percentages gezien op 35 en 73 dagen, de hoogste absolute aantallen op 64 en 73 dagen. De TCRβ transductie status was vrij stabiel in de periode 35 tot 73 dagen, maar erg laag (figuur 18). In totaal werden 31 muizen uit het SCID-hu hanging drop model geanalyseerd, hun individuele transductiestatus is terug te vinden in ‘Transductiestatus SCID-hu hanging drop model (bijlage 3)’. Het SCID-hu hanging drop model leek minder efficiënt in het genereren van getransduceerde T-cellen dan het SCID-hu Thy/Liv injectie model. Analyse voor 64 dagen post-transplantatie lijkt optimaal, de tijdbeperkende factor is hierbij voornamelijk de TCRα getransduceerde fractie. 3.2.2. De specificiteit van de getransduceerde cellen De tetrameerkleuringen uitgevoerd op de succesvol getransduceerde muizen binnen het SCID-hu hanging drop model waren negatief. Mogelijks waren de gebruikte tetrameren te oud en niet meer functioneel. De experimenten zijn nog niet opnieuw uitgevoerd, zodat deze hypothese niet bevestigd kon worden. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 37 Discussie 1. Resultaten van het onderzoek Onze data bevestigen dat door HSC te transduceren met de genen coderend voor de TCRα en TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR en vervolgens te laten uitrijpen in een SCID-hu Thy/Liv injectie model, antigeenspecifieke T-cellen gemaakt kunnen worden. In het SCID-hu Thy/Liv hanging drop model is het nog niet gelukt antigeenspecifieke T-cellen te maken. Vier muizen van het SCID-hu Thy/Liv injectie model werden geanalyseerd naar specificiteit en leverden wel degelijk antigeenspecifieke T-cellen op. Binnen de TCRαβ getransduceerde fractie kleurde gemiddeld 14,8% aan met tetrameer. Binnen de TCRα only getransduceerde fractie werd 0,3% tot 0,9% antigeenspecifieke T-cellen gevonden en binnen de TCRβ only getransduceerde fractie 0,0% tot 2,7%. De hypothese dat TCRα only en TCRβ only getransduceerde T-cellen vaker een antigeenspecifieke TCR zouden tot expressie brengen dan niet-getransduceerde T-cellen kon niet aangetoond worden. Op basis van de analyse op dag 32 na injectie (figuur 15, B) zou dit vermoed kunnen worden, maar de analyse op dag 25 na injectie (figuur 14) levert tegenstrijdige evidentie wat betreft de TCRβ only getransduceerde T-cellen (‘de specificiteit van de getransduceerde T-cellen (3.1.4)’). Verder onderzoek is bijgevolg nodig om deze hypothese te bevestigen. Van de bestudeerde celpopulaties uit deze 4 muizen (zowel getransduceerde als niet-getransduceerde cellen) is 86,4% tot 96,2% CD4+ CD8+ DP en bevindt 1,2% tot 4,5% van de cellen zich in het CD8 SP, mature stadium en 2,6% tot 8,5% in het CD4 SP, mature stadium. In het SCID-hu Thy/Liv injectie model vond negatieve selectie plaats. Dit bleek uit de aanwezigheid van 0,6% tot 2,5% CD8SP cellen binnen de CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen (figuur 15, C). Hieruit kan geconcludeerd worden dat het SCID-hu Thy/Liv model de volledige uitrijping van T-cellen ondersteund. Een laatste conclusie uit onze resultaten betreft het tijdstip van analyse. Het heeft weinig zin in het SCID-hu Thy/Liv injectie model analyses te doen later dan 70 dagen post-injectie. Analyses worden best gedaan tussen de 27 en de 70 dagen post-injectie. Voor het SCID-hu hanging drop model geldt dezelfde conclusie, analyse best tussen de 35 en 64 dagen posttransplantatie. Deze enkele successen wijzen op de mogelijkheden van de techniek. Het doel is positieve en negatieve selectie verder te bestuderen en deze kennis vervolgens toe te passen op het OP9DL1 co-cultuur systeem om efficiënte generatie van tumorspecifieke T-cellen te bekomen die Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 38 in de kliniek gebruikt kan worden. Om na te gaan welke de inefficiënte en dus voor verbetering vatbare schakels zijn in het productieproces van antigeenspecifieke T-cellen werden bijkomende experimenten gedaan. Uit experimenten met T-cel klonen blijkt dat de CMV en de HA2 tetrameren specifiek die T-cellen aankleuren die de respectievelijke antigeenspecifieke TCR tot expressie brengen. De TCRαβ getransduceerde cellen zijn echter niet allemaal specifiek voor het bedoelde antigeen. De idee dat TCRαβ getransduceerde cellen een vaste specificiteit zouden hebben bepaald door de specificiteit van de getransduceerde TCR blijkt onjuist. Bij deze stelling werd geen rekening gehouden met het uiteindelijke gebruik van de getransduceerde TCR ketens in de assemblage van een TCR. CMV TCRβ getransduceerde cellen bleken slechts in 52% van de gevallen de CMV TCRβ keten effectief op hun membraan te hebben en dus in maximaal in 52% van de gevallen te gebruiken voor hun TCR. Mogelijks zijn in de gebruikte foetale lever CD34+ cellen, die beschouwd worden als HSC, cellen aanwezig die reeds TCR genherschikkingen achter de rug hebben en mogelijks is deze populatie dus niet zo zuiver als we dachten. Er werd echter geen literatuur gevonden om deze hypothese te ondersteunen. Een andere hypothese om de discrepantie tussen de aanwezigheid van NGFR, en het dus getransduceerd zijn met de TCRβ keten, en de afwezigheid van Vβ13 te verklaren is dat hoewel de T-cellen getransduceerd zijn met het TCRβ gen van een antigeenspecifieke TCR, ze toch een andere, endogeen herschikte TCRβ keten gekozen hebben om hun TCR te assembleren. Vanuit het in vivo T-cel ontwikkelingsmodel is dit niet zo verwonderlijk, TCRβ herschikking treedt op tot wanneer een pre-TCR een stopsignaal zendt. Dit zou impliceren dat het introduceren van een TCRβ keten in HSC niet noodzakelijkerwijs aanleiding geeft tot β-selectie en tot stop van TCRβ genherschikking zoals in natuurlijke omstandigheden het geval is. Mogelijks speelt de insertieplaats hier een rol, de insertie van het TCRβ gen gebeurt immers op een willekeurige plaats in het DNA van de HSC. Een tweede mogelijkheid is dat de pTα absoluut noodzakelijk is voor β-selectie en dat die pTα nog niet geëxpresseerd wordt in HSC. Mogelijks moeten eerst endogene TCRβ herschikkingen plaatsgrijpen vooraleer pTα geëxpresseerd wordt. In de literatuur vinden we echter terug dat TCRα de pTα kan vervangen, dus bij dubbel getransduceerde cellen wordt dit probleem niet verwacht, althans o.b.v de literatuur (Buer, 1997). Een boeiend gegeven is dat we in de NGFR positieve populatie met uitzondering van Vβ13 lagere frequenties van andere Vβ domeinen zien t.o.v. de NGFR negatieve populatie, wat er op wijst dat endogene herschikking in zekere mate toch geremd wordt, maar mogelijks niet even efficiënt als in vivo. Als endogene TCRβ herschikking doorgaat na transductie dan kunnen TCRαβ getransduceerde cellen ofwel de geïntroduceerde TCR tot expressie brengen, Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 39 ofwel een hybride waarvan specificiteit en affiniteit onvoorspelbaar zijn, ofwel een volledig endogene TCR gezien TCRα genherschikking sowieso doorgaat tot op het moment van positieve selectie. De tetrameer positieve cellen die gevonden werden in 2 van onze experimenten vormen geen mooi afgezonderde populatie. Tetrameerpositiviteit toont zich als een ‘smeer’ overgaand van negatief naar positief. Dit beeld ondersteunt de hypothese van de hybride TCR en van continuïteit in TCRβ genherschikking na transductie. 2. Risico’s van getransduceerde T-cellen Boven geformuleerde hypothese is erg relevant in het kader van het grootste gevaar van het via transductie richten van T-cellen: heterologe paring. Heterologe paring is het assembleren van een TCR met een endogene TCR keten en een geïntroduceerde TCR keten. De specificiteit van een hieruit verkregen hybride TCR is niet voorspelbaar en kan mogelijks leiden tot auto-immuniteit. Dit is één van de grote risico’s die deze vorm van cellulaire immunotherapie zou hebben in de klinische praktijk. Indien dit niet alleen in TCRα only en TCRβ only getransduceerde, maar ook in TCRαβ getransduceerde T-cellen zou gelden, zou steeds moeten worden nagegaan of TCRαβ getransduceerde T-cellen de geïntroduceerde TCR keten genen effectief gebruiken in hun TCR. Een test na transductie om de antigeenspecificiteit van de getransduceerde T-cellen na te gaan zou steeds nodig zijn. Bovendien is het niet gezegd dat een toename van affiniteit gepaard gaat met toename van effector functie. T-cellen met hoge affiniteit zouden een lagere in vivo efficaciteit kunnen hebben, omdat hun mogelijkheid om van één doelwitcel naar een volgende doelwitcel te migreren gedaald is (Moss, 2001). Er zijn reeds een aantal oplossingen bedacht om het risico op auto-immuniteit te verlagen. Een eerste optie is de introductie van cysteines in de constante regio van de getransduceerde TCRα en TCRβ ketens. Dit zou preferentiële onderlinge paring promoten en zo de totale oppervlakte expressie van de geïntroduceerde TCR ketens vergroten en de mismatch met endogene TCR ketens verkleinen (Kuball et al., 2007). Een tweede optie is de introductie van een mutatie in de getransduceerde TCR genen die paring met endogene eiwitten kan blokkeren (Moss, 2001). Het genetisch ontwerpen van T-cellen met een induceerbaar suïcide fenotype via de insertie van een herpes simplex virus thymidine kinase is een derde optie, bij ernstige auto-immuniteit kunnen de getransduceerde T-cellen dan gedood worden met acyclovir of ganciclovir (Helene, 1997), waardoor ook de auto-immuniteit verdwijnt. De vierde en elegantste oplossing zou echter een locatiespecifieke insertie van de TCR ketens zijn, op de plaats van de endogene TCR ketens. Op die manier wordt de in vivo situatie maximaal gerespecteerd en verwachten we stopzetting van TCRβ Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 40 genherschikking en bijgevolg efficiëntere generatie van antigeenspecifieke T-cellen. Momenteel is er veel onderzoek aan de gang om retro- en lentivirale insertie in het kader van gentherapie te oriënteren (Frecha et al., 2008). Hierdoor zal het mogelijk worden in de toekomst viraal genoom gericht in gastheergenoom te laten incorporeren, zodat nadelige bijwerkingen door insertionele mutagenese vermeden zullen worden. 3. Vooruitzichten en immunotherapie in breder perspectief Kanker is één van de belangrijkste oorzaken van sterfte wereldwijd: in 2004 stierven 7,4 miljoen mensen (13% van alle sterfte) ten gevolge van kanker. Long-, maag-, colorectale, lever- en borstkanker staan in voor het merendeel van de kankersterfte (WHO, 2009). Meer dan 30% van de kankersterfte zou voorkomen kunnen worden. Primaire preventie via levensstijl- en omgevingsaanpassingen blijft de meest geschikte manier om het probleem wereldwijd aan te pakken (Danaei et al., 2005). We mogen ons echter niet blindstaren op het voorkombare aspect. Implementatie van de primaire preventie verloopt langzaam en een projectie naar de toekomst voorspelt een exponentiële toename van de kankersterfte, met een geschatte 12 miljoen doden in 2030. Huidige therapie, wanneer zij aan de man komt, heeft vrij hoge genezingscijfers voor enkele van de meest voorkomende tumoren, zoals borstcarcinoom, cervixcarcinoom en colorectaal carcinoom. Bepaalde tumoren hebben echter een slechte prognose, omdat ze met de huidige standaardtherapieën niet goed te behandelen zijn (WHO, 2009). De huidige standaardtherapie voor de meeste tumoren is een combinatie van heelkundige resectie, chemotherapie en radiotherapie. Geen van deze drie technieken valt specifiek de tumor aan, steeds wordt gezond weefsel mede getroffen door de therapie. Bij heelkundige resectie is de anatomische onzekerheid over de begrenzing van een tumor de reden om gezond weefsel dat niet levensnoodzakelijk is mee te verwijderen. Chemotherapie wordt systemisch toegediend en doodt cellen via directe beschadiging van hun DNA (en RNA). Alle delende cellen zijn er vatbaar voor en het verschil in delingssnelheid tussen tumoren en normaal weefsel is niet zo groot. Dit resulteert in een nauw therapeutisch venster tussen effectieve behandeling van een tumor en toxiciteit voor normaal weefsel. De dosis en het schema van de chemotherapie zijn beperkt door de tolerantie van de normale weefsels, in het bijzonder de sneldelende weefsels, zoals het beenmerg en de gastro-intestinale tract mucosa. Radiotherapie voegt energie toe aan bestraalde weefsels, hierdoor ontstaat ionisatie en excitatie van atomen Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 41 en moleculen, wat zich uit in DNA enkel- en dubbelstreng breuken en bijgevolg celdood. Wederom kan niet vermeden worden dat gezond weefsel getroffen wordt (Kumar and Clark, 2005). Tal van ernstige bijwerkingen maken deze klassieke tumorbehandeling erg zwaar voor de patiënt en in veel gevallen kan genezing niet gegarandeerd worden. Chemotherapie en radiotherapie hebben de prognose van de meeste tumoren enorm verbeterd, wat maakt dat we nu steeds vaker geconfronteerd worden met hun lange termijn bijwerkingen. Eén ervan is uitermate lastig, maar onvermijdbaar, gezien zij intrinsiek is aan het werkingsmechanisme. Tien tot twintig jaar na genezing van de primaire tumor zien we namelijk het ontstaan van secundaire tumoren. Zowel chemo- als radiotherapie veroorzaken celdood door het induceren van mutaties in het genoom. Door hun gebrek aan specificiteit doen ze dit zowel in tumorcellen als in normale cellen (Kumar and Clark, 2005). Plaatsen we hier de elegante benadering van de immunotherapie tegenover, dan wordt de theoretisch superieure kracht ervan duidelijk. Tumorspecifieke T-cellen kunnen specifiek migreren naar antigeenexprimerende tumorsites onafhankelijk van de locatie ervan in het lichaam, ze kunnen zelfs diep in de weefsels doordringen. Daarenboven kunnen T-cellen blijven prolifereren als antwoord op immunogene antigenen geëxpresseerd door de tumor, totdat alle tumorcellen verdwenen zijn. Tot slot kan een immunologisch geheugen opgebouwd worden om bij recidief antigeendragende tumoren uit te schakelen (Disis et al., 2009). Immunotherapie heeft echter ook theoretische nadelen, beperkingen en moeilijkheden. Een tumor kan gezien worden als een vreemd lichaam, maar meestal wordt hij door het lichaam gezien als lichaamseigen en is er geen afstotingsreactie. Deze niet-immunogene tumoren zijn bijgevolg niet direct behandelbaar via actieve immunotherapie (dit is het eigen immuunsysteem stimuleren e.g. via vaccinatie), passieve immunotherapie (e.g. door toedienen van tumorspecifieke T-cellen) is hier wel een mogelijkheid. Binnen een tumor kunnen er cellen zijn met sterk immunogene tumorantigenen en cellen met weinig immunogene tumorantigenen. Het immuunstelsel zal in staat zijn de ‘afwijkende’ tumorcellen met sterk immunogene tumorantigenen te doden, maar niet die met weinig immunogene tumorantigenen. Op deze wijze vindt een selectie plaats van een weinig immunogeen antigenrepertoire binnen de tumorcellen en stijgt de kans op ontsnapping aan het immuunstelsel van de overblijvende tumorcellen. Bijkomende moeilijkheden voor immunotherapie zijn de immunosuppressieve effecten van tumoren gemedieerd door o.a. TGFβ, oplosbaar Fas ligand en indolamine-2,3-dioxygenase. In de micro-omgeving van een Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 42 tumor zijn er naast immunostimulerende dus ook immunosupprimerende factoren en met immunotherapie doen we de balans overhellen naar de immunostimulerende zijde (Finn, 2008 ; WHO, 2009). In de praktijk bracht immunotherapie ons reeds hoopgevende resultaten bij patiënten met progressieve, therapieresistente ziekte (Mackensen et al., 2006 ; Morgan et al., 2006 ; Yee et al., 2002). Maar zoals in de inleiding aangehaald, zijn de resultaten tot nog toe niet in overeenstemming met de verwachtingen gegroeid uit haar theoretische nulli secundus positie. De zoektocht naar verklaringen en oplossingen voor het huidig beperkte succes is op volle gang. Een tumor kan op verschillende manieren ontkomen aan eliminatie door immunotherapie e.g. door MHC downregulatie op tumorcellen, door verandering van tumor antigenen, door verlies van de homing capaciteit van in vitro geproduceerde T-cellen, door tumor geïnduceerde T-cel deletie of door de onderdrukking van T-cel functie via door de tumor geproduceerde of geïnduceerde factoren (Gabrilovich, 2003). In een recente studie door Hunder et al. (2008) werd tumor escape voorkomen door de infusie van geëxpandeerde autologe CD4+ T-cel klonen om tumoraal geïnduceerde immunosuppressie te overwinnen bij patiënten met gemetastaseerd melanoma. Deze CD4+ T-cellen coördineerden een effectieve, verlengde anti-tumorale immuunrespons. Deze bredere immuunrespons blokkeert waarschijnlijk ontsnappingsroutes zoals verlies van expressie van het target antigen, waarmee de tumor anders de immuuncontrole zou kunnen omzeilen (Weiner, 2008). Het is een boeiende periode in de ontwikkeling van tumorspecifieke therapieën, waaronder immunotherapie. Ondanks tot nog toe matig succes blijft het geloof groot. Verder onderzoek zal ons inzicht in de complexe interactie tussen het immuunstelsel en tumoren vergroten en ons helpen ons eigen verdedigingssysteem te ondersteunen in haar strijd tegen tumoren. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 43 Referentielijst ASAI O., LONGO DL., TIAN ZG., HORNUNG P.D., TAUB DD., RUSCETTI FW., MURPHY WJ. : Suppression of graft-versus-host disease and amplification of graft-versustumor effects by activated natural killer cells after allogeneic bone marrow transplantation. J Clin Invest, 1998, 101(9), 1835-42. BLATTMAN J.N., GREENBERG P.D. : Cancer immunotherapy: a treatment for the masses. Science, 2004, 305(5681), 200-5. BLOM B., SPITS H. : Development of human lymphoid cells. Annu. Rev. Immunol., 2006, 24, 287-320. BUER J., AIFANTIS I., DISANTO JP., FEHLING HJ., VON BOEHMER H. : T-cell development in the absence of the pre-T-cell receptor. Immunol Lett., 1997, 57(1-3), 5-8. DAVIS M.M., BJORKMAN P.J. : T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature, 1988, 334(6181), 395-402. DE SMEDT M., HOEBEKE I., PLUM J. : Human bone marrow CD34+ progenitor cells mature to T cells on OP9-DL1 stromal cell line without thymus microenvironment. Blood Cells Mol Dis., 2004, 33(3), 227-32. DIETRICH PY., LE GAL FA., DUTOIT V., PITTET MJ., TRAUTMAN L., ZIPPELIUS A., COGNET I., WIDMER V., WALKER PR., MICHIELIN O., GUILLAUME P., CONNEROTTE T., JOTEREAU F., COULIE PG., ROMERO P., CEROTTINI JC., BONNEVILLE M., VALMORI D. : Prevalent role of TCR alpha-chain in the selection of the preimmune repertoire specific for a human tumor-associated self-antigen. J Immunol., 2003, 170(10), 5103-9. DAZZI F., SZYDLO RM., CROSS NC., CRADDOCK C., KAEDA J., KANFER E., CWYNARSKI K., OLAVARRIA E., YONG A., APPERLEY JF., GOLDMAN JM. : Durability of responses following donor lymphocyte infusions for patients who relapse after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia. Blood, 2000, 96, 2712-16. DISIS ML., BERNHARD H., JAFFEE, EM. : Use of tumour-responsive T-cells as cancer treatment. Lancet, 2009, 373, 673-83. DUDLEY ME., WUNDERLICH JR., ROBBINS PF., YANG JC., HWU P., SCHWARTZENTRUBER DJ., TOPALIAN SL., SHERRY R., RESTIFO NP., HUBICKI AM., ROBINSON MR., RAFFELD M., DURAY P., SEIPP CA., ROGERS-FREEZER L., MORTON KE., MAVROUKAKIS SA., WHITE DE., ROSENBERG SA. : Cancer regression Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 44 and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science, 2002, 298, 850-4. DUNN G.P., OLD L.J., SCHREIBER R.D. : The three Es of cancer immunoediting. Annu. Rev. Immunol., 2004, 22, 329-60. FINN O.J. : Cancer immunology. N Engl J Med., 2008, 358(25), 2704-15. FRECHA C., SZECSI J., COSSET FL., VERHOEYEN E. : Strategies for targeting lentiviral vectors. Curr Gene Ther., 2008, 8(6), 449-60. GABRILOVICH D., PISAREV V. : Tumor escape from immune response: mechanisms and targets of activity. Curr Drug Targets, 2003, 4(7), 525-36. GAO Q., QIU SJ., FAN J., ZHOU J., WANG XY., XIAO YS., XU Y., LI YW., TANG ZY. : Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T-cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection. J Clin Oncol, 2007, 25, 2586-93. GATTINONI L., POWELL D.J., Jr., ROSENBERG S.A., RESTIFO N.P. : Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol., 2006, 6(5), 383-93. HELENE M., LAKE-BULLOCK V., BRYSON J.S., JENNINGS C.D., KAPLAN A.M. : Inhibition of graft-versus-host disease. Use of a T cell-controlled suicide gene. J. Immunol., 1997, 158, 5079-82. HUGHES MS., YU Y.Y., DUDLEY ME., ZHENG Z., ROBBINS PF., LI Y., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther., 2005, 16(4), 457-72. JANEWAY C.A., TRAVERS P., WALPORT M., SHLOMCHIK M.J. : Immunobiology. Garland Science Publishing, New York, 2005. JENKINSON E.J., FRANCHI LL., KINGSTON R., OWEN J.J. : Effect of deoxyguanosine on lymphopoiesis in the developing thymus rudiment in vitro: application in the production of chimeric thymus rudiments. Eur. J. Immunol., 1982, 12(7), 583-7. KODAMA H., NOSE M., NIIDA S., NISHIKAWA S., NISHIKAWA S. : Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Exp. Hematol., 1994, 22(10), 979-84. KINGSTON R., JENKINSON E.J., OWEN J.J. : A single stem cell can recolonize an embryonic thymus, producing phenotypically distinct T-cell populations. Nature, 1985, 317(6040), 811-3. LEHAR S.M., BEVAN M.J : T cell development in culture. Immunity, 2002, 17(6), 749-56. MACKENSEN A., MEIDENBAUER N., VOGL S., LAUMER M., BERGER J., ANDREESEN R. : Phase I study of adoptive T-cell therapy using antigen-specific CD8+ T Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 45 cells for the treatment of patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol., 2006, 24(31), 5060-9. LOKHORST HM., SCHATTENBERG A., CORNELISSEN JJ., VAN OERS MHJ., FIBBE W., RUSSEL I., DONK NWCJ., VERDONCK LF. : Donor lymphocyte infusions for relapsed multiple myeloma after allogeneic stem-cell transplantation: predictive factors for response and long-term outcome. J. Clin. Oncol., 2000, 18, 3031-37. MAILLARD I., FANG T., PEAR WS. : Regulation of lymphoid development, differentiation, and function by the notch pathway. Annu Rev Immunol., 2005, 23, 945-74. MCCUNE J.M. : Development and applications of the SCID-hu mouse model. Semin. Immunol., 1996, 8(4), 187-96. MCCUNE J.M., NAMIKAWA R., KANESHIMA H., SHULTZ L.D., LIEBERMAN M., WEISSMAN I.L. : SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science, 1988, 241, 1632–1639. MORGAN R.A., DUDLEY M.E., WUNDERLICH J.R., HUGHES M.S., YANG J.C., SHERRY R.M., ROYAL R.E., TOPALIAN S.L., KAMMULA U.S., RESTIFO N.F., ZHENG Z., NAHVI A., DE VRIES C.R., ROGERS-FREEZER L.J., MAVROUKAKIS S.A., ROSENBERG S.A. : Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science, 2006, 314(5796), 126-9. MOSS P. : Redirecting T cell specificity by TCR gene transfer. Nat Immunol., 2001, 2(10), 900-1. MUELLER N. : Overview of the epidemiology of malignancy in immune deficiency. J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 1999, 21, Suppl 1: S5-10. NAMIKAWA R., WEILBAECHER K.N., KANESHIMA H., YEE E.J., MCCUNE J.M. : Long-term human hematopoiesis in the SCID-hu mouse. J Exp Med., 1990, 172(4), 1055-63. PAGES F., BERGER A., CAMUS M., SANCHEZ-CABO F., COSTES A.,MOLIDOR R., MLECNIK B., KIRILOVSKY A., NILSSON M., DAMOTTE D., MEATCHI T., BRUNEVAL P., CUGNENC PH., TRAJANOSKI Z., FRIDMAN WH., GALON J. : Effector memory T-cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med, 2005, 353, 2654-66. PLUM J., DE SMEDT M., VERHASSELT B., KERRE T. VANHECKE D., VANDEKERCKHOVE B., LECLERCQ G. : Human T lymphopoiesis. In vitro and in vivo study models. Ann N Y Acad Sci., 2000, 917, 724-31. ROBBINS PF., DUDLEY ME., WUNDERLICH J., EL-GAMIL M., LI YF., ZHOU J., HUANG J., POWELL DJ., ROSENBERG S.A. : Cutting edge: persistence of transferred Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 46 lymphocyte clonotypes correlates with cancer regression in patients receiving cell transfer therapy. J Immunol., 2004, 173, 7125-30. ROSENBERG SA., RESTIFO NP., YANG JC., MORGAN RA., DUDLEY ME. : Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer, 2008, 8(4), 299-308. SCHMITT T.M., ZUNIGA-PFLUCKER J.C. : Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity., 2002, 17(6), 749-56. SCHMITT T.M., ZUNIGA-PFLUCKER J.C. : T-cell development, doing it in a dish. Immunol Rev., 2006, 209, 95-102. SHANKARAN V., IKEDA H., BRUCE A.T., WHITE J.M, SWANSON P.E., OLD L.J., SCHREIBER R.D. : IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature, 2001, 410(6832), 1107-11. SIM GK., OLSSON C., AUGUSTIN A. : Commitment and maintenance of the alpha beta and gamma delta T cell lineages. J Immunol., 1995, 154(11), 5821-31. SPANGRUDE G.J., HEIMFELD S., WEISSMAN I.L. : Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science, 1988, 241(4861), 58-62. SPITS H. : Development of alphabeta T cells in the human thymus. Nat. Rev. Immunol., 2002, 2(10), 760-72. VERHASSELT B., NAESSENS E., VERHOFSTEDE C., DE SMEDT M., SCHOLLEN S., KERRE T., VANHECKE D., PLUM J. : Human immunodeficiency virus nef gene expression affects generation and function of human T cells, but not dendritic cells. Blood, 1999, 94(8), 2809-18. WEINER LM. : Cancer immunotherapy -- the endgame begins. N Engl J Med., 2008, 358(25), 2664-5. WHO : Cancer Factsheet N°297, February 2009. Opgehaald op 7 april 2009, van http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html YEE C., THOMPSON J.A., BYRD D., RIDDELL S.R., ROCHE P., CELIS E., GREENBERG P.D. : Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2002, 99(25), 16168-73. ZEHN D., BEVAN M.J. : T cells with low avidity for a tissue-restricted antigen routinely evade central and peripheral tolerance and cause autoimmunity. Immunity, 2006, 25(2), 26170. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 47 ZHANG L., CONEJO-GARCIA J.R., KATSAROS D., GIMOTTY P.A., MASSOBRIO M., REGNANI G., MAKRIGIANNAKIS A., GRAY H., SCHLIENGER K., LIEBMAN M.N., RUBIN S.C., COUCKOS G. : Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med., 2003, 348(3), 203-13. ZOU W. : Regulatory T-cells, tumor immunity and immunotherapy. Nat. Rev. Immunol, 2006, 6, 295-307. Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 48 Bijlage 1: Transductiestatus SCID-hu Thy/Liv injectie model Figuur 1. Analyse dag 82 post-injectie Figuur 2.. Analyse dag 27 post-injectie (1) Figuur 3. Analyse dag 27 post-injectie (2) Figuur 4. Analyse dag 53 post-injectie Figuur 5. Analyse dag 70 post-injectie Figuur 6. Analyse dag 45 post-injectie Figuur 7. Analyse dag 82 post-injectie Figuur 8. Analyse dag 94 post-injectie Figuur 9. Analyse dag 95 post-injectie Figuur 10. Analyse dag 32 post-injectie Figuur 11. Analyse dag 73 post-injectie Figuur 12. Analyse dag 82 post-injectie Bijlage 2: Nagaan Vβ repertoire en aanwezigheid van TCRγδ Tcellen NGFR+ % TCRγδ Vβ13 Vβ2 Vβ5 Vβ7 Vβ8 Vβ12 Vβ17 Vβ22 totaal (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 0,75 0,6 42,90 0,0 1,2 2,4 2,2 2,7 3,4 0,5 7,35 0,4 45,05 0,3 0,3 0,7 0,4 0,3 1,1 0,2 28,05 0,1 2,40 4,6 1,9 2,4 3,1 2,4 4,9 2,1 63,85 0,1 2,60 5,0 1,4 2,0 2,0 1,6 4,0 1,9 eGFP+ NGFR+ eGFPNGFReGFP+ NGFReGFP- Tabel 1. Nagaan Vβ-repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-cellen binnen CMV-specifieke TCR getransduceerde cellen gegenereerd in een SCID-hu Thy/Liv injectie model (analyse dag 28 post-injectie). De weergegeven cijfers zijn percentages van het totaal aantal levende lymfocyten, de eerste kolom (%totaal) geeft aan wat de verhouding NGFR+ en NGFR- cellen is binnen die populatie, de andere kolommen geven aan in welk percentage van de cellen het onderzochte Vβ domein (of de TCRγδ) teruggevonden werd. De cijfers in de kolommen %totaal en Vβ13(%) zijn het gemiddelde van 2 metingen (die zeer goed overeenkomen), de cijfers in de andere kolommen zijn afkomstig uit een eenmalige meting. Bijlage 3: Transductiestatus SCID-hu hanging drop model Figuur 1. Analyse dag 66 post-transplantatie Figuur 2. Analyse dag 72 post-transplantatie (1) Figuur 3. Analyse dag 72 post-transplantatie (2) Figuur 4. Analyse dag 73 post-transplantatie Figuur 5. Analyse dag 35 post-transplantatie Figuur 6. Analyse dag 64 post-transplantatie (1) Figuur 7. Analyse dag 64 post-transplantatie (2)
