Woord vooraf - Howest DSpace

Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Woord vooraf
In het laatste jaar van onze opleiding is een stageperiode van vijftien weken voorzien
waarvan zeven weken eindwerkstage. Voor mijn eindwerkstage kwam ik in het AZ St Jan
in Brugge terecht waar ik in het centrum voor reproductieve geneeskunde (CRG labo) een
vergelijkende studie zou maken tussen twee verschillende cryopreservatiemethodes.
Graag wil ik biologe-embyologe Valerie Standaert bedanken voor de goede begeleiding
gedurende deze zeven weken alsook voor de informatie die zij tot mijn beschikking stelde
om mijn eindwerk te maken. Ik wil ook mijn dank betuigen aan de andere personeelsleden
van het CRG labo die mij gedurende deze zeven weken begeleid hebben.
Dr. Sc. Nicole Kelner die mijn begeleidster was gedurende deze zeven weken wil ik ook
bedanken voor de goede opvolging.
1
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Samenvatting
Cryopreservatie is een techniek waarmee onder andere embryo’s gedurende lange tijd
kunnen bewaard worden in vloeibare stikstof. Er bestaan verschillende cryopreservatiemethodes die elk gebruik maken van andere cryoprotectanten en/of een ander invriesprogramma. In het AZ St Jan Brugge worden momenteel dimethylsulfoxide-sucrose (DMSOsucrose) als cryoprotectanten gebruikt met een aangepast invriesprogramma. Het DMSOsucrose wordt in het labo zelf aangemaakt en dit is arbeidsintensief. Daarom wil men
overschakelen naar een andere methode die commercieel beschikbaar is.
In het theoretisch deel wordt uitgelegd wat in vitro fertillisatie en cryopreservatie inhouden.
In het deel resultaten wordt een vergelijking gemaakt tussen twee cryopreservatiemethodes, namelijk tussen DMSO-sucrose en een methode van vitrolife die gebruik maakt van
propaandiol (PROH) en sucrose. De twee methoden worden op drie vlakken met elkaar
vergeleken. Op vlak van: overleving, evolutie en evolutie tot blastocyst stadium.
DMSO-sucrose scoort op twee van de drie vlakken significant beter dan de methode van
vitrolife. Alvorens een wijziging van methode plaatsvindt moeten er aanpassingen in het
vitrolife protocol doorgevoerd worden.
2
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Lijst met afkortingen en symbolen
2PN
:
twee pronucleï of voorkernen (voorloper van een kern)
DMSO
:
dimethylsulfoxide
EBSS
:
Earle’s balanced salt solution
EFS
:
embryo freezing solution
ETS
:
embryo thawing solution
ET
:
embryo transfer
FRET
:
frozen embryo transfer
HCG
:
humaan chorion gonadotrofine
Hepes
:
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HES
:
hepes gebufferde Earle’s medium met HSA
HSA
:
humaan serum albumine
ICM
:
inner cell mass
ICSI
:
intracytoplasmatische spermacel injectie
IVF
:
in vitro fertilisatie
IUI
:
intra-uteriene inseminatie
LAF
:
laminaire flow
ml
:
milliliter
mm
:
millimeter
OPU
:
Oöcyt pick-up, eicelpunctie
PBS
:
phosphate buffered saline
PROH
:
propaandiol
Sec
:
seconden
3
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
T
:
temperatuur
TE
:
trofectoderm
4
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Verklarende woordenlijst
Blastocoel
: ook klievingsholte genoemd, is een holte die centraal gelegen is in
de blastocyst
Blastocyst
: is een embryonaal ontwikkelingsstadium, gevormd op dag 5 of
dag 6 van de embryonale ontwikkeling waarbij de blastocoel is
gevormd die de ICM bevat en omgeven is door het trofectoderm
Blastomeer
: een delingscel van het embryo
Bull’s eye structuur
: ontstaat door samentrekking van het cytoplasma
Cumuluscomplex
: steun- en voedingscellen die de eicel omgeven
Ectoderm
: kiemlaag die de huid en het zenuwstelsel vormt
Endoderm
: kiemlaag die het bloed, het skelet, de spieren, het bindweefsel en
de nieren vormt
Endometrium
: baarmoederslijmvlies, dit wordt tijdens de menstruatie afgestoten
tijdens de zwangerschap menstrueert de vrouw niet waardoor het
embryo zich in het endometrium kan innestelen
Eutectisch punt
: de temperatuur waarbij een mengsel van stoffen zal smelten of
stollen
5
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Glad endoplasmatisch reticulum : is een onderdeel van de cel die instaat voor het vervoer
van stoffen vanuit het ruw ER, het oplsaan van calcium ionen, de
synthese van lipiden en fosfolipiden en detoxificatie.
Meerkernigheid
: er zijn meerdere kernen aanwezig in één blastomeer, dit wordt als
abnormaal beschouwd, tenzij de kernen even groot zij, dit wijst er
dan op dat de cel in deling is
Mesoderm
: kiemlaag die het spijsverteringsstelsel en de inwendige organen
vormt
Morula
: embryonaal ontwikkelingsstadium op dag vier en is het resultaat
van de elkaar snel opvolgende klievingsdelingen, zo ontstaat er
een bolvormige tros van kleine bolvormige blastomeren,
Oöcyt
: synoniem voor eicel
Poollichaam
: een kern die uitgestoten wordt tijdens de meiotische delingen bij
de vorming van de eicel
Trofectoderm
: het geheel van cellen die zorgen voor extra-embryonale structuren
zoals de placenta, het zorgt eveneens voor de uitwisseling van
voedingsstoffen en afvalproducten
Zona pellucida
: een membraan opgebouwd uit glycoproteïnen die het plasmamembraan van de eicel omgeeft. Eenmaal één zaadcel door de
zona pellucida geraakt zal deze in normale omstandigheden ondoordringbaar worden voor andere zaadcellen.
6
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Lijst van tabellen en figuren
Tabel 2.1: Eigenschappen van DMSO en PROH (5)......................................................... 20
Tabel 3.1: Gebruikte materialen ........................................................................................ 32
Tabel 3.2: Gebruikte reagentia .......................................................................................... 33
Tabel 3.3: Gebruikte toestellen .......................................................................................... 33
Tabel 3.4: Invriesoplossingen DMSO-sucrose protocol..................................................... 38
Tabel 3.5: Dooioplossingen DMSO-sucrose protocol ........................................................ 39
Tabel 4.1: Resultaten DMSO-sucrose ............................................................................... 47
Tabel 4.2: Resultaten PROH ............................................................................................. 48
Figuur 2.1: De uitvoering van een ICSI ............................................................................. 15
Figuur 2.2: De cyclus bij een kunstmatige bevruchting .................................................... 16
Figuur 2.3: Links een achtcellig embryo op dag drie, rechts een blastocyst op dag vijf .... 18
Figuur 2.4: Een invriesstrootje ........................................................................................... 22
Figuur 2.5: Een laborante die een seeding uitvoert .......................................................... 23
Figuur 2.6: Een isotone oplossing ..................................................................................... 24
Figuur 2.7: Normaal embryo met 2PN, abnormaal meerkernig embryo met 3PN ........... 27
Figuur 2.8: Fragmentatie ................................................................................................... 28
Figuur 2.9: Gradaties bij fragmentatie ............................................................................... 29
Figuur 2.10: Links een hatching blastocyst, Rechts een hatched blastocyst ................... 30
Figuur 2.11 : Blastocyst ..................................................................................................... 31
Figuur 3.1 : ID rods, ID jackets en een invriesstrootje ....................................................... 33
Figuur 3.2 : De inversiemicroscoop Nikon Eclipse TE2000U............................................34
7
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Figuur 3.3 : De stereomicroscoop Nikon SMZ 1000..........................................................34
Figuur 3.4 : De cryogene tank............................................................................................35
Figuur 4.1: Overlevingspercentage bij de DMSO-Sucrose methode ................................. 47
Figuur 4.2: Overlevingspercentage PROH methode ......................................................... 49
8
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Inhoudsopgave
Woord vooraf ..................................................................................................................... 1
Samenvatting ..................................................................................................................... 2
Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................. 3
Verklarende woordenlijst .................................................................................................. 5
Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................. 7
Inhoudsopgave .................................................................................................................. 9
1
Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................. 12
2
Literatuurstudie ................................................................................................. 14
2.1
Doelstelling .......................................................................................................... 14
2.2
In Vitro Fertilisatie ................................................................................................ 14
2.3
Cryopreservatie algemeen ................................................................................... 19
2.3.1
Wat is cryopreservatie? ....................................................................................... 19
2.3.2
Principe ................................................................................................................ 19
2.3.3
Cryoprotectanten ................................................................................................. 20
2.4
Traag Invriezen .................................................................................................... 21
2.4.1
Dehydratatie ........................................................................................................ 21
2.4.2
Seeding................................................................................................................ 22
2.5
Vitrificatie ............................................................................................................. 24
2.6
Ontdooien ............................................................................................................ 25
2.6.1
Rehydratatie ........................................................................................................ 25
2.7
Evaluatie en embryodeling .................................................................................. 26
2.7.1
Dag 0 (bij ICSI, niet bij IVF) ................................................................................. 26
2.7.2
Dag 1 ................................................................................................................... 26
2.7.3
Dag 2 ................................................................................................................... 28
2.7.4
Dag 3 ................................................................................................................... 29
2.7.5
Dag 4 (morula stadium) ....................................................................................... 29
2.7.6
Dag 5 – 6 ............................................................................................................. 30
9
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
3
Materiaal en methode ........................................................................................ 32
3.1
Gebruikte materialen, reagentia en toestellen ..................................................... 32
3.1.1
Invriesstrootjes , ID jacket en ID rod .................................................................... 34
3.1.2
Microscopen ........................................................................................................ 35
3.1.3
De cryogene tank ................................................................................................. 36
3.2
Het DMSO-sucrose protocol ................................................................................ 37
3.2.1
Samenstelling EBSS ............................................................................................ 37
3.2.2
Bereiding van EBSS-stockoplossing ................................................................... 37
3.2.3
Bereiding van HES .............................................................................................. 37
3.2.4
Bereiding van de sucrose-oplossing (1M) ........................................................... 37
3.2.5
Invriesstockoplossing (0,1M sucrose) .................................................................. 38
3.2.6
Dooistockoplossing (0,2M sucrose) ..................................................................... 38
3.2.7
Bereiding van ontdooi – en invriesmedia ............................................................. 38
3.2.8
Werkwijze invriezen ............................................................................................. 40
3.2.9
Werkwijze ontdooien ............................................................................................ 41
3.2.10
Programma invriestoestel.................................................................................... 42
3.3
Het protocol van vitrolife ...................................................................................... 42
3.3.1
Gebruikte media .................................................................................................. 42
3.3.2
Werkwijze invriezen ............................................................................................. 42
3.3.3
Werkwijze ontdooien ............................................................................................ 43
3.3.4
Programma invriestoestel .................................................................................... 44
3.4
Methode ............................................................................................................... 45
4
Resultaten .......................................................................................................... 46
4.1
Leerproces ........................................................................................................... 46
4.2
Resultaat.............................................................................................................. 46
4.2.1
DMSO-Sucrose .................................................................................................... 47
4.3
PROH .................................................................................................................. 48
4.4
Zijn er significante verschillen tussen beide methoden? ..................................... 49
4.4.1
significantie naar 100% overleving toe ................................................................ 50
4.4.2
significantie naar evolutie toe .............................................................................. 51
4.4.3
significantie naar evolutie tot blastocyst toe ........................................................ 52
10
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
5
Discussie en Conclusie ..................................................................................... 53
Literatuurlijst .................................................................................................................... 54
Bijlagen ............................................................................................................................. 57
Bijlage 1 – Human Blastocyst Vitrification Protocol ........................................................... 58
Bijlage 2 – delingschema van een embryo ........................................................................ 60
Bijlage 3 – Verschillende stadia bij compactatie ............................................................... 63
Voor akkoord verklaring ................................................................................................. 64
11
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
1
Inleiding, situatieschets en probleemstelling
Koppels met een bestaande kinderwens kunnen vroeg of laat geconfronteerd worden met
een harde realiteit, op natuurlijke wijze kinderen krijgen is niet altijd mogelijk zonder hulp
van buitenaf. Ook alleenstaande vrouwen of homoseksuele (lesbische) koppels met een
bestaande kinderwens kunnen de hulp van een fertiliteitscentrum inroepen. Indien een
vrouw niet spontaan zwanger wordt zal ze na verloop van tijd de hulp van een fertiliteitsarts inroepen. De arts zal in eerste plaats nagaan of de vrouw ooit al zwanger is geweest
en hoe lang het koppel al een kinderwens heeft. Als de vrouw nog nooit spontaan zwanger is geweest en de kinderwens al meer dan één jaar duurt, worden zowel bij de man als
bij de vrouw verschillende onderzoeken gedaan, bijvoorbeeld : het nagaan van de functionaliteit van de eileiders of onderzoek naar de vruchtbaarheid van het sperma van de
man. Afhankelijk van de resultaten van de verschillende onderzoeken wordt in overleg
tussen de fertiliteitsarts en het koppel een adequate behandeling voorgeschreven.
In vitro betekent letterlijk ‘in glas’, wat in dit geval wil zeggen dat de bevruchting buiten het
lichaam van de vrouw gebeurt. Er zijn verschillende manieren om een koppel te helpen
hun bestaande kinderwens te vervullen. Tijdens een IVF behandeling wordt de vrouw
hormonaal gestimuleerd zodat meerdere eicellen samen tot rijping worden gebracht. De
eicellen van de vrouw worden na de afname bevrucht met zaadcellen van de partner of
donor, zo worden embryo’s gevormd. Deze embryo’s worden beoordeeld volgens verschillende morfologische criteria die een beeld geven over de ‘kwaliteit’ van het embryo.
Als de kwaliteit voldoende is worden er één of meer embryo’s teruggeplaatst in de baarmoeder van de vrouw. De overtallige embryo’s van voldoende kwaliteit kunnen ingevroren
worden. Later kunnen ze opnieuw ontdooid worden en eventueel teruggeplaatst worden
als ze de procedure overleven.
Tijdens de invries- en dooiprocedure kunnen embryo’s beschadigd worden, om dit te
voorkomen zullen invriesbeschermende stoffen of cryoprotectanten gebruikt worden. Momenteel gebruikt het labo CRG in het AZ St.-Jan AV dimethylsulfoxide (DMSO) met su12
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
crose. Deze cryoprotectanten lopen op in concentratie, men spreekt daarom van een invriesreeks. De invriesreeks met DMSO-sucrose wordt in het labo zelf aangemaakt, dit is
zeer arbeidsintensief. Belangrijk naar accreditering van het labo toe, is dat van alle gebruikte reagentia alles, zoals lotnummers, gekend moet zijn, ook dit is moeilijk en vraagt
veel tijd en energie. Het zou gemakkelijker en nuttig zijn om over te schakelen op een
commercieel beschikbaar medium dat met de nodige garanties en certificaten geleverd
wordt. Onder andere Vitrolife en Cook bieden zo’n kit aan die gebruik maakt van propaandiol en sucrose als cryoprotectanten.
Vooraleer de overschakeling naar een andere methode en cryoprotectanten kan gebeuren moet deze eerst gevalideerd worden. Dit wil zeggen dat de nieuwe methode minstens
even goed of liefst nog beter moet zijn dan de gebruikte methode. Zo moet er ondermeer
een vergelijkende studie gebeuren naar overleving en evolutie toe. Onder overleving verstaat men de kwaliteit van het embryo na het ontdooien, evolutie is het al dan niet doordelen van een embryo na een ontdooiprocedure. De methode van Vitrolife zal vergeleken
worden met de bestaande methode van ‘home-made’ DMSO-sucrose. Voor het onderzoek zullen embryo’s gebruikt worden die niet in aanmerking komen om teruggeplaatst te
worden, zoals embryo’s met een minder goede kwaliteit, embryo’s met meerkernige
blastomeren of embryo’s met een afwijkend bevruchtingspatroon. Deze embryo’s worden
verdeeld tussen de twee verschillende methodes (Vitrolife en DMSO-sucrose) . Na invriezen zullen ze ontdooid worden en zal overleving en evolutie nagegaan worden.
13
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2
Literatuurstudie
2.1
Doelstelling
Het doel is over te stappen van de huidige methode met dimethylsulfoxide-sucrose
(DMSO) naar een andere methode die commercieel beschikbaar is. Deze gebruikt propaandiol en sucrose als cryoprotectanten en ook een ander invriesprogramma.
2.2
In Vitro Fertilisatie
Koppels die om verschillende redenen hun kinderwens niet in vervulling zien gaan, nemen
vaak hun toevlucht tot IVF. Als verminderde vruchtbaarheid vastgesteld wordt bij de man
en/of bij de vrouw, voorbeeld slechte kwaliteit van het sperma, problemen met de eicellen,
of als er geen directe oorzaak kan gevonden worden, kan IVF een oplossing bieden om
deze wens toch te vervullen.
Er zijn verschillende manieren die een koppel zullen helpen om hun kinderwens te vervullen :
- IUI : staat voor intra-uteriene inseminatie, bij deze techniek zal opgewerkt en gecapaciteerd sperma van de partner in de baarmoeder van de vrouw gebracht worden.
- IVF : In een cultuurschaal wordt een cumulus complex met eicel samen gebracht met
zaadcellen. Op die manier gebeurt de bevruchting nog min of meer via natuurlijke selectie, maar buiten het lichaam van de vrouw.
- ICSI (zie figuur 2.1) : staat voor intracytoplasmatische sperma injectie. Bij een ICSI
zal men één zaadcel rechtstreeks in de eicel injecteren. ICSI gebeurt als het sperma
van mindere kwaliteit is of wanneer een voorgaande IVF gefaald heeft.
14
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Figuur 2.1: De uitvoering van een ICSI, met rechts de naald die de spermacel zal injecteren,
en links de houder die de eicel op zijn plaats houdt (13)
Bij een IUI zal afhankelijk van de cyclus al dan niet een hormoonstimulatie gegeven worden. Het doel is één tot maximum drie follikels tot rijping te laten komen. Vlak voor de eisprong zal humaan chorion gonadotrofine (HCG) gegeven worden, 36 uur later vindt de
eisprong plaats. De dag zelf wordt een gecapaciteerd spermastaal van de man via een
inseminatie katheter ingebracht in de baarmoeder van de vrouw.
Bij de start van de IVF/ICSI behandeling zal de vrouw eerst een hormoonstimulatie ondergaan, dit zorgt dat er meerdere eicellen tegelijk kunnen rijpen in het ovarium. De rijping
gebeurt in kleine blaasjes die follikels heten en wordt nagegaan via oestradiol bepaling en
echografie. Voor de follikelaspiratie of punctie krijgt de vrouw een inspuiting met HCG. Dit
hormoon zorgt voor de verdere uitrijping van de eicellen. De follikels worden 34 tot 36 uur
na toediening van het HCG aangeprikt en leeggezogen met behulp van een dubbel lumen
naald. Het aanprikken van de follikels is de oöcyt pick up (OPU) en gebeurt onder echografische begeleiding. Het verkregen follikelvocht zal in het labo onderzocht worden op de
15
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
aanwezigheid van eicellen, de verkregen eicellen worden dan direct in cultuurmedium
geplaatst. (zie figuur 2.2: de cyclus bij een kunstmatige bevruchting)
Figuur 2.2: De cyclus bij een kunstmatige bevruchting (14)
Op de dag van de OPU moet de man een spermastaal naar het labo brengen. Als de man
op deze dag niet aanwezig kan zijn om een spermastaaltje af te geven, kunnen zijn zaadcellen voor de start van de behandeling ingevroren worden en terug ontdooid worden op
de dag van de OPU. De eicellen worden dan via IVF of ICSI bevrucht. Als het gaat om
een IVF behandeling zal het cumuluscomplex niet van de eicellen verwijdert worden omdat het complex nodig is voor de binding van de zaadcel(len). Bij een ICSI behandeling
zullen de cumuluscomplexen met de eicellen behandeld worden met een enzym, hyaluronidase. Dit enzym zorgt ervoor dat de cumuluscellen loskomen van de eicel, de eicellen
komen vrij en kunnen op hun rijpheid beoordeeld worden. Daarna vindt de bevruchting
(injectie) plaats. Zestien tot twintig uur na de bevruchting wordt geëvalueerd om de correct
bevruchte eicellen te scheiden van alle andere, alleen de correct bevruchte eicellen worden verder opgevolgd. Alle culturen, van eicellen of embryo’s, gebeuren in de incubator,
die het milieu van de baarmoeder en de eileider zo goed mogelijk nabootst. De atmosfeer
16
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
in de incubator bestaat uit 6% CO2 en 5% O2 bij 37°C. De embryo’s worden dagelijks geevalueerd en na ten vroegste twee tot maximaal zes dagen kunnen de geschikte embryo(‘s) teruggeplaatst worden in de baarmoeder, dit proces heet de embryo transfer (ET).
Als een embryo vijf dagen oud is spreekt men van een blastocyst, als er gewacht wordt tot
dag vijf of zes om het embryo terug te plaatsen kan een andere selectie gebeuren dan op
dag twee of drie. Dit is te verklaren door de genoomovergang die normaal optreedt op dag
drie. Tijdens de eerste drie dagen deelt het embryo deels via het genoom van zijn vader
maar hoofdzakelijk via dat van zijn moeder, op dag drie moet het eigen genoom geactiveerd zijn. Ongeveer 50% van de embryo’s zullen deze genoomovergang niet maken en
stoppen met delen, door te wachten tot dag vijf of zes kan een embryo teruggeplaatst
worden die deze genoomovergang wel maakt. Aan de andere kant moet er ook rekening
gehouden worden met het feit dat een embryo buiten het lichaam van de moeder nooit in
ideale omstandigheden zit, dus snelle terugplaatsing op dag twee of drie heeft ook zijn
voordelen, het embryo zit namelijk sneller terug in zijn natuurlijke omgeving. Verschillende
studies tonen aan dat geen van beide methoden voordeel heeft op de ander, een zwakker
embryo zal bijvoorbeeld in niet ideale omstandigheden de genoomovergang niet maken
maar misschien wel in de baarmoeder. Eén of meerdere embryo’s mogen teruggeplaatst
worden. Dit is via de wet vastgelegd door het Koninklijk Besluit van 4 juni 2003 en dit om
de kans op meerlingen te verkleinen. Het maximum aantal teruggeplaatste embryo’s varieert volgens de leeftijd en het aantal pogingen. De terugplaatsing gebeurt door middel van
een katheter, allereerst word het embryo samen met wat cultuurmedium geaspireerd, vervolgens wordt de katheter langs de cervix hoog in de uterus gebracht en zal de dokter het
embryo in de uterus spuiten. De ganse procedure duurt zo’n tien tot twintig minuten en
wordt zonder verdoving uitgevoerd.
Na de terugplaatsing zullen op verschillende tijdstippen bloedafnames gebeuren, waarvan
de eerste zeven dagen na de OPU. Als de oestrogenen te laag staan zal dan nog eens
HCG bijgegeven worden. De tweede bloedafname gebeurt veertien dagen na de OPU, is
bij de eerste bloedafname geen HCG gegeven, zullen deze resultaten bevestigen of er
zwangerschap is of niet. Wordt er wel HCG gegeven bij de eerste afname, zal eenentwin17
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
tig dagen na de OPU nog een derde bloedafname gebeuren om te bevestigen of er
zwangerschap is of niet. Overtallige embryo’s van voldoende kwaliteit kunnen na de transfer ingevroren worden om eventueel later te ontdooien en als ze de procedure overleven
terug te plaatsen, dit heet de ‘frozen embryo transfer’ (FRET). (8,10)
Figuur 2.3: Links een achtcellig embryo op dag drie, rechts een blastocyst op dag vijf (15)
18
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2.3
2.3.1
Cryopreservatie algemeen
Wat is cryopreservatie?
Cryopreservatie betekent bewaren door invriezen, bij deze techniek worden cellen, weefsels of organen ingevroren zodat ze op een later tijdstip ontdooid kunnen worden om
eventueel opnieuw te gebruiken. In dit geval gaat het om humane delingsembryo’s die
meestal bij temperaturen van -196°C (de temperatuur van vloeibaar stikstof) worden bewaard. (7)
2.3.2
Principe
Bij cryopreservatie daalt het metabolisme van de cellen door temperatuursverlaging tot er
geen biochemische reacties meer kunnen gebeuren. Een embryo bevat veel water en dat
moet eerst via osmose verwijderd worden. Er worden daarvoor bepaalde stoffen (cryoprotectanten) gebruikt. Het water vormt tijdens het invriesproces ijskristallen die de embryonale structuren kunnen breken. In de praktijk zal ongeveer een helft van de delingsembryo’s het proces van invriezen en ontdooien goed doorstaan.(9)
Verschillende stappen van een cryopreservatieprocedure :
- evaluatie van overtallige embryo’s
- invriezen
- ontdooien
- evaluatie na ontdooien
- transfer als er overleving is (FRET), (overleving is het aantal intacte blastomeren na
het ontdooien gedeeld door het aantal intacte blastomeren voor het invriezen)
19
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2.3.3
Cryoprotectanten
Cryoprotectanten beschermen de cellen die ingevroren worden doordat ze een isotoon
milieu in stand houden, ze remmen de bevriezing zodat deze niet te snel gebeurt en ze
verminderen de oplosbaarheid van potentieel toxische of genotoxische opgeloste stoffen.
Er zijn twee soorten cryoprotectanten, permeabele – en niet permeabele stoffen. De permeabele stoffen zijn klein genoeg om doorheen het celmembraan van het embryo te dringen en nemen de plaats in van water. De niet permeabele stoffen zijn te groot om doorheen het celmembraan te dringen en blijven buiten de cel waar ze zorgen voor een hypertoon extracellulair milieu waardoor de wateruitstroom van het embryo wordt bevordert.
Trehalose en sucrose zijn voorbeelden van niet permeabele cryoprotectanten. Propyleen
glycol, glycerol, PROH en DMSO zijn voorbeelden van permeabele cryoprotectanten. (6)
(tabel 2.1 geeft een overzicht van de eigenschappen van DMSO en PROH)
Naam
Dimethylsulfoxide
1,2-Propaandiol
Molecuul formule
C2H6SO
C3H8O2
Molecuul massa
78,13g/mol
76,11g/mol
Kookpunt
189°C
187°C
Smeltpunt
18,5°C
-60°C
Structuur formule
Tabel 2.1: Eigenschappen van DMSO en PROH (5)
20
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2.4
Traag Invriezen
Ieder celtype heeft een andere afkoelsnelheid, deze is gelimiteerd door de snelheid
waarmee het water doorheen de celmembraan passeert. Deze is afhankelijk van :
- de bouw en permeabiliteit van het celmembraan (waterdoorlaatbaarheid membraan, doorlaatbaarheid voor cryoprotectanten, soort membraaneiwitten)
- de oppervlaktevolume ratio van de cel (hoe groter deze ratio hoe sneller een cel
zal dehydrateren, kleine cellen hebben een groot oppervlak in vergelijking met hun
volume)
- de temperatuur (hoe hoger de T, hoe beter de permeabiliteit van de celmembraan
dus hoe groter de dehydratatiesnelheid)
- het osmotisch druk verschil tussen de twee kanten van het membraan
Belangrijk bij het traag invriezen is het gebruik van cryoprotectanten, deze zorgen echter
voor een verlaging van het vriespunt met 2-3°C waardoor er een groter risico op intracellulaire kristalvorming ontstaat, daardoor is de uitvoering van een ‘seeding’ (zie 2.4.2) zeer
belangrijk. (6)
2.4.1
Dehydratatie
Dehydratatie betekent in dit geval het uitdrogen van het embryo, cryoprotectanten zijn
hiervoor verantwoordelijk. In de praktijk worden cryoprotectanten gebruikt in concentraties
van ongeveer 0,75M tot en met 1,5M. De concentratie van de gebruikte cryoprotectanten
in het medium is hoger dan in het embryo (hypertoon milieu). Het embryo zal osmotisch
reageren en zal water verliezen. De permeabele cryoprotectant (DMSO of PROH) dringt
door de celwand van het embryo en neemt de plaats van water in. Sucrose is te groot en
kan niet in de cel binnendringen. De snelheid waarmee het embryo water verliest is echter
hoger dan de snelheid waarmee de cryoprotectant het embryo binnendringt, het embryo
zal hierdoor tijdelijk krimpen. Dit wordt verholpen door een invriesreeks met oplopende
concentratie aan cryoprotectant te gebruiken, het embryo krijgt dan tijd om zijn oorspronkelijk celvolume te behouden. Verschillende cryoprotectanten samen zorgen ervoor dat
het embryo zo weinig mogelijk water bevat en dus ook de kans op intracellulaire kristalvorming kleiner wordt.(3,5)
21
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Als het embryo in de laatste invriesoplossing (1,5M) zit en zijn oorspronkelijk celvolume
terug heeft wordt het opgezogen in een invriesstrootje. De strootjes (rietjes) die gebruikt
worden om in te vriezen zijn CBS-rietjes (Cryo Bio System), het zijn ‘high security straws’
die dichtgelast kunnen worden om zo virale contaminatie van de ene naar de andere patiënt te verhinderen. De manier van laden wordt op onderstaande tekening (figuur 2.4)
getoond, medium – lucht – medium met embryo – lucht – medium – lucht. Deze strootjes
worden vervolgens dichtgebrand in het lasapparaat en in het invriestoestel geladen. Het
invriesprogramma dat doorlopen wordt is afhankelijk van de gebruikte cryoprotectanten, in
elk programma zal rond –6°C tot –7°C een ‘seeding’ moeten uitgevoerd worden. Na volledig doorlopen van het programma worden de rietjes uit het invriestoestel gehaald en blijven ze bewaard in vloeibare stikstof.
Figuur 2.4: Een invriesstrootje, A stelt het stukje voor dat dichtgebrand wordt door het lasapparaat, B is de plug, C is lucht, D is medium, E is het medium met het embryo
2.4.2
Seeding
‘Seeding’ is een belangrijke stap in het invriesproces, in deze stap worden ijskristallen
geïnduceerd in het extracellulair milieu van het embryo. In een isotoon medium vindt ijskristalvorming normaal plaats tussen -5°C en -15°C, spontane ijsvorming zal in de praktijk
slechts optreden rond -10°C. Om ijskristalvorming tussen -5°C en -10°C te induceren is
een inductor nodig, men spreekt van een zogenaamde ‘ent’, een ijzeren staaf, schaar of
pincet kan daarvoor gebruikt worden. De ijzeren ‘ent’ wordt eerst in vloeibare stikstof geplaatst en vervolgens tegen het medium gehouden die het embryo omgeeft. Belangrijk
hierbij is dat het embryo niet rechtstreeks door de ‘ent’ wordt aangeraakt omdat het hierdoor kan beschadigd worden. In de praktijk gebeurt de ‘seeding’ meestal wanneer het
invriestoestel een temperatuur van -6°C tot -7°C bereikt heeft.
22
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Bij een automatische ‘seeding’ zorgt het toestel zelf voor de ‘seeding’, bij een manuele
‘seeding’ moet de laborant even de rietjes uit het toestel halen of het toestel open doen en
de afgekoelde ent ertegen houden.(3)
Figuur 2.5: Een laborante die een seeding uitvoert (15)
Het doel van ‘seeden’ is kristallisatie gecontroleerd induceren, door ‘seeden’ treedt er
kristalvorming op in het extracellulair milieu. Het embryo komt in een hypertoon milieu
terecht en verliest opnieuw water doordat het embryo water verliest verkleint de kans op
intracellulaire kristalvorming. Het ‘seeden’ is vooral belangrijk wanneer cryoprotectanten
worden gebruikt, deze hebben een vriespuntverlagende werking waardoor een spontane
kristallisatie of ijskristalvorming in het extracellulaire milieu mogelijk pas op een zeer lage
temperatuur optreed. Op die manier kan de cel niet tijdig reageren op de plots sterk stijgende osmolariteit in het extracellulaire milieu. Als gevolg hiervan zal de cel het concentratieverschil compenseren door zelf te bevriezen wat schadelijk is voor het embryo. De
stijging van de osmolariteit is te verklaren doordat opgeloste stoffen zoals cryoprotectanten slechts zullen mee invriezen bij temperaturen tussen -20°C en -30°C dit noemt men
het eutectisch punt (zie figuur 2.6). Voordat dit punt bereikt wordt zal het water reeds aan
het bevriezen zijn waardoor de cryoprotectanten steeds dichter bijeen in het niet bevroren
water komen te liggen en bijgevolg zal de osmolariteit stijgen.(3,6)
23
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Figuur 2.6: Hoe meer de temperatuur daalt in een isotone oplossing, hoe meer water zal
kristalliseren en hoe groter de concentratie aan cryoprotectant bijgevolg zal worden (6 gewijzigd)
2.5
Vitrificatie
Bij vitrificatie wordt zeer snel ingevroren en is geen dure invriesapparatuur vereist. Bij deze methode wordt de eicel of het embryo in een sterk hyperosmotisch medium geplaatst
met een concentratie cryoprotectant van 8 tot 10M waardoor een zeer snelle dehydratatie
optreedt. Daarna wordt de cel direct overgebracht naar vloeibare stikstof, dit ganse proces
duurt slechts enkele minuten. Doordat de cel bij deze methode zo snel wordt afgekoeld,
hebben de water moleculen de tijd niet om te kristalliseren. In plaats van ijskristallen wordt
er een glasachtige structuur gevormd. Het woord vitrificatie is dan ook afkomstig van het
Latijnse woord ‘vitrum’ wat glas betekent. Vitrificatie geeft goede resultaten maar heeft
ook nadelen, zo kan slechts één tot maximum twee embryo’s per keer ingevroren worden
terwijl bij de trage invriesmethode er meer dan twee embryo’s tegelijk kunnen ingevroren
worden. Eén van de redenen waarom vitrificatie het traag invriezen niet vervangen heeft
wordt duidelijk wanneer meerdere embryo’s moeten ingevroren worden, de manuele arbeid tijdens de invriesprocedure bij het traag invriezen moet slechts één keer doorlopen
worden wat ongeveer 30min duurt, terwijl het vitrificatieproces embryo na embryo moet
herhaald worden en uiteindelijk meer tijd in beslag zal nemen. Het invriezen van slechts
24
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
één tot twee embryo’s tegelijk heeft ook voordelen, als minder embryo’s tegelijk (van één
of verschillende patiënten) ingevroren worden zal ook de kans op eventuele fouten veel
minder groot worden.(3,8)
2.6
Ontdooien
In vele gevallen ontstaat schade aan het embryo tijdens het ontdooien en niet tijdens het
invriezen, om dit te voorkomen wordt de ontdooisnelheid aangepast aan de invriessnelheid. Tijdens het ontdooien kan al blijken of het embryo degeneratief is of niet. Degeneratief wil zeggen dat de cellen (blastomeren) van het embryo kapot zijn gesprongen, de cellen hebben ook geen duidelijke contouren meer. Een traag ingevroren embryo moet theoretisch traag ontdooid worden, in de praktijk blijkt dit niet helemaal te kloppen zo kan een
traag ingevroren embryo zonder problemen vlug ontdooid worden. Eén van de oorzaken
van schade tijdens het ontdooien is de vorming van gasbellen tijdens het invriezen. Tijdens het ontdooien kunnen deze gasbellen dan in korte tijd uitgroeien tot zeer grote intracellulaire vacuolen, deze vacuolen kunnen opblazen en zo de zona pellucida beschadigen. Tijdens het ontdooien moeten de cryoprotectanten terug uitgewisseld worden voor
water, dit proces heet rehydratatie.
2.6.1
Rehydratatie
Het principe van rehydratatie is omgekeerd aan dat van dehydratatie. Waar tijdens het
dehydrateren met oplopende concentraties cryoprotectant gewerkt wordt, zal de concentratie aan cryoprotectant nu lager zijn. Het gevolg hiervan is dat de concentratie van de
cryoprotectant hoger zal zijn in het embryo dan in het omgevende medium. Het embryo
bevindt zich nu in een hypotoon milieu en zal water beginnen opnemen en permeabele
cryoprotectant verliezen, de cryoprotectant wordt met andere woorden uitgewisseld voor
het water. Als er te weinig cryoprotectant in het ontdooimedium aanwezig is zal het embryo te veel water opnemen waardoor het zal opzwellen en uiteindelijk zal lyseren, om dit
te voorkomen wordt een aflopende reeks van ontdooimedia gebruikt.(3)
25
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2.7
Evaluatie en embryodeling
Tijdens de evaluatie worden de embryo’s beoordeeld volgens een reeks criteria die afhankelijk zijn van het stadium van het embryo. Deze criteria zijn gebaseerd op de morfologische kenmerken van het embryo, het morfologisch beste embryo zal worden teruggeplaatst. De embryo’s worden elke dag gedurende maximaal 5 tot 6 dagen geëvalueerd.
Vanaf dag twee kunnen geschikte embryo’s teruggeplaatst worden.
2.7.1
Dag 0 (bij ICSI, niet bij IVF)
De dag waarop de bevruchting zal gebeuren wordt er gekeken of de eicellen één poollichaam hebben, met andere woorden of ze rijp zijn om te injecteren. Er wordt onder meer
ook gekeken naar volgende eigenschappen:
- De aanwezigheid van een glad endoplasmatisch reticulum
- Amorfe eicellen
- Is er sprake van vacuolisatie
- De aanwezigheid van een bull’s eye structuur
- Eventuele afwijkingen aan de zona pellicuda
2.7.2
Dag 1
Zestien tot twintig uur na de fertilisatie wordt gekeken of er bevruchting is. De embryo’s
hebben nu twee pronucleï (2PN) en twee poollichamen (zie figuur 2.7). Daarnaast zal ook
gekeken worden naar :
- De grootte van de kern(en), zijn ze gelijk van grootte of niet?
- De ligging van het kernmateriaal : polair, verspreid of asynchroon (zie bijlage 2)
- Terugtrekking van het cytoplasma
- De aanwezigheid van vacuolen
Alles wat afwijkt wordt als abnormaal beschouwd, alleen de correct bevruchte eicellen
zullen geselecteerd worden en overgezet worden in een nieuw cultuurplaatje.
26
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Na 24 uur wordt een tweede evaluatie uitgevoerd, kijkend naar een eventuele doordeling van het embryo, belangrijk tijdens deze evaluatie is de aan – of afwezigheid van
de kernen:
- als een embryo niet gedeeld is en de kernen nog zichtbaar zijn wil dit zeggen dat
het embryo een vertraagd delingsschema heeft
- als het embryo niet gedeeld is en de kernen niet zichtbaar zijn is dit een teken dat
de deling is begonnen
- een embryo die reeds gedeeld is, heeft een normaal delingsschema. Bij terugplaatsing zal in de mate van het mogelijke rekening gehouden worden met deze delingsschema’s. (zie Bijlage 2: delingschema van een embryo)
Figuur 2.7: Links een normaal embryo met 2PN, rechts een abnormaal meerkernig embryo
met 3PN (16,15)
27
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2.7.3
Dag 2
Op deze dag wordt gekeken hoeveel blastomeren het embryo bevat. Het embryo moet
dan twee tot viercellig zijn. Er wordt gekeken naar volgende criteria:
- aantal blastomeren:
tweecellig: de blastomeren hebben
bij voorkeur een gelijke grootte, ze zijn im-
mers van één en dezelfde cel afkomstig
driecellig: met bij voorkeur één grote en twee kleine blastomeren, één grote die
dus nog niet is doorgedeeld en twee kleinere afkomstig van een grotere die wel al
is doorgedeeld
viercellig: met bij voorkeur vier gelijke blastomeren
vijfcellig: met bij voorkeur drie grote en twee kleinere blastomeren (zie bijlage
voor figuren)
- grootte van de blastomeren
- meerkernigheid van de blastomeren
- fragmentatie van het embryo (zie figuur 2.8 en 2.9)
Figuur 2.8: Fragmentatie (15)
28
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Figuur 2.9: Gradaties bij fragmentatie waarbij : A geen fragmentatie, B < 20%, C > 20% maar
< 50%, D > 50% fragmentatie
2.7.4
Dag 3
Op deze dag worden de zes tot achtcellige embryo’s opgespoord, die dan verder geëvalueerd worden.
- aantal blastomeren:
zescellig: met bij voorkeur twee grote en vier kleinere blastomeren, de vier kleine
zijn afkomstig van twee grote die al zijn doorgedeeld
zevencellig: met bij voorkeur één grote en zes kleinere blastomeren
achtcellig: met bij voorkeur acht gelijke blastomeren
- grootte van de blastomeren
- meerkernigheid
- fragmentatie
2.7.5
Dag 4 (morula stadium)
In dit stadium wordt gekeken of compactie aanwezig is. Bij compactie zullen de blastomeren niet meer als aparte cellen zichtbaar zijn met de stereomicroscoop. Er zijn verschillende gradaties bij compactatie weergegeven met een nummer van één tot en met vier
(zie bijlage 3). Waarbij:
1: staat voor volledige compactie
2: staat voor onvolledige compactie
3: voor regionale compactie
4: voor fusie
29
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
2.7.6
Dag 5 – 6
In dit stadium zou er sprake moeten zijn van een blastocyst, de beoordeling van dit stadium gebeurt volgens het Gardner scoring system. De blastocyst bestaat uit een soort holte
(blastocoel), rond deze blastocoel bevindt zich een buitenste laag cellen die het trofectoderm (TE) noemt, in de holte zelf zitten een aantal cellen de zogenaamde ‘inner cell mass’
(ICM). Het TE maakt geen deel uit van het eigenlijke embryo, deze cellen ontwikkelen
zich tot de placenta en andere ondersteunende weefsels. Uit de ICM ontstaan de drie
kiembladen, ectoderm, mesoderm en endoderm die zullen uitgroeien tot specifieke lichaamsweefsels. (zie figuur 2.11: blastocyst)
1) Early blastocyst: de blastocoel neemt minder dan de helft van het volume van het
embryo in
2) Blastocyst: de blastocoel neemt de helft of meer in van het volume van het embryo
3) Full blastocyst: de blastocoel neemt het volledige volume van het embryo in
4) Expanding blastocyst: het volume van de blastocoel is nu groter dan het
volume van het eerdere embryo
5) Hatching blastocyst: het trofectoderm begint doorheen de zona te breken
6) Hatched blastocys: de blastocyst heeft de zona volledig verlaten
Figuur 2.10: Links een hatching blastocyst, Rechts een hatched blastocyst (15,17)
30
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurstudie
Eveneens wordt er gekeken naar de ‘Inner cell mass’ deze krijgt ook een score namelijk
A, B of C. Waarbij:
A) dicht opeen, veel cellen
B) minder dicht opeen, enkele cellen
C) zeer weinig cellen
Tenslotte wordt er ook gekeken naar het trofectoderm, deze krijgt eveneens een score
gaande van A tot en met C. Waarbij:
A) Vele cellen die een samenhangend epitheel vormen
B) Enkele cellen die een los epitheel vormen
C) Zeer weinig cellen
Figuur 2.11 : Blastocyst (18)
31
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3
3.1
Materiaal en methode
Gebruikte materialen, reagentia en toestellen
Zie tabel 3.1 voor de gebruikte materialen, tabel 3.2 voor de gebruikte reagentia en tabel
3.3 voor de gebruikte toestellen.
Materiaal
Lotnummer
Merk
Cultuurfles 50mL
6075802
Falcon
Cultuurfles 100mL
6171032
Falcon
Cultuurschaal 35 x 10mm
7093174
Falcon
Cultuurschaal 60 x 15mm
6227020
Falcon
Denudeer pipet
700588
Swemed
Embryo straw (rietje)
CBS4948
Cryo bio system
Filter
21527
Pall corporation
Gegradueerde pipet 1mL
6314239
Falcon
Gegradueerde pipet 5mL
7094718
Falcon
Gegradueerde pipet 10mL
6357466
Falcon
ID jacket blauw
CBS4605
Cryo bio system
ID jacket geel
CBS4773
Cryo bio system
ID jacket oranje
CBS3733
Cryo bio system
CF43862, CF42991
ID rods
CF43825, CF43862
Cryo bio system
CF43188, CF42991
naalden
070322
BD
Pipet tips
7196C0
Thermo Scientific
Spuit 1mL
0711031
Terumo
Spuit 10mL
0612014
BD
Tabel 3.1: Gebruikte materialen
32
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
Reagentia
Lotnummer
Merk
1,2-Propaandiol invriesoplossingen
008045
Vitrolife
1,2-Propaandiol dooioplossingen
007968
Vitrolife
BLAST medium
501265
Vitrolife
DMSO (15M)
056K01731
Sigma
(zie 3.2.1 en 3.2.2)
6MB0038
BioWhittaker
Humaan Serum Albumine (HSA) (20%)
06C21C
Apotheek C.A.F.-D.C.F.
Olie (minerale)
930570379
Irvine Scientific
Sucrose
044K0044
Sigma
HAS (HES) (zie 3.2.3)
/
/
Dooistockoplossing (zie 3.2.6)
/
/
Invriesstockoplossing (zie 3.2.3)
/
/
Earle’s balanced salt solution (EBSS)
hepes gebufferde Earle’s medium met
Tabel 3.2: Gebruikte reagentia
Toestel
Merk
Model
Analytische balans
Mettler
AE160
Cryogene tank
Air Liquide
Arpege 140
Drukvat
Air liquide
TP60
Etikettenprinter
Labxpert
Brady
Incubator
Heraeus
Thermo Kendro Series 6000
Inversiemicroscoop
Nikon
EclipseTE2000-U
Invriestoestel
Planer
Kryo10 serie II
Koelkast
Dometic
ML305C
Laminaire flow
De Bock & Vermeulen
Bioflow
Laminaire flow
Heraeus
Heraguard
Lasapparaat
Cryo bio system
Soudeuse paillettes
Microscoop
Nikon
SMZ1000
Pipetautomaat
Falcon
Express
Verwarmplaat microscoop
Tokai Hit
Thermo plate
Tabel 3.3: Gebruikte toestellen
33
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.1.1
Invriesstrootjes , ID jacket en ID rod
Figuur 3.1 : ID rods, ID jackets en een invriesstrootje (19)
Rechts : het invriesstrootje waarin het embryo geladen wordt.
Links : de ID rods en ID jackets die gebruikt worden voor de identificatie van een embryo,
elk invriesstrootje krijgt een combinatie van een gekleurde ID rod en gekleurde ID jacket
en wordt vervolgens in een gekleurde visotube geplaatst. De visotube en de ID jacket
worden ook voorzien van een sticker met patiëntengegevens die door de etikettenprinter
wordt afgedrukt.
34
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.1.2
Microscopen
Inversiemicroscoop:
Een inversiemicroscoop is anders gebouwd dan een conventionele microscoop. De
bron en de koeler bevinden zich boven het object, de lenzen onder het object. Ze zijn
aal om levende organismen, cellen of weefsels te bekijken. Een nadeel is wel de hoge
kostprijs. In het Centrum voor Reproductieve geneeskunde (CRG) labo wordt hij gebruikt
voor de evaluatie van de embryo’s
Figuur 3.2 : De inversiemicroscoop
Figuur 3.3 : De stereomicro-
Nikon Eclipse TE2000-U (20)
scoop Nikon SMZ1000 (20)
Stereomicroscoop:
Een stereomicroscoop is een microscoop met twee objectieven en twee oculairen, één
van beiden voor elk oog. Hierdoor krijgt de gebruiker een beeld waarin diepte wordt gezien. Ze worden gebruikt om kleine organismen te bestuderen en om eventuele manipulaties te verrichten. In het CRG labo worden ze gebruikt voor manipulaties zoals het overzetten van embryo’s van één medium naar een ander.(11)
35
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.1.3
De cryogene tank
De tank zelf is goed geïsoleerd zodat de temperatuur in het vat niet zou stijgen. De canisters bevatten de invriesstrootjes, voor het laden van de strootjes worden de canisters
even doorheen de opening van het bewaarvat getrokken, de canisters worden dan teruggeplaatst in het bewaarvat waar ze ondergedompeld worden in vloeibare stikstof.
Figuur 3.4: De cryogene tank
36
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.2
3.2.1
Het DMSO-sucrose protocol
Samenstelling EBSS
Deze gebalanceerde zoutoplossing bevat alle ionen essentieel voor de levensnoodzakelijke processen van eukaryote cellen (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, PO43- en Cl-). De zoutoplossing
is aangevuld met fenolrood, NaHCO3 en glucose.
3.2.2
Bereiding van EBSS-stockoplossing
• Weeg op een balans 1,19g hepes af.
• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale laminaire flow (LAF)
werkbank.
• Los de hepes op in 10mL EBSS.
• Filter (0,2-0,8µm) deze oplossing in de cultuurfles.
• De oplossing is 3 weken houdbaar bij 4°C.
3.2.3
Bereiding van HES
• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank.
• Trek met behulp van een naald en spuit 20mL HSA (20%) op en spuit deze in een cultuurfles van 100mL.
• Leng aan tot 100mL met de EBSS stockoplossing.
• Sluit de cultuurfles af en meng.
• De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C
3.2.4
Bereiding van de sucrose-oplossing (1M)
• Weeg op een balans 13,7g sucrose af en giet over in een cultuurfles.
• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank.
• Pipetteer 40mL EBSS-stockoplossing in de cultuurfles
• Sluit de cultuurfles af en meng.
37
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
• Trek met behulp van een naald en spuit de sucrose-oplossing op en filtreer in een
nieuwe cultuurfles.
• De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C.
3.2.5
Invriesstockoplossing (0,1M sucrose)
• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank.
• Pipetteer 45mL HES in een cultuurfles.
• Pipetteer hierbij 5mL sucrose-oplossing (1M).
• Sluit de cultuurfles en meng.
• De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C.
3.2.6
Dooistockoplossing (0,2M sucrose)
• De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank.
• Pipetteer 40mL HES in een cultuurfles.
• Pipetteer hierbij 10mL sucrose-oplossing.
• Sluit de cultuurfles en meng.
• De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4°C.
3.2.7
Bereiding van ontdooi – en invriesmedia
a) Invriesoplossingen (1 week houdbaar)
Oplossing
Concentratie
DMSO (15M)
Invriesstockoplossing
HES (buffer)
F2
F3
1,5M DMSO +
1mL
9mL
/
/
0,09M sucrose
F2
1,5M DMSO
1mL
/
9mL
/
F1
0,75M DMSO
/
/
3mL
3mL
HES
/
/
/
3mL
/
Tabel 3.4: Invriesoplossingen DMSO-sucrose protocol
38
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
Werkwijze:
• De bereiding van de DMSO-sucrose invriesreeks gebeurt minimum één uur voor de
invriesprocedure en wordt uitgevoerd in de horizontale laminair flow werkbank.
• De DMSO-sucrose invriesreeks is samengesteld uit drie DMSO-sucrose invriesoplosingen : ‘Freeze’ 1, F2 en F3, die elk in een centrifugeerbuis worden aangemaakt
• Voor het maken van F2 wordt F3 gefiltreerd om te steriliseren. Voor het maken van F1
wordt F2 gefiltreerd. Met behulp van een naald en spuit worden F3 en F2 opgetrokken,
er wordt een microfilter op de spuiten geplaatst en de oplossingen worden gefiltreerd in
een nieuwe centrifugeerbuis.
b) Dooioplossingen (1week houdbaar)
Oplossing
Concentratie
DMSO (15M) Dooistock
T1
T3
HES
T1
1,5M DMSO
1mL
9mL
/
/
/
T2
1,0M DMSO
/
2mL
3mL
/
/
T3
0,75M DMSO
/
3mL
3mL
/
/
T4
0,375M DMSO
/
2mL
/
2mL
/
Dooistock
/
/
3mL
/
/
/
HES
/
/
/
/
/
3mL
Tabel 3.5: Dooioplossingen DMSO-sucrose protocol
Werkwijze:
• De bereiding van de DMSO-sucrose dooireeks gebeurt in de horizontale laminair flow
werkbank.
• De DMSO-sucrose dooireeks is samengesteld uit 4 DMSO-sucrose dooioplossingen :
‘Thaw’ 1, T2, T3, T4, die elk in een centrifugeerbuis worden aangemaakt.
• Voor het maken van T2 en T3 wordt T1 gefiltreerd om te steriliseren. Trek met behulp
van een naald en spuit T1 op. Plaats een microfilter op de spuit en filtreer T1 in een
nieuwe centrifugeerbuis.
39
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.2.8
Werkwijze invriezen
1) Evalueer de embryo’s die moeten ingevroren worden
2) Print stickers af met de initialen van de patiënt met behulp van het Brady toestel
3) Kies een combinatie van visotubes, ID jackets en ID rods en leg deze klaar
4) Zet het invriesapparaat aan en selecteer het DMSO-sucrose programma
5) Leg klaar: - Invriesreeks (HES, F1, F2, F3), 20min op voorhand uit koelkast halen
- Spuit van 1,0mL
- Tussenstukje voor de spuit
- Invriesstrootjes
- Vier cultuurplaatjes die genummerd worden en waarop de initialen van de
patiënt en het medium genoteerd worden
- Denudeerpipet + houder
- Pipet van 150µL + pipettips
5) Leg de verwarmplaat van de microscoop af
6) Leg de embryo’s eerst 5min in 150µL HES
7) Leg ze daarna 10min in 150µL F1
8) Controleer tijdens die 10min of het invriesapparaat klaar staat, het invriesapparaat
maakt een auditief signaal wanneer hij de juiste temperatuur heeft
9) Leg de embryo’s daarna 10min in 150µL F2
10) Daarna 10min in 300µL F3, tijdens deze 10min worden de embryo’s geladen in het
invriesstrootje voorzien van ID jacket en ID rod, de uiteinden toe gebrand in het
lasapparaat en uiteindelijk in het invriesapparaat geladen
11) Het invriesprogramma loopt, het invriesapparaat zal een auditief signaal maken wanneer de seeding moet uitgevoerd worden
12) Als het invriesprogramma is afgelopen geeft het invriestoestel opnieuw een
auditief signaal. Haal de invriesstrootjes uit het toestel en stop ze onmiddellijk in vloeibare stikstof, daarna worden de strootjes in de juiste houder in de cryogene tank ge
stopt.
40
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.2.9
Werkwijze ontdooien
1) Leg klaar: - Dooireeks (T1, T2, T3, T4, dooistock, HES), 20minuten op voorhand
klaarleggen
- Zes plaatjes genummerd
- Cultuurplaatje in de incubator klaarzetten, genummerd
- Schaar
- Spuit van 1,0mL
- Gesteriliseerd tussenstukje voor de spuit
- Pipet van 150µL + pipettips
- Denudeerpipet + houder
2) Leg de verwarmplaat van de microscoop af
3) Haal de rietjes uit de cryogene tank en laat ze 30sec opwarmen op kamer temperatuur
rol ze vervolgens 30sec over een verwarmplaat (37°C)
4) Ontsmet de rietjes alvorens ze open te knippen
5) Knip de rietjes open en doe de inhoud in een 150µL T1 voor 5min
6) Lokaliseer de embryo’s
7) Leg ze na 5min in 150µL T2
8) Na opnieuw 5min in 150µL T3
9) Daarna 5min in 150µL T4
10) 5min in 150µL dooistock
11) +/- 5min in 150µL HES
12) Plaats de embryo’s in het cultuurplaatje die klaarstaat in de incubator
13) Evalueer de embryo’s op overleving
41
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.2.10 Programma invriestoestel
1) Start temperatuur: 0°C
2) De temperatuur daalt van 0°C tot aan -6,5°C aan een snelheid van -1°C/min
3) Bij -6,5°C is er een plateau (wachttijd) van 300seconden
4) Tijdens het plateau gebeurt de manuele seeding
5) De temperatuur daalt van -6,5°C tot aan -40°C aan een snelheid van -0,3°C/min
6) De temperatuur daalt van -40°C tot aan -80°C aan een snelheid van -3°C/min (1)
7) Als het invriesprogramma is doorlopen geeft het invriestoestel een auditief signaal, haal
dan de invriesstrootjes uit het toestel en plaats ze eerst in vloeibare stikstof en dan op
de juiste plaats in de canisters die zich in de cryogene tank bevinden.
3.3
3.3.1
Het protocol van vitrolife
Gebruikte media
De kit van vitrolife maakt gebruik van PROH in plaats van DMSO, er wordt eveneens gebruik gemaakt van sucrose.
a) Invriesoplossingen (freeze-kit1)
10mL cryo-PBS, PBS met 25g/mL HSA
10mL embryo freezing solution 1 (EFS 1), 1,5M propaandiol
10mL embryo freezing solution 2 (EFS 2), 1,5M propaandiol en 1,0M sucrose
b) Dooioplossingen (thaw-kit1)
10mL embryo thawing solution 1 (ETS 1), 1M 1,2-PROH + 0,2M sucrose
10mL embryo thawing solution 2 (ETS 2), 0,5M 1,2-PROH + 0,2M sucrose
10mL embryo thawing solution 3 (ETS 3), 0,2M sucrose
10mL cryo-PBS
3.3.2
Werkwijze invriezen
1) Evalueer de embryo’s die moeten ingevroren worden
2) Print stickers af met de initialen
3) Kies een combinatie van visotubes, ID jackets en ID rods en leg ze klaar
42
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
4) Leg de verwarmplaat van de microscoop af
5) Leg het invriesapparaat aan en kies het PROH-sucrose programma
6) Leg klaar: - Freeze-kit 1 (cryo-PBS, EFS1, EFS2), 30min op voorhand uit koelkast
halen
- Spuit van 1,0mL en gesteriliseerd tussenstukje
- Drie cultuurplaatjes die genummerd worden en waarop de initialen van de
patiënt en het medium genoteerd worden
- Denudeerpipet + houder
- Pipet van 150µL + pipettips
7) Plaats de embryo’s eerst 2-5min in 150µL cryo-PBS
8) Daarna minimum 10min in EFS1, niet langer dan 20min
9) Daarna 10min in 300µL F3, tijdens deze 10min worden de embryo’s geladen in het
invriesstrootje voorzien van ID jacket en ID rod, de uiteinden toe gebrand in het
lasapparaat en uiteindelijk in het invriesapparaat geladen
10) Het invriesapparaat zal een auditief signaal maken wanneer de seeding moet uitgevoerd worden
11) Wanneer het invriesprogramma is afgelopen maakt het invriestoestel opnieuw een
auditief signaal. Haal de invriesstrootjes uit het toestel en steek ze in de cryogene
tank en in de juiste visotube
3.3.3
Werkwijze ontdooien
1) Leg klaar: - Dooireeks (ETS1, ETS2, ETS3, cryo-PBS), 20minuten op voorhand klaar
leggen
- Vier plaatjes genummerd
- Cultuurplaatje in de incubator klaarzetten, genummerd
- Schaar
- Spuit van 1,0mL
- Tussenstukje voor de spuit
43
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
- Pipet van 150µL + pipettips
- Denudeerpipet + houder
2) Leg de verwarmplaat van de microscoop af
3) Maak een cultuurplaatje en plaats deze 24 uur op voorhand in de incubator
4) Haal de rietjes uit de cryogene tank en laat ze 30sec opwarmen op kamer temperatuur
rol ze vervolgens 30sec over een warmplaat van 30°C
5) Ontsmet de rietjes alvorens ze open te knippen
6) Knip de rietjes open en doe de inhoud in een 150µL ETS1 voor 5min
7) Daarna 5min in 150µL ETS2
8) Dan 5-10min in 150µL ETS3
9) Dan 6min in cryo-PBS op kamertemperatuur
10) Daarna 6min in cryo-PBS op 37°C
11) Zet de embryo’s over in het cultuurplaatje die klaar sta at in de incubarot
12) Evalueer op overleving
3.3.4
Programma invriestoestel
1) Start temperatuur: 20°C
2) De temperatuur daalt van 20°C tot aan -7°C met een snelheid van -2°C/min
3) Een plateau van 600sec bij -7°C
4) Tijdens het plateau zal na 120sec de ‘seeding’ uitgevoerd worden
5) De temperatuur daalt van -7°C tot aan -30°C met een snelheid van -0,3°C/min
6) De temperatuur daalt van -30°C tot aan -80°C met een snelheid van -10°C/min (2)
7) Als het invriesprogramma is doorlopen geeft het invriestoestel een auditief signaal, haal
dan de invriesstrootjes uit het toestel en plaats ze eerst in vloeibare stikstof en dan op
de juiste plaats in de canisters die zich in de cryogene tank bevinden
44
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Materiaal en methode
3.4
Methode
Humane embryo’s worden beoordeeld naargelang hun kwaliteit, de meest geschikte worden teruggeplaatst. De overtallige embryo’s van goede kwaliteit kunnen worden ingevroren om ze te bewaren. De embryo’s die niet voldoen om te bewaren, zoals embryo’s met
een abnormale bevruchting, meerkernigheid of een te snelle of trage deling, kunnen gebruikt worden om het protocol van DMSO met dat van PROH te vergelijken, na verkregen
instemming van de patiënt. De embryo’s worden geëvalueerd, ingevroren via het DMSO
of PROH protocol, ontdooid via het overeenstemmende protocol en tenslotte wordt de
overleving nagegaan. De embryo’s worden ingevroren op dag drie, terug ontdooid en geëvalueerd om te zien of er overleving is. Na de evaluatie worden ze in de incubator nog
drie dagen in cultuur gehouden en gedurende die drie dagen elke dag geëvalueerd om te
kijken of er enige evolutie is.
De overleving is het aantal intacte blastomeren van het embryo voor invriezen gedeeld
door het aantal intacte blastomeren na ontdooien, maal honderd.
Evolutie betekent dat het embryo na ontdooien terug verder deelt.
45
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
4
4.1
Resultaten
Leerproces
Tijdens de eerste week waren de resultaten slecht. De embryo’s waren op het moment
van ontdooien allemaal degeneratief. Zowel tijdens het invriezen als tijdens ontdooien
kunnen dan ook verschillende zaken misgaan. De seeding bijvoorbeeld is zeer belangrijk
en dient correct uitgevoerd te worden, zo mag de seeding niet op het embryo zelf gebeuren en worden de invriesstrootjes tijdens het seeden het best horizontaal gehouden. De
oorzaak van de slechte resultaten lag ergens anders, de invriesstrootjes werden na het
invriezen uit het invriestoestel gehaald op een schaaltje gelegd en in het invriesvat geplaatst. Gedurende de korte periode dat de invriesstrootjes op het schaaltje lagen hadden
ze dus de tijd om traag op te warmen waardoor er terug een osmolariteitsverschil ontstond. Het medium rond het embryo begon namelijk terug te ontdooien waardoor het embryo in een hypotoon milieu terecht kwam en terug water begon op te nemen, het hypotone milieu ontstaat doordat de cryoprotectant zich opnieuw kan verspreiden in het medium
en de concentratie bijgevolg daalt. Wanneer het dan in de cryogene tank werd geplaatst
ontstonden intracellulaire ijskristallen waardoor het embryo degeneratief werd. De embryo’s moeten dus direct nadat ze uit het invriestoestel zijn gehaald in een beker vloeibare
stikstof worden geplaatst. Vanuit deze beker worden ze dan in de cryogene tank geplaatst
en zo hebben ze de tijd niet om terug op te warmen.
4.2
Resultaat
Van de ingevroren embryo’s word de overleving bekeken om zo een vergelijking te kunnen maken tussen het DMSO en PROH protocol. De embryo’s werden na het ontdooien
geëvalueerd op het aantal intacte blastomeren.
46
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
4.2.1
DMSO-Sucrose
embryo nr. overleving (%)
evolutie
embryo nr. overleving (%)
evolutie
1
56
nee
10
29
nee
2
100
early blastocyst
11
100
ja
3
100
ja
12
100
ja
4
80
nee
13
100
early blastocyst
5
100
ja
14
100
early blastocyst
6
100
ja
15
degeneratief
/
7
100
ja
16
100
early blastocyst
8
100
ja
17
100
Ja
9
83
ja
18
75
ja
Tabel 4.1: Resultaten DMSO-sucrose
Overleving:
100
90
Percentage (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100% intact
50-99%
<50%
Intactheid
Figuur 4.1: Overlevingspercentage bij de DMSO-Sucrose methode
47
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
66,67% (12/18) van de embryo’s is na ontdooien 100% intact.
22,22% % (4/18) van de embryo’s is na ontdooien <100% maar >50% intact.
11,11 % (2/18) van de embryo’s is na ontdooien <50% intact.
Evolutie:
Bij 82% (14/17) van de ontdooide embryo’s is er evolutie, het degeneratief embryo wordt
niet meegeteld omdat hier toch geen evolutie meer mogelijk is.
Van die 82% zal 29% (4/14) evolueren tot in het blastocyst stadium waarbij de evolutie op
dag 6 niet verder zal zijn dan een early blastocyst.
4.3
PROH
embryo nr. overleving (%)
evolutie
Embryo nr.
overleving (%)
evolutie
1
100
expanded blastocyst
12
100
expanded blastocyst
2
71
nee
13
100
nee
3
86
expanded blastocyst
14
67
degeneratief
4
75
nee
15
100
expanded blastocyst
5
86
nee
16
56
nee
6
60
early blastocyst
17
100
nee
7
78
full blastocyst
18
44
ja
8
60
nee
19
57
nee
9
67
nee
20
70
nee
10
57
nee
21
50
nee
11
67
nee
22
100
ja
Tabel 4.2: Resultaten PROH
48
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
Overleving:
100
90
Percentage (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100% intact
50-99%
<50%
Intactheid
Figuur 4.2: Overlevingspercentage PROH methode
27,27% (6/22) van de embryo’s is na ontdooien 100% intact.
68,18% (15/22) van de embryo’s is na ontdooien <100% maar >50% intact.
4,55% (1/22) van de embryo’s is na ontdooien <50% intact.
Evolutie:
Bij 36,36% (8/22) van de ontdooide embryo’s is er evolutie.
Van die 36,36% zal 75% (6/8) evolueren tot in het blastocyst stadium waarbij de evolutie
op dag 6 varieert van een early tot een expanded blastocyst.
4.4
Zijn er significante verschillen tussen beide methoden?
Er zijn dus enkele opmerkelijke verschillen tussen beide methoden namelijk:
- naar 100% overleving toe
- naar evolutie toe
- naar evolutie tot blastocyst toe
49
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
Via statistiek zal aangetoond worden of er sprake is van een significant verschil, de gebruikte methode is de Chi-kwadraatverdeling.
4.4.1
significantie naar 100% overleving toe
Data:
Observed:
100% overleving
PROH
DMSO
Totaal
ja
6
12
18
nee
16
6
22
Totaal
22
18
40
ja
9,9
8,1
18
nee
12,1
9,9
22
Totaal
22
18
40
Expected:
100% overleving
PROH
DMSO
Totaal
Berekeningen:
1. Hypothesen
:
H0: er is geen significant verschil tussen beide methoden naar 100% overleving toe
H1: er is wel een significant verschil tussen beide methoden naar 100% overleving toe
2. Gegevens :
Kans: 0,05
Vrijheidsgraden: 1
3. Berekeningen:
Via de chi.toets wordt een p-waarde bekomen van 0,0127
4. Besluit
De p-waarde is kleiner dan de vooropgestelde waarde van 0,05, de nulhypothese
wordt verworpen. Er kan besloten worden met een zekerheid van 95% dat er een significant verschil is tussen beide methoden naar 100% overleving toe.
50
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
4.4.2
significantie naar evolutie toe
Data:
Observed:
evolutie
PROH
DMSO
Totaal
ja
8
14
22
nee
14
3
17
Totaal
22
17
39
ja
12,41
9,59
22
nee
9,59
7,41
17
Totaal
22,00
17,00
39,00
Expected:
evolutie
PROH
DMSO
Totaal
Berekeningen:
1. Hypothesen
H0: er is geen significant verschil tussen beide methoden naar evolutie toe
H1: er is wel een significant verschil tussen beide methoden naar evolutie toe
2. Gegevens :
Kans: 0,01
Vrijheidsgraden: 1
3. Berekeningen
Via de chi.toets wordt een p-waarde bekopen van 0,0041
4. Besluit
De p-waarde is kleiner dan de vooropgestelde waarde van 0,01, de nulhypothese
wordt verworpen. Er kan besloten worden met een zekerheid van 99% dat er een
significant verschil is tussen beide methoden op vlak van evolutie.
51
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Resultaten
4.4.3
significantie naar evolutie tot blastocyst toe
Data:
Observed:
blastocyst
PROH
DMSO
Totaal
ja
6
4
10
nee
2
10
12
Totaal
8
14
22
ja
3,64
6,36
10,00
nee
4,36
7,64
12,00
Totaal
8,00
14,00
22,00
Expected:
blastocyst
PROH
DMSO
Totaal
De geobserveerde waarden zijn allemaal kleiner of gelijk aan tien, in dit geval is het beter
om de Fisher-exact test te gebruiken om een nauwkeurigere analyse te bekomen.
Berekeningen:
1. Hypothesen
H0: er is geen significant verschil tussen beide methoden naar evolutie tot blastocyst
toe
H1: er is wel een significant verschil tussen beide methoden naar evolutie tot
blastocyst toe
2. Gegevens:
Kans: 0,05
Vrijheidsgraden: 1
3. Berekeningen:
Via de Fisher-exact test wordt een p-waarde bekomen van 0,0743
4. Besluit
De p-waarde is groter dan de vooropgestelde waarde van 0,05, de nulhypothese
wordt aanvaard.Er kan besloten worden met een zekerheid van 95% dat er geen
significant verschil is tussen beide methoden op vlak van evolutie tot blastocyst toe.
52
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Discussie en Conclusie
5
Discussie en Conclusie
In de beginfase van het project waren er problemen met de overleving van de embryo’s,
ze waren bij beide methoden allemaal degeneratief en dit kon niet want het huidige protocol geeft in de dagelijkse praktijk goede resultaten. Met de hulp in het labo is de fout ontdekt en is die ook opgelost.
Bij de methode van DMSO-sucrose heeft 66,67% van de embryo’s na ontdooien een intactheid van 100%, 22,22% heeft een intactheid van <100% maar >50% en 11,11% heeft
een intactheid van <50%. Indien het degeneratief embryo niet meegeteld wordt is er bij
82% van de ontdooide embryo’s evolutie, 29% van deze embryo’s zal verder evolueren
tot een blastocyst.
Bij de methode van PROH heeft 27,27% van de embryo’s na ontdooien een intactheid
van 100%, 68,18% heeft een intactheid van <100% maar >50% en 4,55% heeft een intactheid van <50%. Bij de ontdooide embryo’s is er bij 36,36% evolutie, 75% van deze
embryo’s zal verder evolueren tot een blastocyst.
Op het eerste zicht zijn er opmerkelijke verschillen tussen beide methoden die in het deel
resultaten statistisch gestaafd worden. Er is met een zekerheid van 95% een verschil tussen beide methoden naar 100% overleving toe, de methode van DMSO-sucrose scoort
hier opmerkelijk beter. Met een zekerheid van 99% is er een verschil tussen beide methoden naar evolutie toe, ook hier scoort de methode van DMSO-sucrose opmerkelijk beter.
Tenslotte is er met een zekerheid van 95% geen verschil tussen beide methoden op vlak
van evolutie tot blastocyst maar het gaat wel in de richting van significantie, door de beperktheid van mijn steekproef op dit vlak, kan er geen significantie aangetoond worden.
Er kan besloten worden dat de huidige methode van DMSO-sucrose op twee van de drie
onderzochte vlakken beter scoort dan het commerciële PROH protocol. Voor een eventuele overschakeling naar een ander protocol kan gebeuren moeten er aanpassingen doorgevoerd worden in het PROH protocol van vitrolife zodat het tenminste even goede resultaten oplevert als het DMSO-sucrose protocol.
53
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Literatuurlijst
Gebruikte protocols :
1) Protocol DMSO-sucrose, AZ St-Jan Brugge CRG labo
Gekregen op 11-02-08
2) Protocol propaandiol, opgesteld door Vitrolife op basis van de werkwijze van Testart
Gekregen op 11-02-08
Boeken en dergelijke :
3) Wetzels, A.M.M (1993-1994), IVF lab, laboratoriumaspecten van in-vitro-fertilisatie,
Cryopreservatie theorie, Organon Nederland
4) Naaktgeboren N. (1993-1994), IVF lab, laboratoriumaspecten van in-vitro fertilisatie,
Cryopreservatie praktijk, Organon Nederland
5) Dhondt J. (2005), Vergelijkende studie van twee invriesprotocols voor humane
meercellige delingsembryo’s, Dhondt J. eindwerk ingediend tot het behalen van de
graad: professionele Bachelor in de Biomedische Laboratoriumtechnologie (Farma
ceutische en Biologische laboratoriumtechnologie) aan de Hogeschool Gent
6) Trounson A. David K. Gardner (2000), Handbook of In Vitro Fertilization, Informa
Healthcare
Sites :
7) Ferti magazine ( ?), Alles wat je wilt weten als een zwangerschap uitblijft [www], Ferti
magazine
URL : http://www.fertimagazine.nl/behandeling
Gezien op 17-02-08
8) Sydney IVF (2008), Sydney IVF [www], Sydney IVF limited
URL : http://www.sydneyivf.com
Gezien op : 17-02-08
9) Mozley E. S.(2003), A Test of Different Cryopreservation Methods on Members of the
Nowakoskiella Clade [www], Botany
54
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
URL : http://www.botany.uga.edu/chytrid/CryopreservationMethods/index.htm
Gezien op : 20-02-08
10) Georgia reproductive specialists (2005), Georgia reproductive specialists [www],
IVF.com Atlanta
URL : http://www.ivf.com
Gezien op 22-02-08
11) Microscopy UK (1995), Microscopy UK [www], Microscopy UK
URL : http://www.microscopy-uk.org.uk
Gezien op 03-03-08
Figuren :
12) Auteur : anoniem (1991), Het year of the ICSI [www] , VUB-CRGUZ Brussel
URL : [ http://www.brusselsivf.be/default_historiek.aspx?ref=AIAAAJ&lang=EN ]
Gezien op : 17-02-08
13) Devroey P. (2007), Welkom bij het centrum voor reproductieve geneeskunde [www],
UZ-Brussel.
URL : [ http://www.brusselsivf.be ]
Gezien op : 17-02-08
14) Advanced fertility center of chicago (1996), Advanced fertility center of chicago [www],
Advanced fertility center of Chicago.
URL : [ www.advancedfertility.com/blastocystimages.htm ]
Gezien op : 18-02-08
15) Malpani A. (2001), How to have a baby : overcoming infertility [www], Internet Health
Resources
URL : [ http://www.infertilitybooks.com/onlinebooks/malpani/index.html ]
Gezien op : 25-02-08
55
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
16) Auteur : anoniem (2006), assisted hatching [www], Bhopal Test Tube Baby Centre
URL : [ http://www.ivf.net.in/ivf&icsi/assited.html ]
Gezien op : 5-03-08
17) KU Medical Center, stem cell research [www], KU Medical Center
URL : [ http://www.kumc.edu/stemcell/images.html ]
Gezien op : 10-03-08
18) Cryo Bio System (2002), High securityhydrophobic plugged embryo straws [www],
Cryo Bio System
URL : [ http://www.cryobiosystem-imv.com/PMA/prodcry2_pma.asp ]
Gezien op : 5-03-08
19) Nikon (2008), Products and support [www], Niko
URL : [ http://www.nikon.com/products/instruments/index.htm ]
56
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Bijlagen
Bijlage 1 – Human Blastocyst Vitrification Protocol
Bijlage 2 – delingschema van een embryo
Bijlage 3 – Verschillende stadia bij compactatie
57
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Bijlage 1 – Human Blastocyst Vitrification Protocol
Human Blastocyst Vitrification Protocol
Vitrification
Place 0,5-1mL of each of the following media into separate Wells of a NUNC 4-well plate
and warm to 37°C
Holding Medium Blastocyst
Equilibration Medium Blastocyst
Vitrification Medium Blastocyst
All manipulations of the blastocysts are carried out on the heated stage (37°C) of a microscope. Cryovials are held on the cryo-canes submerged in liquid Nitrogen.
Collapse the blastocoel by inserting an ICSI needle or by using a laser beam.
Transfer the blastocysts from culture into the Holding Medium for at least 5min but a
maximum of 20min.
Move an appropriate number of blastocysts into the Equilibration Medium. The blastocysts
remain in this solution for 2min. The blastocysts will tend to float to the surface, if so, collect them and replace them to the bottom of the dish.
While waiting for the 2min to expire, make a 20µL droplet of the Vitrification Medium on a
non-toxic surface, preferably a culture dish. Making a small droplet of the Vitrification Medium enables easy loading into the VitroloopTM. (The 20µL droplet can only be used once).
When 30sec remain, attach the VitroloopTM to the magnetic wand and dip the VitroloopTM
into the Vitrification Medium.
When 10sec remain, begin collecting the blastocysts. Transfer the blastocysts in a minimal volume of Equilibration Medium to avoid dilution of the droplet.
58
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Transfer the blastocysts into the 20µL droplet of the Vitrification Medium for 45sec. Mix
the blastocysts within the Vitrification Medium with the pipette. When 5-10sec remain,
collect the blastocysts and place them onto the VitroloopTM.
Immediately plunge the VitroloopTM into the cryovial filled with nitrogen
Warming
Place 0,5-1mL of each of the following media into separate wells of a NUNC 4-well plate
and warm to 37°C.
Warming Medium 1 Blastocyst
Warming Medium 2 Blastocyst
Warming Medium 3 Blastocyst
All manipulations of the blastocysts are carried out on the heated stage (37°C) of a microscope.
Remove the VitroloopTM from the vial at low temperature (LN2)
1.Remove the VitroloopTM from the vial al mow temperature (LN2).
2.Place the VitroloopTM quickly into Warming Medium 1. Only submerge the nylon loop
3.Allow the blastocysts to fall from the loop and sink to the bottom. Leave for 2min.
4.Transfer the blastocysts into Warming Medium 2 for 3min.
5.Transfer the blastocysts into Warming Medium 3 for 5-10min.
6.Rinse the blastocysts in culture medium several times and continue culture according to laboratory practice. Vitrolife recommends using G-2TM or EmbryoGlue for this
procedure.
59
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Bijlage 2 – delingschema van een embryo
Dag 1 : 2PN + 2 poollichamen
embryo met 2 polaire kernen en 2 poollichamen
embryo met 2 poollichamen en 2 kernen met verspreid
kernmateriaal
embryo met 2 poollichamen en 2 asynchrone kernen,
asynchrone kernen krijgen minder punten bij de scoring
wanneer een geschikt embryo gekozen wordt voor de transfer
zullen polaire kernen en kernen met verspreid kernmateriaal
voorrang krijgen
60
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Dag 2 : twee tot vier cellig embryo
Rechts staan de normale embryo’s, alles wat van dit beeld afwijkt wordt als abnormaal
Beschouwt, links staat telkens een voorbeeld van een abnormaal embryo
Goed : 2 cellig met
Fout : 2 cellig
gelijke blastomeren
met ongelijke
blastomeren
Goed : 3 cellig met
Fout : 3 cellig
1 grote en 2 kleine
met 2 grote
blastomeren
en 1 kleine
blastomeer
Goed : 4 gelijke
Fout : 4 ongel-
blastomeren
ijke blastomeren
61
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Dag 3 : zes tot acht cellig stadium
Goed : 5 cellig, met 3 grote en 2 kleine blasomeren.
de 2 kleine blastomeren zijn afkomstig van 1 grotere die is
doorgedeeld
Goed : 6 cellig, met 2 grote blastomeren die nog niet zijn
doorgedeeld, en 4 kleinere blastomeren
Goed : 7 cellig, met 1 grote blastomeer die nog niet is doorgedeeld
en 6 kleinere blastomeren
Goed : 8 cellig, met 8 gelijke blastomeren
62
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Bijlage 3 – Verschillende stadia bij compactatie
A : Volledige compactatie
B : Onvolledige compactatie
C : Regionale compactatie
D : Fusie
63
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
Voor akkoord verklaring
Naam Familienaam
Stagementor : Valerie Standaert
Naam Familienaam
Stagebegeleider : Nicole Kellner
64
Vergelijking van twee verschillende
cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo’s
65
66
67
68