Verterende bodembacteriën

Verterende bodembacteriën?
-Aanwezigheid van amylase-producerende bacteriën in de bodem-
Samenvatting
Bodembacteriën zijn belangrijk voor het milieu, onder andere omdat zij allerlei stoffen kunnen
afbreken. Dit wordt gedaan door enzymen die door de bacteriën uitgescheiden worden. Een
voorbeeld van een dergelijk enzym is amylase. Amylase breekt zetmeel af tot glucose en
wordt veel in de industrie gebruikt. Ook in de bodem komt amylase voor. In dit experiment
gaan we bodemmonsters screenen op de aanwezigheid van amylase producerende
bacteriën.
Inleiding
Gestorven planten, dieren en micro-organismen blijven als organisch materiaal achter in de
bodem. Dit organisch materiaal bestaat uit hoogmoleculaire en dus energierijke stoffen.
Hoogmoleculaire stoffen zijn stoffen met een hoge molecuulmassa. De gestorven
organismen dienen als voedingsstof voor andere organismen. Veel organismen kunnen de
hoogmoleculaire stoffen echter niet direct gebruiken. Hiervoor moeten ze eerst worden
afgebroken in laagmoleculaire stoffen. Ze worden als het ware verteerd tot kleine moleculen
die door de cel gemakkelijk opgenomen kunnen worden. Deze extracellulaire vertering wordt
ook wel de hydrolyse van de moleculen genoemd.
De enzymen komen op verschillende manieren in de bodem terecht. Ze kunnen betrokken
zijn bij de stofwisseling binnen de bacteriecel. Wanneer deze bacterie sterft, kunnen de
enzymen vrijkomen. Ook kunnen enzymen uitgescheiden worden door levende
bodembacteriën om hun werk buiten de cel uit te voeren. Enzymen die met dat doel in de
bodem worden losgelaten (extra-cellulaire enzymen), worden wel exo-enzymen genoemd.
Normaal gesproken kunnen enzymen niet lange tijd werkzaam blijven na uitscheiding. Dit
komt omdat ze gedenatureerd of afgebroken worden door andere enzymen. Wanneer een
enzym gedenatureerd is, verliest het zijn werking. De enzymen kunnen dan niet meer de
hoogmoleculaire stoffen afbreken tot laagmoleculaire stoffen. Soms echter blijven enzymen
na het vrijkomen wel vrij lang werkzaam. Dit komt waarschijnlijk doordat ze aan humus of
kleideeltjes gebonden zitten.
Een voorbeeld van in de bodem voorkomend exo-enzym is amylase. Dit enzym breekt o.a.
zetmeel af tot glucose. Glucose kan dan vervolgens gemakkelijk door bacteriën opgenomen
worden om als koolstof- en energiebron gebruikt te worden. Het doel van deze proef is om
de amylase productie te testen van in de grond voorkomende organismen.
Doel
Het screenen van bodemmonsters op de aanwezigheid van amylase producerende bacteriën.
Theorie
Zetmeel kan worden beschreven als een keten van aan elkaar gekoppelde
glucosemoleculen. Een rechte zetmeelketen wordt amylose genoemd. Een vertakte
polymeer wordt amylopectine genoemd. Beide polymeren kunnen worden afgebroken door
het genoemde exo-enzym amylase. In figuur 1 staat meer informatie over de enzymreactie
zelf. De structuurformules kun je vinden in het Binastabellenboek, tabel 67.
Op een voedingsbodem waarin zich zetmeel bevindt, zal de amylaseproducerende bacterie
zich kunnen voortplanten. Dit zal resulteren in een afname van de hoeveelheid zetmeel op
de plaatsen waar de bacterie zich bevindt. Jood is een indicator voor zetmeel en niet voor
glucose. In de proef zal met behulp van jood worden aangetoond waar zetmeel is
afgebroken.
Micro-organismen zijn overal aanwezig, niet alleen in de bodem, maar ook in de lucht en aan
je eigen handen. Daarom is het van belang dat er bij deze proef steriel gewerkt wordt.
Anders zou het namelijk door een verontreiniging in de proef kunnen lijken alsof er amylase
aanwezig is in het onderzochte stukje bodem, terwijl dit niet zo is.
Er zal onder andere met steriel water en een steriele petrischaal worden gewerkt. Het
overplaatsen van de bacteriesuspensie in een petrischaal moet dan ook op een steriele wijze
gedaan worden.
Aangrijpingspunten enzymen
Amylose en amylopectine zijn aan elkaar gebonden door (1-4) bindingen; de zijtakken in
amylopectine zijn aan deze ketens gebonden door (1-6) bindingen. De belangrijkste in de handel
verkrijgbare amylases zijn:
-amylase: dit hydrolyseert (1-4) bindingen in polymeren van glucose, maar alleen binnen de
ketens; dit leidt tot korte ketens (dextrinen). Op industriële schaal wordt het gewonnen uit bacteriën.
-amylase: dit hydrolyseert (1-4) bindingen in polymeren van glucose, zodanig dat aan het eind van
een keten twee glucose moleculen worden afgesplitst. Deze delen worden ook wel maltose genoemd.
Het kan (1-6) bindingen niet passeren. In de industrie wordt het verkregen uit gerst en mout.
amyloglucosidase: dit enzym breekt (1-4) bindingen, zodanig dat steeds glucose wordt afgesplitst
van de einden van de ketens. Het kan (1-6) bindingen niet passeren. Het wordt voornamelijk uit
schimmels geïsoleerd.
(1-6) glucosidase: dit hydrolyseert (1-6) bindingen en komt uit verschillende soorten bacteriën.
Figuur 1: Enzymreactie
Uitvoering
Dit experiment is een bewerking van het experiment ‘Amylase uit bodembacteriën’ van het
Europees Initiatief voor Biotechnologische Educatie.
Materialen
-
1 gram luchtdroge grond, op 10 cm diepte verzameld
steriele petrischalen met daarin 15 à 20 mL zetmeelvoedingsagar
15 mL steriel water in afgesloten flesje
joodoplossing (in KI-oplossing)
steriele wattenstaafjes
markeerstift (om op petrischalen te schrijven)
broedstoof van 30 °C
Proefbeschrijving
-
Het bodemmonster. Omdat we micro-organismen gaan bekijken die in de bodem leven,
moeten we natuurlijk grond hebben. Er leven heel veel micro-organismen in de grond,
dus een theelepel is meer dan voldoende. Om kwalitatief goede bacteriën te hebben,
moet je eerst een beetje graven, 10 cm is voldoende diep.
- De grond moet eerst drogen, omdat er anders teveel vocht
in zit. Dit kun je doen door de grond een paar uur in de
stoof (of exsiccator) te zetten of door het een hele nacht in
het lokaal te laten staan.
- Voor het experiment heb je 1 gram grond nodig, weeg dit
af.
- Het suspenderen van het monster. Neem de afgewogen
grond en voeg deze bij de buis met 15 mL steriel,
gedestilleerd water. Schud dit krachtig zodat de grond
goed wordt gesuspendeerd.
- Het uitplaten. Schrijf duidelijk met een marker je naam op
zowel het deksel als de bodem van de petrischaal.
Vermeld ook de plaats waar het bodemmonster vandaan
kwam. Neem een steriel wattenstaafje en doop deze in de
Figuur 2: Een geënte
zojuist gemaakte suspensie. Strijk met het vochtige
petrischaal
wattenstaafje over de voedingsbodem. Maak hierbij een
zigzagbeweging zoals aangegeven in figuur 2. Open de
petrischaal alleen in de buurt van een gasvlam.
- Zet de petrischaal op zijn kop in de stoof gedurende 2 à 3 dagen bij 30 C. De schaal
moet op de kop omdat anders de condens die eventueel ontstaat de groeiende bacteriën
zou kunnen laten uitvloeien.
Veiligheid
Als het niet toegestaan is of niet wenselijk wordt geacht om met onbekende organismen te
werken kan desnoods een cultuur van Bacillus subtilis worden gebruikt in plaats van de
bodemorganismen. Bij de uitvoering van dit practicum moet zo steriel mogelijk worden
gewerkt. Het is niet verstandig cultures te kweken vanuit de (niet bekende) organismen op
deze platen.
Joodoplossing wordt vaak gebruikt. Men zou daarom kunnen vergeten dat het een giftig
mengsel is.
Resultaten
Giet voorzichtig een klein beetje van de joodoplossing over de plaat zodat er ongeveer een
laagje van 1 mm over de hele plaat vloeit. ontstaat. Wacht een minuut en giet dan het teveel
aan joodoplossing af.
Beschrijf nauwkeurig wat je ziet op de plaat. Maak een tekening of maak een duidelijke foto.
Vragen
1. Hoe verklaar je de verschillende kleuringen op de plaat?
2. Op welke plekken is de amylase afgebroken door de bacteriën?
3. Waarom zien niet alle platen er hetzelfde uit?
Documentatie
European Initiative for Biotechnology Education, module N°1: Inleiding Biotechnologie
(1998).