UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
DRACHT DOOR EMBRYOTRANSPLANTATIE BIJ DE MERRIE: BEÏNVLOEDENDE FACTOREN.
door
Stephanie SCHEEMAEKER
Promotor:
Prof. dr. P. Daels
Copromotor:
J. Govaere
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2014 Stephanie Scheemaeker
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk
uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
DRACHT DOOR EMBRYOTRANSPLANTATIE BIJ DE MERRIE: BEÏNVLOEDENDE FACTOREN.
door
Stephanie SCHEEMAEKER
Promotor:
Prof. dr. P. Daels
Copromotor:
J. Govaere
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2014 Stephanie Scheemaeker
VOORWOORD
In mijn voorwoord wil ik graag een aantal mensen extra bedanken. Zij hebben allen op hun eigen
manier bijgedragen in het tot stand komen van deze literatuurstudie.
In het bijzonder wens ik mijn promotor, professor dr. Peter Daels, te bedanken. Eerst en vooral
bedankt om mij te willen bijstaan als promotor! Ik ben u enorm dankbaar voor uw goede begeleiding,
uw tijd, en uw kennis. Merci!!!
Langs deze weg wens ik ook mijn copromotor, Jan Govaere, te bedanken om me te helpen bij de
afwerking van mijn literatuurstudie. Bedankt om me te wijzen op een aantal belangrijke
aandachtpunten.
Ook dierenarts Ward De Bie verdient hier vermeld te worden. Bedankt om mij te laten kennismaken
met de praktische kant van mijn onderwerp. Dit heeft mijn interesse in de voortplantingstechniek,
embryotransplantatie, nog meer aangewakkerd.
Mijn broer, Hans Scheemaeker, wil ik bedanken voor het nalezen van mijn literatuurstudie. Bedankt
voor de inspanning en de tips.
Graag wens ik mijn ouders te bedanken. Dankzij jullie krijg ik de kans om mijn droom in vervulling te
laten gaan, namelijk dierenarts worden!
Als laatste bedank ik mijn vrienden. Mede door jullie steun, vertrouwen en jullie vriendschap ben ik
reeds aan mijn voorlaatste jaar diergeneeskunde bezig!
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .................................................................................................................................... 1
INLEIDING ............................................................................................................................................... 2
LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................................. 3
1. Invloed transplantatiemethode ....................................................................................................... 3
1.1. Chirurgisch versus niet-chirurgisch.................................................................................................. 3
1.1.1. Chirurgische methode ................................................................................................................. 3
1.1.2. Niet-chirurgisch methode ............................................................................................................ 3
1.1.2.1.
Conventionele techniek ......................................................................................................... 4
1.1.2.2.
Techniek van Wilsher ............................................................................................................ 4
1.1.2.3.
Resultaten.............................................................................................................................. 5
1.1.3. Bekomen resultaten .................................................................................................................... 5
1.2. Invloed van de ervaring van de dierenarts ...................................................................................... 6
1.3. Hygiëne ............................................................................................................................................ 6
1.4. Invloed van het sedativum ............................................................................................................... 7
1.5. Seizoen ............................................................................................................................................ 8
2. Bijkomende therapiën ...................................................................................................................... 9
2.1. Progesteron ..................................................................................................................................... 9
2.2. NSAID ............................................................................................................................................ 10
2.3. Antibiotica ...................................................................................................................................... 11
3. Eigenschappen van het embryo ................................................................................................... 11
3.1. Ouderdom ...................................................................................................................................... 11
3.2. Grootte – Ontwikkelingsstadium .................................................................................................... 11
3.3. Grootte – Ouderdom ...................................................................................................................... 13
3.4. Kwaliteit .......................................................................................................................................... 14
4. Bewaring van het embryo .............................................................................................................. 15
4.1. Gekoeld .......................................................................................................................................... 15
4.1.1. Medium ..................................................................................................................................... 15
4.1.2. Temperatuur ............................................................................................................................. 16
4.1.3. Duur van bewaring .................................................................................................................... 16
4.2. Cryopreservatie.............................................................................................................................. 16
4.2.1. Grootte en ontwikkelingsstadium embryo ................................................................................. 17
4.2.2. Cryoprotectant .......................................................................................................................... 17
4.2.3. Techniek ................................................................................................................................... 18
4.2.3.1.
Slow-freezing ....................................................................................................................... 18
4.2.3.2.
Vitrificatie ............................................................................................................................. 18
4.2.3.3.
Conclusie ............................................................................................................................. 19
5. Draagmerrie .................................................................................................................................... 19
5.1. Type ............................................................................................................................................... 19
5.1.1. Leeftijd ...................................................................................................................................... 19
5.1.2. Type paard ................................................................................................................................ 20
5.1.3. Reproductieve voorgeschiedenis ............................................................................................. 20
5.1.4. Toestand genitaaltractus .......................................................................................................... 20
5.1.5. Conditiescore ............................................................................................................................ 21
5.2. Synchronisatie draagmerrie ........................................................................................................... 21
5.2.1. Dagen geovuleerd draagmerrie ................................................................................................ 21
5.2.2. Mate van sychroniteit draagmerrie versus donormerrie ........................................................... 22
6. Beïnvloedende factoren op de embryoproductie ....................................................................... 23
6.1. Superovulatie ................................................................................................................................. 23
6.2. Seizoen .......................................................................................................................................... 24
6.3. Hengst – Aangewend sperma ....................................................................................................... 24
6.4. Keuze van de donormerrie ............................................................................................................ 24
6.4.1. Reproductieve voorgeschiedenis ............................................................................................. 24
6.4.2. Leeftijd ...................................................................................................................................... 25
6.4.3. Tijdstip uterusspoeling postovulatoir ........................................................................................ 25
6.4.4. Sport – Inspanning .................................................................................................................... 26
BESPREKING ....................................................................................................................................... 27
REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 29
BIJLAGEN .................................................................................................................................................
Tabel 1. Invloed van de embryotransplantatiemethode op het drachtigheidspercentage
waargenomen op 12 tot 16 dagen en/of 50 tot 60 dagen dracht ....................................................
Tabel 2. Invloed van de dag postovulatoir, waarop het embryo bij de draagmerrie wordt
ingebracht, op het drachtigheidspercentage ...................................................................................
SAMENVATTING
In de literatuur is men er het algemeen over eens dat synchronisatie van donor- en draagmerrie het
belangrijkste aandachtspunt is binnen embryotransplantatie bij het paard. De drachtresultaten zijn
optimaal indien de draagmerrie 1 dag vόόr (+ 1) tot 5 dagen na (- 5) de donormerrie ovuleert.
Rekening houdend met dit tijdsvenster zijn de drachtresultaten het best als de draagmerrie reeds 3 tot
6 dagen is geovuleerd (Carnevale et al., 2000; Jacob et al., 2012).
Een correcte transplantatietechniek, uitgevoerd volgens de regels, staat centraal in het bereiken van
een maximaal drachtigheidspercentage. Bij het niet-chirurgisch inbrengen van het embryo is de
ervaring van de dierenarts alsook het toepassen van asepsie positief gecorreleerd met het
drachtigheidspercentage (Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Daels,
2007).
Optimale drachtresultaten worden verkregen bij gebruik van een dag 7 embryo, dat zich in het
(uitgekipt) blastocyststadium bevindt (Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Jacob et al., 2012).
Een embryonale kwaliteit van graad 1 geeft aanleiding tot de beste drachtigheidspercentages
(Carnevale et al., 2000). Voor behoud van de embryonale kwaliteit bij bewaring van het embryo is het
van belang een correcte bewaringstemperatuur en bewaringsmethode te handhaven. Transplantatie
van een gekoeld embryo (5°C) heeft geen verschil in drachtigheidspercentages ten opzichte van
transplantatie van een vers embryo (Carney et al., 1991; Carnevale et al., 2000). Bij cryopreservatie
van embryo’s leidt “slow-freezing” alsook vitrificatie tot eenzelfde embryonale leefbaarheid (Hochi et
al., 1995). De drachtigheidspercentages na transplantatie van een bevroren embryo zijn lager in
vergelijking met transplantatie van een gekoeld embryo (Squires et al., 2003; Stout, 2012).
Een verminderde uteriene tonus en een afwijkende uteriene omgeving bij de draagmerrie op moment
van transplantatie gaan gepaard met een lager drachtigheidspercentage na embryotransplantatie
(Carnevale et al., 2000). Aangezien deze abnormaliteiten voornamelijk voorkomen bij oudere merries,
is het aangeraden merries jonger dan 15 jaar te selecteren (Carnevale en Ginther, 1992).
Factoren met geen of onduidelijke invloed op de drachtresultaten na embryotransplantatie of factoren,
die een invloed hebben op het percentage embryonale sterfte, zijn: seizoen en toediening van
progestagenen,
niet-steroïdale
ontstekingsremmers
of
antibiotica.
Er
is
geen
verschil
in
drachtigheidspercentage naargelang de maand, tijdens dewelke het embryo wordt getransplanteerd
(Iuliano en Squires, 1985; Carnevale et al., 2000). Wel treedt er meer embryonale sterfte op indien de
embryotransplantatie tijdens de transitieperiode plaatsgrijpt (Carnevale et al., 2000). Toediening van
progestagenen vόόr en na de embryotransplantatie zorgt voor minder embryonale sterfte (Willmann et
al., 2011). Bij de verschillende auteurs is er onenigheid omtrent het aanwenden van niet-steroïdale
ontstekingsremmers en antibiotica: ofwel leidt het tot een toename van het drachtigheidspercentage,
ofwel heeft het geen invloed op het drachtigheidspercentage (Panzani et al., 2009; González et al.,
2010; Koblischke et al., 2010).
Kortom, bij embryotransplantatie zijn voornamelijk eigenschappen, gecorreleerd met het embryo en de
draagmerrie, van groot belang om een optimaal drachtigheidspercentage te verkrijgen.
1
INLEIDING
Embryotransplantatie is een voortplantingstechniek, waarbij een embryo van een donormerrie wordt
ingebracht in een andere merrie, de draagmerrie. In de draagmerrie ontwikkelt het embryo zich verder.
De verschillende indicaties voor embryotransplantatie zijn: 1) sportpaarden, opdat ze aan de
competitie kunnen blijven deelnemen, 2) merries met een reproductieprobleem, 3) merries met een
niet-reproductief gezondheidsprobleem en 4) jonge (tweejarige) merries. Naast deze indicaties is de
mogelijkheid tot het verkrijgen van meerdere veulens per jaar van eenzelfde (waardevolle) merrie, een
bijkomend voordeel van embryotransplantatie bij de merrie (Squires et al., 2003; Daels, 2007; Brinsko
et al., 2011).
Embryotransplantatie is voor de eerste maal toegepast bij de merrie in de jaren ’70 (Squires et al.,
2003). De voortplantingstechniek heeft een moeizame start gekend bij het paard in vergelijking met
andere diersoorten, zoals het rund. Redenen voor deze tragere ontwikkeling zijn onder andere de
terughoudendheid van de fokverenigingen, het gebrek aan een efficiënte methode voor de inductie
van superovulatie, en de synchronisatie van de draagmerrie (Wilsher en Allen, 2004; Allen, 2005). Het
is pas in de jaren ’90 dat deze voortplantingstechniek sterke vooruitgang begint te boeken. Deze
vooruitgang is er voornamelijk gekomen doordat de meeste fokverenigingen, met uitzondering van
deze van de Engelse Volbloed en de Franse Draver, zich niet langer verzetten tegen het toepassen
van embryotransplantatie bij de voortplanting (Allen, 2005).
De belangrijkste landen, waar embryotransplantatie bij de merrie wordt toegepast, zijn de Verenigde
Staten, Argentinië en Brazilië. Landen, waar embryotransplantatie minder intensief wordt uitgebaat,
maar ook een belangrijke voortplantingstechniek is bij het paard, zijn: Australië, Canada, Duitsland,
Frankrijk en Italië (Squires et al., 2003). De laatste jaren is de toepassing van embryotransplantatie bij
de merrie ook in Noord-Europa sterk toegenomen. Dit is voornamelijk het gevolg van het beschikken
over de mogelijkheid om embryo’s gedurende 24 h koel te bewaren en te transporteren. Hierdoor is
het mogelijk om een embryo te transporteren naar een erkende inrichting voor embryotransplantatie,
zonder dat de eigenaar van het embryo over een draagmerrie moet beschikken (Daels, 2007).
Volgens Scherzer et al. (2008) is embryotransplantatie bij het paard minder efficiënt ten gevolge van
de bijzondere voortplantingsfysiologie van de merrie enerzijds, waarbij slechts één tot twee follikels
per oestrische cyclus ovuleren, en de lage vitaliteit van paardenembryo’s na invriezen en ontdooien
anderzijds. De efficiëntie en het succes van embryotransplantatie bij de merrie is niet alleen
afhankelijk van deze twee bovenstaande elementen. Het doel van deze literatuurstudie is dan ook om
na te gaan welke factoren van invloed zijn op het drachtigheidspercentage na embryotransplantatie bij
de merrie.
2
LITERATUURSTUDIE
1. INVLOED TRANSPLANTATIEMETHODE
1.1. CHIRURGISCH VERSUS NIET-CHIRURGISCH
Het verkregen embryo kan zowel transcervicaal (niet-chirurgisch) als via een flankincisie of
laparotomie ter hoogte van de linea alba (chirurgisch), worden ingebracht bij de geschikte
draagmerrie.
De
twee
verschillende
werkwijzen
op
zich
beïnvloeden
het
uiteindelijke
drachtigheidspercentage bij de draagmerrie.
1.1.1. Chirurgische methode
Embryotransplantatie (ET) via de chirurgische methode kan op twee manieren worden uitgevoerd: via
een laparotomie ter hoogte van de linea alba, of via een flankincisie. Het is voornamelijk de laatste
techniek, die in gebruik is.
De chirurgische techniek, uitgevoerd via een flankincisie, is in de jaren ‘80 beschreven door Squires et
al. (1982) en Iuliano et al. (1985). De ingreep gebeurt onder sedatie en met behulp van lokale
infiltratieanesthesie. Voor het uitvoeren van de flankincisie wordt een verticale huidincisie van 15-20
cm gemaakt. Met de incisie wordt gestart in het midden van de denkbeeldige lijn tussen de tuber
coxae en de laatste rib, 10 cm ventraal van de lumbale dwarsuitsteeksels. Daarna worden de
onderliggende buikspieren stomp gekliefd en het onderliggend peritoneum ingesneden. Via de
gemaakte opening in het abdomen wordt het proximale derde deel van de uterushoorn
geëxterioriseerd. Met een steriele naald wordt de uteruswand geperforeerd. Een steriele glazen pipet,
die het embryo samen met 5 ml cultuurmedium bevat, wordt doorheen de gemaakte opening in de
uterus geledigd.
1.1.2. Niet-chirurgisch methode
Ook de niet-chirurgische methode kent twee uitvoeringswijzen: er is de conventionele techniek en de
techniek van Wilsher (Wilsher en Allen, 2004). De voorbereiding van de draagmerrie is voor beide
technieken gelijk. Bij de voorbereiding moet er grote zorg besteed worden aan de uitwendige hygiëne
van de perineumstreek van de merrie. Allereerst wordt de staart van de draagmerrie aan de basis
omzwachteld en opzij gefixeerd. Alvorens te beginnen met het reinigen van de perineumstreek moet
het rectum geledigd worden. Ideaal gezien kan een steriele, niet-pluizende doek in het vestibulum
vaginae worden ingebracht om te voorkomen dat er fecesdruppels in de vagina terechtkomen. Daarna
worden het perineum, de vulva en het vestibulum vaginae zeer goed gereinigd met een oplossing van
povidone-jood. Het is van belang deze antiseptische oplossing na de reiniging goed af te spoelen,
opdat geen restanten achterblijven ter hoogte van de ventrale vulvacommissuur. Nadat alles
afgedroogd is, worden het perineum, de vulva en het vestibulum vaginae met alcohol gereinigd
(Squires et al., 1982; Wilsher en Allen, 2004; Brinsko et al., 2011).
3
1.1.2.1.
Conventionele techniek
Het embryo wordt in een steriel rietje, samen met 0,25 of 0,50 ml cultuurmedium, gebracht. De
vloeistofkolom wordt onderbroken door minimum twee luchtbellen, waarbij het embryo zich tussen de
twee luchtbellen in bevindt. De aanwezige luchtbellen in het rietje hebben een dubbel doel: de
beweging van het embryo in het rietje minimaliseren en de uitdrijving van het embryo uit het rietje
verzekeren (Carnevale et al., 2000; Brinsko et al., 2011).
De conventionele transcervicale methode is reeds door verschillende onderzoekers beschreven
(Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Daels, 2007; Brinsko et al., 2011).
Het rietje met het embryo wordt in een cassoupipet geladen, waarna het achtereenvolgens omgeven
wordt door een steriele, harde beschermhuls en flexibel plastiek omhulsel. De dierenarts, die twee
paar steriele handschoenen draagt met daartussen de pipet, gaat met zijn hand intravaginaal en
palpeert naar de portio vaginalis cervicis en het ostium uteri externum. Wanneer het ostium uteri
externum is gelokaliseerd, wordt het beschermend plastiek omhulsel met de pipet geperforeerd. Al of
niet onder vingerbegeleiding, wordt de inseminatiepipet doorheen het cervicaal kanaal begeleid over
een afstand van ongeveer 5 cm. Daarna wordt de arm in het rectum gebracht om de uterus
transrectaal op te tillen en de inseminatiepipet te begeleiden tot in het corpus uteri. Met behulp van de
cassoupipet wordt het embryo vanuit het rietje in het corpus uteri gedreven.
1.1.2.2.
Techniek van Wilsher
Een alternatieve techniek voor de conventionele niet-chirurgische transplantatiemethode wordt voor
het eerst beschreven en uitgevoerd door Wilsher en Allen (2004). Het doel van deze techniek is het
bekomen van een vlotte passage van de cassoupipet doorheen het cervicaal kanaal met een
minimum aan manipulatie van het geslachtsstelsel en een hoog niveau van steriliteit. Eenmaal alle
hygiënische maatregelen in acht zijn genomen ter hoogte van de perineumstreek, wordt een steriel
vaginaal speculum, het Polansky speculum, intravaginaal gebracht. Met behulp van een focale
lichtbron kan de portio vaginalis cervicis zichtbaar worden gemaakt. Via het speculum wordt een
aangepaste weefselklem, de “Wilsher equine embryo transfer forceps”, ingebracht (Figuur 1). De
dierenarts grijpt met deze tang het ventrale deel van de portio vaginalis cervicis en trekt dit naar
caudaal. Op deze manier komt de cervix uteri, en hiermede het cervicaal kanaal, in een rechte lijn te
liggen met het corpus uteri.
Fig. 1 De “Wilsher equine embryo transfer forceps”, die het ventrale deel van de portio
vaginalis cervicis naar caudaal trekt (naar Wilsher en Allen, 2004).
4
Het te transplanteren embryo wordt in een inseminatiepipet gebracht, op dezelfde manier zoals
beschreven bij de conventionele techniek. Bij deze techniek wordt het embryo door een groter volume
aan cultuurmedium omgeven, namelijk 2,5 ml. Dergelijk groot volume wordt gebruikt, opdat het
embryo niet blijft kleven aan het rietje bij het uitdrijven en bijgevolg verloren gaat (Allen, 2005). De
inseminatiepipet, die omgeven wordt door een steriel plastiek omhulsel, wordt vervolgens via het
speculum intravaginaal gebracht. Onder visuele controle wordt de pipet doorheen het ostium uteri
externum in het cervicaal kanaal geschoven. Wanneer de pipet zich een vijftal cm in de cervix bevindt,
wordt het plastiek omhulsel geperforeerd. In een vloeiende beweging wordt de pipet doorgevoerd tot
in de uterus, waar het embryo wordt geplaatst. Daarna worden pipet, tang en speculum verwijderd uit
het geslachtsstelsel van de merrie.
1.1.2.3.
Resultaten
De niet-chirurgische techniek van Wilsher is een veelbelovende methode: de hiermee verkregen
drachtigheidspercentages zijn hoger in vergelijking met de klassieke methode. In de studie van
Wilsher en Allen (2004) werd op dag 20 een drachtigheidspercentage van 85% bekomen. Dergelijk
resultaat is, tot op het moment van de studie, nog niet verkregen met de conventionele transcervicale
ET-techniek.
1.1.3. Bekomen resultaten
Uit verschillende studies is gebleken dat het drachtigheidspercentage hoger is bij gebruik van de
chirurgische ten opzichte van de niet-chirurgische methode (Castleberry et al., 1980; Iuliano et al.,
1985; Carnevale et al., 2000; Wilsher en Allen, 2004). Een overzicht van drachtresultaten na ET via de
chirurgische en niet-chirurgische techniek is te zien in Tabel 1 (zie bijlagen).
Mogelijke oorzaken voor het mindere succes van de transcervicale methode zijn: de plaats in de
uterus waar het embryo wordt gedeponeerd, de vrijstelling van prostaglandine F2 alfa (PGF2α) en/of
oxytocine ten gevolge van manipulatie van de cervix met eventueel luteolyse, en contaminatie van de
uterus onder progesteroninvloed leidend tot een infectieuze endometritis (Iuliano et al., 1985; Wilsher
en Allen, 2004). In tegenstelling tot Wilsher en Allen (2004), stelt Koblischke et al. (2008) dat de
stijging in PGF2α na ET niet te wijten is aan de manipulatie van de cervix bij de transcervicale
methode, maar aan het optreden van een subklinische endometritis.
Zoals reeds eerder vermeld werden met de chirurgische methode betere drachtresultaten bekomen in
vergelijking
met
de
niet-chirurgische
methode.
Ondertussen
zijn
de
niet-chirurgische
transplantatietechniek en de gebruikte materialen dermate geëvolueerd, dat de drachtresultaten deze
van de chirurgische methode overtreffen. Mede door de verbeterde resultaten, maar ook wegens
ethische overwegingen, wordt vandaag het embryo enkel nog via de niet-chirurgische techniek
getransplanteerd (Brinsko et al., 2011; Vandenberghe et al., 2012).
5
1.2. INVLOED VAN DE ERVARING VAN DE DIERENARTS
Het succes van een methode wordt grotendeels bepaald door de individuele wijze van uitvoering.
Algemeen wordt aanvaard dat een dierenarts met meer ervaring een hoger drachtigheidspercentage
verwerft (Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985). De ervaring van de dierenarts heeft voornamelijk
significante verschillen bij de transcervicale methode. Volgens Stout (2006) zou dit te wijten zijn aan
het onvermogen van de onervaren dierenarts om het embryo in de uterus te deponeren. Bij de
chirurgische methode blijkt de variatie tussen dierenartsen geringer te zijn (Squires et al., 1999).
1.3. HYGIENE
Het is van allergrootste belang volkomen aseptisch te werken tijdens de manipulatie en het inbrengen
van het embryo in de uterus van de draagmerrie. Eender welke contaminatie, die ontstaat tijdens het
inbrengen van het embryo, gaat namelijk gepaard met embryonale sterfte. Daarnaast zijn, in het kader
van de natuurlijke dekking of kunstmatige inseminatie (KI) en de embryonale spoeling, hygiënische
maatregelen bij de donormerrie ook van belang om een gezond embryo te verkrijgen. Eenmaal een
gezond embryo verkregen, moet het embryo op hygiënische wijze gemanipuleerd worden. Onder de
manipulatie van het embryo worden alle handelingen gerekend vanaf het moment na de embryonale
spoeling van de uterus van de donormerrie tot vόόr het inbrengen van het embryo in de uterus van de
draagmerrie.
Het inbrengen van het embryo in de uterus van de draagmerrie moet, zoals eerder aangehaald,
volkomen aseptisch verlopen. In geval van de niet-chirurgische methode zijn er verschillende
hygiënische maatregelen, die in acht moeten worden genomen, om asepsie te verzekeren. De
volgende hygiënische maatregelen, bij de draagmerrie uitgevoerd, zijn van belang: het omzwachtelen
van de staart, het rectaal verwijderen van de feces, het reinigen van de perineumstreek met een
jodiumhoudende oplossing waarna dit afgespoeld wordt met water, het reinigen van de
perineumstreek met alcohol, het omgeven van de transferpipet met een steriel plastiek omhulsel en
het dragen van twee paar steriele rectale handschoenen door de dierenarts (Squires et al., 1982;
Carnevale et al., 2000; Daels, 2007). Ondanks het zorgvuldig reinigen van de perineumstreek, met als
doel de feces ter hoogte van de vulvastreek te verwijderen, zullen alsnog fecale restanten
achterblijven in het caudale deel van het vestibulum vaginae. Via de transferpipet of de arm van de
operator kan deze fecale contaminatie meegevoerd worden tot in de cervix en eventueel aanleiding
geven tot endometritis. Zoals reeds eerder vermeld trachtten Wilsher en Allen (2004) dergelijke fecale
contaminatie van het vestibulum vaginae te verminderen door het brengen van een steriele
absorberende doek in het vestibulum vaginae alvorens het rectum te ledigen (Figuur 2). De handdoek
absorbeert hierbij de naar binnen getreden feces en andere contaminaties. Na het ledigen van het
rectum en het reinigen van de perineumstreek wordt de doek uit het vestibulum vaginae verwijderd.
6
Fig. 2 De aanwezigheid van een steriele, absorberende doek in het vestibulum vaginae (uit Wilsher en
Allen, 2004).
Indien bij deze bovenstaande handelingen toch onvoldoende aandacht aan hygiëne wordt besteed,
kan dit leiden tot een, al of niet subklinische, endometritis (Vanroose et al., 2000; Wilsher en Allen,
2004; Koblischke et al., 2008; González et al., 2010). Of de ontstane endometritis tijdelijk is of
persisteert, is afhankelijk van de effectiviteit van de uteriene klaring van de merrie en de grootte van
de contaminatie. In geval het gaat om een infectieuze endometritis, speelt de resistentie van het
infectieuze agens ook een rol (Troedsson, 1999).
1.4. INVLOED VAN HET SEDATIVUM
Tijdens het transcervicaal deponeren van het embryo in de uterus kan de draagmerrie al dan niet
gesedeerd worden. Als sedativum kan onder andere gebruik gemaakt worden van acepromazine of
xylazine (Fleury en Alvarenga, 1999; Foss et al., 1999; Carnevale et al., 2000; Wilsher en Allen, 2004;
Panzani et al., 2009). Door de sedatie verslapt de vulva en wordt de merrie rustiger, waardoor ze
minder reageert op de manipulaties van de dierenarts (Fleury en Alvarenga, 1999; Carnevale et al.,
2000).
Er is nog geen onderzoek gebeurd naar een negatieve invloed van het sedativum op het
drachtigheidspercentage na ET. Wel werd in het onderzoek van Blanchard et al. (2010) opgemerkt dat
intraveneuze toediening van acepromazine, xylazine en butorfanol vόόr de natuurlijke dekking, geen
negatieve invloed had op het drachtigheidspercentage.
7
1.5. SEIZOEN
Merries hebben een seizoensgebonden poly-oestrische cyclus. Dit wil zeggen dat de merrie tijdens
het voortplantingsseizoen, dat in het noordelijk halfrond duurt van april tot september, meerdere
oestrische cycli doorloopt (Hughes et al., 1975). Door een toename van de dagtemperatuur en het
lengen van de dagen komt de ovariële activiteit bij de merrie op gang. Daarna wordt de merrie
ongeveer om de 21 dagen hengstig. Bij het korten van de dagen neemt de folliculaire activiteit ter
hoogte van de ovaria af om uiteindelijk in anoestrus te gaan (Sertich, 1989).
Van februari tot maart en van september tot oktober is er sprake van de transitieperiode binnen het
voortplantingsseizoen van de merrie (Nagy et al., 2000). Deze periode vormt de overgang van de
winter anoestrus naar de normale cycliciteit respectievelijk de normale cycliciteit naar de winter
anoestrus. De transitieperiode wordt gekenmerkt door lange, onregelmatige oestrische periodes
(Ginther, 1974). Tijdens deze oestrische periodes komen meerdere kleine follikels van 15-25 mm tot
ontwikkeling, maar deze ovuleren niet. Ondertussen zijn de serum- en hypofysaire concentraties van
het luteïniserend hormoon (LH) laag en van het follikel stimulerend hormoon (FSH) stijgend (Silvia et
al., 1976). Om de transitieperiode van winter anoestrus naar normale cycliciteit in te korten zijn er
verschillende opties: toename van de daglichtlengte of toediening van gonadotrofine releasing
hormoon (GnRH), FSH-extract, progesteron al of niet gecombineerd met oestradiol of progestagenen
(Wiepz et al., 1988).
In het onderzoek van Carnevale et al. (2000) werd er bij de eerste drachtcontrole geen verschil gezien
in drachtigheidspercentage na ET bij draagmerries die zich in de transitieperiode bevinden en
behandeld worden met een progestageen (Altrenogest), ten opzichte van cyclische merries. Wel werd
er een niet-significante hogere graad aan embryonale sterfte waargenomen indien ET plaatsgreep in
de transitieperiode. In tegenstelling tot deze bevindingen merkten Iuliano et al. (1985) op dat het
drachtigheidspercentage lager was indien ET werd uitgevoerd tijdens de transitieperiode. Belangrijk
om weten is dat de draagmerries in de studie van Iuliano et al. (1985) niet hormonaal werden
voorbereid indien het embryo werd getransplanteerd in de transitieperiode.
Wat betreft de invloed van de maand in het voortplantingsseizoen, waarin ET wordt uitgevoerd, op het
drachtigheidspercentage na ET, werd er in de studie van Iuliano en Squires (1985) en Carnevale et al.
(2000) geen verband opgemerkt. Wel werd er in de studie van Iuliano en Squires (1985) een nietsignificante stijging van het drachtigheidspercentage gezien in geval van ET na één augustus. Men
vermoedde echter dat deze stijging niet alleen veroorzaakt werd door het moment van ET tijdens het
voortplantingsseizoen, maar gedeeltelijk ook door de bekwaamheid van de dierenarts.
8
2. BIJKOMENDE THERAPIËN
2.1. PROGESTERON
Bij de merrie, die al of niet door ET drachtig is, is het progesteronhormoon de gehele dracht van
belang. De eerste 40 dagen van de dracht is progesteron afkomstig van het primair corpus luteum
(CL). Rond dag 37 vormen zich de endometriale cups, die equine chorion gonadotrofine (eCG)
produceren. Het eCG houdt het primair CL in stand en zorgt voor de vorming van secundaire CL’s. Tot
dag 120 van de dracht produceren de secundaire CL’s progesteron, waarna ze in regressie gaan.
Ongeveer vanaf 60 dagen dracht worden er door de foetale gonaden progestagenen geproduceerd en
gesecreteerd. Deze foetale progestagenen zijn tot het einde van de dracht aanwezig in de maternale
circulatie (Hinrichs et al., 1987).
In het kader van ET wordt soms geopteerd voor toediening van progestagenen aan de draagmerrie.
Draagmerries, die niet in staat zijn een dracht in stand te houden wegens een te lage
progesteronproductie door het corpus luteum of na ovariëctomie, komen hiervoor in aanmerking. De
behandeling met progestagenen start reeds vijf dagen vόόr ET en moet gedurende de eerste 100 tot
120 dagen van de dracht dagelijks worden toegediend aan de draagmerrie (Brinsko et al., 2011).
Er is nog geen literatuur voorhanden, die een invloed van het exogeen progestageen op het
drachtigheidspercentage na ET beschrijft. Wel hebben Willmann et al. (2011) het effect van een oraal
progesteronpreparaat, namelijk Altrenogest (Regu-Mate®), op de ontwikkeling van het embryo bij een
normale dracht onderzocht. Eerst en vooral werd er geen invloed, uitgaande van de exogene
progestagenen, op het drachtigheidspercentage waargenomen. Daarnaast werd opgemerkt dat de
progesteron behandeling geen invloed had op de embryonale ontwikkeling tot dag 22 (ovulatie op dag
0). Tussen dag 30 en 45 werd wel een verschil gezien in embryonale ontwikkeling tussen de nietbehandelde en de behandelde merries. Zo vertoonden de behandelde merries van 4 tot 8 jaar en
merries ouder dan 8 jaar kleinere respectievelijk grotere embryo’s ten opzichte van niet-behandelde
merries uit dezelfde leeftijdscategorie. Het toegediend progestageen zorgt namelijk voor het wegvallen
van de negatieve correlatie tussen de leeftijd van de merrie en de diameter van het embryo. Hierbij
valt te benadrukken dat het exogeen progestageen niet rechtstreeks de embryonale groei stimuleert,
maar zorgt voor een algemene ondersteuning van de embryonale ontwikkeling. Met de studie kwam
men tot de conclusie dat toediening van progestagenen aan oudere merries of merries met een
voorgeschiedenis van veel embryonale sterfte zorgt voor een ondersteuning van de embryonale
ontwikkeling met minder embryonale sterfte tot gevolg.
Zoals hierboven reeds vermeld worden progestagenen ook toegediend aan draagmerries, die een
bilaterale ovariëctomie hebben ondergaan (Brinsko et al., 2011). Bij dergelijke merries ontbreekt een
endogene progesteronproductie, waardoor deze draagmerries enkel met behulp van exogene
progestagenen een dracht in stand kunnen houden. In de studie van Hinrichs et al. (1987) werd
opgemerkt dat bij deze gesteriliseerde merries, waaraan progesteron werd toegediend vanaf 5 dagen
9
vόόr ET tot 100 dagen dracht, een normale dracht, partus, colostrumproductie, lactatie en
moedergedrag aanwezig waren.
2.2. NSAID
Na ET kan aan de draagmerrie niet-steroïdale ontstekingsremmers (NSAID’s) worden toegediend. Het
aanwenden van NSAID’s na ET kent twee indicaties: de vrijstelling van PGF2α ter hoogte van de
uterus inhiberen en de eventueel ontstane, steriele endometritis onderdrukken. De steriele
endometritis ontstaat door trauma, veroorzaakt door de transferpipet bij het inbrengen van het embryo
in de uterus (Foss et al., 1999).
Aanvankelijk werd gesteld dat de PGF2α-vrijstelling ter hoogte van de uterus een gevolg was van de
manipulatie van de cervix tijdens het niet-chirurgisch inbrengen van het embryo (Handler et al., 2003).
In de studie van Koblischke et al. (2008) werd deze hypothese verworpen en verondersteld dat de
PGF2α-vrijstelling veroorzaakt werd door een inflammatie van het endometrium. Deze endometriale
inflammatie kan geïnduceerd worden door het ingebrachte embryo, het gebruikte transportmedium
en/of bacteriële contaminatie.
Koblischke et al. (2008) bestudeerden de invloed van de NSAID’s, meclofenamaat en flunixine
meglumine, op het drachtigheidspercentage na ET. In de studie werd opgemerkt dat beide
ontstekingsremmers de embryonale ontwikkeling niet beïnvloeden: er was geen verschil in
ontwikkelingsstadium en diameter van het embryo tussen de behandelingsgroep en de groep merries,
die geen NSAID werden toegediend (de controlegroep). Een aantal merries uit de controlegroep
ondergingen luteolyse als gevolg van een toegenomen productie van cyclo-oxygenase 2 (COX-2) en
bijgevolg vrijstelling van PGF2α. Deze PGF2α-vrijstelling gebeurde onafhankelijk van een bacteriële
contaminatie van het endometrium en leidde tot het beëindigen van de dracht. In de
behandelingsgroep werd de productie van COX-2 door de NSAID’s onderdrukt, zodat luteolyse niet
optrad. Uit de studie van Koblischke et al. (2008) bleek dat meclofenamaat efficiënter is in het
onderdrukken van de PGF2α-productie dan flunixine meglumine. Naast suppressie van de PGF2αproductie, werd ook de productie van prostaglandine E (PGE), uitgaande van het embryo, onderdrukt.
PGE is echter van belang voor de maternale herkenning van het embryo en stimuleert de intrauteriene migratie tussen dag 9 en 16 (ovulatie op dag 0). In de preventie van endometritis na ET is het
gebruik van meclofenamaat te verkiezen boven flunixine meglumine, omdat meclofenamaat de PGEproductie minder inhibeert. In een daaropvolgende studie van Koblischke et al. (2010) werd
aangetoond dat behandeling van de draagmerries met NSAID’s (eenmaal flunixine meglumine
intraveneus en 3 dagen lang tweemaal daags vedaprofen per oraal) leidt tot een toename van het
drachtigheidspercentage na transcervicale ET. Hieruit werd geconcludeerd dat behandeling met
NSAID’s na ET een routine moet worden (Koblischke et al., 2008; Koblischke et al., 2010).
Daarentegen stelden Panzani et al. in 2009 geen verbetering van de drachtigheidspercentages vast
bij gebruik van flunixine meglumine als NSAID. Volgens Panzani et al. (2009) is gebruik van NSAID’s
na ET onnodig.
10
2.3. ANTIBIOTICA
In geval van ET wordt veelal vόόr en na de transplantatie profylactisch antibiotica toegediend aan de
draagmerrie. Dit vermindert het risico op het optreden van een (subklinische) endometritis ten gevolge
van bacteriële contaminatie van de uterus, veroorzaakt gedurende het inbrengen van het embryo in
de uterus (Stout, 2006). In de studie van Panzani et al. (2009) werd procaïne benzylpenicilline
dagelijks intramusculair geïnjecteerd tot drie dagen na ET. Ondanks deze antibioticumbehandeling
werd er geen verbetering van de drachtigheidspercentages opgemerkt ten opzichte van nietbehandelde merries. In tegenstelling hiermee bekwamen González et al. (2010) hogere
drachtigheidspercentages na ET bij eenmalig intraveneus gebruik van een fluoroquinolone, namelijk
enrofloxacine, bij gezonde merries die gevoelig zijn aan endometritis.
Zowel procaïne benzylpenicilline en enrofloxacine bezitten een breedspectrum activiteit. Eventueel ligt
het verschil in de bevindingen van Panzani et al. (2009) en González et al. (2010) omtrent het
drachtigheidspercentage,
in
de
toedieningswijze
(intramusculair
versus
intraveneus),
de
behandelingsfrequentie of de farmacokinetiek van beide antibiotica.
Een nadeel aan het profylactisch gebruik van antibiotica is dat het de ontwikkeling van
antibioticumresistentie bij veel voorkomende, pathogene uteriene bacteriën in de hand werkt
(González et al., 2010).
3. EIGENSCHAPPEN VAN HET EMBRYO
3.1. OUDERDOM
De ouderdom van het embryo wordt bepaald door het moment van uterusspoeling postovulatoir. De
embryonale leeftijd heeft ook een invloed op het drachtigheidspercentage na ET. Deze invloed is meer
uitgesproken in geval van niet-chirurgische ET ten opzichte van chirurgische ET (Iuliano et al., 1985).
Iuliano et al. (1985) en Jacob et al. (2012) merkten de hoogste drachtigheidspercentages op bij nietchirurgische transplantatie van dag 7 embryo’s. Dag 6 embryo’s gingen gepaard met lagere
drachtigheidspercentages, doordat deze kleiner en hierdoor meer fragiel zijn ten opzichte van dag 7
embryo’s. Terwijl dag 8 en dag 9 embryo’s gepaard gingen met lagere drachtigheidspercentages
wegens hun grootte. Dag 8 en 9 embryo’s kunnen namelijk wegens hun grotere diameter makkelijker
beschadigd worden door het aangewend materieel. In het onderzoek van Fleury en Alvarenga (1999)
werd er net geen verschil in drachtigheidspercentages waargenomen bij niet-chirurgische
transplantatie van dag 7, 8 en 9 embryo’s.
3.2. GROOTTE – ONTWIKKELINGSSTADIUM
Het drachtigheidspercentage na ET wordt ook beïnvloed door het ontwikkelingsstadium van het
getransfereerd embryo. De verschillende ontwikkelingsstadia zijn de volgende: morula, vroege
blastocyst, blastocyst en uitgekipte blastocyst (Figuur 3). Het vroegste ontwikkelingsstadium, dat kan
worden uitgespoeld, is de morula. De morula bestaat uit totipotente stamcellen. Dit zijn cellen, die op
zichzelf kunnen uitgroeien tot een volledig nieuw organisme. De morula ontwikkelt zich verder tot
blastocyst. Deze kenmerkt zich door de aanwezigheid van een holte gevuld met vocht, de blastocoele.
11
In de periferie van de blastocyst bevindt zich een celmassa, de embryoblast of kiemschijf, van waaruit
zich het embryo vormt. Het geheel wordt omgeven door de trofoblast, die het foetaal deel van de
placenta vormt. Bij een vroege blastocyst is de blastocoele nog klein en onduidelijk in tegenstelling tot
de verder ontwikkelde blastocyst (Cornillie, 2010).
Op dag 6 of 7 van de dracht wordt bij het paardenembryo een acellulair kapsel gevormd tussen de
trofoblast en de zona pellucida. Dit stevig anti-adhesief kapsel, bestaande uit glycoproteïnes, neemt,
na uitkippen van de blastocyst uit de zona pellucida, in dikte toe. De aanwezigheid van het kapsel laat
een zekere flexibiliteit van het embryo toe tijdens de migratie, fixatie en oriëntatie in de uterus
(Ginther, 1998).
Fig.3 Ontwikkelingsstadia van het paardenembryo (naar Brinsko et al., 2011).
Het ontwikkelingsstadium van het embryo is afhankelijk van de dag van spoelen postovulatoir. Bij het
uitvoeren van de uteriene spoeling op dag 6 of 7 (ovulatie op dag 0) kan het embryo zich in het morula
stadium bevinden. Een vroege spoeling op dag 6 kan ook leiden tot een vroege blastocyst. Een
vroege blastocyst, blastocyst of een uitgekipte blastocyst wordt verkregen bij spoeling op dag 7 of 8.
Terwijl een uteriene spoeling op dag 9 enkel aanleiding heeft tot een uitgekipte blastocyst (Brinsko et
al., 2011).
In de studie van Carnevale et al. (2000) werd een lager drachtigheidspercentage opgemerkt bij
transplantatie van embryo’s in het morula stadium ten opzichte van de andere ontwikkelingsstadia.
Men dacht dat het tegenvallend drachtigheidspercentage bij deze morula’s niet zozeer het gevolg was
12
van het ontwikkelingsstadium zelf, maar van een vertraagde ontwikkeling bij de embryo’s. De
embryo’s, die werden gebruikt in de studie, waren voornamelijk verkregen door uteriene spoeling op
dag 7 of 8. De kans dat 7 of 8 dagen oude embryo’s zich dan nog in het morula stadium bevinden is
klein en is eerder te wijten aan een vertraagde ontwikkeling. De vertraagde embryonale ontwikkeling
kan het gevolg zijn van een intrinsiek defect van het embryo, van een inseminatie postovulatoir, of van
een voedingsarme omgeving in de tuba uterina of de uterus van de donormerrie respectievelijk
draagmerrie. In diezelfde studie werd een hoog drachtigheidspercentage, namelijk 64,2%, bekomen
op dag 12 bij transplantatie van een vroege blastocyst. Dit ging echter gepaard met een hoog
percentage embryonale sterfte, zodat op dag 50 het drachtigheidspercentage gedaald was naar
47,7%. Hoge drachtigheidspercentages met een geringe embryonale sterfte tussen dag 12 en dag 50
werden verkregen bij transplantatie van embryo’s als (uitgekipte) blastocyst.
Er kan worden besloten dat transplantatie van embryo’s met een ontwikkelingsachterstand weinig
succesvol is. Daarentegen is het beter om, al of niet uitgekipte, blastocysten te transplanteren:
inbrengen van embryo’s in dit ontwikkelingsstadium geeft de hoogste drachtigheidspercentages en
gaat gepaard met een geringe embryonale sterfte.
3.3. GROOTTE – OUDERDOM
Een belangrijke factor, die bepalend is voor het drachtigheidspercentage na ET, is de grootte van het
embryo. De embryonale diameter heeft voornamelijk een invloed op het drachtigheidspercentage in
geval van een niet-chirurgische ET (Iuliano et al., 1985; Carney et al., 1991).
Bij een zich normaal ontwikkelend embryo is de diameter positief gecorreleerd met de ouderdom van
het embryo. Anders uitgedrukt: hoe ouder het embryo en dus hoe later de uteriene spoeling
postovulatoir plaatsgrijpt, hoe groter de embryonale diameter is (Iuliano et al., 1985). Deze theorie
gaat echter niet op voor embryo’s met een ontwikkelingsachterstand. Onderontwikkelde embryo’s, ook
wel “small-for-age” embryo’s genoemd, hebben een significant kleinere diameter dan normaal
ontwikkelde embryo’s van dezelfde leeftijd. Ginther et al. (1985) toonden aan dat deze te kleine
embryo’s
gepaard
gaan
met
een
grotere
embryonale
sterfte
en
dus
een
lager
drachtigheidspercentage. De vertraagde groei van de embryo’s werd door Willmann et al. (2011)
verklaard door de leeftijd van de donormerrie: er trad namelijk een vertraagde embryonale
ontwikkeling op bij donormerries ouder dan 8 jaar. Zoals reeds eerder aangehaald meenden
Carnevale et al. (2000) dat deze ontwikkelingsachterstand te wijten was aan een intrinsiek defect van
het embryo, een postovulatoire inseminatie of een tekort aan voeding in het geslachtsapparaat van de
donor- en draagmerrie. Kortom, om de slaagkansen bij transplantatie van een te klein embryo zo goed
mogelijk in te schatten, moet naast de leeftijd van het embryo, ook de leeftijd van de donormerrie in
acht worden genomen.
13
In de studies van Iuliano et al. (1985) en Carney et al. (1991) werd aangetoond dat ET van embryo’s
groter dan 1,7 mm overeenstemt met een lager drachtigheidspercentage ten opzichte van kleinere
embryo’s. Volgens Iuliano et al. (1985) en Stout (2003) is dit voornamelijk te wijten aan het materiaal,
aangewend voor het inbrengen van het embryo. Dit materiaal is namelijk niet aangepast voor
transplantatie van grote embryo’s: bij gebruik bestaat er een grote kans op beschadiging van het
embryo, wat gepaard gaat met een verminderde embryonale leefbaarheid. Om embryo’s, die te groot
zijn voor het transferrietje, te transplanteren, kan daarom gebruik gemaakt worden van aangepast
materiaal (Jasko, 2002). In dit geval is het drachtigheidspercentage onafhankelijk van de embryonale
diameter.
3.4. KWALITEIT
Om de embryonale kwaliteit kwantitatief uit te drukken, werd door McKinnon et al. (1988) een
scoresysteem opgesteld. Aan de hand van dit scoresysteem kan op objectieve wijze de embryonale
leefbaarheid en de kans op drachtig zijn van de draagmerrie na ET worden beoordeeld (Carney et al.,
1991). Op basis van de morfologie van het embryo wordt er een graad van 1 tot 4 toegekend (Figuur
4). Een graad 1 embryo is excellent en heeft geen morfologisch abnormaliteiten. Een embryo met
enkele kleine afwijkingen, zoals een onregelmatige vorm of enkele geëxtrudeerde blastomeren, wordt
als goed beschouwd en krijgt graad 2. Bij graad 3 embryo’s, die als matig worden bestempeld, zijn de
morfologische afwijkingen opvallend. Zo kunnen we bij deze matige embryo’s het volgende aantreffen:
degenererende cellen, een gecollabeerde blastocoele alsook geëxtrudeerde blastomeren. De minst
kwalitatieve embryo’s zijn graad 4 embryo’s, die gedegenereerd of onbevrucht zijn (Carnevale et al.,
2000; Brinsko et al., 2011).
Fig. 4 Vroege blastocyststadia met verschillende gradatie (naar Brinsko et al., 2011).
14
De kwaliteit van het embryo beïnvloedt in sterke mate het drachtigheidspercentage na ET. Algemeen
kan worden gesteld dat het drachtigheidspercentage positief gecorreleerd is met de kwaliteit van het
embryo. Dit werd aangetoond door Carney et al. (1991) en Carnevale et al. (2000): ET van graad 3 en
graad 4 embryo’s gaat duidelijk gepaard met een lager drachtigheidspercentage op dag 12 en dag 50
(ovulatie op dag 0) ten opzichte van graad 1 en graad 2 embryo’s. In dezelfde studie van Carnevale et
al. (2000) werden nauwelijks verschillen opgemerkt in de drachtigheidspercentages op dag 12 bij
gebruik van graad 1 en graad 2 embryo’s. Wel werd, bij echografisch onderzoek op dag 50,
opgemerkt dat bij graad 2 embryo’s, wegens hun minieme afwijkingen, meer embryonale sterfte
optreedt dan bij graad 1 embryo’s.
4. BEWARING VAN HET EMBRYO
Embryo’s, die als vers worden geclassificeerd, worden binnen het uur na uterusspoeling
getransplanteerd in de geschikte draagmerrie. Deze verse embryo’s kunnen gedurende een uur bij
kamertemperatuur worden bewaard in een specifiek medium, namelijk Dulbecco’s fosfaatgebufferde
zoutoplossing met 10% foetaal kalfserum (Carnevale et al., 1987; Carney et al., 1991). Indien het
embryo 6 tot 24 h in dit medium wordt bewaard bij kamertemperatuur, leidt dit tot een verminderde
drachtigheidspercentage na ET volgens Douglas (1982) en Imel (1981).
Niet alle paardenfokkers zijn in staat om een vers embryo ter plaatse te transplanteren in een
gesynchroniseerde draagmerrie. Dit komt doordat niet alle fokkers over de mogelijkheden beschikken
om draagmerries te onderhouden. In dergelijke omstandigheden is het aangewezen om het verkregen
embryo te transporteren naar een erkend station voor ET, waar er wel (synchrone) draagmerries zijn
gestald (Carney et al., 1991; Squires et al., 1999; Squires et al., 2003). Opdat de levensvatbaarheid
van het embryo niet in het gedrang komt tijdens het transport, moet deze dan ook op de correcte
manier bewaard worden. Dit kan op twee manieren: gekoeld of via cryopreservatie.
4.1. GEKOELD
4.1.1. Medium
Voor bewaring van embryo’s langer dan een uur werd vroeger voornamelijk geopteerd voor vergast
Ham’s F10 medium met 90% stikstofgas (N2), 5% koolstofdioxide (CO2) en 5% zuurstofgas (O2),
waaraan 10% foetaal kalfserum is toegevoegd (Carnevale et al., 1987; Carney et al., 1991; Squires et
al., 2003). Vanuit praktisch oogpunt gezien is de bereiding van het vergast Ham’s F10 medium in
veldomstandigheden niet ideaal. Om deze reden werd door verschillende onderzoekers naar een
alternatief bewaringsmedium gezocht. Als bewaringsmedium wordt nu gebruik gemaakt van Ham’s
F10 medium gebufferd met hydroxyethylpiperazine-ethaansulfonaat (HEPES), Embryo Holding
Solution (EmCare™) of Vigro™ Holding Plus.
In vergelijking met het vergast Ham’s F10 medium merkten Carnevale et al. (1987), bij gebruik van
HEPES gebufferde Ham’s F10 medium, een aantal verschillen op: een verminderde embryonale
kwaliteit, een tragere groei van het embryo na 24 h bewaring, en een lager drachtigheidspercentage
na transplantatie. In de studies van McCue et al. (2000) en Moussa et al. (2002) werd een vergelijking
15
gemaakt omtrent de embryonale leefbaarheid en het drachtigheidspercentage na ET tussen de
commerciële media, Embryo Holding Solution en Vigro™ Holding Plus, enerzijds en het vergast
Ham’s F10 medium anderzijds. Bewaring van embryo’s in Embryo Holding Solution of Vigro™ Holding
Plus, elk op basis van een zwitterionische buffer, ging gepaard met eenzelfde embryonale
leefbaarheid en bijgevolg gelijkaardige drachtigheidspercentages na ET.
4.1.2. Temperatuur
De uitgespoelde embryo’s, die zich in een bewaarmedium bevinden, worden afgekoeld en bewaard bij
een temperatuur van 5°C. Achtereenvolgens wordt het geheel in een geïsoleerde container (vb.
Equitaner) geplaatst, opdat het embryo goed afgeschermd wordt tegen externe factoren waaronder
licht en te koude/warme temperaturen (Carnevale et al., 1987; Carney et al., 1991; Squires et al.,
2003).
In de studie van Herrera et al. (2014) werd waargenomen dat de leefbaarheid van embryo’s, bewaard
in Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing aan 32°C gedurende een tiental uren, behouden blijft.
Verder is er weinig literatuur beschikbaar, die de invloed van bewaring van het gekoeld embryo bij
verschillende temperatuur op het drachtigheidspercentage na ET bestudeert.
4.1.3. Duur van bewaring
De
bewaringsduur
van
het
gekoeld
embryo,
opdat
de
embryonale
kwaliteit
en
het
drachtigheidspercentage na ET nauwelijks wijzigt, is afhankelijk van het gebruikt medium en de
bewaringstemperatuur.
De duur van bewaring loopt op tot 24 h wanneer het embryo bewaard wordt aan 5°C in vergast Ham’s
F10 medium, Embryo Holding Solution of Vigro™ Holding Plus. Bewaring van embryo’s in HEPES
gebufferde Ham’s F10 medium bij 5°C gedurende 24 h is ook mogelijk, maar zoals eerder vermeld
leidt dit tot lagere drachtigheidspercentages in vergelijking met de andere media (Carney et al., 1991;
Squires et al., 2003). Fleury et al. (2002) toonden aan dat transplantatie van embryo’s, bewaard in
HEPES gebufferde Ham’s F10 medium bij 15-18°C gedurende minstens 18 h, geen negatieve invloed
heeft op het drachtigheidspercentage na ET.
In het onderzoek van Carney et al. (1991) en Carnevale et al. (2000) werd aangetoond dat het
drachtigheidspercentage na transplantatie niet verschilt bij gebruik van verse embryo’s enerzijds en
embryo’s die bewaard worden in vergast Ham’s F10 medium bij 5°C gedurende 24 h anderzijds.
Kortom, er is geen verschil in embryonale leefbaarheid tussen een vers en een gekoeld embryo,
indien het embryo maximum 24 h bij 5°C bewaard wordt.
4.2. CRYOPRESERVATIE
Cryopreservatie of invriezen van embryo’s brengt verschillende voordelen met zich mee. Zo maakt het
internationaal transport van (genetisch waardevolle) embryo’s mogelijk. Daarnaast verdwijnt de nood
om voor elk gespoeld embryo een gesynchroniseerde draagmerrie direct ter beschikking te hebben.
Een ander voordeel van deze bewaringsmethode is de mogelijkheid om embryo’s, afkomstig van
waardevolle jonge merries, die zichzelf nog moeten bewijzen, te gaan bewaren in een soort van
16
donorbank voor embryo’s totdat de merries hun waarde bewezen hebben. Uiteindelijk kan
cryopreservatie ook toegepast worden om, alvorens het embryo te transplanteren, eerst na te gaan of
het embryo drager is van een genetisch defect. Hiervoor kan het embryo dan tijdelijk ingevroren
worden tot de resultaten bekend zijn (Squires et al., 2003; Stout, 2012).
Cryopreservatie van embryo’s kan op twee verschillende manieren worden toegepast. Enerzijds is er
de conventionele methode, waar het embryo traag wordt ingevroren (“slow-freezing”). Anderzijds kan
het embryo ook via vitrificatie of verglazing worden bewaard. De overlevingskansen na ontdooien van
het embryo, die via cryopreservatie wordt bewaard, zijn afhankelijk van de grootte en het
ontwikkelingsstadium van het embryo enerzijds en het gebruikte cryoprotectant anderzijds. Er moet
vermeld worden dat de embryonale leefbaarheid, en bijgevolg de drachtigheidspercentages na ET,
steeds lager is na ontdooien van ingevroren embryo’s in vergelijking met gekoelde embryo’s (Squires
et al., 2003; Stout, 2012).
4.2.1. Grootte en ontwikkelingsstadium embryo
De grootte van het embryo, en hiermee gepaard gaand het ontwikkelingsstadium, is een beperkende
factor voor cryopreservatie. In geval van vitrificatie is de grootte van het embryo van meer belang dan
wanneer het embryo traag wordt ingevroren. Zo werd door Slade et al. (1985), Eldridge-Panuska et al.
(2005), Carnevale (2006), Barfield et al. (2009) en Scherzer et al. (2011) opgemerkt dat bij traag
invriezen van grotere embryo’s de kans op dracht, na ontdooien en ET, groter was ten opzichte van
embryo’s die vitrificatie hadden ondergaan.
Enkel embryo’s in een vroeg ontwikkelingsstadium (morula, vroege blastocyst), waarvan de diameter
kleiner is dan 300 µm, kunnen ingevroren worden (Czlonkowska et al., 1985; Slade et al., 1985). Om
dergelijke embryo’s te verkrijgen, moet de uterusspoeling reeds plaatsgrijpen kort nadat het embryo
de tuba uterina heeft verlaten. De spoeling moet daarom in de loop van dag 6 (ovulatie op dag 0)
uitgevoerd worden. Indien te vroeg gespoeld, bestaat het risico dat het embryo nog aanwezig is in de
tuba uterina. Terwijl te laat spoelen eventueel leidt tot het verkrijgen van een te groot embryo voor
cryopreservatie (Stout, 2003).
Weinig embryo’s groter dan 300 µm overleven het proces van cryopreservatie. Het weinig permeabel,
acellulair kapsel, dat op dag 6 of 7 onder de zona pellucida van het paardenembryo wordt gevormd,
zou hiervoor een oorzaak zijn. Wegens de aanwezigheid van het kapsel wordt er te weinig
cryoprotectant opgenomen, waardoor de embryonale cellen onvoldoende beschermd zijn tijdens de
cryopreservatie. Hierbij wordt een positieve correlatie opgemerkt tussen de dikte van het kapsel en het
aantal dode embryonale cellen na cryopreservatie (Squires et al., 1999).
4.2.2. Cryoprotectant
Bij het invriezen van embryo’s is het van belang een cryoprotectant aan het medium toe te voegen.
Indien dit niet gebeurt, overleeft het embryo het invriesproces niet. Gedurende het invriezen van het
embryo worden er zowel intra- als extracellulair kleine ijskristallen gevormd. Tijdens het ontdooien
treedt er rekristallisatie op, waarbij de kleine ijskristallen versmelten tot grotere ijskristallen met cellyse
17
tot gevolg. Om de embryonale cellen hiertegen te beschermen, wordt een cryoprotectant toegevoegd
aan het medium. Dit cryoprotectant wordt opgenomen door de embryonale cellen, waardoor het zich
zowel intra- als extracellulair bevindt. De cryoprotectieve stof verhindert dat het embryo wordt
beschadigd door de gevormde ijskristallen (Stout, 2012; Oldenhof et al., 2013).
Het cryoprotectant, dat het meest aangewend wordt bij de cryopreservatie van embryo’s, is glycerol.
Toevoeging van glutamine aan glycerol zou volgens Lagneaux et al. (2000) gepaard gaan met een
verminderd aantal dode embryonale cellen en een hoger drachtigheidspercentage na ET.
Door verschillende onderzoekers werd er naar alternatieven gezocht voor glycerol. Zowel 1,2propanediol, ethyleenglycol, methanol en dimethylsulfoxide hebben een minder beschermend
vermogen dan glycerol en zijn dus geen goede alternatieven (Meira et al., 1993; Young et al., 1997;
Bass et al., 2004; Stout, 2012).
4.2.3. Techniek
4.2.3.1.
Slow-freezing
Bij “slow-freezing” wordt het embryo stapsgewijs blootgesteld aan het cryoprotectant. Hiervoor wordt
het embryo in oplossingen, met toenemende concentratie aan het cryoprotecant, ondergedompeld.
Uiteindelijk volgt de gecontroleerde koeling van het embryo in verschillende stadia met behulp van
vloeibaar stikstof. Een gebruikt “slow-freezing” programma is het volgende: koeling aan 4°C per min
van kamertemperatuur tot - 6°C, 15 min rust aan - 6°C om vervolgens te koelen aan 0,3°C per min tot
- 30°C. Met een koelsnelheid van 0,1°C per min wordt het embryo gekoeld tot aan - 33°C. Verdere
koeling tot - 196°C gebeurt door het embryo daarna onder te dompelen in vloeibare stikstof (Slade et
al., 1985; Moussa et al., 2005; Stout, 2012).
Het is van belang de correcte koelsnelheid te hanteren. Indien het embryo namelijk te snel wordt
afgekoeld, kan dit gepaard gaan met letale intracellulaire kristalvorming. Te traag afkoelen is ook geen
optie, want dit gaat gepaard met erge dehydratie van het embryo (Stout, 2012).
Een nadeel aan deze methode is dat het lang duurt: ongeveer 2,5 h. Als alternatief kan de veel
snellere methode voor invriezen, namelijk vitrificatie, verkozen worden (Stout, 2012).
4.2.3.2.
Vitrificatie
Bij vitrificatie wordt het embryo zeer snel ingevroren. Er treedt hierbij een directe overgang op van een
vloeibare naar een vaste, glasachtige fase zonder ijskristalvorming. Opdat het embryo voldoende
beschermd is tegen de snelle afkoeling, moet er vier tot vijf maal meer cryoprotectant worden
aangewend ten opzichte van “slow-freezing” (Stout, 2012).
Het embryo, dat zich in een rietje bevindt, wordt ondergedompeld in vloeibaar stikstof. Op deze manier
wordt het embryo aan een snelheid van 2500°C per min ingevroren (Stout, 2012). Deze
invriessnelheid is acht maal hoger (20000°C per min) indien gebruik gemaakt wordt van de “openpulled straw” (OPS) techniek. De rietjes, die bij deze techniek worden aangewend, worden eerst verhit
om ze daarna uit te rekken totdat een inwendige diameter van 0,8 mm en een wanddikte van 0,07 mm
verkregen wordt. Nadat de rietjes aan de lucht zijn afgekoeld, worden ze met een scheermesje ter
hoogte van hun smalste punt doorgesneden. Via het capillair effect wordt het embryo, samen met
18
cultuurmedium en cryoprotectant, opgezogen in het rietje. Uiteindelijk wordt het rietje met zijn smalste
uiteinde ondergedompeld in vloeibaar stikstof (Vajta et al., 1998). Het voordeel aan de OPS-techniek
is het gebruik van een lagere concentratie aan cryoprotectant, dat in te hoge concentraties toxisch
blijkt te zijn (Stout, 2012).
Zoals reeds eerder vermeld is cryopreservatie van embryo’s groter dan 300 µm weinig succesvol.
Choi et al. (2011) hebben echter een techniek ontwikkeld, waardoor vitrificatie van blastocysten met
een diameter tot 650 µm mogelijk is. Bij deze vitrificatiemethode wordt eerst het kapsel van het
embryo gepuncteerd met een micromanipulator, waarna het embryo aan vitrificatie wordt
onderworpen. Wegens de punctie van het kapsel treedt er een collaps op van de blastocoele. Bij
gebruik
van
deze
techniek
werden
normale
drachtigheidspercentages
verkregen
van
gecryopreserveerde embryo’s.
4.2.3.3.
Conclusie
Bij cryopreservatie van embryo’s met een diameter kleiner dan 300 µm is er geen verschil in
embryonale leefbaarheid tussen de “slow-freezing” methode en de vitrificatietechniek (Hochi et al.,
1995). Daarnaast werd in de studie van Moussa et al. (2005) opgemerkt dat er geen verschil in
embryonale leefbaarheid was bij aanwenden van de OPS-techniek ten opzichte van “slow-freezing”.
Aangezien vitrificatie sneller en goedkoper is in vergelijking met “slow-freezing”, en wegens
bovenstaande bevindingen, kan worden besloten dat vitrificatie een goed alternatief is voor “slowfreezing” van embryo’s (Stout, 2012).
5. DRAAGMERRIE
De belangrijkste component binnen ET is zonder twijfel de draag- of receptormerrie. Omwille van deze
reden moet er veel aandacht worden besteed aan de verzorging en opvolging van deze merries. Op
het moment van ET wordt de meest geschikte draagmerrie geselecteerd, zich baserend op
verschillende factoren. Van primordiaal belang is de synchroniteit tussen donor- en draagmerrie.
Andere factoren met betrekking tot de draagmerrie, die eventueel een rol spelen, zijn: de leeftijd, het
ras, de reproductieve voorgeschiedenis, de toestand van de genitaaltractus en de conditiescore.
5.1. TYPE
5.1.1. Leeftijd
In geval van een conventionele dracht beïnvloedt de leeftijd van de merrie duidelijk de
drachtigheidspercentages. Carnevale en Ginther (1992) toonden met hun studie aan dat dracht bij
oude merries (≥ 15 jaar) gepaard gaat met lagere drachtigheidspercentages en meer embryonale
sterfte ten opzichte van jonge merries (5-7 jaar). Men veronderstelde dat deze lagere reproductieefficiëntie bij oudere merries te wijten is aan een verminderde contractiliteit van het myometrium, een
hogere incidentie van endometritis en de aanwezigheid van intra-uterien ontstekingsexsudaat.
Ondanks deze bovenstaande bevindingen omtrent de invloed van de leeftijd van de merrie op de
drachtigheidspercentages bij een conventionele dracht, werd door Carnevale et al. (2000) geen
19
significante verschillen in drachtigheidspercentage na ET opgemerkt tussen draagmerries behorend
tot een verschillende leeftijdsgroep. In diezelfde studie waren de drachtigheidspercentages op dag 50
na ET 58,7% en 51,7% voor draagmerries van 2-9 jaar respectievelijk 10-18 jaar. Er moet echter
vermeld worden dat de draagmerries aan een strenge selectie werden onderworpen, waardoor
voornamelijk draagmerries zonder abnormaliteiten ter hoogte van het geslachtsstelsel aan het
onderzoek deelnamen. Daarnaast hadden de draagmerries, in de leeftijdsgroep van 10-18 jaar, een
gemiddelde leeftijd van 12 jaar, waarbij slechts enkelen ouder waren dan 15 jaar. Dit heeft tot gevolg
dat er in dit onderzoek geen uitspraken mogen worden gemaakt over de invloed van de leeftijd van de
draagmerrie op de drachtresultaten na ET.
5.1.2. Type paard
Met het type paard wordt bedoeld: is de draagmerrie een paard of pony? Er is weinig literatuur
beschikbaar omtrent de invloed van het type paard, dat dienst doet als draagmerrie, op de
drachtigheidspercentages na ET. Wel werd door Stout (2006) vermeld dat een sterk verschil in de
genetische grootte van het embryo en de grootte van de draagmerrie gevolgen heeft voor de intrauteriene en postnatale ontwikkeling: het beïnvloedt de mature grootte van het veulen, maar het kan
ook aanleiding geven tot een verhoogd risico op intra-uteriene of postnatale sterfte. Deze discrepantie
in grootte, die bestaat bij het inbrengen van een paardenembryo in de uterus van een pony, kan dus
aanleiding geven tot een lager drachtigheidspercentage na 11 maanden dracht. Daarnaast beïnvloedt
de ontwikkeling van een paardenembryo in een pony ook de expressie van bepaalde genen (Peugnet
et al., 2013). Zo treedt er een verminderde genexpressie van onder andere de genen, die coderen
voor insuline-achtige groeifactor 2 (IGF-2), IGF-2 receptor en glucose transporter 1 (GLUT-1).
5.1.3. Reproductieve voorgeschiedenis
De reproductieve voorgeschiedenis (pariteit) van de draagmerrie wordt in verschillende bronnen
aangehaald als één van de invloedsfactoren, die het succes van ET bepalen (Sertich, 1989; Foss et
al., 1999; Camargo et al., 2013). Er is echter nog geen literatuur voorhanden, waarin de invloed van
de reproductieve voorgeschiedenis van de draagmerrie op het drachtigheidspercentage na ET wordt
onderzocht.
5.1.4. Toestand genitaaltractus
Tot de genitaaltractus van de merrie behoren de vulva, het vestibulum, de vagina, de uterus, de tubae
uterinae en de ovaria. Pathologische afwijkingen in morfologie en fysiologie ter hoogte van de
genitaaltractus van de draagmerrie op moment van ET, zoals een verminderde uteriene tonus of
abnormale
uteriene
omgeving,
kunnen
aanleiding
geven
tot
veranderingen
in
het
drachtigheidspercentage na ET. Zo waren in het onderzoek van Carnevale et al. (2000) de
drachtigheidspercentages na ET lager en trad er meer embryonale sterfte op bij draagmerries met een
lage tot matige uteriene tonus ten opzichte van een hoge uteriene tonus. De uteriene tonus staat in
verband met de serumconcentratie aan progesteron. Zo werd een lagere serumconcentratie aan
progesteron gevonden bij draagmerries met een inefficiënte uteriene tonus ten opzichte van een hoge
20
uteriene tonus (Carnevale et al., 2000). De lagere progesteronconcentraties in het bloed leiden niet
alleen tot een verminderde uteriene tonus, maar zorgen daarbij ook voor een mindere kwalitatieve
uteriene omgeving voor de ontwikkeling van het embryo. Volgens Ball et al. (1987) zou een afwijkende
uteriene omgeving (chronische endometritis, periglandulaire fibrose) het drachtigheidspercentage niet
beïnvloeden bij inbrengen van een normaal gezond embryo.
Zoals reeds eerder vermeld leidt toediening van progestagenen tot een algemene ondersteuning van
de embryonale ontwikkeling. De exogene progestagenen zullen wel zorgen voor een toename van de
uteriene tonus, maar deze bieden geen oplossing voor de chronische endometritis noch voor de
periglandulaire fibrose, die eventueel aanwezig is.
5.1.5. Conditiescore
In verschillende onderzoeken wordt de conditiescore (BCS) van de draagmerrie weergegeven (Kelley
et al., 2011; Camargo, 2013). De BCS van een merrie moet goed zijn om als draagmerrie dienst te
doen (Stout, 2006). Er is echter nog geen literatuur voorhanden, die de invloed van de BCS van de
draagmerrie op het drachtigheidspercentage na ET beschrijft.
5.2. SYNCHRONISATIE DRAAGMERRIE
Eén van de belangrijkste factoren, die het succes van ET beïnvloedt, is de synchronisatie tussen
donor- en draagmerrie wat betreft het moment van ovulatie. Draagmerries, die 1 dag vόόr (+ 1) tot 3
dagen na (- 3) de donormerrie ovuleren, zijn het meest geschikt. Het is aangewezen om per
donormerrie meerdere draagmerries voorhanden te hebben, opdat er zeker één draagmerrie ovuleert
rond de periode van de ovulatie van de donormerrie (Jacob et al., 2012).
Vandaag de dag worden hormonen toegediend om een nauw tijdsvenster tussen de ovulatie van de
donor- en draagmerrie te bekomen. Een mogelijke synchronisatietherapie is een tien dagen durende
therapie met progesteron, startend bij de donormerrie en één tot twee dagen later bij de draagmerrie.
De donor- en draagmerrie bevinden zich bij de start van de therapie in anoestrus en bezitten geen
preovulatoire follikels ter hoogte van de ovaria. Op de laatste dag van de therapie worden beide
merries met een prostaglandineanaloog geïnjecteerd, opdat luteolyse van het ontwikkelde corpus
luteum optreedt. Een minder complexe synchronisatietherapie is de injectie van PGF2α bij de
donormerrie en één tot twee dagen later bij de draagmerrie (Allen, 2005).
De synchroniteit, omtrent het moment van ovulatie, tussen donor- en draagmerrie kan op twee
manieren geïnterpreteerd worden: enerzijds als het aantal dagen dat de draagmerrie is geovuleerd en
anderzijds als de mate van synchroniteit tussen donor- en draagmerrie.
5.2.1. Dagen geovuleerd draagmerrie
Naargelang de dag na ovulatie (ovulatie op dag 0), waarop het embryo wordt getransplanteerd,
kunnen de drachtuitkomsten verschillend zijn. Dit wordt weergegeven in Tabel 2 (zie bijlagen). In de
studie van Jacob et al. (2012) werden hogere drachtuitkomsten bekomen indien de ET plaatsgreep op
dag 3-5. Hetzelfde drachtigheidspercentage werd bekomen door Carnevale et al. (2000) bij ET op dag
21
6. Wanneer de ET zeer vroeg postovulatoir plaatsgreep, namelijk op dag 2, bekwamen Jacob et al.
(2012) een drachtigheidspercentage van slechts 33%. In beide studies is er een afname van de
drachtuitkomsten bij ET vanaf dag 7. Dezelfde dalende trend in drachtigheidspercentages kwam voor
in het onderzoek van Sertich (1989).
Een mogelijke reden voor het verband tussen het aantal dagen geovuleerd op het ogenblik van ET en
het drachtigheidspercentage is het verschil in progesteroninvloed op de conditie van de uterus op
moment van ET. Het progesteronhormoon, afkomstig van het corpus luteum, is van belang tijdens de
dracht en staat in voor de mobiliteit, fixatie, oriëntatie en overleving van het embryo (Kastelic et al.,
1987). Zowel bij dracht als niet-dracht is er een gelijk verloop van de serumconcentratie aan
progesteron gedurende de eerste 14 dagen van de oestrische cyclus (Brinsko et al., 2011). Sevinga et
al. (1999) merkten op dat de progesteronconcentraties op dag 8 en 9 lager waren bij niet-drachtige ten
opzichte van drachtige merries. Men suggereert dat dit verschil geassocieerd is met de fysiologische
veranderingen van dracht, die plaatsgrijpen vόόr dag 8. Doordat de uterus van een draagmerrie, die
op dag 9 voor ET wordt aangewend, onder lagere progesteroninvloed staat ten opzichte van een
drachtige merrie op dag 9, is het uterien milieu onvoldoende voorbereid om een dracht na ET in stand
te kunnen houden (Carnevale et al., 2000). Baserend op de resultaten van het onderzoek van
Carnevale et al. (2000) en Jacob et al. (2012) verdient het de voorkeur het embryo te transplanteren in
de draagmerrie tussen dag 3 en dag 6. In deze tijdspanne is de uteriene omgeving van de
draagmerrie voldoende voorbereid door de inwerking van progesteron om het embryo te ontvangen.
5.2.2. Mate van sychroniteit draagmerrie versus donormerrie
McKinnon et al. (1988) stelden vast dat de hoogste drachtigheidspercentages verkregen worden
wanneer de draagmerrie 1 dag vroeger (+ 1) tot 3 dagen later (- 3) dan de donormerrie ovuleert. Door
gebruik te maken van dit nauw tijdsvenster moeten per donormerrie veel draagmerries worden
opgevolgd. Dit heeft als doel ten minste één geschikte draagmerrie te hebben op het moment de
donormerrie ovuleert. Het aanhouden van meerdere draagmerries per donormerrie gaat gepaard met
een toename van de kostprijs van de transplantatie ten gevolge van de extra arbeid, stalling en
voeding voor elke bijkomende draagmerrie (Jacob et al., 2012).
Het tijdsvenster voor sychroniteit kan echter verruimd worden. Zo werd in de studie van Jacob et al.
(2012) geen significante verschillen in drachtigheidspercentage opgemerkt wanneer de draagmerrie 1
dag vroeger (+ 1) tot 5 dagen later (- 5) dan de donormerrie was geovuleerd. Een asychroniteit van - 6
ging wel gepaard met een significante daling van het drachtigheidspercentage. In een studie van
Wilsher en Allen (2009) werden dag 10 embryo’s getransplanteerd in draagmerries, die pas drie
dagen geovuleerd waren. Er is dus sprake van een asynchroniteit tussen donor- en draagmerrie van 7. Ondanks dit grote verschil ontwikkelden drie van de acht getransplanteerde embryo’s zich tot
embryo’s met een hartslag. In een daaropvolgende studie toonden Wilsher et al. (2010) aan dat
transplantatie van dag 10 embryo’s naar een draagmerrie met een asynchroniteit van + 2 tot - 6
gepaard gaat met drachtigheidspercentages gaande van 63 tot 100%. Transplantatie van dag 10
22
embryo’s naar + 4 en - 9 recipiënten resulteerde niet in dracht. Opmerkelijk was dat in beide studies
de embryonale ontwikkeling initieel normaal, maar vertraagd was. Er werd opgemerkt dat de
embryonale ontwikkeling, maar ook de vroege placentatie van de getransplanteerde embryo’s,
voornamelijk beïnvloed werd door het uterien milieu en niet zozeer door de leeftijd van het embryo.
Wilsher en Allen (2009) vermoedden dat de maximum grenzen van asynchroniteit bij de merrie
voornamelijk bepaald worden door de samenstelling van het uterien milieu, dat onder meer bepaald
wordt door de serumconcentraties aan progesteron. Uit deze resultaten kan geconcludeerd worden
dat dag 10 embryo’s over een betere resistentie beschikken tegenover een asynchrone overplanting
ten opzichte van jongere embryo’s. Waardoor bij aanwenden van dag 10 embryo’s voor een breder
tijdsvenster kan worden geopteerd.
6. BEÏNVLOEDENDE FACTOREN OP DE EMBRYOPRODUCTIE
6.1. SUPEROVULATIE
Van nature uit heeft de merrie meestal maar één ovulatie per oestrische cyclus. Het aantal ovulaties
per cyclus is afhankelijk van het seizoen en het ras. Zo komen multipele ovulaties frequenter voor bij
Europese Warmbloed paarden ten opzichte van de traditionele Amerikaanse rassen (Sertich, 1989).
Het onvermogen om multipele ovulaties bij de donormerrie te induceren is een limiterende factor in de
aanwending van ET bij het paard (Allen, 2005; Hinrichs, 2013). Dit in tegenstelling tot de meeste
andere diersoorten zoals het rund, het schaap en het varken. Oorzaken, voor het weinige succes van
de inductie van superovulatie bij de merrie, zijn: een lagere concentratie aan receptoren voor eCG ter
hoogte van het ovarieel weefsel ten opzichte van andere diersoorten en het feit dat de ovulatie van
follikels beperkt is tot de ovulatiegroeve (Allen, 2005).
Om superovulatie bij de donormerrie te verkrijgen kan gebruik gemaakt worden van een extract, dat
voornamelijk FSH bevat. Bij verschillende onderzoekers gaf gebruik van FSH-extract aanleiding tot 27 ovulaties per cyclus (Wade et al., 1987; Squires et al., 1999; Alvarenga et al., 2001; Allen, 2005).
Alvarenga et al. (2001) merkten op dat de toename van het aantal uitgespoelde embryo’s minder sterk
uitgesproken was naarmate het aantal ovulaties per cyclus groter werd. Dit was vermoedelijk ten
gevolge van een mindere kwaliteit van de oöcyten, die na ovulatie in de tuba uterina terecht komen.
Squires et al. (1987) merkten op dat bij gebruik van embryo’s, afkomstig van merries waarbij
superovulatie is geïnduceerd, er geen invloed was op het drachtigheidspercentage na ET.
Alternatieve therapieën om superovulatie bij de merrie te induceren, al of niet effectief, zijn toediening
van eCG, GnRH, porcien FSH (pFSH), inhibine vaccin of desloreline acetaat. Gebruik van eCG en
GnRH zijn niet effectief om superovulatie bij de merrie te induceren (Squires et al., 2003). Porcien
FSH daarentegen leidt bij toediening van een hoge dosis tweemaal daags tot gemiddeld 1,4 ovulaties
per cyclus (Squires et al., 1986). Wegens de teleurstellende resultaten, die verkregen worden met
pFSH, wordt dit hormoon commercieel ook niet aangewend. Met inhibine vaccins kunnen ook
multipele ovulaties worden verkregen, maar wegens de neveneffecten (anafylactische reacties,
abcesvorming) worden deze vaccins niet gebruikt (Squires et al., 1999). Nagao et al. (2012) merkten
23
op dat gebruik van het synthetische desloreline acetaat effectief is om dubbele ovulaties bij de merrie
te induceren.
6.2. SEIZOEN
Zoals reeds eerder vermeld hebben paarden een seizoensgebonden poly-oestrische cyclus. Bij
paarden, levend in het noordelijk halfrond, is de natuurlijke voortplantingsperiode van april tot
september (Hughes et al., 1975).
In het onderzoek van Koblischke et al. (2008) werd een groter percentage positieve spoelingen
bekomen tijdens het voortplantingsseizoen ten opzichte van deze buiten het voortplantingsseizoen.
Positieve spoelingen zijn spoelingen, waarbij één of meerdere embryo’s uit de uterus worden
gespoeld. Bij Iuliano en Squires (1985) werden grotere percentages positieve spoelingen bekomen
tijdens het voortplantingsseizoen indien de embryospoeling vόόr één augustus plaatsgreep in plaats
van na één augustus.
6.3. HENGST – AANGEWEND SPERMA
In de voortplanting van het paard kan gekozen worden voor de natuurlijke dekking en voor KI.
Vandaag de dag gaat de voorkeur naar KI. De hoofdreden hiervoor is om de overdracht van
geslachtsziekten (van hengst naar merrie en omgekeerd) te beperken (Aurich, 2011).
Verschillende factoren, die geassocieerd zijn met het sperma, hebben indirect een invloed op de
slaagkans van de ET. Het gebruikte sperma beïnvloedt namelijk het percentage positieve spoelingen.
Dit percentage wordt in sterke mate bepaald door de kwaliteit en kwantiteit van het sperma. Zowel de
seminale kwaliteit als kwantiteit varieert tussen hengsten onderling, maar ook individueel kan er een
sterke variatie optreden. Zoals aangehaald door Johnson et al. (1997) is de hoeveelheid en
samenstelling van het sperma afhankelijk van de leeftijd, het ras, de voeding, het seizoen, het aantal
keer dekken per tijdseenheid en de intensiteit van de seksuele prikkeling.
Uit verschillende studies blijkt dat gebruik van vers sperma gepaard gaat met hogere
drachtigheidspercentages en bijgevolg meer positieve spoelingen in vergelijking met gekoeld of
diepvriessperma (Squires et al., 1982; Stout, 2003; Squires et al., 2003; Vazquez et al., 2010).
Gebruik van vers sperma gaf in de studie van Meadows et al. (2000) aanleiding tot een embryoopbrengst van 88%. Terwijl voor zowel gekoeld als diepvriessperma dit slechts 47% bedroeg.
Aangezien een zo hoog mogelijk percentage positieve spoelingen wordt beoogd, wordt er, indien
mogelijk, best gekozen voor inseminatie met vers sperma.
6.4. KEUZE VAN DE DONORMERRIE
6.4.1. Reproductieve voorgeschiedenis
Vaak worden merries met een slechte reproductieve voorgeschiedenis aangewend als donormerrie.
Deze merries zijn vaak niet in staat om een veulen op de natuurlijke wijze of via KI te verkrijgen
(Squires et al., 2003). Dergelijke merries hebben een laag percentage positieve spoelingen ten
24
gevolge van verhoogde embryonale sterfte of een pathologie ter hoogte van de uterus of de eileiders
(Ball et al., 1989; Foss et al., 1999).
6.4.2. Leeftijd
De leeftijd van de donormerrie heeft een invloed op het percentage positieve spoelingen en op het
drachtigheidspercentage na ET. Vogelsang en Vogelsang (1989), Meadows et al. (2000) en Uliani et
al. (2010) toonden aan dat het percentage positieve spoelingen alsook het drachtigheidspercentage
na ET afnamen in functie van de leeftijd van de donormerrie. Als drempelwaarde voor de leeftijd van
de donormerrie wordt 15 jaar vooropgesteld. Zo vertonen donormerries ouder dan 15 jaar een
verminderd percentage positieve spoelingen. Daarnaast geven de embryo’s, afkomstig van deze
oudere donormerries, ook aanleiding tot een lager drachtigheidspercentage en een hoger percentage
drachtverlies (Uliani et al., 2010). In tegenstelling tot deze bevindingen merkten Carney et al. (1991)
net geen verschil op in de embryonale kwaliteit en drachtigheidspercentages na ET ten opzichte van
de leeftijd van de donormerrie.
Een mogelijke reden voor de negatieve correlatie tussen de donormerries leeftijd en het verminderd
drachtigheidspercentage na ET is een vertraagde embryonale ontwikkeling. Een mogelijke verklaring
voor deze vertraagde embryonale ontwikkeling bij ouder wordende merries is de afname van de
folliculaire activiteit ter hoogte van de ovaria alsook van de kwaliteit van de oöcyt (Vanroose et al.,
2000). Willmann et al. (2011) stelden vast dat een hogere leeftijd van de merrie (> 8 jaar) gepaard
gaat met een vertraagde ontwikkeling van het embryonale vesikel in zijn eerste levensdagen.
Uiteindelijk trad er een normalisatie van de embryonale ontwikkeling op, waarna de dracht à terme
verliep. Echter bij Morris en Allen (2002) werd een vertraagde embryonale ontwikkeling in verband
gebracht met een toename van de embryonale sterfte.
Ball et al. (1989) veronderstelden dat het hoger percentage embryonale sterfte, dat optreedt na
transplantatie van embryo’s afkomstig van oudere donormerries (19,4 ± 1 jaar), het gevolg zou zijn
van embryonale defecten. Volgens hen zouden dergelijke defecten eigen kunnen zijn aan het embryo
of ontstaan zijn onder invloed van omgevingsfactoren aanwezig in de tuba uterina van de oudere
donormerrie. Zo bleek uit de studie van Ball et al. (1989) dat niet alleen een wijziging in morfologische
eigenschappen van het embryo oorzaak was van de verhoogde embryonale sterfte: er trad meer
embryonale sterfte op van embryo’s met gradatie 2 tot 3 (goed tot matig) afkomstig van oude,
subfertiele merries ten opzichte van embryo’s met eenzelfde gradatie afkomstig van jongere, normaal
fertiele merries. Kortom, ook de leeftijd van de donormerries heeft een invloed op het percentage
embryonale sterfte.
6.4.3. Tijdstip uterusspoeling postovulatoir
Om het embryo, dat zich ontwikkelt in de donormerrie, te verkrijgen is het van belang om na dag 6
(ovulatie op dag 0) de uterus te spoelen. Zo werd door Battut et al. (1998) aangetoond dat het embryo
de uterus bereikt tussen dag 6 en 6,5. Vόόr dag 6 bevindt het embryo zich nog in de tuba uterina,
waar deze door de spoelvloeistof niet wordt bereikt. Zoals reeds eerder vermeld bepaalt de dag van
spoeling postovulatoir de leeftijd en hiermede geassocieerd de grootte en het ontwikkelingsstadium
25
van het embryo. Zoals hierboven reeds aangehaald, bepalen de grootte en het ontwikkelingsstadium
van het embryo mede het drachtigheidspercentage na ET (Carnevale et al., 2000).
Meadows et al. (2000) merkten dat het transport van het embryo in de tuba uterina en de embryonale
ontwikkeling bij merries ouder dan 13 jaar vertraagd was. Wegens deze bevinding zou het beter zijn
om bij oudere donormerries de uterus op dag 8 of 9 te spoelen (Squires et al., 1999). Hierdoor is de
kans op aanwezigheid van het embryo in de uterus groter alsook zijn de uitgespoelde embryo’s verder
ontwikkeld.
6.4.4. Sport – Inspanning
Eén van de doelgroepen voor ET zijn merries, die deelnemen aan wedstrijden voor dressuur, jumping,
polo of andere prestaties (Squires et al., 2003). Deze atletische donormerries verschillen van nietatletische donormerries wegens het beschikken over een goede conditie. Ondanks de aanwezigheid
van een grotere ovariële arteriële bloedvloei, die optreedt bij sportpaarden vόόr de ovulatie (Kelley et
al., 2010), was er in de studie van Pessoa et al. (2011) geen verschil in embryoproductie tussen de
atletische donormerries en de niet-atletische donormerries. De bevindingen zijn anders wanneer het
effect van inspanning op de embryo-opbrengst wordt nagegaan bij niet-atleten. Mortensen et al.
(2009) merkten namelijk dat het percentage positieve spoelingen lager was bij niet-atletische merries,
die aan een trainingsschema werden onderworpen, ten opzichte van niet-atletische merries op rust.
Hittestress, die optreedt ten gevolge van inspanning, is een mogelijke verklaring voor de verminderde
fertiliteit. Stress gaat gepaard met een vrijstelling aan glucocorticosteroïden. In de studie van Kelley et
al. (2011) werd bij de niet-atletische merries na inspanning een stijging in cortisolconcentratie gezien.
Deze gestegen cortisolwaarden gaven aanleiding tot lagere concentraties aan LH ten opzichte van
merries op rust. Het LH staat in voor de stimulatie van de follikelrijping, de ovulatie en de luteïnisatie
van het corpus luteum (Cunningham en Klein, 2007). De gebrekkige LH-concentratie, die optreedt bij
niet-atletische merries onder hittestress secundair aan inspanning, zou dus verantwoordelijk kunnen
zijn voor het lagere percentage positieve spoelingen.
Seiranen et al. (2011) toonden aan dat bij de atletische merries het moment van inspanning ten
opzichte van de bevruchting bepalend is voor de vruchtbaarheid. Kortom, er kan worden gesteld dat
bij atletische merries inspanning vόόr de bevruchting een positieve invloed heeft op het
drachtigheidspercentage. Hierbij is het drachtigheidspercentage hoger naarmate de inspanning korter
vόόr de bevruchting werd geleverd. Een verklaring hiervoor is niet gekend. Daarnaast werd opgemerkt
dat
het
leveren
van
een
inspanning
na
de
bevruchting
net
nadelig
was
voor
het
drachtigheidspercentage. Mogelijks zorgt de toename in lichaamstemperatuur, die optreedt bij
inspanning, tot een beschadiging van het aanwezige embryo (Mortensen et al., 2009). Een andere
mogelijke verklaring, volgens Seiranen et al. (2011), is dat de merrie reeds niet meer drachtig is bij de
start van de periode van inspanning. Anders gesteld: de inspanning na de bevruchting zou niet de
oorzaak zijn voor het lager drachtigheidspercentage.
26
BESPREKING
Sinds de eerste toepassing van embryotransplantatie bij de merrie, is de techniek enorm geëvolueerd.
Met het oog op een verbetering van de drachtuitkomsten, wordt er veel onderzoek gedaan naar
mogelijke invloedsfactoren op het drachtigheidspercentage na embryotransplantatie. Voor de hand
liggende factoren zijn: de transplantatiemethode, de synchronisatie van donor- en draagmerrie, en de
embryonale kwaliteit. Opvallend is dat toediening van progestagenen en NSAID’s de drachtuitkomst
na embryotransplantatie ook kunnen beïnvloeden.
In de beginperiode van embryotransplantatie bij de merrie worden hogere drachtigheidspercentages
bekomen bij het gebruik van de chirurgische methode ten opzichte van de niet-chirurgische methode
(Castleberry et al., 1980; Iuliano et al., 1985; Carnevale et al., 2000; Wilsher en Allen, 2004).
Ondertussen zijn de drachtigheidspercentages, bekomen met de chirurgische en niet-chirurgische
methode, gelijk aan elkaar. Drachtigheidspercentages van 80% en meer zijn niet meer ongewoon voor
de niet-chirurgische methode (Losinno et al., 2000; Jasko, 2002; Wilsher en Allen, 2004; Jacob et al.,
2012). Om dergelijke drachtresultaten te verkrijgen, moet er strikt aseptisch te werk worden gegaan bij
het manipuleren en inbrengen van het embryo. Hoe meer ervaring de uitvoerende dierenarts heeft,
hoe hoger de bekomen drachtigheidspercentages (Squires et al., 1982; Iuliano et al., 1985).
Belangrijk bij embryotransplantatie is de synchronisatie van donor- en draagmerrie omtrent het
moment van ovulatie. Aanvankelijk werd een tijdsvenster van + 1 tot - 3 gecorreleerd met de hoogste
drachtigheidspercentages (McKinnon et al., 1988). Jacob et al. (2012) toonden aan dat een verruiming
van het tijdsvenster met twee dagen, van + 1 tot - 5, gepaard gaat met gelijkaardige
drachtigheidspercentages. Het gebruik van een breder tijdsvenster is economisch voordeliger, omdat
er minder draagmerries per donormerrie moeten worden aangehouden vooraleer een geschikte
draagmerrie gevonden wordt.
Logischerwijs
hebben
factoren,
eigen
aan
het
embryo,
ook
een
invloed
op
het
drachtigheidspercentage na embryotransplantatie. Wegens de positieve correlatie tussen de
embryonale kwaliteit en het drachtigheidspercentage leidt de transplantatie van graad 1 embryo’s tot
de hoogste drachtigheidspercentages (Carnevale et al., 2000). Samen met de embryonale kwaliteit
moet ook de embryonale diameter worden beoordeeld. De diameter van het embryo moet hierbij
steeds worden gecorreleerd met de leeftijd en bijgevolg het ontwikkelingsstadium van het embryo.
Embryo’s kunnen er namelijk morfologisch normaal uitzien (graad 1) en tegelijkertijd onderontwikkeld
zijn. Transplantatie van deze “small-for-age” embryo’s kenmerkt zich door een grotere embryonale
sterfte en bijgevolg een lager drachtigheidspercentage ten opzichte van transplantatie van normaal
ontwikkelde embryo’s (Ginther et al., 1985).
Het is aan te raden progestagenen toe te dienen aan draagmerries, die ouder zijn (> 8 jaar) of een
voorgeschiedenis van embryonale sterfte hebben. De exogene progestagenen ondersteunen namelijk
de embryonale ontwikkeling, waardoor er minder risico is op embryonale sterfte bij deze merries
(Willmann et al., 2011). Gebruik van NSAID’s bij de draagmerrie kunnen ook een invloed hebben op
de drachtuitkomsten na embryotransplantatie. NSAID’s worden aangewend ter inhibitie van de
PGF2α-vrijstelling en/of de trauma geïnduceerde, steriele ontstekingsreactie, die kan optreden door
27
het niet-chirurgisch inbrengen van het embryo. De bevindingen omtrent het gebruik van NSAID’s bij de
draagmerrie na inbrengen van het embryo zijn verdeeld. Gebruik van flunixine meglumine bij de
draagmerrie
gaf
in
de
studie
van
Panzani
et
al.
(2009)
geen
verbetering
van
het
drachtigheidspercentage, terwijl Koblischke et al. (2010) een duidelijke toename van het
drachtigheidspercentage opmerkten. Er moet opgemerkt worden dat de merries, bij aanvang van de
studie van Koblischke et al. (2010), vrij waren van genitale aandoeningen. De toestand van het
genitaal stelsel, bij de merries in de studie van Panzani et al. (2009), was onbekend. Aanwezigheid
van merries met genitale afwijkingen, waarop NSAID’s geen invloed hebben, kan een eventuele
verklaring zijn waarom de toediening van flunixine meglumine in het onderzoek van Panzani et al.
(2009) geen invloed had op het drachtigheidspercentage.
Bijzonder is de invloed van het type paard (paard of pony) op de drachtresultaten en meer bepaald op
het veulenpercentage na embryotransplantatie. Het inbrengen van een embryo, afkomstig van een
paard, in een pony gaat gepaard met een lager drachtigheidspercentage ten opzichte van inbrengen
van hetzelfde embryo in een paard (Stout, 2006). De reden hiervoor is dat de grootte van het veulen
ten dele genetisch bepaald is. Zo bezit een paardenembryo een grotere genetische grootte dan een
ponyembryo. Uiteindelijk kan de foetus, uitgaand van een paardenembryo en aanwezig in de uterus
van een pony, absoluut te groot zijn. Wegens een tekort aan voedingsstoffen intra-uterien of dystocie,
kan
er
intra-uteriene
respectievelijk
postnatale
sterfte
optreden:
dit
leidt
tot
een
lager
veulenpercentage na embryotransplantatie.
Uiteindelijk moet worden besloten dat de draagmerrie de essentiële factor is binnen de
embryotransplantatie. Draagmerries kunnen worden geselecteerd naar leeftijd, reproductieve
voorgeschiedenis, toestand van de genitaaltractus en conditiescore. Niet alle factoren, met betrekking
tot de draagmerrie, zijn echter te controleren. Dit heeft tot gevolg dat het transplanteren van een
perfect gezond embryo, waarbij de verschillende aandachtspunten omtrent techniek en embryo
worden gerespecteerd, nog steeds kan leiden tot embryonale sterfte.
28
REFERENTIELIJST
Allen W.R. (2005). The development and application of the modern reproductive technologies to
horse breeding. Reproduction in Domestic Animals 40, p. 310-329.
Alvarenga M.A., McCue P., Squires E.L., Neves Neto J.R. (2001). Improvement of ovarian
superstimulatory response and embryo production in mares treated with EPE twice daily. In: Katila T.,
Wade J.F. (Editors). Havemeyer Foundation Monograph Series No. 3. R & W Publications Ltd,
Newmarket, p. 79-80.
Aurich C. (2011). Actual use of artificial insemination in horse breeding. Wiener tierärztliche
Monatsschrift 98, p. 150-155.
Ball B.A., Hillman R.B., Woods G.L. (1987). Survival of equine embryos transferred to normal and
subfertile mares. Theriogenology 28, p. 167-174.
Ball B.A., Little T.V., Weber J.A., Woods G.L. (1989). Survival of day-4 embryos from young, normal
mares and aged, subfertile mares after transfer to normal recipient mares. Journals of Reproduction
and Fertility 85, 187-194.
Barfield J.P., McCue P.M., Squires E.L., Seidel Jr. G.E. (2009). Effect of dehydration prior to
cryopreservation of large equine embryos. Cryobiology 59, p. 36-41.
Bass L.D., Denniston D.J., Maclellan L.J., McCue P.M., Seidel Jr. G.E., Squires E.L. (2004).
Methanol as a cryoprotectant for equine embryos. Theriogenology 62, p. 1153-1159.
Battut I., Colchen S., Fieni F., Tainturier D. (1998). Success rates when attempting to nonsurgically
collect equine embryos at 144, 156 or 168 hours after ovulation. Equine Veterinary Journal 25, p. 6062.
Blanchard T.L., Thompson J.A., Brinsko S.P., Varner D.D., Love C.C., Ramsey J., O’Meara A.
(2010). Pregnancy rates in tranquilized maiden Thoroughbred mares. Journal of equine veterinary
science 30, p. 187-190.
Brinsko S.P., Terry L.B., Dickson D.V., Schumacher J., Love C.C., Hinrichs K., Hartman D. (2011).
Manual of Equine Reproduction. 3th edition. Mosby, Inc., Maryland Heights, p. 23-288.
Camargo C.E., Weiss R.R., Kozicki L.E., Duarte M.P., Duarte M.C.G., Lunelli D., Weber S., de Abreu
R.A. (2013). Some factors affecting the rate of pregnancy after embryo tranfer derived from the
Brazilian Jumper horse breed. Journal of Equine Veterinary Science 33, p. 924-929.
Carnevale E.M. (2006). Vitrification of equine embryos. Veterinary Clinics of North America: Equine
Practice 22, p. 831-841.
Carnevale E.M., Ginther O.J. (1992). Relationships of age to uterine function and reproductive
efficiency in mares. Theriogenology 37, p. 1101-1115.
Carnevale E.M., Ramirez R.J., Squires E.L., Alvarenga M.A., Vanderwall D.K., McCue P.M. (2000).
Factors affecting pregnancy rates and early embryonic death after equine embryo transfer.
Theriogenology 54, p. 965-979.
Carnevale E.M., Squires E.L., McKinnon A.O. (1987). Comparison of Ham’s F10 with CO2 or HEPES
buffer for storage of equine embryos at 5 C for 24 h. Journal of Animal Science 65, p. 1775-1781.
29
Carney N.J., Squires E.L., Cook V.M. (1991). Comparison of pregnancy rates from transfer of fresh
versus cooled, transported equine embryos. Theriogenology 36, p. 23-32.
Castleberry R.S., Schneider H.J., Griffin J.L. (1980). Recovery and transfer of equine embryos.
Theriogenology 13, p. 90-90.
Choi Y.H., Velez I.C., Riera F.L., Roldán J.E., Hartman D.L., Bliss S.B., Blanchard T.L., Hayden
S.S., Hinrichs K. (2011). Successful cryopreservation of expanded equine blastocysts. Theriogenology
76, p. 143-152.
Cornillie P. (2010). Embryologie van de huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 5758.
Cunningham J.G., Klein B.G. (2007). Control of Ovulation and the Corpus Luteum. In: Cunningham
J.G., Klein B.G. (Editors) Textbook of Veterinary Physiology, Saunders, St. Louis, p. 475-482.
Czlonkowska M., Boyle M.S., Allen W.R. (1985). Deep freezing of horse embryos. Journals of
Reproduction and Fertility 75, p. 485-490.
Daels P. (2007). Embryo transfer tips and trics. In: Proceedings 5th European Veterinary
Conference, Voorjaarsdagen, Amsterdam, p. 213-215.
Douglas R.H. (1982). Some aspects of equine embryo transfer. Journal of Reproduction and Fertility,
Suppl. 32, p. 405-408.
Eldridge-Panuska W.D., Caracciolo di Brienza V., Seidel Jr. G.E., Squires E.L., Carnevale E.M.
(2005). Establishment of pregnancies after serial dilution or direct transfer by vitrified equine embryos.
Theriogenology 63, p. 1308-1319.
Fleury J.J., Alvarenga M.A. (1999). Effects of collection day on embryo recovery and pregnancy
rates in a nonsurgical equine embryo transfer program. Theriogenology 51, p. 261-261.
Fleury J.J., Fleury P.D.C., Landin-Alvarenga F.C. (2002). Effect of embryo diameter and storage
period on pregnancy rates obtained with equine embryos stored in Ham’s F-10 with Hepes Buffer at a
temperature of 15-18°C – preliminary results. Theriogenology 58, p. 749-750.
Foss R., Wirth N., Schiltz P., Jones J. (1999). Nonsurgical embryo transfer in a private practice. In:
Proceedings of the Annual Convention of the AAEP 45, Albuquerque, NM, USA, p. 210-212.
Ginther O.J. (1974). Occurrence of anestrus, estrus, diestrus, and ovulation over a 12-month period
in mares. American Journal of Veterinary Research 35, p. 1173-1179.
Ginther O.J. (1998). Equine pregnancy: physical interactions between the uterus and conceptus. In:
Proceedings of the Annual Convention of the AAEP 44, Baltimore, MD, USA, p. 73-104.
Ginther O.J., Bergfelt D.R., Leith G.S., Scraba S.T. (1985). Embryonic loss in mares: incidence and
ultrasonic morphology. Theriogenology 24, p. 73-86.
González C., Moreno L., Fumuso E., Carcía J., Rivulgo M., Confalonieri A., Sparo M., Sánchez Bruni
S. (2010). Enrofloxacin-based therapeutic strategy for the prevention of endometritis in susceptible
mares. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 33, p. 287-294.
Herrera C., Morikawa M.I., Goya F., Llorente J. (2014). Equine embryo gender determination by
Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) on the same day of flushing. Journal of Equine Veterinary
Science 34, p. 172-173.
30
Hinrichs K. (2013). Assisted reproduction techniques in the horse. Reproduction, Fertility and
Development 25, p. 80-93.
Hinrichs K., Sertich P.L., Palmer E., Kenney R.M. (1987). Establishment and maintenance of
pregnancy after embryo transfer in ovariectomized mares treated with progesterone. Journals of
reproduction & fertility 80, p. 395-401.
Hochi S., Fujimoto T., Oguri N. (1995). Large equine blastocysts are damaged by vitrification
procedures. Reproduction, fertility and development 7, p. 113-117.
Hughes J.P., Stabenfeldt G.H., Evans J.W. (1975). The oestrus cycle of the mare. Journal of
Reproduction and Fertility, Suppl. 23, p. 161-166.
Imel K.J. (1981). Recovery, culture and transfer of equine embryos. M.S. Thesis. Colorado State
University, Fort Collins. Bron: Journal of Animal Science (1987) 65, p. 1775.
Iuliano M.F., Squires E.L. (1985). Embryo transfer in two-year-old donor mares. Theriogenology 24,
p. 647-654.
Iuliano M.F., Squires E.L., Cook M. (1985). Effect of age of equine embryos and method of transfer
on pregnancy rate. Journal of Animal Science 60, p. 258-263.
Jacob J.C.F., Haag K.T., Santos G.O., Oliveira J.P., Gastal M.O., Gastal E.L. (2012). Effect of
embryo age and recipiënt asynchrony on pregnancy rates in a commercial equine embryo transfer
program. Theriogenology 77, p. 1159-1166.
Jasko D.J. (2002). Comparison of pregnancy rates following nonsurgical transfer of day 8 equine
embryos using various transfer devices. Theriogenology 58, p. 713-715.
Johnson
L.,
Blanchard
T.L.,
Varner
D.D.,
Scrutchfield
W.L.
(1997).
Factors
affecting
spermatogenesis in the stallion. Theriogenology 48, p. 1199-1216.
Kastelic J.P., Adams G.P., Ginther O.J. (1987). Role of progesterone in mobility, fixation, orientation,
and survival of the equine embryonic vesicle. Theriogenology 27, p. 655-663.
Kelley D.E., Gibbons J.R., Smith R., Vernon K.L., Pratt-Phillip S.E., Mortensen C.J. (2011). Exercise
affects both ovarian follicular dynamics and hormone concentrations in mares. Theriogenology 76, p.
615-622.
Koblischke P., Budik S., Müller J., Aurich C. (2010). Practical experience with the treatment of
recipient mares with a non-steroidal anti-inflammatory drug in an equine embryo transfer programme.
Reproduction in domestic animals 45, p. 1039-1041.
Koblischke P., Kindahl H., Budik S., Aurich J., Palm F., Walter I., Kolodziejek J., Nowotny N.,
Hoppen H.-O., Aurich C. (2008). Embryo transfer induces a subclinical endometritis in recipient mares
which can be prevented by treatment with non-steroid anti-inflammatory drugs. Theriogenology 70, p.
1147-1158.
Lagneaux D., Pomarici A.M., Sattler M., Bruneau B., Duchamp G., Camillo F., Palmer E. (2000).
Effect of L-glutamine for freezing equine embryos: evaluation by DAPI staining and transfer of multiple
embryos to recipient mares. Journal of Reproduction and Fertility 56, p. 561-568.
Losinno L., Aguilar J.J., Lisa H. (2001). Impact of multiple ovulations in a commercial equine embryo
transfer programme. In: Katila T., Wade J.F. (Editors). Havemeyer Foundation Monograph Series No.
3. R & W Publications Ltd, Newmarket, p. 81-83.
31
McCue P.M., Scoggin C.F., Meira C., Squires E.L. (2000). Pregnancy rates for equine embryos
cooled for 24 h in Ham’s F-10 versus EmCare™ embryo holding solution. In: Proceedings of the
Annual Conference of Society of Theriogenology, p. 147-147. Bron: Theriogenology (2003) 59, p. 154154.
McKinnon A.O., Squires E.L., Voss J.L., Cook V.M. (1988). Equine embryo transfer: a review.
Compendium: continuing education for veterinarians 10, p. 343-355.
Meadows S., Lisa H., Welsh C. (2000). Factors affecting embryo recovery, embryo development and
pregnancy rate in a commercial embryo transfer programme. In: Allen W.R., Wade J.F. (Editors).
Havemeyer Foundation Monograph Series No. 1. R & W Publications Ltd, Newmarket, p. 61-62.
Meira C., Alvarenga M.A., Pappa O.F., Abba E., Landon E., Alvarenga F.C. (1993). Cryopreservation
of equine embryos using glycerol and 1,2-propanediol as cryoprotectants. Equine Veterinary Journal
15, p. 64-66.
Morris L.H.A., Allen W.R. (2002). Reproductive efficiency of intensively managed Thoroughbred
mares in Newmarket. Equine Veterinary Journal 34, p. 51-60.
Mortensen C.J., Choi Y.H., Hinrichs K., Ing N.H., Kraemer D.C., Vogelsang S.G., Vogelsang M.M.
(2009). Embryo recovery from exercised mares. Animal Reproduction Science 110, p. 237-244.
Moussa M., Bersinger I., Doligez P., Guignot F., Duchamp G., Vidament M., Mermillod P., Bruyas J.F. (2005). In vitro comparisons of two cryopreservation techniques for equine embryos: slow-cooling
and open pulled straw (OPS) vitrification. Theriogenology 64, p. 1619-1632.
Moussa M., Duchamp G., Mahla R., Bruyas J.-F., Daels P.F. (2002). Comparison of pregnancy rates
for equine embryos cooled for 24 h in Ham’s F-10 and emcare holding solutions. Theriogenology 58,
p. 755-757.
Nagao J.F., Neves Neto J.R., Papa F.O., Alvarenga M.A., Freitas-Dell’Aqua C.P., Dell’Aqua Jr. J.A.
(2012). Induction of double ovulation in mares using deslorelin acetate. Animal Reproduction Science
136, p. 69-73.
Nagy P., Guillaume D., Daels P. (2000). Seasonality in mares. Animal Reproduction Science 60-61,
p. 245-262.
Oldenhof H., Gojowsky M., Wang S., Henke S., Yu C., Rohn K., Wolkers W.F., Sieme H. (2013).
Osmotic stress and membrane phase changes during freezing of stallion sperm: mode of action of
cryoprotective agents. Biology of Reproduction 88, p. 68-78.
Panzani D., Crisci A., Rota A., Camillo F. (2009). Effect of day of transfer and treatment
administration on the recipient on pregnancy rates after equine embryo transfer. Veterinary Research
Communications 33, p. 113-116.
Peugnet P., Valentino S., Tarrade A., Wimel L., Reigner F., Serteyn D., Chavatte-Palmer P. (2013).
Intrauterine growth restriction after between-breed embryo transfer is associated with strong
alterations in placental structure and function in horses. Reproduction, Fertility and Development 26, p.
150-151.
Pessoa M.A., Cannizza A.P., Reghini M.F.S., Alvarenga M.A. (2011). Embryo transfer efficiency of
Quarter Horse athletic mares. Journal of Equine Veterinary Science 31, p. 703-705.
32
Sairanen J., Katila T., Virtala A.-M., Ojala M. (2011). Effects of racing on equine fertility. Animal
Reproduction Science 124, p. 73-84.
Scherzer J., Davis C., Hurley D.J. (2011). Laser-assisted vitrification of large equine embryos.
Reproduction in Domestic Animals 46, p. 1104-1106.
Scherzer J., Fayrer-Hosken R.A., Ray L., Hurley D.J., Heusner G.L. (2008). Advancements in large
animal embryo transfer and related biotechnologies. Reproduction in Domestic Animals 43, p. 371376.
Sertich P.L. (1989). Transcervical embryo transfer in performance mares. Journal of the American
Veterinary Medical Association 195, p. 940-945.
Sevinga M., Schukken Y.H., Hesselink J.W., Jonker F.H. (1999). Relationship between ultrasonic
characteristics of the corpus luteum, plasma progesterone concentration and early pregnancy
diagnosis in Friesian mares. Theriogenology 52, p. 585-592.
Silvia P.J., Squires E.L., Nett T.M. (1986). Changes in the hypothalamic-hypophyseal axis of mares
associated with seasonal reproductive recrudescence. Biology of Reproduction 35, p. 897-905.
Slade N.P., Takeda T., Squires E.L., Elsden R.P., Seidel Jr. G.E. (1985). A new procedure for the
cryopreservation of equine embryos. Theriogenology 24, p. 45-58.
Squires E.L., Carnevale E.M., McCue P.M., Bruemmer J.E. (2003). Embryo Technologies in the
horse. Theriogenology 59, p. 151-170.
Squires E.L., Garcia R.H., Ginther O.J., Voss J.L., Seidel G.E. (1986). Comparison of equine
pituitary extract and follicle stimulating hormone for superovulating mares. Theriogenology 26, p. 661670.
Squires E.L., Iuliano M.F., Shideler R.K. (1982). Factors affecting the success of surgical and
nonsurgical equine embryo transfer. Theriogenology 17, p. 35-41.
Squires E.L., McCue P.M., Vanderwall D. (1999). The current status of equine embryo transfer.
Theriogenology 51, p. 91-104.
Squires E.L., McKinnon A.O., Carnevale E.M., Morris R.P., Nett T.M. (1987). Reproductive
characteristics of spontaneous single and double ovulating mares and superovulated mares. Journal
of reproduction and fertility 35, p. 399-403.
Stout T.A.E. (2003). Selection and management of the embryo transfer donor mare. Pferdeheilkunde
19, p. 685-688.
Stout T.A.E. (2006). Equine embryo transfer: review of developing potential. Equine Veterinary
Journal 38, p. 467-478.
Stout T.A.E. (2012). Cryopreservation of equine embryos: current state-of-the-art. Reproduction in
Domestic Animals 47, p. 84-89.
Troedsson M.H.T. (1999). Uterine clearance and resistance to persistent endometritis in the mare.
Theriogenology 52, p. 461-471.
Uliani R.C., Ramires Neto C., Dell’Aqua Jr. J.A., Pessoa M.A., Camargo A.L., Alvarenga R.,
Alvarenga M.A. (2010). Effect of mare breed and age on embryo transfer efficiency. Animal
Reproduction Science 121, p. 303-304.
33
Vajta G., Holm P., Kuwayama M., Booth P.J., Jacobsen H., Greve T., Callesen H. (1998). Open
pulled straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos.
Molecular Reproduction and Development 51, p. 53-58.
Vandenberghe L.T.M., Govaere J., Nelis H., Hoogewijs M., Daels P., Van Soom A. (2012).
Embryotransplantatie bij het paard: onmisbaar in de moderne fokkerij. Vlaams Diergeneeskundig
Tijdschrift 81, p. 274-282.
Vanroose G., de Kruif A., Van Soom A. (2000). Embryonic mortality and embryo-pathogen
interactions. Animal Reproduction Science 60-61, p. 131-143.
Vazquez J.J., Garcia A., Kass P.H., Liu I.K.M., Ball B.A. (2010). Influence of environmental
temperature, exercise, semen type and ovulation characteristics on reproductive performance in a
commercial embryo transfer program. Animal Reproduction Science 121, p. 301-302.
Vogelsang S.G., Vogelsang M.M. (1989). Influence of donor parity and age on the success of
commercial equine embryo transfer. Equine Veterinary Journal 21, p. 71-72.
Wade J.M., Kelly M.F., Hayden T.J., Gordon I. (1987). Non-surgical recovery and transfer of equine
embryos. Theriogenology 27, p. 290-290.
Wiepz G.J., Squires E.L., Chapman P.L. (1988). Effects of norgestomet, altrenogest, and/or estradiol
on follicular and hormonal characteristics of late transitional mares. Theriogenology 30, p. 181-193.
Willmann C., Schuler G., Hoffmann B., Parvizi N., Aurich C. (2011). Effects of age and altrenogest
treatment on conceptus development and secretion of LH, progesterone and eCG in early-pregnant
mares. Theriogenology 75, p. 421-428.
Wilsher S., Allen W.R. (2004). An improved method for nonsurgical embryo transfer in the mare.
Equine veterinary Education 16, p. 39-44.
Wilsher S., Allen W.R. (2009). Uterine influences on embryogenesis and early placentation in the
horse revealed by transfer of day 10 embryos to day 3 recipient mares. Reproduction 137, p. 583-593.
Wilsher S., Clutton-Brock A., Allen W.R. (2010). Successful tranfer of day 10 horse embryos:
influence of donor-recipient asynchrony on embryo development. Reproduction 139, p. 575-585.
Young C.A., Squires E.L., Seidel G.E., Kato H., McCue P.M. (1997). Cryopreservation procedures
for day 7-8 equine embryos. Equine Veterinary Journal 29, p. 98-102.
34
BIJLAGEN
Tabel 1. Invloed van de embryotransplantatiemethode op het drachtigheidspercentage
waargenomen op 12 tot 16 dagen en/of 50 tot 60 dagen dracht
Gebruikte methode
Auteur
Aantal
12 tot 16
50 tot 60
ET’s
dagen
dagen
Iuliano et al. (1985)
43
-
72
Iuliano en Squires (1985)
36
-
78
Ball et al. (1986)
20
55
-
Carney et al. (1991)
104
-
64
McCue et al. (1999)
40
73
-
Carnevale et al. (2000)
558
68
58
Niet-chirurgisch;
Iuliano et al. (1985)
40
-
45
conventionele methode.
Wade et al. (1987)
15
-
60
Fleury en Alvarenga (1999)
511
75
-
Foss et al. (1999)
123
83*
-
Carnevale et al. (2000)
78
47
40
Losinno et al. (2000)
933
81*
-
Jasko (2002)
126
83**
-
Jacob et al. (2012)
288
-
66
Wilsher en Allen (2004)
20
85
-
Chirurgisch via flankincisie.
Niet-chirurgisch; Wilsher techniek.
*Drachtdiagnose op 30 dagen dracht.
**Tijdstip drachtdiagnose niet vermeld.
Tabel 2. Invloed van de dag postovulatoir, waarop het embryo bij de draagmerrie wordt
ingebracht, op het drachtigheidspercentage
Dag
Drachtigheidspercentage op 60 dagen
Drachtigheidspercentage op 50 dagen
postovulatoir
Jacob et al. 2012
Carnevale et al. 2000
2
33
-
3
66
-
4
66
-
5
62
54
6
55
66
7
58
56
8
56
55
9
-
41