View/Open - Howest DSpace

Optimalisatie van HRMCA
toepassingen
• Genotypering BRCA1/2 SNP’s
• Mutatiescanning NF1
Filip Slabbinck
Overzicht
• Inleiding
• Borstkanker
• Neurofibromatose type 1
• Technieken: HRMCA
– Mutatiedetectie
– Genotypering met behulp van ongelabelde probes
• Resultaten
• Conclusie
Inleiding en doelstelling
• BRCA1/2 gescreend dmv High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA)
• NF1 gescreend dmv directe sequenering op cDNA  omslachtig en
arbeidsintensief
• Algemene doelstelling: optimaliseren van 2 HRMCA toepassingen
– Genotypering mbv ongelabelde probes van BRCA1/2 SNP’s
– Mutatiescanning van het NF1 gen
Borstkanker
• Incidentie
– 2e grootste doodsoorzaak
– meest voorkomende kanker bij vrouwen
– Risico-ontwikkeling: ± 1 op 10
– 1% borstkankerpatiënten zijn mannen
Borstkanker
• Genetische gevoeligheid
– 80% sporadische kanker
– 5-10% genetische oorzaak
– Onderscheid erfelijke en familiale borstkanker
• Erfelijk
–
–
–
–
5-8% alle borstkankers
Autosomaal dominant
80% families een BRCA-mutatie
Verhoogd risico op ovariumkanker
• Familiaal
– 15% alle borstkankers
– 15-30% families een BRCA-mutatie
– verhoogd risico op ovariumkanker
Borstkanker
• BRCA1/2
– BRCA1
• Positie: 17q21
• 24 exonen
– BRCA2
• Positie: 13q12.3
• 27 exonen
– Tumorsuppressorgenen
• Verantwoordelijk voor 70-80% van alle erfelijke borstkankers
• Personen met mutatie  verhoogd risico
Neurofibromatose type 1 (NF1)
• Klinische aspecten en diagnostische criteria
–
–
–
–
Neurofibromatose type 1 of ziekte van Von Recklinghausen
Autosomaal dominant
NF1 tumorsuppressorgen
Variabele expressie
Neurofibromatose type 1 (NF1)
• NF1 gen
– Positie: 17q11.2
– 60 exonen
– Mutatie analyse  moeilijk
Technieken: HRMCA
• LCGreen Plus
– dsDNA-verzadigende fluorescente kleurstof
Technieken: HRMCA
• Mutatiedetectie met HRMCA
– Principe: thermostabiliteit
– T : dsDNA denatureert  ssDNA
– Smeltcurve: fluorescentie uitgezet tov temperatuur
100%
fluorescentie
0% fluorescentie
Technieken: HRMCA
• Genotypering mbv
ongelabelde probes
• Eenvoudig en snel
• Asymmetrische PCR
• Probelengte: 20-30 bp
Resultaten
• Genotypering mbv ongelabelde probes
– 4 genotyperingsprotocols geoptimaliseerd
– Belangrijke parameters: Ta, DMSO en aantal cycli
• SNP c.562-34 C>T BRCA1 8: Ta 53°C, 50 cycli en 3% DMSO
CC
TT
CT
• SNP c.2201 C>T BRCA1 11.8 en 11.9
– Ta 58°C, 50 cycli: links BRCA1 11.8, rechts BRCA1 11.9
CC
TT
CC
TT
CT
CT
• SNP c.7470 G>A BRCA2 14.2
– Ta 53°C, 55 cycli
GG
AA
GA
• 1 probe  verschillende SNP’s (vb. SNP c.2201 C>T en SNP c.2196 G>A)
Legende:
GA (heterozygoot)
GG (homozygoot wild type)
CC (homozygoot wild type)
CT (heterozygoot)
TT (homozygoot variant)
• Validatie dmv een blinde screening
– 95 patiënten
– 3 SNP’s met 100% accuratie detectie
TT
CC
CT
Resultaten
• Mutatiescanning van het NF1 gen
– 11 van de 60 exonen geoptimaliseerd met PCR55
– Exon 2 geoptimaliseerd na sequeneren
•
Na sequeneren rode curven = SNP (c.168 C>T (p.Ser56Ser))
– Belangrijke parameter: lengte
– Validatie van ieder exon gebeurt met positieve en negatieve controles
Conclusie
• HRMCA
–
–
–
–
Eenvoudig
Snel
Goedkoop
gevoelig
• Genotypering mbv ongelabelde probes
– Doorgedreven optimalisatie is vereist
• Mutatiescanning van het NF1 gen
– Toekomst: na validatie  overschakeling naar HRMCA
• Algemeen
– Optimalisatie HRMCA protocols  sterke reductie sequeneren
Dank aan
Kathleen Claes
Mieke Demeyere
Kim De Leeneer
Ilse Coene
Justine Simkens