NEN 6394

Nederlandse
NEN 6394
Vruchtenlimonades. Bepaling van
het gehalte aan vrije aminozuren.
Kolomchromatografische methode
Fruit lemonades. Determination of free amino acids content.
Column chromatographic method
1e druk, mei 1996
ICS 67.080.10;67.160.20
Vo
1
Onderwerp en toepassingsgebied
2
Term en definitie
or
gehalte aan vrij aminozuur: Hoeveelheid DL-aminozuur
in een monster gedeeld door het volume van het
monster.
OPMERKING
Het gehalte aan vrij aminozuur wordt uitgedrukt in
mmol/l.
Beginsel
ev
be
3
Pr
De vrije aminozuren, aanwezig in een op pH = 2 gebrachte
hoeveelheid vruchtenlimonade, worden door kolomchromatografie gescheiden in de afzonderlijke aminozuren met geschikt gekozen elutiemiddelen. Deze aminozuren worden direct of in gederivatiseerde vorm bepaald
met een daarvoor geschikte detector. Via berekening van
de verhouding van de geregistreerde piekoppervlakken
ten opzichte van een standaard wordt het gehalte aan
vrije aminozuren in de vruchtenlimonade bepaald.
iew
4
Reagentia en hulpstoffen
5.3 pH-meter (zie NEN 2833).
Kalibreer de meter voor gebruik met behulp van bufferoplossingen met nauwkeurig bekende pH in het gebied
van pH = 7 en pH = 10.
5.4
6
4.1 Gebruik een interne standaard zoals aangegeven
inB.1.
4.2 Gebruik een standaardmengsel van aminozuren
zoals aangegeven in bijlage С
4.3 Gebruik chemicaliën zoals aangegeven in de
gebruiksaanwijzing van de fabrikant van de vloeistofchromatograaf.
OPMERKING
Het laboratoriummonster moet direct worden geanalyseerd of worden ingevroren om bederf door bacteriën en schimmels te voorkomen.
7
7.1
Toestellen en hulpmiddelen
hulp-
Werkwijze
Chromatografische voorwaarden
Stel de apparatuur in zoals aangegeven in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. De chromatografische voorwaarden voor een goede scheiding zijn van zoveel factoren afhankelijk dat deze norm slechts een algemene
richtlijn kan geven.
7.2
5.1 Gebruikelijke laboratoriumtoestellen en
middelen en in het bijzonder de onderstaande.
Voorbehandeling van het monster
Meng het laboratoriummonster goed. Verwijder koolstofdioxide uit het monster door ultrasone trilling in het
bad (5.4) en filtreer of centrifugeer het voor de verwijdering van zwevende bestanddelen.
Alle reagentia en chemicaliën moeten geschikt zijn voor
vloeistofchromatografische doeleinden en vrij zijn van
ammoniumhoudende verbindingen. Onder water wordt
in deze norm verstaan dubbel gedestilleerd of daarmee
in kwaliteit overeenkomend water met een geleidingsvermogen van ten hoogste 10 \iS.
5
Ultrasoon bad.
eld
Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen.
toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten.
This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when
a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded.
Deze norm beschrijft een kolomchromatografische
methode voor de bepaling van het gehalte aan vrije
aminozuren van vruchtenlimonades.
5.2 Een vloeistofchromatograaf (zie bijlage A) geschikt
voor het bepalen van aminozuren, bestaande uit de volgende onderdelen:
- één of meer, al dan niet dubbelwandige, vloeistofchromatografiekolommen met een geschikte kolomvulling;
- één of meer vloeistofpompen;
- verwarmingssysteem met thermostaat voor regeling
van de kolomtemperatuur, waarbij de temperatuurvariatie niet groter mag zijn dan ± 0,1 °C;
- indien nodig: een thermostaatbad waarin het reactiemengsel met de eluerende aminozuren kan reageren,
waarbij de temperatuurvariatie niet groter mag zijn
dan ± 0,5 °C;
- spectrofotometer geschikt om de al dan niet gederivatiseerde aminozuren te detecteren;
- schrijver;
- voorziening om piekoppervlakken te meten, bij voorkeur een elektronisch integratiesysteem.
Bepaling van de responsfactoren
Chromatografeer enige malen een hoeveelheid standaardmengsel aminozuren (bijlage C), al dan niet voorzien van een interne standaard. Bereken per aminozuur
van deze chromatogrammen de gemiddelde respons-
Nederlands
N Normalisatie-instituut
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
© 1996 Nederlands Normalisatie-instituut
Kalfjeslaan 2, Postbus 5059,2600 GB Delft, Telefoon (015) 2 690 390, Fax (015) 2 690 190
Biz. 2
NEN 6394:1996
factor zoals aangegeven in A.5.4 of A.5.5 en de variatiecoëfficiënt (NEN 1047). De variatiecoëfficiënt mag niet
meer bedragen dan 3 %.
Bereken voorts de scheiding (p) zoals aangegeven in bijlage A onder A.5.1 van enige "kritische" aminozuren, die
zijn aangegeven in bijlage A onder A.4. De scheiding (p)
moet ten minste 67 % bedragen. Voor het bepalen van de
responsfactoren moeten de retentietijden constant blijven.
7.3
Bepaling in het analysemonster
8
Vo
Pipetteereen hoeveelheid van het voorbehandelde monster en voeg hierbij een zodanige hoeveelheid interne
standaard (zie bijlage B) dat de te verkrijgen pieken van de
belangrijkste aminozuren in het analysemonster en de
piek van de interne standaard ongeveer even groot zijn.
Chromatografeer onder dezelfde instrumentele omstandigheden als gebruikt bij het standaardmengsel. De
retentietijden, berekend zoals aangegeven in bijlage A
onder A.5.2, moeten in vergelijking met die van het standaardmengsel binnen nader aan te geven grenzen vallen.
9
De precisie van de methode is vastgesteld dooreen inter­
laboratoriumonderzoek, uitgevoerd in 1990 volgens
ISO 5725-2. Aan dat onderzoek namen acht laboratoria
deel. Er werden monsters onderzocht van sinaasappel­
limonade.
Voor de uit het onderzoek verkregen waarde voor de herhaalbaarheidslimiet en de reproduceerbaarheidslimiet
geldt een betrouwbaarheidsdrempel van 95 %.
9.1
or
Methode met interne standaard
Bereken het gehalte aan aminozuur /met behulp van de
formule:
ns • A-, • Ksi
Ki h
~'
VAS
9.2
be
Methode met externe standaard
i
r
y
waarin:
F
is de gebruikte verdunningsfactor;
Aj is het piekoppervlak van het te bepalen aminozuur /,
in m m 2 of integratoreenheden;
K, is de responsfactor van het te bepalen aminozuur /",
in mmol/mm 2 of mmol per integratoreenheid;
V
is het volume van het analysemonster, in I;
ki is het gehalte aan aminozuur /, in mmol/l.
10
Verslag
eld
Bereken het gehalte aan aminozuur /met behulp van de
formule:
K
Reproduceerbaarheid R
OPMERKING
In overeenstemming met ISO 5725-1 geldt:
reproduceerbaarheidsomstandigheden: Omstandig­
heden waarin beproevingsresultaten worden verkre­
gen bij toepassing van dezelfde methode op identiek
monstermateriaal in verschillende laboratoria door
verschillende personen met verschillende de appara­
tuur.
iew
8.2
OPMERKING
In overeenstemming met ISO 5725-1 geldt:
enkelvoudig beproevingsresultaat: Het resultaat dat
wordt verkregen door een beproevingsmethode een­
maal volgens de beschreven werkwijze uit te voeren.
herhaalbaarheidsomstandigheden: Omstandigheden
waarin onderling onafhankelijke beproevingsresul­
taten worden verkregen bij toepassing van dezelfde
methode op identiek monstermateriaal in hetzelfde
laboratorium door dezelfde persoon met dezelfde
apparatuur binnen een kort tijdsbestek.
Het absolute verschil tussen twee enkelvoudige beproe­
vingsresultaten die in reproduceerbaarheidsomstandigheden zijn verkregen zal, bij normaal en correct gebruik
van de methode, de in tabel 1 vermelde reproduceerbaar­
heid R niet meer dan eenmaal per 20 gevallen overschrij­
den.
ev
Pr
waarin:
F
is de gebruikte verdunningsfactor;
ns is de hoeveelheid interne standaard, in mmol;
Af is het piekoppervlak van het te bepalen aminozuur /",
in m m 2 of integratoreenheden;
KSj is de responsfactor van het te bepalen aminozuur /
ten opzichte van de interne standaard s, dimensieloos;
V
is het volume van het analysemonster, in I;
As is het piekoppervlak van de interne standaard, in
m m 2 of integratoreenheden;
к-, is het gehalte aan aminozuur /', in mmol/l.
Herhaalbaarheid г
Het absolute verschil tussen twee enkelvoudige beproe­
vingsresultaten die in herhaalbaarheidsomstandigheden
zijn verkregen zal, bij normaal en correct gebruik van de
methode, de in tabel 1 vermelde herhaalbaarheid г niet
meer dan eenmaal per 20 gevallen overschrijden.
Berekening (zie ook bijlage A.5.3)
8.1
Precisie
Vermeld in het verslag:
- de gevolgde methode door de vermelding: volgens
NEN 6394;
- de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie
van het monster;
- de verkregen gehaltes aan vrije aminozuren, in
mmol/l;
- eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn
waargenomen die het resultaat kunnen hebben
beïnvloed.
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Tabel 1 : Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid
Gemiddelde
Aminozuur
Herhaalbaarheidsomstandigheden
Reproduceerbaarheidsomstandigheden
mmol/l
mmol/l
r
mmol/l
asparaginezuur
0,202
0,0020
0,006
mmol/l
0,0044
threonine
0,012
0,0020
0,006
0,0021
0,007
serine
0,109
0,0036
0,010
0,0039
0,013
asparagine
0,241
0,0056
0,016
0,0181
0,052
glutaminezuur
0,075
SR
Ft
mmol/l
0,013
0,007
0,0048
0,015
0,677
0,0068
0,019
0,0194
0,057
glycine
0,022
0,0008
0,002
0,0044
0,013
alanine
0,087
0,0043
0,012
0,0033
0,013
leucine
0,007
0,0006
0,002
0,0019
0,005
y-aminoboterzuur
0,239
0,0068
0,019
0,0177
0,052
lysine
0,019
0,0004
0,001
0,0015
0,004
arginine
0,325
0,0111
0,032
0,0078
0,031
be
iew
ev
Pr
or
Vo
0,0026
proline
eld
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Biz. 4
NEN 6394:1996
(blanco)
be
iew
ev
Pr
or
Vo
eld
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Biz. 5
NEN 6394:1996
Bijlage A
(normatief)
Het chromatografisch systeem
A . I Eisen te stellen aan het chromatografisch
systeem
Het chromatografische systeem moet geschikt zijn om de
onder A.3 genoemde aminozuren te scheiden.
A.2.1
Eisen te stellen aan het chromatogram
Invloeden op de scheiding
or
De scheiding van de aminozuren is van vele factoren
afhankelijk zoals:
- fysisch-chemische eigenschappen van de aminozuren;
- eigenschappen van de kolomvulling;
- pH en ionensterkte van de gebruikte buffers;
- toevoegingen aan de buffers;
- temperatuur van de kolom;
- pompsnelheid.
Het blijkt dat sommige aminozuren door bovenstaande
factoren sterker worden beïnvloed dan andere aminozuren (bijlage C).
A.2.2
Derivatisering
In het gebied waarin wordt gewerkt, moet voor de desbetreffende aminozuren een lineair verband bestaan tussen
extinctie en concentratie.
A.2.4
Retentietijd
Voor het karakteriseren van vruchtenlimonades zijn
onder meer de volgende aminozuren van belang:
glutaminezuur
glycine
proline
serine
glutamine
tyrosine
Andere aminozuren die nog kunnen voorkomen:
cystine
histidine
isoleucine
leucine
lysine
A.4
methionine
phenylalanine
threonine
ornithine
valine
Kritische combinaties van aminozuren
Sommige combinaties van aminozuren zijn ook onder
optimale omstandigheden moeilijk of niet te scheiden.
Het betreft de volgende kritische combinaties:
be
iew
Lineariteit
ev
Pr
De extinctie die na de derivatisering wordt gemeten kan
sterk afhankelijk zijn van de reactietemperatuur en de
reactietijd. Het constant houden van de reactietemperatuur en de reactietijd is dan ook noodzakelijk.
A.2.3
Belangrijke aminozuren
alanine
Y-aminoboterzuur
arginine
asparagine
asparaginezuur
Vo
A.2
A.3
de basische aminozuren:
- ornithine-lysine
- histidine-ammoniak
de
-
neutrale en zure aminozuren:
threonine-serine
asparagine-glutaminezuur
proline-glycine
glycine-alanine
valine-cystine
eld
De retentietijden van de aminozuren uit het monster
mogen enigszins veranderen, mits de responsfactoren
van de aminozuren uit het standaardmengsel van aminozuren ongewijzigd blijven.
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Biz. 6
NEN 6394:1996
Vo
Figuur A.1: Voorbeeld berekening van de scheiding van twee pieken
A.5
Berekening
A.5.1 Berekening van de scheiding (p) van de twee
pieken
A.5.3.2 Piekhoogte
Bij het gebruik van een gestandaardiseerd systeem kan in
plaats van het piekoppervlak met de piekhoogte worden
volstaan.
Trek een rechte (a) die de maxima van de beide pieken ver­
bindt. Bepaal het minimum tussen de twee pieken en trek
een rechte (c) door dit punt loodrecht op de basislijn (b).
Meet de afstand (v) langs lijn с vanaf de basislijn tot het
snijpunt met het minimum tussen de twee pieken en de
afstand (h) van de basislijn tot het snijpunt met lijn a.
A.5.4 Berekening van de responsfactor met een interne
standaard
De scheiding van de pieken, is gelijk aan:
Bereken de responsfactor uit chromatogram S uit:
(fc^v) .
n
100
%
or
=
Kc! =
Berekening van de retentietijden
Bepaal de afstand of de tijd van de maxima van de pieken
ten opzichte van een vast referentiepunt.
A.5.3
nri: • As
ms
waarin:
KSi is de responsfactor van aminozuur /ten opzichte van
de interne standaard s;
rrij is de hoeveelheid aminozuur /, in mmol;
As is het piekoppervlak van de interne standaard, in
m m 2 of integratoreenheden;
ms is de hoeveelheid interne standaard, in mmol;
A
is het piekoppervlak van aminozuur /, in m m 2 of inte­
gratoreenheden.
be
iew
ev
Pr
waarin:
p is de scheiding tussen de pieken, in %;
h is de afstand van de basislijn tot het snijpunt van lijn a
en lijn c;
v is de afstand van de basislijn tot het snijpunt van het
minimum tussen de twee pieken en lijn с
A.5.2
OPMERKING
Indien een integrator wordt gebruikt, wordt Д uitge­
drukt in integratoreenheden.
Berekening voor kwantitatieve doeleinden
Aj = hrbj
waarin:
Aj is het oppervlak van de desbetreffende piek, in mm 2 ;
h-, is de hoogte van de desbetreffende piek ten opzichte
van de basislijn, in m m ;
bj is de breedte van de desbetreffende piek op de helft
van de hoogte /i,-f in mm.
Bereken de responsfactor uit het chromatogram van het
standaardmengsel van aminozuren (bijlage C) uit:
eld
A. 5.3.1
Piekoppervlak
Bereken het piekoppervlak met:
A.5.5 Berekening van de responsfactor met een externe
standaard
waarin:
Kj is de responsfactor van aminozuur /;
m-, is de hoeveelheid aminozuur /, in mmol;
A
is het piekoppervlak van aminozuur /, in m m 2 of inte­
gratoreenheden.
Dit document is een voorbeeld van NEN / This document is a preview by NEN
Bestelformulier
Stuur naar:
NEN Uitgeverij
t.a.v. afdeling Marketing
Antwoordnummer 10214
2600 WB Delft
NEN Uitgeverij
Postbus 5059
2600 GB Delft
Vlinderweg 6
2623 AX Delft
T (015) 2 690 390
F (015) 2 690 271
Ja, ik bestel
__ ex. NEN 6394:1996 nl Vruchtenlimonades - Bepaling van het gehalte aan
vrije aminozuren - Kolomchromatografische methode
www.nen.nl/normshop
€ 31.80
Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via
www.nen.nl/normshop
Stel uw vraag aan
Klantenservice via:
@NEN_webcare
Gratis e-mailnieuwsbrieven
Retourneren
Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen,
Fax: (015) 2 690 271
E-mail: [email protected]
Post: NEN Uitgeverij,
t.a.v. afdeling Marketing
Antwoordnummer 10214,
2600 WB Delft
(geen postzegel nodig).
normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze
e-mailnieuwsbrieven. www.nen.nl/nieuwsbrieven
Gegevens
Bedrijf / Instelling
T.a.v.
O M
O V
Voorwaarden
• De prijzen zijn geldig
tot 31 december 2015,
E-mail
tenzij anders aangegeven.
• Alle prijzen zijn excl. btw,
Klantnummer NEN
verzend- en handelingskosten
Uw ordernummer
BTW nummer
en onder voorbehoud bij
o.m. ISO- en IEC-normen.
Postbus / Adres
• Bestelt u via de normshop een
PostcodePlaats
pdf, dan betaalt u geen
handeling en verzendkosten.
TelefoonFax
• Meer informatie: telefoon
(015) 2 690 391, dagelijks
Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres)
van 8.30 tot 17.00 uur.
Postbus / Adres
• Wijzigingen en typefouten
in teksten en prijsinformatie
PostcodePlaats
voorbehouden.
• U kunt onze algemene
voorwaarden terugvinden op:
DatumHandtekeningwww.nen.nl/leveringsvoorwaarden.
Normalisatie: de wereld op één lijn.
preview - 2015