Preview

UDC 663.813.014:547.466.062
Vruchtesappen
Bepaling van het gehalte aan vrije aminozuren
Kolomchromatografische methode
Fruit juices - Determination of free amino acids content •
Column chromatographic method
1
NEDERLANDSE
NORM
NEN 2850
1e druk, april 1984
Onderwerp en toepassingsgebied
Deze norm beschrijft een kolomchromatografische bepaling van vrije aminozuren in vruchtesappen.
Vo
2
Definitie
gehalte aan vrij aminozuur:
monster.
De hoeveelheid DL-aminozuur in een monster gedeeld door de massa van het
3
Beginsel
De vrije aminozuren, aanwezig in een op pH = 2 gebrachte hoeveelheid vruchtesap, worden door middel van
kolomchromatografie gescheiden in de afzonderlijke aminozuren met behulp van geschikt gekozen elutiemiddelen.
Deze aminozuren worden direct of in gederivatiseerde vorm bepaald met een daarvoor geschikte detector.
Via berekening van de verhouding van de geregistreerde piekoppervlakken ten opzichte van een standaard
wordt het gehalte aan vrije aminozuren in het vruchtesap bepaald.
4
or
Reagentia en hulpstoffen
Pr
be
Alle reagentia en chemicaliën moeten geschikt zijn voor vloeistofchromatografische doeleinden en vrij zijn
van ammoniumhoudende verbindingen.
Gebruik dubbel gedestilleerd water of daarmee in kwaliteit overeenkomend water met een geleidingsvermogen van ten hoogste 10 uS.
iew
ev
4.1
Interne standaard.
Gebruik een interne standaard zoals aangegeven in bijlage B.1.
4.2
Standaardmengsel van aminozuren.
Gebruik een standaardmengsel van aminozuren zoals aangegeven in bijlage С
4.3
Chemicaliën.
Gebruik chemicaliën zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant van de vloeistofchromatograaf.
5
Toestellen en hulpmiddelen
eld
Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen.
toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten.
This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when
a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded.
Opmerking
Het gehalte aan vrij aminozuur wordt uitgedrukt in mmol/kg.
Gebruikelijke laboratoriumtoestellen en hulpmiddelen en in het bijzonder de volgende.
5.1
Een vloeistofchromatograaf (zie bijlage A) geschikt voor het bepalen van aminozuren, bestaande uit de
volgende onderdelen:
- één of meer, al dan niet dubbelwandige, vloeistofchromatografiekolommen, voorzien van een geschikte
kolomvulling;
- één of meer vloeistofpompen;
- verwarmingssysteem met thermostaat voor regeling van de kolomtemperatuur, waarbij de temperatuurvariatie niet groter mag zijn dan ± 0,1 ° C ;
- indien nodig: een thermostaatbad waarin het reactiemengsel met de eluerende aminozuren kan
reageren, waarbij de temperatuurvariatie niet groter mag zijn dan ± 0,5 ° C ;
- spectrofotometer geschikt om de al dan niet gederivatiseerde aminozuren te detecteren;
- schrijver;
- voorziening om piekoppervlakken te meten, bij voorkeur een elektronisch integratiesysteem.
5.2
pH-meter volgens NEN 2833. De meter moet voor gebruik worden geijkt op bufferoplossingen met
nauwkeurig bekende pH.
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 2850
NEN 2850
2
6
Voorbehandeling van het monster
Meng het laboratoriummonster goed en filtreer of centrifugeer het ter verwijdering van zwevende
bestanddelen.
Opmerking
Het laboratoriummonster moet direct worden geanalyseerd of worden ingevroren om bederf door bacteriën en
schimmels te voorkomen.
7
Werkwijze
7.1
Chromatografische condities
Vo
Stel de apparatuur in zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
De chromatografische condities voor een goede scheiding zijn van zoveel factoren afhankelijk, dat deze
norm slechts een algemene richtlijn kan geven.
7.2
Bepaling van responsfactoren
Chromatografeer enige malen een geschikte hoeveelheid standaardmengsel aminozuren (bijlage C), al dan
niet voorzien van een interne standaard (chromatogram s).
Bereken per aminozuur van deze chromatogrammen de gemiddelde responsfactor zoals aangegeven in
bijlage A onder A.5.4 of A.5.5 en de variatiecoëfficiënt volgens NEN 1047 blad 3.1. De variatiecoëfficiënt mag
niet meer bedragen dan 3%.
Bereken voorts de scheiding (p) zoals aangegeven in bijlage A onder A.5.1 van enige "kritische" aminozuren,
die zijn aangegeven in bijlage A onder A.4. De scheiding (p) moet ten minste 67% bedragen.
Voor het bepalen van de responsfactoren dienen de retentietijden constant te blijven.
or
7.3
Bepaling in het analysemonster
Weeg een geschikte hoeveelheid van het voorbehandelde monster af en voeg hierbij een zodanige
hoeveelheid interne standaard (zie bijlage B) dat de te verkrijgen pieken van de belangrijkste aminozuren in
het analysemonster en de piek van de interne standaard ongeveer even groot zijn. Chromatografeer onder
dezelfde instrumentele omstandigheden als gebruikt bij het standaardmengsel. De retentietijden, berekend
zoals aangegeven in bijlage A onder A.5.2, dienen in vergelijking met die van het standaardmengsel binnen
nader aan te geven grenzen te vallen.
be
Pr
Voer de bepaling in duplo uit.
8
Berekening (zie ook bijlage A.5.3)
8.1
Methode met interne standaard
iew
ev
7.4
Bereken het gehalte aan aminozuur / met behulp van de formule:
, _ _.
rns-ArKsi
Kj — r •
-
m-As
8.2
Methode met externe standaard
eld
waarin:
F
is de gebruikte verdunningsfactor;
ms
is de hoeveelheid interne standaard, in mmol;
Aj
ïïThet piekoppervlak van het te bepalen aminozuur /, in mm2 of integratoreenheden;
Ksi
is de responsfactor van het te bepalen aminozuur /ten opzichte van de interne standaard s;
m
is de massa van het analysemonster, in g;
As
is het piekoppervlak van de interne standaard, in mm2 of integratoreenheden;
kj
is het gehalte aan aminozuur /, in mmol/kg.
Bereken het gehalte aan aminozuur / met behulp van de formule:
m
waarin:
F is de gebruikte verdunningsfactor;
Aj is het piekoppervlak van het te bepalen aminozuur /, in mm2 of integratoreenheden;
Kj is de responsfactor van het te bepalen aminozuur /;
/г? is de massa van het analysemonster, in g;
kj is het gehalte aan aminozuur /, in mmol/kg.
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 2850
3
8.3
Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van twee bepalingen volgens 8.1 en 8.2, als aan de
voorwaarde van de herhaalbaarheid (9) is voldaan.
Geef het gehalte aan aminozuren op in twee decimalen.
9
Herhaalbaarheid
Het verschil tussen de uitkomsten van een bepaling in duplo, kort na elkaar uitgevoerd door dezelfde analist
onder dezelfde omstandigheden, mag niet groter zijn dan 5 % van hun gemiddelde. Dit geldt voor aminozuurgehalten van 0,5 mmol/kg of meer.
10
Verslag
be
iew
ev
Pr
or
Vo
Vermeld in het verslag:
a. type en identificatie van het laboratoriummonster;
b. de verkregen gehalten aan vrije aminozuren, in mmol/kg;
c. de gevolgde methode door de vermelding: volgens NEN 2850.
eld
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
NEN 2850
4
Bijlage A
Het chromatografische systeem
A.1
Eisen te stellen aan het chromatografische systeem
Het chromatografische systeem moet geschikt zijn om de onder A.3 genoemde aminozuren te scheiden.
A.2
Eisen te stellen aan het chromatogram
A.2.1
Invloeden op de scheiding
Vo
De scheiding van de aminozuren is van vele factoren afhankelijk zoals:
- fysisch-chemische eigenschappen van de aminozuren;
- eigenschappen van de kolomvulling;
- pH en ionensterkte van de gebruikte buffers;
- toevoegingen aan de buffers;
- temperatuur van de kolom;
- pompsnelheid.
Het blijkt dat sommige aminozuren door bovenstaande factoren sterker worden beïnvloed dan andere
aminozuren (bijlage C).
A.2.2
Derivatisering
A.2.3
or
De extinctie die wordt gemeten na de derivatisering, kan sterk afhankelijk zijn van de reactietemperatuur en
de reactietijd. Het constant houden van de reactietemperatuur en de reactietijd is dan ook noodzakelijk.
Lineariteit
In het gebied waarin wordt gewerkt, moet voor de desbetreffende aminozuren een lineair verband bestaan
tussen extinctie en concentratie.
A.2.4
Retentietijd
Pr
ev
A.3
be
De retentietijden van de aminozuren uit het monster mogen enigszins veranderen, mits de responsfactoren
van de aminozuren uit het standaardmengsel van aminozuren ongewijzigd blijven.
Belangrijke aminozuren
iew
Voor het karakteriseren van vruchtesappen zijn onder meer de volgende aminozuren van belang:
glutaminezuur
glycine
proline
serine
eld
alanine
y-aminoboterzuur
arginine
asparagine
asparaginezuur
Andere aminozuren die nog kunnen voorkomen:
cystine
glutamine
histidine
isoleucine
leucine
lysine
A.4
Kritische combinaties van aminozuren
methionine
ornithine
fenylalanine
threonine
tyrosine
valine
Sommige combinaties van aminozuren zijn ook onder optimale omstandigheden moeilijk of niette scheiden.
Het betreft de volgende kritische combinaties:
de basische aminozuren:
- ornithine-lysine
- histidine-ammoniak
de neutrale en zure aminozuren:
- threonine-serine
- asparagine-glutaminezuur
- proline-glycine
- glycine-alanine
- valine-cystine
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Bestelformulier
Stuur naar:
NEN Standards Products & Services
t.a.v. afdeling Klantenservice
Antwoordnummer 10214
2600 WB Delft
NEN Standards Products & Services
Postbus 5059
2600 GB Delft
Vlinderweg 6
2623 AX Delft
T (015) 2 690 390
F (015) 2 690 271
Ja, ik bestel
__ ex. NEN 2850:1984 nl Vruchtesappen - Bepaling van het gehalte aan vrije
aminozuren - Kolomchromatografische methode
www.nen.nl/normshop
€ 24.20
Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via
www.nen.nl/normshop
Gratis e-mailnieuwsbrieven
Retourneren
Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen,
Fax: (015) 2 690 271
E-mail: [email protected]
Post: NEN Standards Products
& Services,
t.a.v. afdeling Klantenservice
Antwoordnummer 10214,
2600 WB Delft
(geen postzegel nodig).
normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze
e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven
Gegevens
Bedrijf / Instelling
T.a.v.
O M
O V
Voorwaarden
• De prijzen zijn geldig
tot 31 december 2016,
E-mail
tenzij anders aangegeven.
• Alle prijzen zijn excl. btw,
Klantnummer NEN
verzend- en handelingskosten
Uw ordernummer
BTW nummer
en onder voorbehoud bij
o.m. ISO- en IEC-normen.
Postbus / Adres
• Bestelt u via de normshop een
PostcodePlaats
pdf, dan betaalt u geen
handeling en verzendkosten.
TelefoonFax
• Meer informatie: telefoon
(015) 2 690 391, dagelijks
Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres)
van 8.30 tot 17.00 uur.
Postbus / Adres
• Wijzigingen en typefouten
in teksten en prijsinformatie
PostcodePlaats
voorbehouden.
• U kunt onze algemene
voorwaarden terugvinden op:
DatumHandtekeningwww.nen.nl/leveringsvoorwaarden.
Normalisatie: de wereld op één lijn.
preview - 2016