Bekijk online

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk
uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen
dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014-2015
GESLACHTSBEPALING VAN EMBRYO’S BIJ DE MENS, RUND EN
PAARD
door
Eline VERCRUYSSE
Promotoren: Prof. dr. Peter Daels
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2015 Eline Vercruysse
Voorwoord
Allereerst zou ik graag mijn promotor, Prof. Peter Daels, bedanken voor het enthousiasme waarmee hij
me geholpen heeft. Ook Phd Pouya Dini wil ik bedanken voor het verwerven van inzicht in de
verschillende technieken, beschreven in mijn literatuurstudie.
Ik wil Ignace Moyaert van de VRV bedanken voor de PowerPoint die hij me mailde in verband met de
technieken die VRV toepast voor de geslachtsbepaling van embryo’s.
Tot slot wil ik ook mijn ouders, mijn vriend en mijn zus bedanken voor hun onvoorwaardelijke steun
gedurende de voorbije jaren.
VOORBLAD
TITELBLAD
VOORWOORD
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .................................................................................................................................................... 1
INLEIDING............................................................................................................................................................... 2
LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................................................. 3
1.
ANATOMIE EN FYSIOLOGIE VAN DE GONADEN ....................................................................................... 3
2.
VERSCHILLENDE GENEN DIE INWERKEN OP DE GESLACHTSBEPALING ............................................ 6
3.
2.1.
GENEN SPECIFIEK VOOR HET MANNELIJK GESLACHT .................................................................. 6
2.2.
GENEN SPECIFIEK VOOR HET VROUWELIJK GESLACHT .............................................................. 6
2.3.
GENEN SPECIFIEK VOOR BEIDE GESLACHTEN .............................................................................. 7
TECHNIEKEN BIJ MENS, RUND EN PAARD: WAT WORDT ER VANDAAG DE DAG GEDAAN? .............. 8
3.1.
BIOPSIE VAN HET EMBRYO ................................................................................................................ 8
3.1.1.
Algemeen ...................................................................................................................................... 8
3.1.2.
Biopsie bij het humane embryo ..................................................................................................... 8
3.1.2.1.
Single cel biopsie bij vroege embryo’s .................................................................................. 9
3.1.2.2.
Biopsie van een morula ........................................................................................................ 9
3.1.2.3.
Biopsie van een blastocyst ................................................................................................. 10
3.1.2.4.
Collectie van blastocoelvocht ............................................................................................. 10
3.1.3.
Biopsie bij het bovine embryo...................................................................................................... 11
3.1.4.
Biopsie bij het equine embryo ..................................................................................................... 11
3.2.
ANALYTISCHE TECHNIEKEN ............................................................................................................ 13
3.2.1.
Bespreking van de technieken .................................................................................................... 13
3.2.1.1.
Detecteren van geslacht-specifiek DNA ............................................................................. 13
3.2.1.1.1.
Polymerase chain reaction (PCR) ................................................................................... 13
3.2.1.1.2.
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ............................................................. 14
3.2.1.1.3.
Fluorescence in situ hybridization (FISH) ........................................................................ 16
3.2.1.2.
3.2.2.
Detecteren van geslachts-specifiek RNA............................................................................ 18
Toepassing bij mens, rund en paard ........................................................................................... 18
3.2.2.1.
Mens ................................................................................................................................... 18
3.2.2.2.
Rund ................................................................................................................................... 19
3.2.2.2.1.
PCR................................................................................................................................. 19
3.2.2.2.2.
LAMP .............................................................................................................................. 21
3.2.2.2.3.
FISH ................................................................................................................................ 23
3.2.2.3.
Paard .................................................................................................................................. 23
3.2.2.3.1.
PCR op DNA sequenties ................................................................................................. 23
3.2.2.3.2.
PCR op een RNA sequentie............................................................................................ 24
BESPREKING ....................................................................................................................................................... 25
REFERENTIELIJST .............................................................................................................................................. 27
SAMENVATTING
Het geslacht van een toekomstig individu wordt vastgelegd op het moment van de bevruchting wanneer
een X-chromosoom van de moeder versmelt met een Y- of X-chromosoom van de vader. In een eerste
fase van de ontwikkeling kan er anatomisch nog geen onderscheid worden gemaakt tussen een
vrouwelijk en mannelijk embryo. In een tweede fase vindt de differentiatie plaats en is het mogelijk om
het geslacht van de foetus te bepalen met behulp van bijvoorbeeld echografie. Bij het rund en het paard
wil men, om onder andere economische redenen, geslachtsratio’s zelf kunnen bepalen en beïnvloeden.
Door het geslacht te bepalen tijdens de embryonale fase, kan men het niet gewilde geslacht uitsluiten
op een vroeg tijdstip in de ontwikkeling. Bij de mens is de geslachtsbepaling van embryo’s slecht een
klein deel van preimplantation genetic diagnosis (PGD) maar is het wel interessant voor koppels die
geslachtsgebonden genetische ziektes dragen. Voor de geslachtsbepaling gaat men cellen collecteren
van een in vivo of in vitro bekomen embryo. Vervolgens gaat men hoofdzakelijk op zoek naar een Yspecifieke DNA sequentie door middel van polymerase chain reaction (PCR), loop-mediated isothermal
amplification (LAMP) of fluorescence in situ hybridization (FISH). Voor de bepaling van het geslacht is
het van belang dat de gebruikte technieken accuraat en precies zijn. Bijkomend moeten deze
technieken, voor het rund en paard, goedkoop en snel uitvoerbaar zijn. Bij de mens is voornamelijk FISH
beschreven voor de geslachtsbepaling. Bij het rund zijn zowel PCR, FISH als LAMP toepasbaar in de
praktijk maar verdient LAMP de voorkeur door de efficiëntie van uitvoering. Door de complexiteit van
het equine embryo is PCR voorlopig de enige techniek beschikbaar bij het paard.
Key words: embryo, fluorescence in situ hybridization, geslachtsbepaling, loop-mediated
isothermal amplification, polymerase chain reaction
1
INLEIDING
Bij de mens is de geslachtsbepaling van embryo’s interessant voor koppels die drager zijn van een
genetische ziekte of vrouwen die problemen hebben met herhaalde spontane abortussen. Door het
gebruik van preimplantation genetic diagnosis (PGD) wil men geslachtsgebonden genetische ziektes bij
hun nakomelingen uitsluiten en/of een abortus vermijden. In Europa is preimplantation genetic
diagnosis, afhankelijk van de nationale wetgeving, ofwel verboden ofwel toegestaan ofwel wordt het
uitgeoefend maar niet aanbevolen. De indicaties voor PGD zijn chromosoom afwijkingen, X-gelinkte
ziektes of een ziekte die één enkel gen aantast (Basille et al., 2009). Preimplantation genetic diagnosis
is verschillend van amniocentese waarbij een punctie van het vruchtwater wordt genomen. Deze
vruchtwaterpunctie is mogelijk vanaf vijftien weken van de zwangerschap tot aan de uitgerekende
datum. Met deze techniek kan men eveneens chromosoom afwijkingen opsporen maar dit pas op een
later stadium in de ontwikkeling van de foetus terwijl preimplantation genetic diagnosis kan ingrijpen nog
voor het embryo zich innestelt in de baarmoeder. Zo kan men zwangere vrouwen, die een hoger risico
hebben op kinderen met genetische abnormaliteiten, meer zekerheid schenken. En eveneens hun
angst, die gepaard gaat met een zwangerschap, verminderen door de bevestiging van de afwezigheid
van genetische ziektes (Fasouliotis en Schenker, 1998).
Bij rund en paard is er een voorkeur wat betreft het geslacht van nakomelingen, voornamelijk op basis
van commerciële doeleinden. Het is bijvoorbeeld voordeliger om vaarskalveren te produceren op een
melkveehouderij. Op fokbedrijven kan men, met behulp van geslachtsbepaling, meer vrouwelijke
nakomelingen produceren om zo meer selectiemogelijkheden te creëren en strenger te selecteren. Bij
paarden is het eerder een individuele voorkeur voor een bepaald geslacht. Voor de Polosport is een
merrie meer gewenst om competities te rijden terwijl men liever hengsten heeft voor
dressuurcompetities. Ook bij volbloeden wordt meer betaald voor een hengst dan een merrie. Om die
redenen gaat men op zoek naar efficiënte technieken om geslachtsratio’s van nakomelingen te
beïnvloeden en zodoende te sturen. Het is noodzakelijk dat deze technieken zeer gevoelig en specifiek
zijn maar ze moeten ook goedkoop zijn en de resultaten moeten snel beschikbaar zijn.
2
LITERATUURSTUDIE
1. ANATOMIE EN FYSIOLOGIE VAN DE GONADEN
Het geslacht van het toekomstig individu wordt vastgelegd op het moment van de bevruchting. Een
mannelijk individu bevat een X en een Y chromosoom terwijl het vrouwelijk individu twee X
chromosomen bevat. Het seks chromosoom in de spermatozoa bepaalt of het embryo testis of ovaria
zal ontwikkelen. Zo zal een individu met een XXY configuratie testes vormen en een individu met een
XO configuratie ovaria (Wilhelm et al., 2007). Het geslacht komt pas tot uiting gedurende de foetale
ontwikkeling en alle secundaire veranderingen vinden plaats na de ontwikkeling van de gonaden en het
verwerven van hun endocriene functie.
De urogenitale kam ontstaat in het intermediaire mesoderm en bestaat uit drie segmenten namelijk het
pronefros, het mesonefros en het metanefros. Het mesonefros vormt de centrale regio van waaruit de
gonaden ontstaan en functioneert in de vroege ontwikkeling als primitieve nieren (Wilhelm et al., 2007).
Het segment wordt gedraineerd door mesonefrotische tubuli die samen fusioneren tot een
mesonefrotische buis, die op zijn beurt de primitieve urine naar de urogenitale sinus transporteert
(Senger P.L., 2005).
De ontwikkeling van de gonaden kan verdeeld worden in twee fasen (Wilhelm et al., 2007). In de eerste
fase zijn de gonaden bi-potentieel, ongedifferentieerd en bestaan uit een genitale kam die identiek is bij
het mannelijk en vrouwelijk embryo. De tweede fase bestaat uit de verdere ontwikkeling van de gonaden
tot testis of ovaria (figuur 1).
Fig. 1: Migratie van primordiale kiemcellen vanuit de dooierzak naar de genitale kam (uit Senger P.L.,
2005).
3
In de eerste fase wordt de genitale kam bevolkt door primordiale germinale cellen (PGC’s), afkomstig
uit de allantoïs (figuur 1). Ze migreren van de dooierzak naar de einddarm om zich uiteindelijk te vestigen
in de ongedifferentieerde gonaden, die gelegen zijn ventromediaal van het mesonefros.
Tijdens de migratie gaan de PGC’s delen waarbij hun aantal significant stijgt om uiteindelijk een
populatie van ongeveer drieduizend cellen te bereiken (Wilhelm et al., 2007). Eenmaal in de genitale
kam verliezen de PGC’s hun motiliteit. Ze blijven prolifereren binnenin de gonaden waarbij hun bipotentiele karakter behouden blijft. De PGC’s stimuleren lokaal bindweefsel om te delen waardoor
primitieve seks koorden ontstaan in de vorm van aaneengesloten strengen bindweefsel (Senger P.L.,
2005). Deze groeiende strengen zorgen ervoor dat de genitale kam groter wordt. Uit het mesonefros
ontstaan de buis van Wolff en de buis van Müller, die initieel bij beide geslachten aanwezig zijn en die
later het mannelijk respectievelijk het vrouwelijk geslachtsapparaat zullen vormen. De buis van Wolff, of
mesonefrotische buis, vormt een continue buis over de volledige lengte van de urogenitale kam. De buis
van Müller, of paramesonefrotische buis, wordt gevormd door invaginatie van het oppervlakte epitheel
van het mesonefros en loopt parallel met de mesonefrotische buis. Afhankelijk van de ontwikkeling van
testis of ovaria zal slechts één van de twee buizen zich verder ontwikkelen in het normale individu.
In een tweede fase vindt de differentiatie van het geslacht plaats. Hierbij is de aan- of afwezigheid van
het testis determing factor (TDF) gen of sex determining region Y (SRY) gen, aanwezig op het Y
chromosoom, bepalend of het mannelijk respectievelijk het vrouwelijk geslachtsapparaat tot
ontwikkeling komt (figuur 2).
Fig. 2: De verschillende stappen die leiden tot de formatie van het mannelijk respectievelijk het
vrouwelijk geslachtsapparaat (naar Senger P.L., 2005).
4
Bij het mannelijk individu worden onder invloed van de expressie van het SRY-gen bi-potentiële
precursoren aangezet welke gaan differentiëren in onder andere Sertollicellen. De Sertollicellen zijn het
eerste celtype dat differentieert en daarom de eerste indicator dat de ongedifferentieerde gonaden zich
ontwikkelen tot testis (Wilhelm et al., 2007). De Sertollicellen worden aanzien als het organisatorisch
centrum van de mannelijke gonaden en orkestreren de differentiatie van alle andere celtypes (Wilhelm
et al., 2007). Zo secreteren de Sertollicellen AMH (anti-Müllerse hormoon) waardoor de verdere
ontwikkeling van de buizen van Müller wordt stilgelegd en deze uiteindelijk degenereren (figuur 3).
Fig. 3: De ontwikkeling en differentiatie van het genitale buizen systeem (uit Wilhelm et al., 2007).
Een tweede belangrijk celtype dat gaat differentiëren uit de bi-potentiële precursoren zijn de
Leydigcellen. De Leydigcellen gaan androgenen produceren die ervoor zorgen dat de buizen van Wolff
verder differentiëren tot de epididymis, vas deferens en seminale vesikels (Wilhelm et al., 2007). Vijf tot
vijftien mesonefrotische tubuli penetreren de primitieve testis en maken verbinding met de primitieve
geslachtskoorden via de rete testis. Samen vormt het een netwerk van kleine buizen die de seminifere
tubuli verbinden met de efferente ducten, welke afkomstig zijn van de mesonefrotische tubuli. Deze
mesonefrotische buizen stimuleren de groei van de epididymis en ductus deferens (Senger P.L., 2007).
De primordiale germinale cellen die nu ingesloten zijn in de evoluerende buizen verliezen hun bipotentieel karakter en gaan in een mitotisch arrest als prospermatogoniën. Deze prospermatogoniën
blijven in dit stadium tot enkele dagen na de geboorte waarna ze terug beginnen te prolifereren.
Bij het vrouwelijk individu ontbreekt het SRY gen door de afwezigheid van het Y-chromosoom, waarop
de TDF locus aanwezig is. Doordat SRY niet aanwezig is in het vrouwelijk embryo differentiëren de
primitieve germinale cellen niet tot Sertollicellen en wordt er geen AMH geproduceerd. Door de
afwezigheid van AMH regresseren de buizen van Wolff en ontwikkelen de buizen van Müller verder tot
5
oviducten, uterus, cervix en craniale vagina (figuur 3). Het craniale deel van de paramesonefrotische
buizen blijft open in de peritoneale holte terwijl de caudale einden versmelten ter hoogte van de
aanhechting aan de caudale wand van de primitieve urogenitale sinus (Senger P.L., 2007). Ter hoogte
van de gonaden fragmenteren, in afwezigheid van TDF, de epitheliale strengen of seks koorden in
cellulaire clusters. Deze cellulaire clusters omsluiten een primitieve germinale cel waardoor zich
uiteindelijk een primordiale follikel ontwikkeld. Deze primordiale follikel is een oöcyt omringd door een
enkele laag granulosacellen. De PGC’s verliezen hun bi-potentiële karakter en ontwikkelen zich tot
miotische oöcyten. Deze oöcyten evolueren verder gedurende de eerste miotische profase tot aan de
geboorte waarna ze in arrest gaan (Wilhelm et al., 2007).
2. VERSCHILLENDE GENEN DIE INWERKEN OP DE GESLACHTSBEPALING
Dankzij het verschil in genexpressie tussen het mannelijk en vrouwelijk individu, is het mogelijk het
geslacht te bepalen in een vroeg ontwikkelingsstadium. Zo kan men, zoals verder wordt beschreven,
het SRY gen detecteren in het DNA van een pre-implantatie embryo met behulp van bijvoorbeeld PCR.
2.1.
GENEN SPECIFIEK VOOR HET MANNELIJK GESLACHT
De ontwikkeling van het geslacht van embryo’s is een resultaat van een genen expressie cascade en
een opeenvolging van signalen die plaatsvinden in de genitale kammen. De trigger voor het tot
ontwikkeling komen van het mannelijk geslacht is de expressie van het SRY gen in de genitale kam
(Ross et al., 2009). SRY codeert een DNA binding proteïne van de high mobility group (HMG) box family
dat noodzakelijk is voor de begeleiding van de testis determinatie. Is SRY niet aanwezig, of is de functie
ervan verzwakt dan ontwikkelen zowel de XX als XY gonaden tot ovaria (Nef et al., 2005).
SRY is een transcriptie factor die andere genen, specifiek voor het mannelijk geslacht, initieert. De
genen waarop SRY inwerkt zijn nog grotendeels onbekend maar een mogelijke kandidaat is het SOX9
gen (Wilhelm et al., 2007). SOX9 of het SRY-related HMG box containing gen encodeert een
transcriptiefactor die kritisch is voor de testis determinatie. SOX9 activeert onder andere de transcriptie
van AMH (Anti-Müllerse hormoon) die zorgt voor de regressie van het kanaal van Müller in mannelijke
embryo’s (Ross et al., 2009).
Andere genen gekend voor hun belang bij de geslachtsbepaling zijn AMH, WT1, SF1, DAX1 en DMRT1.
Deze genen zijn in meerdere vertebraten bewaard en tonen gonaden-specifieke expressie gedurende
de periode van geslachtsbepaling. Echter de sequentie, de geslachtsspecificiteit en timing van de
expressie verschilt tussen de verschillende species (Morrish en Sinclair, 2002). Verschillende genen
worden per diersoort vermeld bij de technieken voor de geslachtsbepaling. Een voorbeeld is het TSPY
(testis-specific protein Y-encoded) gen bij het rund of DYS14 bij de mens (Carneiro et al., 2011).
2.2.
GENEN SPECIFIEK VOOR HET VROUWELIJK GESLACHT
Voor meer dan vijftig jaar gaat men ervan uit dat de ontwikkeling van het vrouwelijk individu “the default
pathway” is. Dit doordat men zich voornamelijk richt op het feit dat SRY de ontwikkeling van het
mannelijk geslacht uitlokt terwijl de ontwikkeling van het vrouwelijk geslacht voortvloeit uit de
afwezigheid van SRY. Alhoewel men geen vrouwelijk determinerend gen, analoog aan SRY, heeft
6
kunnen identificeren, vermoedt men wel dat een specifiek programma voor de organogenese van de
ovaria geactiveerd wordt. Helaas zijn momenteel slechts enkele genen gekend die direct gelinkt zijn aan
de vroegste gebeurtenissen in de ontwikkeling van de ovaria, zoals follistatin, Wnt4, Bmp2, DAX1 en
GDF9 (Nef et al., 2005). Er is dus een nood aan kennis omtrent de moleculaire regulatie van de vroege
ovariële ontwikkeling en hun additionele genen.
De geslachtschromosomen van het embryo worden bepaald op het moment van de bevruchting
wanneer een oöcyt versmelt met een spermatozoa die ofwel een X chromosoom ofwel een Y
chromosoom draagt. Vrouwelijke embryo’s, die twee X-chromosomen dragen, bezitten potentieel
tweemaal de hoeveelheid X-gelinkte enzymen in vergelijking met het mannelijk embryo, die enkel één
X chromosoom bezit (De La Fuente et al., 1999). Om over-expressie te vermijden wordt één van de
twee X-chromosomen ad random geïnactiveerd in een vroeg stadium van de embryonale ontwikkeling.
De X-in activatie vereist een specifiek RNA namelijk het X-inactivated-specific transcript (Xist) RNA. Xist
is een lang, niet coderend RNA dat één X-chromosoom in elke vrouwelijke cel inactiveert door het te
coaten. Het Xist RNA wordt specifiek door het geïnactiveerd X-chromosoom tot expressie gebracht en
is bijgevolg beperkt tot het vrouwelijk individu. Het restant van het geïnactiveerd X-chromosoom blijft in
de kern aanwezig als het lichaampje van Barr.
2.3.
GENEN SPECIFIEK VOOR BEIDE GESLACHTEN
Het is van belang om genen die specifiek zijn voor beide geslachten te kunnen aantonen om de
betrouwbaarheid van een techniek en de aanwezigheid van DNA in het onderzochte staal te bevestigen.
Amelogenine is een extracellulair matrix proteïne, gesecreteerd door ameloblasten, voor de constructie
van tand email. De genen voor amelogenine zijn aanwezig op zowel het X- als het Y-chromosoom.
Wanneer amelogenine gen aanwezig is in een biopsie van een embryo kan men ervanuit gaan dat de
staalname correct is uitgevoerd en het resultaat waarschijnlijk betrouwbaar is. Verder nog vindt men bij
het paard een verschil in lengte tussen het amelogenine gen op het Y-chromosoom (AMELY) en
amelogenine gen op het X-chromosoom (AMELX) waardoor men bijkomend ook het geslacht kan
bepalen (Herrera et al., 2014).
Tijdens de evolutie hebben de genen op het Y-chromosoom meerdere veranderingen ondergaan zoals
degeneratie, duplicatie, translocatie en inversie. Vergelijkende mapping van deze genen tussen
diersoorten onderling is weinig bruikbaar met uitzondering van de zinc finger genes (ZFX en ZFY)
(Aurich en Schneider, 2014). Het ZFY gen is gelokaliseerd op het Y-chromosoom en het ZFX gen op
het X-chromosoom (Peippo et al., 1995). Net als het amelogenine gen, kan men ervan uitgaan dat
wanneer de zinc finger genes aanwezig zijn in een staal, het resultaat betrouwbaar is. Verder kan men,
zoals bij het amelogenine gen, het geslacht bepalen op basis van het verschil in lengte tussen de zinc
fingers genes (Sang-Hyun et al., 2010).
7
3. TECHNIEKEN BIJ MENS, RUND EN PAARD: WAT WORDT ER VANDAAG DE DAG
GEDAAN?
Geslachtsbepaling wordt gebruikt om het geslacht van een embryo tijdens een vroeg stadium van de
ontwikkeling te bepalen op een niet-destructieve manier. Vervolgens worden enkel die embryo’s met
het gewenste geslacht overgebracht naar het moederdier. Verschillende methodes worden beschreven
voor de geslachtsbepaling van humane, boviene en equine embryo’s waaronder immunologische,
cytogenische en moleculaire technieken (Weikard et al., 2001).
3.1.
BIOPSIE VAN HET EMBRYO
3.1.1.
Algemeen
Iedere techniek van geslachtsbepaling vereist een staal DNA van een pre-implantatie embryo. Het is
belangrijk dat de methode van biopsie geen nadelig effect heeft op de ontwikkeling van het embryo.
Daarom is het noodzakelijk dat een biopt wordt genomen op het juiste moment in de ontwikkeling van
het embryo.
Vierentwintig uur na de bevruchting van de eicel, begint de zygote te delen. De zygote is omsloten door
een zona pellucida die ervoor zorgt dat de delende cellen bijeen blijven en implantatie nog niet kan
plaatsvinden. Tijdens de afdaling in de eileider blijft het embryo delen. Op een gegeven moment, 4 tot
5 dagen bij het paard en rund en 4 dagen bij de mens, krijgt deze het uitzicht van een moerbei en wordt
het een morula genoemd (Ambartsumyan en Clark, 2008). Een morula bestaat uit blastomeren die
morfologisch identiek zijn. Het embryo ondergaat compactie en vormt zo een blastocyst, bestaande uit
trofoblasten (uitwendige blastomeren), een kiemknop (inwendige blastomeren) en een blastocoel
(centrale holte). De blastocyst gaat expanderen waarbij een kleine opening ontstaat in de zona pellucida
waaruit de blastocyst kan ontsnappen (‘hatching’).
De technieken van biopsie zijn verschillend tussen mens, rund en paard afhankelijk van de manier
waarop het embryo bekomen wordt. Zo wordt er bij de mens uitsluitend met in vitro bevruchte (IVF)
embryo’s gewerkt. Hierbij collecteert men eicellen uit de ovaria en worden deze eicellen buiten het
menselijk lichaam bevrucht. Bij het rund worden zowel in vitro als in vivo bevruchte embryo’s gebruikt
terwijl men bij het paard tot nu toe voornamelijk met in vivo bevruchte embryo’s werkt waarbij de reeds
bevruchte eicellen uit de baarmoeder worden gespoeld. Het paard onderscheid zich bijkomend van de
mens en het rund doordat het embryo omgeven wordt door een capsule noodzakelijk voor de overleving
van het vruchtje. Door dit capsule zijn de conventionele technieken van biopsie niet mogelijk bij het
paard maar is er een aangepaste techniek ontwikkeld (Betteridge K.J., 2007).
3.1.2.
Biopsie bij het humane embryo
Bij de mens is preimplantation genetic diagnosis (PGD) mogelijk op verschillende stadia van de
embryonale ontwikkeling doordat de humane embryo’s in vitro worden bevrucht. Zo kan men PGD
verrichten op (1) een oocyt poollichaampje voor of na de bevruchting, (2) een blastomeer in het
delingsstadium, (3) cellen uit het morula stadium of (4) cellen uit het blastocyst stadium. Een andere
mogelijkheid om een biopt te bekomen voor PGD, is het nemen van blastocoelvocht uit een blastocyst
zonder dat er cellen verwijderd worden.
8
Tijdens de eerste miotische deling van de oöcyt en dus nog voor de bevruchting plaatsvindt, worden
twee poollichaampjes gevormd, die beide uitsluitend maternaal DNA bevatten (Wu et al., 2014). Door
de afwezigheid van paternaal DNA heeft biopsie van een poollichaampje, voor de geslachtsbepaling
van een embryo, geen enkele zin. Biopsie van een poollichaampje maakt het mogelijk om in PGD de
specifieke maternale bijdrage voor het embryo te bestuderen maar is in deze literatuurstudie van geen
verder belang.
3.1.2.1. Single cel biopsie bij vroege embryo’s
Een eerste mogelijkheid om een biopt te verkrijgen voor geslachtsbepaling is een enkele blastomeer
collecteren op dag 3 na de bevruchting wanneer het embryo het 6-10 cel stadium heeft bereikt. De zona
pellucida wordt mechanisch, chemisch of door middel van laserstralen geopend. Vervolgens wordt één
blastomeer geaspireerd (figuur 4) en verwijderd uit het embryo om verder te worden getest (Fasouliotis
en Schenker, 1998).
Fig. 4: Single cel biopsie van een blastomeer in het delingsstadium. Een enkele cel wordt uit het embryo
geaspireerd met behulp van een pipet (uit Milachich T., 2014).
Een voordeel van deze techniek is dat de individuele blastomeren nog steeds totipotent zijn waardoor,
na het verwijderen van één enkele blastomeer, de verdere ontwikkeling van het embryo niet verstoord
wordt. Een nadeel is dat slechts 1 tot maximaal 2 blastomeren kunnen verwijderd worden en
beschikbaar zijn voor verdere analyse.
3.1.2.2. Biopsie van een morula
Zakharova et al. (2014) ging na of biopsie op een dag 4 morula meer klinisch bruikbaar is dan een dag
5 blastocyst. Het nemen van een leefbaar biopt van een morula werd als extreem moeilijk beschouwd
doordat de dicht aaneengesloten cellen sterk adhereren met elkaar. In deze studie werd aangetoond
dat een calcium vrij cultuur medium decompactie initieert waardoor men succesvol drie tot zeven cellen
kan verzamelen (figuur 5). De methode van biopsie is vergelijkbaar met deze van een delingsstadium
embryo, maar het aantal cellen die men bekomt bedraagt evenveel als bij een biopsie van een
blastocyst. Een voordeel ten opzichte van een biopsie van het delingsstadium embryo is dat men minder
beschadigde en dus meer leefbare cellen bekomt, cruciaal voor bepaalde analyse technieken.
9
Fig. 5: Biopsie van een compacte morula. (A) embryo voor biopsie. (B-G) verschillende stappen van
biopsie. (H) een embryo twee uur na biopsie (uit Zakharova et al., 2014).
3.1.2.3. Biopsie van een blastocyst
Een derde techniek is het nemen van trofoblastcellen uit het blastocyst stadium op dag 5 of 6 post
inseminatie. Hierbij wordt een gaatje in de zona pellucida gemaakt waaruit de trofoblast gaat uitstulpen.
Vervolgens worden de cellen die uitstulpen afgesneden en gebruikt voor verder onderzoek (Hinrichs en
Choi, 2012). Men kan tot 10 cellen verwijderen als men embryo’s langer op cultuur houdt. Hierdoor krijgt
men een grotere hoeveelheid materiaal om te analyseren maar slechts 50% van de normaal bevruchte
eicellen bereikt dit stadium in vitro (Fasouliotis en Schenker, 1998).
3.1.2.4. Collectie van blastocoelvocht
Een alternatieve methode werd beschreven door Milachich T. (2014) namelijk het verwijderen van het
vocht uit de blastocyst holte zonder dat embryonale cellen verwijderd worden. Men gaat een dag 5
blastocyst immobiliseren met een holding pipet om vervolgens de blastocoel vloeistof voorzichtig te
aspireren met een ICSI pipet tot de blastocyst volledig collabeert (figuur 6).
Fig. 6: Aspiratie van blastocoel inhoud gebruikmakende van de ICSI pipet (uit Milachich T., 2014).
In ongeveer 90% van de stalen was genomisch DNA aanwezig, nodig voor onder andere de
geslachtsbepaling. Deze benadering moet eerst grondig worden bestudeerd vooraleer ze in de praktijk
kan worden toegepast. Men weet niet zeker of het aanwezige DNA in de blastocoel vloeistof het
volledige embryo representeert maar door het opsporen van Y-specifieke genen kan men wel het
geslacht bepalen (Palini et al., 2013).
10
3.1.3.
Biopsie bij het bovine embryo
Bij het rund kan men een biopt nemen van zowel een in vivo als een in vitro bevruchte embryo. De in
vivo geproduceerde embryo’s worden gecollecteerd uit gesuperovuleerde runderen bijvoorbeeld op dag
7 of 8 na oestrus. Voor de in vitro bevruchte embryo’s gaat men onder echografische begeleiding
oöcyten aspireren uit immature follikels en verder in vitro matureren en fertiliseren (Hasler et al., 2002).
Vroeger werd een micropipet doorheen de zona pellucida geduwd of werd de zona ingesneden om
vervolgens cellen te verwijderen uit het embryo door deze blastomeren aan te zuigen (Macháty et al.,
1993). Tegenwoordig zijn veel eenvoudigere technieken beschreven die makkelijker te hanteren zijn
onder veldomstandigheden. Zo verzamelt men bijvoorbeeld cellen van het embryo door een klein stukje
van het embryo en de zona pellucida af te snijden met een microlemmet of scheermesje (Hinrichs en
Choi, 2012).
Wanneer embryo’s na biopsie worden ingevroren is het van groot belang dat de zona pellucida zo min
mogelijk beschadigd wordt tijdens het proces van biopsie. Cenariu et al. (2012) vergelijkt drie biopsie
technieken waarbij de techniek die het minst schade berokkend aan de zona, het meest
overlevingskansen biedt voor het embryo. (1) Een eerste techniek is de naaldtechniek waarbij het
embryo gepositioneerd wordt door middel van een holding pipet en een fijne naald doorheen de zona
wordt geprikt. De naald wordt vervolgens verplaatst doorheen de zona totdat men een kleine scheur in
de zona bekomt die net groot genoeg is om de biopsie pipet in te brengen. Twee tot drie cellen worden
geaspireerd van een morula of vier tot vijf cellen van het trophectoderm van een blastocyst. (2) Bij de
aspiratietechniek wordt het embryo eveneens gefixeerd door middel van een holding pipet maar wordt
de zona pellucida gepuncteerd met een biopsie pipet. Met dezelfde biopsie pipet worden 2 tot 3 cellen
geaspireerd uit een morula of vier tot vijf cellen geaspireerd uit het trophectoderm van een blastocyst.
(3) De microblade techniek is dezelfde als deze beschreven in voorgaande alinea. Men maakt hier geen
gebruik van een holding pipet maar maakt men krasjes in het oppervlakte van het draagschaaltje om
het embryo te stabiliseren. Het microlemmet wordt tegen het embryo geplaatst en doormiddel van een
zaagbeweging verkrijgt men een aantal cellen. Deze cellen worden vervolgens gecollecteerd met
behulp van een aspiratie pipet.
Zoals verwacht zijn de drachtpercentages of nog de overlevingskansen van de embryo’s na
cryopreservatie het hoogst bij de techniek die het minste schade aan de zona verricht, namelijk de
naaldtechniek (57% drachtig). Terwijl de percentages na cryopreservatie bij de microblade techniek het
laagste zijn (31% drachtig). De naaldtechniek is echter wel het meest arbeidsintensief. Wanneer
embryo’s niet ingevroren worden en de zona van minder belang is voor de viabiliteit van het embryo, is
de microblade techniek de meest efficiënte methode die in de praktijk bruikbaar is voor biopsie (Cenariu
et al., 2012).
3.1.4.
Biopsie bij het equine embryo
De resultaten van de huidige technieken voor in vitro productie van equine embryo’s zijn veelbelovend
maar worden nog niet toegepast in de praktijk doordat slechts weinig zygoten het blastocyst stadium
bereiken. De embryo’s die toch ex vivo blastuleren bezitten het karakteristiek en vitaal glycoproteïne
kapsel niet (Tremoleda et al., 2003). Door de relatief lage efficiëntie om embryo’s in vitro te cultiveren is
11
de commerciële toepassing van IVF beperkt en werkt men bij de geslachtsbepaling van
paardenembryo’s voorlopig enkel met in vivo bevruchte embryo’s (Carnevale en Sessions, 2012).
Zoals reeds eerder is aangehaald (zie 3.1.1.) onderscheidt het embryo van het paard zich van embryo’s
van andere diersoorten door de aanwezigheid van een capsule tussen de zona pellucida en het embryo.
Deze acellulaire capsule van glycoproteïnen wordt gevormd nadat het embryo de uterus heeft bereikt
op dag 6,5 na de ovulatie en is aanwezig tot ongeveer dag 21 van de dracht (Choi et al., 2010). Alhoewel
de exacte functie van de capsule niet gekend is, gaat men ervan uit dat het grotendeels verantwoordelijk
is voor onder andere het behoud van de sferische vorm van de conceptus tijdens de periode van
maternale drachtherkenning (Stout et al., 2005). De capsule zou ook dienen om conceptus eiwitten op
te slaan en de conceptus te beschermen tegen de maternale immuniteit (Hinrichs en Choi, 2012).
Stout et al. (2004) heeft aangetoond dat de verdere intra-uteriene ontwikkeling stopt na het verwijderen
van de capsule van een morula of vroege blastocyst (dag 6) of een geëxpandeerd blastocyst (dag 7 en
8). Hieruit kan men besluiten dat het capsule essentieel is voor het voortbestaan van het equine embryo.
Wanneer men het embryo middendoor klieft, zoals men in de praktijk doet bij bovine embryo’s, bedragen
de drachtpercentages 23-67% voor de gekliefde morula’s of vroege blastocysten (dag 6), terwijl geen
enkel van de geëxpandeerde, gekliefde blastocysten (dag 7 of 8) tot dracht hebben geleid (Choi et al.,
2010). Daaruit kan men stellen dat dag 6,5 embryo’s betere kandidaten zijn voor biopsie. Daarentegen
wordt in de praktijk slechts zelden voor dag 7 een embryo gespoeld uit de merrie doordat het embryo’s
soms later dan dag 6,5 in de baarmoeder aankomt. Als men een merrie spoelt voor dag 7 en het embryo
komt verlaat aan in de baarmoeder dan wordt het embryo niet gecollecteerd. Terwijl, zou men een dag
later diezelfde merrie spoelen, het embryo wel wordt gecollecteerd. Daarom wordt een equine embryo
best gecollecteerd op dag 7 of 8. Op dit stadium is de blastocyst geëxpandeerd en is de capsule volledig
gevormd (Choi et al., 2010).
Als men al het voorgaande in rekening brengt, moet men eerst de zona pellucida (dag 6 embryo’s)
respectievelijk de capsule (dag 7 en 8 embryo’s) doorbreken vooraleer men een biopt kan nemen. Het
doorbreken van de zona of capsule is mogelijk zonder de viabiliteit van het embryo in het gedrang te
brengen. Hiervoor gebruikt men een Piezo drill waarmee men een gaatje in de zona pellucida
respectievelijk de capsule boort zonder dat het scheurt. Vervolgens worden cellen geaspireerd met
behulp van een micropipet. In een dag 6 embryo wordt het biopt op een ad random plaats aan de
periferie van de morula of vroege blastocyst genomen. Bij een dag 7 of 8 embryo wordt de pipet weg
van de kiemknop geplaatst en trofoblastcellen worden geaspireerd waarbij blastocoel vocht verloren
gaat. Hierdoor collabeert de blastocyst (figuur 7F) zonder nadelige gevolgen voor het embryo (Hinrichs
en Choi, 2012). Het resulterende defect in het kapsel wordt herstelt of heeft geen invloed op de verdere
ontwikkeling van het embryo in utero (Choi et al., 2010).
12
Fig. 7: Microscopische foto’s van het equine embryo. (A) Dag 6 morula voor en (B) na trofoblast biopsie
met behulp van een Piezo drill. (C) Dag 6 vroege blastocyst voor en (D) na biopsie. (E) Dag 7
geëxpandeerde blastocyst voor en (F) na biopsie. Merk op: een gevouwen capsule is zichtbaar in de
perivitelliene ruimte van de dag 6 vroege blastocyst na micromanipulatie en een deel van de zona
pellucida blijft verbonden aan het capsule bij de dag 7 blastocyst na micromanipulatie (naar Choi et al.,
2010).
3.2.
ANALYTISCHE TECHNIEKEN
Verschillende technieken zijn beschreven waaronder (1) X-linked enzym activiteit meten door middel
van biochemische microassay, (2) antigeenherkenning in mannelijke embryo’s door middel van H-Y
antiserum, (3) cytogenetische analyse of karyotypering, (4) fluorescence in situ hybridisatie (FISH), (5)
polymerase chain reaction (PCR) of (6) loop-mediated isothermal amplification (LAMP). De recentste,
meest accurate technieken worden hieronder kort besproken en verschillen tussen de mens, rund en
paard. Het bepalen van het geslacht door middel van karyotypering en de immunologische detectie van
het mannelijk specifieke H-Y antigeen zijn in onbruik geraakt omdat ze niet efficiënt en/of accuraat
genoeg zijn en worden daarom in deze literatuurstudie niet verder besproken (Peippo et al., 1995).
3.2.1.
Bespreking van de technieken
3.2.1.1. Detecteren van geslacht-specifiek DNA
3.2.1.1.1.
Polymerase chain reaction (PCR)
Uit de cel(len), die we bekomen na biopsie van het embryo, kunnen we DNA extraheren. Vervolgens
kunnen we met behulp van de PCR een DNA doelwitsequentie amplificeren zodat deze zichtbaar kan
worden gemaakt met behulp van gelelektroforese. Indien we een Y-specifiek DNA sequentie kunnen
aantonen dan is het genetisch materiaal afkomstig van een mannelijk individu. Is de Y-specifieke
sequentie afwezig dan is het staal afkomstig van een vrouwelijk embryo.
13
Elke amplificatiecyclus van PCR bestaat uit drie stappen: template denaturatie, primer ontharding
(hybridisatie) en primer verlenging (elongatie). Iedere stap is temperatuur afhankelijk waarbij een
thermocycler de buisjes opwarmt en afkoelt afhankelijk van de ingestelde temperatuur van iedere stap.
De reactiebuisjes bestaan telkens uit een set specifieke primers, een staal DNA (van het biopt van een
embryo), Taq polymerase, nucleotiden (dNTP) en een buffer. Tijdens de eerste stap wordt de
temperatuur verhoogd tot 95°C waardoor het dubbelstrengig DNA ontdubbelt in twee enkele strengen
DNA. Vervolgens wordt in een tweede stap de temperatuur verlaagd tot 65°C waarbij één primer bindt
per DNA streng en dit op hun specifieke doelwitsequentie. Deze primers vormen het startpunt waaruit
het DNA polymerase (Taq) de complementaire streng aanmaakt (stap drie), die opgebouwd wordt uit
vrije nucleotiden (dNTP). Deze derde stap kan versneld worden door de temperatuur te verhogen tot
72°C. Enkel die DNA sequentie waarop een primer is gebonden wordt vermenigvuldigd. Een cyclus
wordt meerdere malen herhaald en na dertig cycli bekomt men meer dan 1 biljoen kopieën van de DNA
doelwitsequentie.
Elke doelwitsequentie bezit een bepaalde lengte, uitgedrukt in baseparen, die via gelelektroforese kan
worden afgelezen. Voor de elektroforese wordt een agarose gel 2% aangemaakt, het PCR product
wordt gekleurd en vervolgens via een pipet aangebracht in een well van de agarose gel. Een elektrisch
veld wordt aangelegd rondom de gel zodat het DNA zich, naargelang het gewicht van de baseparen,
kan verplaatsen doorheen de agarose gel. Het elektrisch veld bestaat uit een kathode (negatieve pool)
aan één zijde van de gel en een anode (positieve pool) aan de tegenovergestelde zijde, verbonden met
elkaar door een batterij die eveneens stroom voorziet. Het elektrisch veld is bevestigd aan een doosje
waarin de gel is geplaatst en die gevuld is met een buffer om de elektriciteit doorheen de gel te geleiden.
Bij het aanleggen van het elektrisch veld zal het DNA, dat voornamelijk negatief geladen is door de
aanwezige fosfaatgroepen, migreren naar de positieve pool. Hoe groter het aantal baseparen hoe
minder ver ze migreren doorheen de gel en hoe kleiner hoe verder. Aan de linkerkant van de gel maakt
men een DNA ladder bestaande uit verschillende DNA moleculen waarvan de lengte gekend is. Door
de band van het ongekende staal te vergelijken met de ladder kan men, als er voldoende DNA in het
staal aanwezig is, de lengte van het ongekende DNA staal aflezen.
3.2.1.1.2.
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
Deze relatief nieuwe techniek is een manier om DNA te vermeerderen zonder dat het gevisualiseerd
moet worden met elektroforese. De volledige reactie gaat door onder isotherme omstandigheden. In
tegenstelling tot PCR, waarbij afwisselend een temperatuur van 95°C en 65°C wordt bereikt, is LAMP
mogelijk bij een relatief constante temperatuur van 60 tot 65°C. Wanneer een doelwitsequentie
succesvol is geamplificeerd, door LAMP, wordt een wit bezinksel van magnesium pyrofosfaat
geproduceerd. Het magnesium pyrofosfaat is een bijproduct van de DNA synthese. Wanneer de DNA
sequentie die we wensen op te sporen (bijvoorbeeld een mannelijke DNA sequentie) aanwezig is, wordt
een wit bezinksel zichtbaar. Is er geen bezinksel waarneembaar dan kunnen we afleiden dat de
specifieke sequentie niet aanwezig is (Notomi et al, 2000).
14
Voor de uitvoering van LAMP heeft men nucleotiden (dNTP) nodig, DNA polymerase, minimaal twee
maar typisch vier specifieke primers en een bijkomende primer set (loop primer) (figuur 8). Het DNA
polymerase dient voor de replicatie van de DNA sequentie en helpt bij het verplaatsen van de gevormde
complementaire streng. De vier specifieke primers bestaan uit een forward inner primer (FIP), een
forward outer primer (FOP), een backward inner primer (BIP) en een backward outer primer (BOP).
Deze primers herkennen zes regio’s (F1c, F2c, F3c, B1c, B2c en B3c) op het doelwit DNA (uit Hirayama
et al., 2013).
Fig. 8: De verschillende soorten primers voor het gebruik van LAMP (uit Hirayama et al., 2013).
Eerst bindt de F2 regio van FIP aan de F2c regio van de doelwitsequentie waardoor de primaire DNA
synthese, met behulp van het DNA polymerase, wordt gestart (figuur 9). Door de binding van de F3
regio van FOP aan de F3c regio van het doelwit DNA, wordt de FIP gelinkte complementaire streng
verplaatst. Deze complementaire enkelvoudige streng dient als een template voor BIP waarbij de B2
regio van BIP hybridiseert aan de B2c regio van de doelwitsequentie. Van hieruit wordt de DNA synthese
geïnitieerd en ontstaat opnieuw een complementaire streng. Wanneer de B3 regio van BIP bindt aan
de B3c regio van de doelwitsequentie wordt de BIP gelinkte complementaire streng verplaatst. Deze
BIP gelinkte streng neemt een specifieke vorm aan, namelijk een streng met een lus aan beide einden
(stem-loop), en vormt de basis voor de verdere DNA amplificatie door de autocycling reactie (figuur 9).
Door het gebruik van loop primers wordt de reactie versneld.
LAMP is een efficiënte en snelle techniek met een hoge specificiteit. De aanwezigheid van niet-doelwit
DNA zal het eindresultaat niet beïnvloeden. Deze hoge specificiteit is te verklaren doordat LAMP zes
verschillende regio’s van het doelwit DNA herkent (Notomi et al, 2000). De hoeveelheid van het DNA
product bekomen door LAMP is aanzienlijk hoger dan bij PCR. Een bijkomend voordeel is dat het
geamplificeerd DNA product niet uit de reactie proefbuizen wordt verwijderd, in tegenstelling tot PCR,
waardoor mogelijke contaminatie van buitenaf verhinderd wordt.
Door gebruik te maken van reverse transcriptase (RTase) kan men LAMP ook aanwenden voor de
amplificatie en detectie van RNA. Hierbij wordt het RNA eerst om gezet tot DNA waarna de reactie
identiek verloopt (Notomi et al., 2000).
15
Fig. 9: Verschillende stappen van DNA amplificatie gebruikmakende van LAMP (uit Hirayama et al.,
2013).
3.2.1.1.3.
Fluorescence in situ hybridization (FISH)
FISH is een techniek om chromosomen moleculair te identificeren en wordt onder andere gebruikt voor
de geslachtsbepaling van embryo’s. Het algemene principe van FISH is dat een gelabelde probe gaat
binden aan een deel of sequentie van het chromosoom dat we wensen op te sporen. Indien de
doelwitsequentie aanwezig is en er binding heeft plaatsgevonden, licht de sequentie op onder een
fluorescentiemicroscoop.
In een eerste stap worden de probes en chromosomen voorbereid. De probes, specifiek voor de
sequentie die we willen aantonen, worden gelabeld met reporter moleculen als biotine, digoxigine en
dinitrophenyl. Typerend aan deze reporter moleculen is dat ze pas na de hybridisatie binden met het
fluorescent reageermiddel. De chromosomen worden in de metafase van de mitose gebracht. Tijdens
16
de metafase liggen de chromosomen op één lijn in het midden van de cel, zijn er het meest
gecondenseerd en dus het beste zichtbaar. Om de metafase te bereiken worden de cellen op cultuur
gebracht voor een korte periode en de delingsstadia opgevolgd. Wanneer de cellen zich in de metafase
bevinden, wordt een mitose inhibitor toegevoegd om de cellen in dit delingsstadium te houden. De cellen
kunnen eventueel ook in de interfase worden gebracht. De interfase is geen delingsstadium maar een
voorbereiding op de mitose waarbij onder andere de chromosomen gekopieerd worden en dus ook goed
zichtbaar zijn.
Vervolgens vindt de hybridisatie stap plaats waarbij de chromosomen worden gefixeerd op een glaasje
en de gelabelde probe wordt toegevoegd. De chromosomen worden samen met de probe kort
geïncubeerd aan 70°C zodat het DNA van zowel de chromosomen als de probe denatureert en met
andere woorden ontdubbelt. Hierdoor kan de enkelstrengige probe aan zijn complementair deel van het
doelwit DNA binden (figuur 10). De laatste stap is de fluorescent labeling stap. Na het wegwassen van
de overmatige probes wordt het glaasje geïncubeerd in een immunofluorescent reageermiddel waarna
een fluorescent signaal wordt geproduceerd ter hoogte van de probe hybridisatie plaatsen. Tot slot wordt
het glaasje onder een fluorescentiemicroscoop onderzocht op de aanwezigheid van oplichtende
sequenties van chromosomen (Trask B.J., 1991).
Fig. 10: Principe van FISH: fluorescent gelabelde probe bindt op een enkelstrengig complementair
doelwit-DNA.
Ried T. (2006). Fluorescence in situ hybridization. Geraadpleegd op 15 april 2015 via
http://nl.wikipedia.org/wiki/Fluorescentie-in-situhybridisatie
FISH als techniek voor de geslachtsbepaling van embryo’s is behoorlijk tijd consumerend en moeilijker
te handhaven dan PCR door het numerieke aantal stappen die nodig zijn. Niettegenstaande heeft FISH
een hoge gevoeligheid en is het een goed alternatief voor PCR (Cenariu et al., 2008).
17
3.2.1.2. Detecteren van geslachts-specifiek RNA
Zoals reeds eerder vermeld (zie 2.2.), wordt één van de twee X-chromosomen in een vrouwelijk individu,
ad random geïnactiveerd in een vroeg stadium van de embryonale ontwikkeling. De X in-activatie vereist
een specifiek RNA namelijk het X-inactivated-specific transcript (Xist) RNA. Het Xist RNA wordt door
het geïnactiveerd X-chromosoom tot expressie gebracht en is bijgevolg typisch aanwezig bij het
vrouwelijk individu (Beckelmann et al., 2012).
Om de aanwezigheid van het Xist RNA aan te tonen kan men gebruik maken van Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction (RT-PCR) (De La Fuente et al., 1999). Zoals eerder aangehaald (zie
3.2.1.1.2.) kan men RNA ook aantonen met behulp van LAMP (Notomi et al., 2000). Bij beide technieken
wordt het RNA eerst vertaald naar complementair DNA (cDNA) door middel van reverse transcriptase.
Vervolgens wordt het cDNA geamplificeerd via PCR of LAMP.
3.2.2.
Toepassing bij mens, rund en paard
3.2.2.1. Mens
Geslachtsbepaling van humane embryo’s vindt zijn toepassing onder andere bij koppels met een hoger
risico op geslachtsgebonden ziektes. Duchenne muscular dystrophy is een voorbeeld van een Xgebonden ziekte. Wanneer het recessieve gen, dat aan de basis ligt van de ziekte, op één van beide Xchromosomen aanwezig is kan het vrouwelijk individu drager zijn van de ziekte. De vrouw kan het
aangetaste X-chromosoom doorgeven aan haar kinderen waarbij haar dochters op hun beurt drager
worden. Wanneer mannelijke embryo’s, die slechts één X-chromosoom bezitten, het aangetaste Xchromosoom erven, komt de ziekte tot uiting. Om die reden gaat men, bij X-gebonden ziektes, het
mannelijk embryo uitsluiten en het vrouwelijk embryo behouden voor de verdere intra-uteriene
ontwikkeling. Bij Y-gebonden ziekten is het logischerwijze opnieuw het mannelijk embryo dat is
aangetast en dat men niet wil behouden.
De single-cell PCR was de eerste techniek die gebruikt werd in PGD, onder andere voor X-gelinkte
mentale achterstand. PCR wordt tegenwoordig echter niet meer gebruikt voor geslachtsbepaling van
humane embryo’s doordat PCR nooit 100% zekerheid schenkt. De mogelijkheid dat de amplificatie in
een PCR reactie mislukt is steeds aanwezig desondanks het gebruik van extra primers (Fasouliotis en
Schenker, 1998) Bijkomend is er kans op contaminatie en allele drop-out (ADO) (Yan et al., 2014). PCR
wordt vooral gebruikt bij de moleculaire analyse van het DNA wanneer de sequentie van het gen defect
gekend is (Basille et al., 2009, Wu et al., 2014). PCR is een klassieke techniek voor pre-implantatie
genetische diagnose (PGD) maar door de beperkte toepassing voor geslachtsbepaling van humane
embryo’s wordt PCR in deze context niet verder besproken.
FISH is een techniek die terzelfdertijd het geslacht van het embryo bepaalt, de ploïde status en de
numerieke abnormaliteiten van de onderzochte chromosomen (Staessen et al., 1999). FISH vereist een
gelabelde probe, die specifiek is voor de sequentie die wij wensen op te sporen. Indien de
doelwitsequentie aanwezig is en er binding heeft plaatsgevonden, licht de sequentie op onder een
fluorescentiemicroscoop. In het geval van geslachtsbepaling maakt men gebruik van probes specifiek
voor het Y- en X- chromosoom, die met verschillende fluorochromen gelabeld zijn (multicolour FISH).
18
Liu et al. (1998) maakt gebruik van een probes die bij binding aan het X-chromosoom groen oplichten
onder de fluorescentiemicroscoop en bij binding aan het Y-chromosoom rood oplichten. Het embryo is
vrouwelijk wanneer men twee groene signalen verkrijgt en mannelijk wanneer men een groen en een
rood signaal waarneemt.
In een humane context is het nadeel van FISH dat men slechts een beperkt aantal chromosomen tegelijk
kan analyseren door het overlap van signalen van twee chromosomen (Wu et al., 2014). Wanneer meer
dan drie verschillende FISH probes worden gebruikt daalt de efficiëntie van de techniek en stijgt de kans
op overlappende signalen dat als één signaal wordt beschouwd (Basille et al., 2009). Een ander nadeel
is de kans dat de hybridisatie mislukt waardoor een vals negatief resultaat bekomen wordt en de
sequentie niet oplicht onder de fluorescentiemicroscoop.
3.2.2.2. Rund
3.2.2.2.1.

PCR
Multiplex PCR en verschillende primer sets
Rattanasuk et al. (2011) onderzocht de geschiktheid van primer paren gebruikmakende van multiplex
PCR. Door het gebruik van een tweede primer, specifiek voor een autosomale sequentie aanwezig in
beide geslachten (zie 2.3.), kan men vals negatieve resultaten vermijden. Vals negatieve resultaten
(vals vrouwelijk) ontstaan wanneer er onvoldoende DNA in het staal aanwezig is of wanneer geen
amplificatie heeft plaatsgevonden. Het BY/BSP paar kan het mannelijk boviene DNA amplificeren,
waarbij de BY primer (300 bp) specifiek is voor het mannelijk embryo en de BSP primer (538 bp) voor
beide geslachten. Enkel wanneer slechts één band van het BSP zichtbaar wordt op de gel dan is het
DNA afkomstig van een vrouwelijk embryo. De aanwezigheid van twee banden zijn een aanwijzing voor
een mannelijk embryo (figuur 11). Enkel wanneer de band voor BSP zichtbaar zijn, worden de resultaten
van de PCR in acht genomen en geïnterpreteerd. Bij afwezigheid is dit te wijten aan hetzij een probleem
van de amplificatie hetzij afwezigheid van cellen (Thibier en Nibart, 1995). Een vals positief resultaat is
enkel mogelijk door DNA contaminatie tijdens de elektroforese (Hirayama et al., 2013).
Fig. 11: Geslachtsbepaling van boviene embryo’s met behulp van PCR en gelelektroforese (uit
Rattanasuk et al., 2011).
19
Lopes et al. (2001) beschrijft het gebruik van de Y-specifieke S1S2 primer (175 bp) en DNA specifieke
C1C2 primer (216 bp). Wanneer beide primers samen in de thermocycler worden gebracht, wordt het
Y-specifieke fragment slechts in kleine hoeveelheden geamplificeerd. Om dit probleem op te lossen
gebruikt men de pit-stop PCR. Hierbij brengt men de C1C2 primer, die het de hoogste aantal kopieën
oplevert, pas na enkele PCR cycli toe aan het reactievat. Hierdoor wordt de aanwezigheid van de Yspecifieke sequentie niet langer gemaskeerd.
Weikard et al. (2001) gebruikt de mannelijk specifieke FBNY sequentie (127 bp) en de microsatelliet
merker FBN17 (136-140 bp en geslachtsonafhankelijk). FBNY is species specifiek en kan worden
aangetoond in verdunde DNA oplossingen wat de gevoeligheid en betrouwbaarheid van de primer
verhoogd.
Uit het bovenstaande blijkt dat er verschillende primerparen beschreven en getest zijn, allemaal met als
doel de gevoeligheid van PCR te verhogen. Echter, het gebruik van multiplex PCR geeft soms een
incorrecte diagnose ten gevolge van de complexiteit van het gebruik van meerdere primers (wat
bijvoorbeeld het geval is bij de S1S2/C1C2 primer set). Kageyama et al. (2004) beschrijft een nieuwe
sequentie op het bovien Y chromosoom, namelijk S4. De PCR primer set specifiek voor de S4 sequentie
amplificeert een mannelijk specifiek product (178 bp) en een product specifiek voor beide geslachten
(145 bp). Alhoewel de oorsprong van het 145 bp product niet gekend is, kan men het wel aanschouwen
als een positieve interne controle voor de geslachtsbepaling.
Amelogenine (AML) is een gen aanwezig zowel op het X als het Y chromosoom. Het AML-X en het
AML-Y zijn homologe genen maar daarom nog niet identiek. Als men een deel van het bovien
amelogenine (bAML) gen amplificeert dat het minst homoloog is tussen het X- en Y chromosoom, kan
men het geslacht achterhalen. Met als voordeel dat zowel de X- als Y-sequenties worden vermeerderd
in dezelfde reactie. Chen et al. (1999) toont aan dat men het geslacht van boviene embryo’s kan bepalen
door amplificatie van het vijfde intron van het bAML dat slechts 45,1% gelijkenis vertoont. Beide AML
sequenties zijn na amplificatie ongeveer gelijk in aantal, in tegenstelling tot de S1S2/C1C2 set. Bij het
vrouwelijk embryo wordt een sequentie van 467 bp geamplificeerd en bij het mannelijk embryo wordt
een band van 467 bp en 341 bp geamplificeerd.

Nested-PCR
Om de betrouwbaarheid van PCR te verhogen kan men naast multiplex PCR ook gebruik maken van
nested-PCR. Hierbij wordt na een eerste amplificatie van de op te sporen sequentie, het product een
tweede maal geamplificeerd. In de tweede amplificatieronde wordt een primer gebruikt die selectief een
sequentie amplificeert binnen de sequentie die geamplificeerd werd door de eerste primers (Virta et al.,
2002).
Kickpatrick and Monson (1993) maakten reeds gebruik van nested-PCR om de sensitiviteit en
specificiteit te verhogen. In een eerste PCR reactie worden ZFX/ZFY regio’s samen met niet- ZFX/ZFY
regio’s geamplificeerd. Niettegenstaande het eerste PCR product niet specifiek genoeg is voor de
geslachtsbepaling, zijn er relatief meer ZFX en ZFY sequenties aanwezig in het geamplificeerd DNA
staal ten opzichte van het originele staal. Vervolgens wordt in de nested-PCR reactie enkel deze
20
sequenties geamplificeerd die overeenstemmen met de ZFX- en ZFY genen. Voor de nested-PCR
worden specifiek primers gemaakt die de niet-overlappende delen van ZFX- en ZFY genen amplificeren
om op die manier het geslacht te kunnen bepalen.
Carneiro et al. (2011) gaat het gebruik na van het testis-specific protein Y-encoded gene (TSPY) voor
de geslachtsbepaling. Het gen biedt als voordeel dat het in meerdere aantallen aanwezig is het
mannelijk bovine genoom, in tegenstelling tot het SRY gen dat slechts één kopie heeft. De amplificatie
van het gen wordt uitgevoerd via nested-PCR en gevisualiseerd via elektroforese. Resultaten worden
bekomen die 100% overeenstemmen met het geslacht.

PCR zonder gelelektroforese
In tegenstelling tot veel betrouwbare PCR technieken, die een elektroforese stap omvatten, maakt
Hasler et al. (2002) gebruik van een uniek PCR protocol. Het geslacht van een boviene embryo wordt
bepaald zonder de extra elektroforese stap. Voordat de amplificatiecyclus start wordt aan het reactievat
Ampli-YTM oplossing toegevoegd. Na 35 cycli worden de tubes onder een ultraviolet transilluminator
geplaatst waarbij het mannelijk DNA roze fluoresceerde en de vrouwelijke stalen weinig tot niets
oplichten.
Virta et al. (2002) maakt gebruik van nested-primers en geslacht specifieke fluorogene probes voor
ZFX- en ZFY genen. Twee fluorogene TagMan probes worden toegevoegd aan het reactievat waarbij
de ene probe specifiek is voor ZFX en de tweede specifiek voor ZFY. De probes dragen verschillende
labels waardoor ZFX en ZFY terzelfdertijd worden opgespoord en tegelijk geslachtsdifferentiatie
mogelijk is.
3.2.2.2.2.
LAMP
Hirayama et al. (2013) beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een isothermische DNA amplificatie
techniek voor de geslachtsbepaling van boviene embryo’s. Gebruikmakende van één of meerdere
cellen uit het boviene embryo wordt nagegaan of er een S4 sequentie (zelfde die gebruikt werd door
Kageyama et al., 2004), specifiek voor het mannelijk individu, aanwezig is in het DNA (figuur 12).
Fig. 12: Resultaat van een LAMP reactie. Links: wit bezinksel van magnesium pyrofosfaat (S4 sequentie
aanwezig). Rechts: geen bezinksel (S4 sequentie afwezig) (naar Hirayama et al., 2013).
21
Er zijn twee soorten reagentia in de kit aanwezig om de S4 sequentie op te sporen samen met de 1.715
satelliet DNA sequentie. Het DNA staal wordt gelijk verdeeld over twee reactiebuisjes, een buisje voor
de S4 sequentie (mannelijk specifieke sequentie) en een buisje voor de 1.715 satelliet DNA sequentie
(mannelijk en vrouwelijk gemeenschappelijke reactie). Door de 1.715 satelliet DNA sequentie op te
sporen kan men aantonen of er al dan niet DNA aanwezig is. Indien er geen DNA aanwezig zou zijn,
dan is er ook geen S4 sequentie aanwezig en kan valselijk worden aangenomen dat het embryo
vrouwelijk is. Uitsluitend wanneer de LAMP reactie in beide reactiebuisjes positief is, dus als de S4
sequentie en de 1.715 satelliet DNA sequentie aanwezig zijn, wordt het embryo als mannelijk
beschouwd. Wanneer enkel de 1.715 satelliet DNA sequentie positief is wordt aangenomen dat het een
vrouwelijk embryo is (Hirayama et al., 1013).
Zoheir en Allam (2010) wilden de LAMP techniek voor bepaling van het geslacht verbeteren door
ethidium bromide (EB) of kopersulfaat (CuSO4) toe te voegen aan de reactiebuisjes nadat de LAMP
procedure beëindigd werd (figuur 13). Voor LAMP gebruiken ze eveneens de S4 sequentie en 1.715
satelliet DNA. Wanneer de LAMP reactie beëindigd is, is het wit bijproduct van magnesium pyrofosfaat
moeilijk zichtbaar met het blote oog (figuur 12). Door het toevoegen van EB of CuSO4 kan men
macroscopisch het resultaat van de LAMP reactie waarnemen. Hierdoor wordt het gebruik van
elektroforese of een troebelheid meter overbodig. Na toevoegen van EB worden de zalmroze tubes als
mannelijk aanschouwd en de tubes met een wijnkleur als vrouwelijk. De kleurintensiteit is afhankelijk
van de hoeveelheid DNA aanwezig in het staal na de uitvoering van de LAMP reactie. Door het
toevoegen van CuSO4 wordt het bezinksel duidelijker zichtbaar. De tubes met een meer zichtbaar
bezinksel zijn vrouwelijk en deze zonder mannelijk. Bij het vrouwelijk individu vindt de LAMP reactie niet
plaats door het gebrek aan de mannelijk specifieke S4 sequentie. Hierdoor worden de nucleotiden
(dNTP) niet verbruikt en gaan deze negatief geladen nucleotiden reageren met CuSO 4, kation
complexen vormen en neerslaan waardoor een duidelijk waarneembaar bezinksel ontstaat.
Fig. 13: (A) Kleurreactie na toevoegen van EB met links een positieve reactie (mannelijk) en rechts een
negatieve kleurreactie (vrouwelijk). (B) Sediment vorming na toevoeging van CuSO4 met links een
positieve reactie en rechts negatief (naar Zoheir en Allam, 2010).
22
3.2.2.2.3.
FISH
Lee et al. (2004) ontwikkelde een bovien Y-chromosoom specifiek PCR product afgeleid van de BtY2
sequentie, als probe voor de fluorescentie in situ hybridisatie. De BtY2 probe wordt gelabeld met de
receptor molecule biotine-16-dUTP. Een biopt wordt typisch verkregen uit boviene embryo’s die het 8
tot 16 cel stadium bereikt hebben. Vervolgens worden de chromosomen uit het biopt in de metafase of
interfase gebracht en geplaatst op een glaasje. De BtY2 probe wordt toegevoegd waarna de FISH
reactie kan doorgaan. Indien het een mannelijk embryo is bindt de BtY2 probe aan de complementaire
sequentie van het DNA en licht de sequentie op onder de fluorescentiemicroscoop. Als het een
vrouwelijk embryo is vindt er geen binding plaats en is er geen fluorescentie te zien onder de
lichtmicroscoop (figuur 14).
Fig. 14: Geslachtsbepaling van boviene blastomeren door middel van FISH. (A) Kernen van mannelijke
blastomeren tijdens de interfase van de celdeling. (B) Kernen van mannelijke blastomeren tijdens
metafase. (C) Kernen van vrouwelijke blastomeren tijdens de interfase en metafase (naar Lee et al.,
2004).
3.2.2.3. Paard
Doordat cryopreservatie en in vitro productie van equine embryo’s nog geen toepassing kent moeten
technieken, gebruikt voor de geslachtsbepaling, binnen een bepaalde tijd uitvoerbaar zijn. Herrera et al.
(2014) toont aan dat het mogelijk is een equine embryo na biopsie 7 tot 10 uren te bewaren zonder een
daling in de drachtpercentages. Eventueel kan men het embryo direct na biopsie naar de moeder
transfereren, maar dan moeten sommige drachten worden afgebroken wanneer het embryo een
ongewenst geslacht blijkt te bezitten (Hinrichs en Choi, 2012). Momenteel wordt enkel PCR beschreven
als een techniek om het geslacht te bepalen van equine embryo’s.
3.2.2.3.1.
PCR op DNA sequenties
In de single PCR amplificeert men het equine SRY gen (eSRY) doormiddel van equine Y-chromosoom
specifieke primers. De aanwezigheid wordt geëvalueerd door middel van agarose gel electroforese. Als
er een 131 bp product van de eSRY primers aanwezig is dan gaat men ervan uit dat het embryo
mannelijk is (Choi et al., 2010). De sensitiviteit van deze PCR is laag doordat het gen slecht in één kopie
aanwezig is in het genoom. Vals negatieve resultaten ten gevolge van afwezigheid van DNA zijn niet
aantoonbaar.
23
In duplex PCR brengt men twee verschillende primers in hetzelfde reactiemengsel zodat men
tegelijkertijd aparte regio’s van eenzelfde gen kan amplificeren. Choi et al. (2010) gebruikte hiervoor
RBMY en GLIPR1 equine specifieke primers. RBMY of RNA-binding motif protein is een Y-specifiek
gen is en GLIPR1 of glioma pathogenesis-related protein 1 is een gen specifiek voor beide geslachten.
Het GLIPR1 amplicatieproduct (113 bp) dient als positieve controle en indien het afwezig is in een staal
dan is het resultaat van de PCR onbetrouwbaar. Indien enkel GLIPR1 aanwezig is dan is het DNA
afkomstig van een vrouwelijk embryo. Als RBMY (245 bp) aanwezig is samen met GLIPR1 dan betreft
het een mannelijk embryo. Het voordeel van het gebruik van deze genen ten opzichte van het SRY gen
en de zinc fingers genen (ZFX en ZFY) is dat de RBMY en GLIPR1 in meerdere kopieën aanwezig zijn
in het genoom. Hierdoor is de sensitiviteit van PCR voor de geslachtsbepaling hoger (Aurich en
Schneider, 2014).
Herrera et al. (2014) maakte gebruik van primers om het equine SRY en amelogenine (AMEL) te
vermeerderen. Zoals eerder vermeld (zie 2.3.) is het amelogenine gen zowel op het X-chromosoom
(AMELX) als op het Y-chromosoom (AMELY) gelokaliseerd. Bij het paard is er een verschil in lengte
tussen beide genen waardoor men bijkomend op basis van het amelogenine gen het geslacht kan
bepalen. Een staal is vrouwelijk als een 184 bp band, overeenkomstig met AMEL, zichtbaar is en
mannelijk als een 429 bp band van het SRY amplificatieproduct en/of twee banden (184 bp en 200 bp)
van AMEL aanwezig zijn. Hasegawa et al. (2000) maakt eveneens gebruik van beide primers maar met
dat verschil dat, na gel elektroforese, drie banden van het AMEL gen zichtbaar zijn bij het mannelijk
embryo namelijk AMELX, AMELY en AMELX/AMELY heteroduplex. Door de amplificatie van beide
primers is het mogelijk een onderscheid te maken tussen XY-hengsten en XY-merries. XY-merries
ontstaan door een gebrek aan het SRY gen of doordat het SRY gen gebrekkig functioneert. Bij zowel
XY-hengsten als XY-merries is een band van het AMELX, AMELY en AMELX/AMELY heteroduplex
zichtbaar. Het onderscheid wordt gemaakt door de afwezigheid van het SRY gen bij XY-merries.
3.2.2.3.2.
PCR op een RNA sequentie
Beckelmann et al. (2012) detecteert het Xist RNA aan de hand van kwantitatieve en kwalitatieve PCR.
Zoals eerder aangehaald (zie 2.2.) wordt één X-chromosoom van het vrouwelijk embryo geïnactiveerd
om over-expressie van X-gelinkte genen te vermijden. Voor deze in-activatie is een specifiek RNA nodig
namelijk het X-inactivated-specific transcript (Xist) RNA. Het Xist RNA wordt in hoge mate en specifiek
door het inactieve X-chromosoom tot expressie gebracht.
De X-chromosoom in-activatie in equine trofoblastcellen begint gradueel rond dag 7,5. Wanneer men
embryo’s collecteert vanaf dag 8 heeft men voldoende RNA voor betrouwbare resultaten na PCR.
Kwantitatieve PCR wordt gebruikt om de DNA sequentie op te sporen en het aantal ervan in het staal
te bepalen. De kwantitatieve PCR is meer betrouwbaar en accurater voor de detectie van Xist RNA dan
de kwalitatieve PCR. Voor die reden is een resultaat enkel betrouwbaar wanneer een positief resultaat
bekomen wordt door kwantitatieve PCR. Men bekomt een vals positief resultaat wanneer Xist enkel
gedetecteerd wordt door de kwalitatieve PCR en niet door de kwantitatieve PCR (Beckelmann et al.,
2012).
24
BESPREKING
Bij de mens is de geslachtsbepaling van embryo’s vaak niet afdoende om geslachtsgebonden
genetische ziektes, met behulp van pre-implantatie genetische diagnose (PGD), uit te sluiten. Dit komt
omdat de helft van de mannelijke embryo’s wel normaal zijn en bijkomend worden dochters niet
geselecteerd op de aanwezigheid van het defecte gen. De dochters die het gen dragen lopen op hun
beurt, als volwassen vrouw, het risico om zieke zonen voor te brengen. Meerdere technieken zijn
beschikbaar voor PGD afhankelijk van de ziekte die wordt getest. FISH wordt gebruikt voor het opsporen
van chromosomale aneuploïdie en geslachtschromosomen en is met andere woorden bruikbaar voor
de geslachtsbepaling van humane embryo’s. Met PCR kan men genen of genensequenties, die
specifiek zijn voor een bepaalde genetische ziekte, opsporen. Indien men FISH gebruikt voor PGD, zijn
er slechts een beperkt aantal chromosomen die simultaan kunnen getest worden. Wanneer men PCR
gebruikt voor PGD loopt men steeds het risico op contaminatie van het DNA staal, allele drop-out (ADO)
of de DNA sequentie die niet geamplificeerd wordt door een te lage hoeveelheid DNA in het staal. Door
de beperkingen van PCR en FISH worden momenteel aanvullende technieken ontwikkeld voor PGD
waaronder comparative genomic hybridization (CGH) en microarray analyse. Deze technieken kunnen
de betrouwbaarheid van PGD verhogen maar vereisen nog teveel tijd waardoor ze louter experimenteel
gebruikt worden.
PGD heeft een enorme waarde voor koppels die genetische ziektes dragen. Maar desondanks de
voordelen is biopsie van het embryo voorlopig een agressieve techniek die het embryo kan verstoren
tijdens zijn ontwikkeling. Daarom wordt er gezocht naar nieuwe benaderingen voor de indirecte evaluatie
van de genetische status van humane embryo’s in IVF programma’s. Deze technieken, zoals de
collectie van blastocoelvocht (zie 3.1.2.4.), zijn veelbelovend maar er is nog verder onderzoek nodig om
uit te maken of deze alternatieve technieken de huidige technieken kunnen vervangen of van additieve
waarde zijn (Milachich T., 2014).
Bij het rund wordt embryotransplantatie reeds routinematig in de praktijk uitgevoerd. Daarom is het
interessant om bijkomend een simpele, snelle en precieze techniek te ontwikkelen om het geslacht van
embryo’s te bepalen. De geslachtsbepaling van embryo’s is belangrijk voor de manipulatie van de
geslachtsratio’s bij gedomesticeerde dieren. Het zorgt voor een verhoogde efficiëntie in de productie
van vlees- en melkvee. Met behulp van PCR kan men met een minimale hoeveelheid doelwit sequentie
het geslacht bepalen. Het nadeel van PCR is dat het tijd consumerend is, technische vaardigheden
vergt en duur materiaal vereist. Doordat een strikte controle van de temperatuur noodzakelijk is tijdens
de verschillende stappen van PCR, is deze techniek niet bruikbaar onder veldomstandigheden. Een
accurate en snelle bepaling van het geslacht is mogelijk met behulp van FISH maar de techniek is te
ingewikkeld om routinematig in de praktijk te gebruiken. LAMP is een recentere techniek die relatief
eenvoudig en op korte tijd uitvoerbaar is. Met behulp van de LAMP embryo sexing kit van Hirayama et
al. (2013) wordt een DNA doelwitsequentie in minder dan veertig minuten geamplificeerd. Indien men
een verschillende fluorescente molecule gebruikt om de mannelijk specifieke primers te labelen dan
deze voor de autologe primer, kan men het blote oog het geslacht aflezen. Met behulp van LAMP kan
men op een snelle en gemakkelijke manier het geslacht van de boviene embryo afleiden zonder het
gebruik van gespecialiseerd materiaal. Dit maakt van LAMP een techniek die bruikbaar is in de praktijk.
25
Bij het paard staan de technieken voor geslachtsbepaling nog in hun kinderschoenen. Voorlopig is PCR
de enige techniek voor geslachtsbepaling van equine embryo’s. Zoals vermeld in bovenstaande alinea,
is PCR niet uitvoerbaar in praktijk omstandigheden en zeker niet in regio’s waar er enkel sporadisch
vraag naar is. Een andere techniek die mogelijk zou kunnen zijn is FISH. Deze techniek wordt
beschreven voor boviene embryo’s (zie 3.2.2.2.3.) maar het is nog niet duidelijk of deze techniek ook
toepasbaar is voor de geslachtsbepaling van het equine embryo door de aanwezigheid van de capsule
(Aurich en Schneider, 2014). Momenteel wordt er gewerkt aan een techniek om het geslacht van equine
embryo’s op een makkelijke, vlugge en betrouwbare manier te bepalen in de praktijk, zonder het gebruik
van gespecialiseerd materiaal. Door het succes van LAMP bij boviene embryo’s gaat men na of dit ook
zijn toepassing vindt bij equine embryo’s. Hiervoor wordt LAMP eerst afgesteld op het DNA uit bloed
van merries en hengsten. Vervolgens heeft men deze techniek aangepast voor de geslachtsbepaling
van cellen genomen uit equine embryo’s. Een volgende stap, om de toepassingsmogelijkheden van de
techniek te vergroten, is de LAMP afstellen op blastocoelvocht in plaats van cellen. Op die manier
creëert men de mogelijkheid om op een efficiënte en betrouwbare manier het geslacht van equine
embryo’s in de praktijk te bepalen, met zo optimaal mogelijke drachtpercentages.
26
REFERENTIELIJST
Ambartsumyan G., Clark A.T. (2008). Aneuploidy and early human embryo development. Human
Molecular Genetics 17, 10-15.
Aurich C., Schneider J. (2014). Sex determination in horses – Current status and future perspectives.
Animal Reproduction Science 146, 34-41.
Basille C., Frydman R., El Aly A., Hesters L., Fanchin R., Tachdjian G., Setffann J., LeLorc’h M., AchourFrydman N. (2009). Preimplantation genetic diagnosis: State of the art. European Journal of Obstetrics
& Gynecology and Reproductive Biology 145, 9-13.
Beckelmann J., Budik S., Bartel C., Aurich C. (2012). Evaluation of Xist expression in preattachment
equine embryos. Theriogenology 78, 1429-1436.
Betteridge K.J. (2007). Equine embryology: An inventory of unanswered questions. Theriogenology 68,
9-21.
Carneiro M.C.A., Takeuchi P.L., Araújo A., Lôbo R.B., Elias F.P., Vila R.A., Miranda-Furtado C.L.,
Ramos E.S. (2011). Sexing single bovine blastomeres using TSPY gene amplification. Genetics and
Molecular Research 10, 3937-3941.
Carnevale E.M., Sessions D.R. (2012). In vitro production of equine embryos. Journal of Equine
Veterinary Science 32, 367-371.
Cenariu M., Groza I., Pop R.A., Stegeran B., Pall E., Catana L., Bartos A. (2008). Bovine embryo sexing
using the fluorescence in situ hybridization (FISH). Veterinary Medicine 65, 110-113.
Cenariu M., Pall E., Cernea C., Groza I. (2012). Evaluation of bovine embryo biopsy techniques
according to their ability to preserve embryo viability. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012,
1-5.
Chen C.M., Hu C.L., Wang C.H., Hung C.M., Wu H.K., Choo K.B., Cheng W.T.K. (1999). Gender
determination in single bovine blastomeres by polymerase chain reaction amplification of sex-specific
polymorphic fragments in the amelogenin gene. Molecular Reproduction and Development 54, 209-214.
Choi Y.H., Gustafson-Seabury A., Velez I.C., Hartman D.L., Bliss S., Riera F.L., Roldán J.E., Chowdhary
B., Hinrichs K. (2010). Viability of equine embryos after puncture of the capsule and biopsy for
preimplantation genetic diagnosis. Reproduction 140, 893-902.
De La Fuente R., Hahnel A., Basrur P.K., King A.W. (1999). X inactive-specific transcript (Xist)
expression and X chromosome inactivation in the preattachment bovine embryo. Biology of
Reproduction 60, 769-775.
Fasouliotis S.J., Schenker J.G. (1998). Preimplantation genetic diagnosis principles and ethics. Human
Reproduction 13, 2238-2245.
27
Hasegawa T., Sato F., Ishida N., Fukushima Y., Mukoyama H. (2000). Sex determination by
simultaneous amplification of equine SRY and amelogenin genes. Journal of Veterinary Science 62,
1109-1110.
Hasler J.F., Cardey E., Stokes J.E., Bredbacka P. (2002) Nonelectrophoretic PCR-sexing of bovine
embryos in a commercial environment. Theriogenology 58, 1457-1469.
Herrera C., Morikawa M.I., Bello M.B., von Meyeren M., Eusebio Centeno J., Dufourq P., Martinez M.M.,
Llorente J. (2014). Setting up equine embryo gender determination by preimplantation genetic diagnosis
in a commercial embryo transfer program. Theriogenology 81, 758-763.
Hinrichs K., Choi Y.H. (2012). Equine embryo biopsy, genetic testing, and cryopreservation. Journal of
Equine Veterinary Science 32, 390-396.
Hirayama H., Kageyama S., Moriyasu S., Sawai K., Minamihashi A. (2013). Embryo sexing and sex
chromosomal chimerism analysis by loop-mediated isothermal amplification in cattle and water
buffaloes. Journal of Reproduction and Development 59, 321-326.
Kageyama S., Yoshida I., Kawakura K., Chikuni K. (2004). A novel repeated sequence located on the
bovine Y chromosome: its application to rapid and precise embryo sexing by PCR. Journal of Veterinary
Medical Science 5, 509-514.
Kirkpatrick B.W., Monson R.L. (1993). Sensitive sex determination assay applicable to bovine embryos
derived from IVM and IVF. Journal of Reproduction and fertility 98, 335-340.
Lee J.H., Park J.H., Lee S.H., Park C.S., Jin D.I. (2004). Sexing using single blastomere derived from
IVF bovine embryos by fluorescence in situ hybridization (FISH). Theriogenology 62, 1452-1458.
Liu J., Zheng X., Baramaki T.A., Yazigi R.A., Compton G., Katz E. (1998). Ultra rapid detection of sex
chromosomes with the use of fluorescence in situ hybridization with direct label DNA probes in single
human blastomeres, spermatozoa, amniocytes, and lymphocytes. Fertility and Sterility 70, 927-932.
Lopes R.F.F., Forell F., Oliveira A.T.D., Rodrigues J.L. (2001). Splitting and biopsy for bovine embryo
sexing under field conditions. Theriogenology 56, 1383-1392.
Macháty Z., Páldy A., Csáki T., Varga Z., Kiss I., Bárándi Z., Vajta G. (1993). Biopsy and sex
determination by PCR of IVF bovine embryos. Journal of Reproduction and Fertility 98, 467-470.
Milachich T. (2014) New advances of preimplantation and prenatal genetic screening and noninvasive
testing as a potential predictor of health status of babies. BioMed Research International 2014, 1-8.
Morrish B.C., Sinclair A.H. (2002). Vertebrate sex determination: many means to an end. Reproduction
124, 447-457.
Nef A., Schaad O., Stallings N.R., Cederroth C.R., Pitetti J.L., Schaer G., Malki S., Dubois-Dauphin M.,
Boizet-Bonhoure B., Descombes P., Parker K.L., Vassalli J.D. (2005). Gene expression during sex
28
determination reveals a robust female genetic program at the onset of ovarian development.
Developmental Biology 287, 361-377.
Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. (2000). Loop
mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid Research 28, e63.
Palini S., Galluzzi L., De Stepfani S., Bianchi M., Wells D., Magnani M., Bulletti C. (2013). Genomic DNA
in human blastocoel fluid. Reproductive BioMedicine Online 26, 603-610.
Peippo J., Huhtinen M., Kotilainen T. (1995). Sex diagnosis of equine preimplantation embryo’s using
the polymerase chain reaction. Theriogenology 44, 619-627.
Rattanasuk S., Parnpai R., Ketudat-Cairns M. (2011). Multiplex Polymerase Chain Reaction Used For
Bovine Embryo Sex Determination. Journal of Reproduction and Development 57, 539-542.
Ross D.G.F., Bowles J., Hope M., Lehnert S., Koopman P. (2009). Profiles of gonadal gene expression
in the developing bovine embryo. Sexual Development 3, 273-283.
Sang-Hyun H., Byoung-Chul Y., Moon-Suck K., Hong-Shik O., Sung-Soo L. (2010). Length difference
between equine ZFX and ZFY genes and its application for molecular sex determination. Journal of
Assisted Reproduction and Genetics 27, 725-728.
Senger P.L. (2005). Pathways to pregnancy and parturition, 2nd rev. ed, Current Conceptions, Pullman,
USA, p. 84-99.
Staessen C., Van Assche E., Joris H., Bonduelle M., Vandervorst M., Liebaers I., Van Steirteghem A.
(1999). Clinical experience of sex determination by fluorescent in-situ hybridization for preimplantation
genetic diagnosis. Molecular Human Reproduction 5, 382-389.
Stout T.A.E., Meadows S., Allen W.R. (2005). Stage-specific formation of the equine blastocyst capsule
is instrumental to hatching and to embryonic survival in vivo. Animal Reproduction Science 87, 269-281.
Thibier M., Nibart M. (1995). The sexing of bovine embryos in the field. Theriogenology 43, 71-80.
Trask B.J. (1991). Fluorescence in situ hybridization. Technical Focus 7, 149-151.
Tremoleda J.L., Stout T.A., Lagutina I., Lazzari G., Bevers M.M., Colenbrander B., Galli C. (2003).
Effects of in vitro production on horse embryo morphology, cytoskeletal characteristics, and blastocyst
capsule formation. Biology of Reproduction 69, 1895-1906.
Virta J., Markola J., Peippo J., Markkula M., Vilkki J. (2002) Sex determination of bovine embryo
blastomeres by fluorogenic probes. Theriogenology 57, 2229-2236.
Weikard R., Kühn C., Brunner R.M., Roschlau D., Pitra C., Laurent P., Schwerin M. (2001). Sex
determination in cattle based on simultaneous amplification of a new male-specific DNA sequence and
autosomal locus using the same primers. Molecular Reproduction and Development 60, 13-19.
29
Wilhelm D., Palmer S., Koopman P. (2007). Sex determination and gonadal development in mammals.
The American Physiological Society 87, 1-28.
Wu P., Whiteford M.L., Cameron A.D. (2014). Preimplantation genetic diagnosis. Obstetrics,
Gynecology and Reproductive Medicine 24, 67-73.
Yan L., Wei Y., Huang J., Zhu X., Shi X., Xia X., Yan J., Lu C., Lian Y., Li R., Liu P., Qiao J. (2014).
Advances in preimplantation genetic diagnosis/screening. Science China Life Sciences 57, 665-671.
Zakharova E.E., Zaletova V.V., Krivokharchenko A.S. (2014). Biopsy of human morula-stage embryos:
outcome of 215 IVF/ICSI cycles with PGS. Plos One 9, 1-6.
Zoheir K.M.A., Allam A.A. (2010). A rapid method for sexing the bovine embryo. Animal Reproduction
Science 119, 92-96.
30