University of Groningen Epigenetic reprogramming of endogenous

University of Groningen
Epigenetic reprogramming of endogenous genes for permanent modulation of gene
expression
Huisman, Christian
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2015
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Huisman, C. (2015). Epigenetic reprogramming of endogenous genes for permanent modulation of gene
expression: Targeted interventions by self-engineered zinc finger proteins [Groningen]: University of
Groningen
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Nederlandse samenvatting
Chapter 10
Chapter 10
Nederlandse samenvatting
Het menselijk lichaam bestaat uit meer dan 200 verschillende celtypes en elk
celtype heeft zijn eigen specifieke functie. De genetische informatie, gecodeerd in
het DNA, instrueert de cellen hoe zij hun functie kunnen uitoefenen. De
genetische informatie bevat ongeveer 20.000 genen, die coderen voor de
functionele eenheden van de cel; de eiwitten. Het eiwitexpressie patroon bepaald
welke biologische processen plaats vinden in de cel. Precieze regulatie van deze
processen, waaronder groei, differentiatie en proliferatie, waarborgen het
normaal functioneren van de cel. Voor het uitoefenen van zijn functie wordt
slecht een deel van het totaal aantal genen in de cel afgeschreven tot eiwitten.
Het aantal genen dat actief getranslateerd wordt tot eiwitten veranderd
voortdurend en wordt gereguleerd door een dynamisch laag bovenop de DNA
genaamd "epigenetische laag. Epigenetica is de extra laag erfelijke informatie
bovenop de DNA sequentie van het genoom. De twee belangrijkste onderdelen
van epigenetische laag zijn DNA-methylatie; de toevoeging van de methylgroep op
de C-nucleotiden van het DNA, en posttranslationele histon modificaties. Histoneiwitten zorgen ervoor dat het DNA netjes wordt opgeslagen in de cel en deze
eiwitten zijn aftelbaar door hun uitstekende staarten die kunnen worden
gewijzigd op vele posities. De modificaties op de histoneiwitten hebben dus
invloed op de expressie van genen.
De epigenetische componenten van een gen (DNA methylatie en
histonmodificaties) hebben dus een belangrijke rol bij de regulatie van
genexpressie. Zo zijn de DNA methylatie niveaus in de promotor regio’s van veel
genen zeer bepalend voor het wel of niet tot expressie komen van deze genen
(Figuur 1). Deregulatie van de epigenetische informatie kan er toe leiden dat
genen afwijkend tot expressie komen, wat vervolgens tot ziekte kan leiden. In
kanker zijn genen met afwijkende expressie vaak nauw betrokken bij de
pathologie van kanker. Genen die belangrijk zijn voor het remmen van celgroei
hebben vaak een verlaagde expressie in kanker noemen we
tumorsuppressorgenen (TSG), waardoor kankercellen ongeremd kunnen groeien.
Genen die celgroei stimuleren hebben vaak een verhoogde expressie in kanker en
noemen we oncogenen. De verhoogde expressie van oncogenen zorgt ervoor dat
kankercellen een groeivoordeel hebben ten opzichte van gezonde cellen. Het aandan wel uitzetten van zulke genen is een mogelijke therapeutische strategie om
kankercellen minder hard te laten groeien.
Het specifiek aan- en uitzetten van genen kan bereikt worden met behulp van
artificiële transcriptiefactoren (ATFs). Een interessante ontwikkeling binnen de
celbiologie heeft het namelijk mogelijk gemaakt om endogene
transcriptiefactoren te customizen, waardoor je ze kunt targetten naar bijna
iedere gewenste plek in het humane genoom. Hierdoor kan in principe van elk
gen de expressie worden gemoduleerd, zowel opwaarts als neerwaarts. In de
220
Nederlandse samenvatting
praktijk is echter gebleken dat het aanzetten van epigenetisch uitgezette genen
nog steeds erg lastig is.
Het DNA-bindende deel van de ATFs gebruikt in deze thesis bestaat uit Zink
Vinger eiwitten. Elke zinkvinger kan drie basenparen herkennen, waardoor zes
zinkvingers tesamen 18 basenparen herkennen (Figuur 1). Dit maakt het mogelijk
om een specifieke locatie in het genoom te targetten. DNA-bindende domeinen
kunnen vervolgens worden gefuseerd aan een genactivator (bv VP64) die het gen
kunnen aanzetten, of aan een genrepressor (bv SKD) die het gen uit kunnen
zetten.
Een van de doelen van dit onderzoek was om de afwijkende
genexpressieniveaus in kankercellen te herstellen met behulp van ATFs en
vervolgens te kijken of er groeiremming plaatsvond. We hebben eerst in
eierstokkanker naar de rol van EpCAM (hoofdstuk 2) en ICAM-1 (hoofdstuk 3)
gekeken. Voor deze genen waren ATFs beschikbaar die eerder voor andere
doeleinden waren gebruikt. We begonnen met het laten zien dat de expressie van
deze genen uitstekend kon worden gemoduleerd met deze ATFs in
eierstokkanker. Bij aanvang van dit onderzoek was slechts een enkel TSG eerder
opgereguleerd mbv ATF technologie (Maspin), en in hoofdstuk 2 en 3 laten we
zien dat we nu ook EPCAM en ICAM-1 konden opreguleren. Na opregulatie van
deze genen konden we laten zien dat ze inderdaad betrokken zijn bij het remmen
van eierstokkanker.
Voor een aantal kandidaat TSGs in baarmoederhalskanker zijn we vervolgens
zelf ATFs gaan ontwikkelen (CCNA1, C13ORF18, TFPI-2 en EPB41L3). Uit eerder
onderzoek in ons lab is gebleken dat deze genen afwijkende DNA methylatie
patronen hebben in baarmoederhalskanker en daarom mogelijk een rol van
betekenis hebben in dit kankertype. Niet alleen waren we zeer goed in staat om
deze genen weer tot expressie te brengen met behulp van onze zelfontworpen
ATFs, we konden ook precies uitvinden of deze genen inderdaad een rol spelen bij
de pathologie van baarmoederhalskanker. Zo hebben we bijvoorbeeld ontdekt dat
C13ORF18, een gen met onbekende functie, groeiremming veroorzaakt in
kankercellen als het tot herexpressie wordt gebracht door middel van een ATF
(hoofdstuk 4). Maar we hebben ook laten zien dat TFPI2 en EPB41L3 een
remmende werking hebben op baarmoederhalskanker celgroei, wat eerder was
aangetoond in andere types kanker. Ook andersom hebben we aangetoond dat
de kandidaat TSGs Maspin en CCNA1 geen directe groeiremminggeven als ze tot
herexpressie worden gebracht, en daarom misschien een minder belangrijke rol
spelen in baarmoederhalskanker.
Echter, het nadeel van ATFs is dat de effecten maar tijdelijk zijn; zodra de ATF
niet meer aanwezig is in de cel, keren genen weer terug naar hun oorspronkelijke
expressieniveau, waardoor een ziekte zich weer opnieuw zou kunnen openbaren.
Het ultieme doel van dit onderzoek was dan ook om genen blijvend aan- of uit te
221
10
Chapter 10
zetten, wat mogelijk bereikt kan worden door de epigenetische foutjes op de
genen te repareren. Hierdoor wordt als het ware de epigenetica van een gen
geherprogrammeerd, waardoor er ‘permanente’ verandering van genexpressie
plaatsvindt. Het genspecifiek overschrijven van de epigenetica kan gedaan
worden door epigenetische enzymen te targetten naar het gen van interesse,
waardoor de enzymen lokaal rechtstreeks invloed kunnen uitoefenen op DNA
methylatie (hoofdstuk 5, 6 en 8) of histonmodificaties (hoofdstuk 7). We noemen
het herschrijven van de epigenetische code van genen ‘Epigenetic Editing’, een
strategie
die het laatste jaar enorm in opmars is, onder anderen vanwege nieuwe enzymen
die zijn ontdekt om DNA te demethyleren in menselijke cellen.
Om genen epigenetisch te herprogrammeren hebben we aan de DNAbindende domeinen DNA (de)methylerende en histon methylerende enzymen
gekoppeld. Tot nu toe zijn slechts een zeer beperkt aantal genen gemoduleerd
door middel van het overschrijven van de epigenetische informatie op het DNA,
maar in dit proefschrift laten we zien dat het wel degelijk mogelijk is om ook via
Epigenetic Editing efficiënt de expressie van genen te moduleren. Om te beginnen
konden we van het welbekende oncogen Her2/neu de expressie verminderen
door een histon modificerend enzyme (G9A) naar het Her2/neu gen te targetten.
Her2/neu is een oncogen wat tot overexpressie komt in ~20% van de borstkanker
gevallen en wordt veel gebruikt als therapeutische target in deze borstkanker
subtype. Inderdaad, het op Her2/neu gerichte enzym verminderde de expressie
van Her2/neu, wat vervolgens weer resulteerde in verminderde kankergroei.
Hoewel de rol van histonmodificaties niet altijd duidelijk is met betrekking tot de
regulatie van gene expressie (er zijn vele histonmodificaties), konden we hier ook
een direct verband zien tussen het aanbrengen van de histonmodificatie en het
afnemen van Her2/neu expressie (hoofdstuk 7).
Histonmodificaties kunnen dus van groot belang zijn voor het bepalen van de
expressie niveaus van genen. Vaak hangen deze modificaties nauw samen met de
mate van DNA methylatie op de genen. Actieve histonmodificaties zijn gelinkt zijn
aan ongemethyleerd DNA, en remmende histonmodificaties zijn gelinkt aan
gemethyleerd DNA. Crosstalk tussen de histonmodificaties en DNA methylatie
zorgen ervoor dat inhiberende histonmodificaties op den duur leidden tot
gemethyleerd DNA en visa versa. DNA methylatie wordt vaak beschouwd als de
stabiele factor in het bepalen van de expressie niveaus van genen op lange
termijn. Geimprinte genen zijn bijvoorbeeld genen die vroeg in de ontwikkeling
worden gemethyleerd en kunnen de rest van het leven uit blijven staan.
In veel ziektes worden afwijkende genexpressie niveaus veroorzaakt door
geleidelijke veranderdingen in DNA methylatie patronen (soms voorafgegaan door
afwijkende histonmodificaties), iets wat ook duidelijk het geval is bij de meeste
kanker types. Om deze genexpressie-niveaus voorgoed weer onder controle te
krijgen is het aanbrengen of verwijderen van DNA methylatie, afhankelijk van het
222
Nederlandse samenvatting
gen en de ziekte, dus zeer belangrijk. De heilige graal om expressieniveaus
blijvend te moduleren lijkt daarom dus het customizen va DNA levels op genen te
zijn. In dit proefschrift hebben we eerst onderzocht of het mogelijk is om DNA
methylatie van TSG in kanker te verwijderen waardoor deze genen weer actief
konden worden (Figuur 1). Tot nu toe was dat nog nooit gelukt om via een
demethylerend enzym gekoppeld aan een zinkvinger een TSG weer te activeren
en daardoor kanker te remmen. Dit komt met name omdat de enzym-family die in
staat is DNA te demethyleren nog niet zolang geleden ontdekt is (gedurende het
vervaardigen van dit proefschrift: Tet-enzymen). Ook is ontdekt dat het richten
Transiente effector domeinen (‘kortdurend’ effect): -gen activatie VP64
-gen repressie SKD
Epigenetic Editing domeinen (‘permanent’ effect): - DNA demethylatie (Tet2)
- DNA methylatie (M.SssI)
m
m
m
m
gen gemethyleerd:
gen komt niet tot
expressie
m
TAACGCGGACAGTGAAGTGCTACATGAGTCGGACTCAGACTCCAGGTGAAGCAGCCAGCAGAGGTCAGAGAGAGACAGCTCACGTTCCGGGTAATGTTGCAGGTCGAT
zinkvinger eiwit
gen promoter
target gen
Epigenetic Editing: gen activatie
gen gedemethyleerd:
gen komt wel
tot expressie
transcriptie
factoren
TAACGCGGACAGTGAAGTGCTACATGAGTCGGACTCAGACTCCAGGTGAAGCAGCCAGCAGAGGTCAGAGAGAGACAGCTCACGTTCCGGGTAATGTTGCAGGTCGAT
zinkvinger eiwit: ontworpen en ge-engineerd om 18 baseparen in de gekozen gen
promoter te binden (deze thesis heeft 9 genen als target: EPCAM, ICAM-1, C13ORF18,
CCNA1, TFPI2, Maspin, EPB41L3, Her2 en PLOD2).
target gen
Figuur 1. Epigenetic Editing. Artificiële transcriptiefactoren zijn fusie-eiwitten die uit een
DNA bindend domein bestaan (bijvoorbeeld een zinkvinger) die verbonden is aan een
effector domein (VP64, SKD). Het effector domain is specifiek naar het gen van interesse
getarget en beïnvloed de expressie van het gen. Door middel van Epigenetic Editing wordt
de epigenetische code (bijv DNA methylatie (weergegeven als rode cirkel) overschreven,
waardoor van een gen ‘blijvend’ de expressie kan worden gemoduleerd. In het voorbeeld
wordt mbv Tet2 de methylatie verwijderd, waardoor transcriptiefactoren die nodig zijn
voor het afschrijven van een gen kunnen binden, en vervolgens vind er transcriptie van
het gen plaats.
223
10
Chapter 10
van zulke enzymen naar promoter regios zorgt voor lokale DNA demethylatie. In
deze thesis beschrijven we een efficiënte methode waarin we ook laten we lokaal
de methylatie levels van TSGs kunnen verminderen, met wel ~35% (hoodstuk 5),
na het targetten van Tet-enzymen. Van onze doelgenen die praktisch niet tot
expressie kwamen, konden we de expressie met een factor 50 verhogen, wat
weer leidde tot verminderde tumor groei. Vervolgens hebben we verder
onderzocht naar methodes om dit proces nog efficiënter te maken. Zo kwamen
we erachter dat we door het toevoegen van een stofje die genen meer bereikbaar
maken voor grote enzymen zoals de Tet-enzymen, de opregulatie verder konden
verbeteren.
Aan de andere kant hebben we gebruik gemaakt van de methylerende enzymen
om genen juist uit te zetten, die aan stonden. Deze methylerende enzymen gingen
we koppelen aan zinkvingers die we vervolgens gingen targetten naar genen te
hard aanstonden. Inderdaad konden we op deze genen DNA methylatie
aanbrengen, wat vervolgens tot verminderde expressie van het gen leidde
(hoofdstuk 8). Zo hebben we PLOD2 weten te methyleren. Dit gen is een
belangrijk target vanwege zijn rol in fibrose en blijvende repressie van dit gen kan
op lange termijn misschien vermeerdering van littekenweefsel helpen voorkomen.
Door het PLOD2 gen te methyleren konden we de expressie gedurende het hele
verloop van het experiment laag houden, ook in afwezigheid van de methylase (10
dagen). Door deze unieke manier van genmodulatie konden we ook andere
epigenetische processen bestuderen die tijdens deze tien dagen optraden. Zo
hebben we precies onderzocht welke histonmodificaties veranderden naar het
aanbrengen van DNA methylatie en konden we op deze manier meer inzicht
krijgen in de crosstalk tussen DNA methylatie en histonmodificaties. Maar ook
andersom konden we nauwkeurig zien welke histonmodificaties veranderden na
het onderdrukken van PLOD2 gebruik makende van SKD-ZFPs. Verder hebben we
in dit onderzoek veel aandacht besteed aan het effect van epigenetische
medicijnen op de genexpressie van onze target genen. Deze epigenetische
medicijnen remmen de werking van epigenetische enzymen, wat vervolgens tot
genactivatie leidt. Hoewel deze medicijnen succesvol worden gebruikt om
bloedkanker-patiënten mee te behandelen vallen de resultaten voor andere
soorten kankers nog tegen, deels door de toxiciteit van deze medicijnen. Deze
toxiciteit wordt ondermeer veroorzaakt doordat deze medicijnen op veel genen
tegelijkertijd werken, dus ook op genen waarvan de expressie niet veranderd
dient te worden. Het gevolg is een scala aan bijeffecten. Mede daarom heeft
hebben we met het huidige onderzoek getracht de bijeffecten van zulke
epigenetische medicijnen te verminderen door alleen zinkvingers te richten naar
genen die een belangrijke rol spelen in het ziekteproces.
Hoewel het niet officieel bewezen is dat zinkvingers enkel aan het gen binden
waarheen ze worden getarget, hebben we wel een belangrijke stap gezet om de
binding van zinkvingers aan het genoom in kaart te brengen. We hebben
gevonden dat genen een aantrekkingskracht op zinkvingers uitoefenen vergeleken
224
Nederlandse samenvatting
met andere delen van het genoom (slechts 2% van het genoom zijn genen), en dat
met name als genen goed bereikbaar zijn, de zinkvingers preferentieel aan het
doel-gen bind (hoofdstuk 7). Dit verklaart ook waarom in het verleden onderzoek
heeft aangetoond dat genen specifiek gemoduleerd kunnen worden met
zinkvingers. Genen die uitstaan, zijn echter iets minder makkelijk te bereiken, wat
ten koste gaat van de specificiteit (hoofdstuk 5). Om de binding van de zinkvinger
aan deze uitgezette, moeilijk bereikbare genen te vergemakkelijken, laat dit
proefschrift ook zien dat lage concentraties van de gebruikte epigenetische
medicijnen in de kliniek (voor bloedkanker patienten) het effect van ATFs sterk
kunnen verbeteren (hoofdstuk 3 en 6). De bereikbaarheid van de ATF naar het
gen wordt verbeterd en we hebben we laten zien dat genen hierdoor voor langere
tijd aangezet kunnen worden dan normaal het geval is met ATFs of deze
epigenetische medicijnen afzonderlijk. In de toekomst kan een combinatie van
epigenetische medicijnen en programmeerbare ATFs misschien een
therapeutische oplossing bieden voor kanker.
Samenvattend kan gezegd worden dat dit proefschrift een hele mooie en
krachtige methode beschrijft hoe genen efficiënt gemoduleerd kunnen worden
mbv zinkvingers gelinkt aan een gen-activator (VP64) of een gen-repressors (SKD).
We konden op een unieke wijze de functie van bepaalde genen onderzoeken in
bepaalde soorten kanker en door modulatie van expressie van bepaalde genen
konden we de kankergroei remmen. Echter, de effecten van deze genexpressiemodulatoren lijken van korte duur te zijn. Om de expressie van genen voor lange
duur te bewerkstelligen konden we dmv Epigenetic Editing de epigenetica van de
doelgenen overschrijven. We konden met een methylerend enzym PLOD2
methyleren en hierdoor bleef de expressie laag voor de gemeten 10 dagen.
Andere genen konden we juist activeren door methylatie weg te halen. Of deze
genen permanent weer aan staan moet in vervolgstudies blijken. Permanente
opregulatie van genen is misschien moeilijker dan het permanent onderdrukken
van genen, omdat er constant processen in de cel aanwezig zijn die methylatie
weer op de genen wil zetten. Het nog efficiënter verwijderen van methylatie zou
hierbij kunnen helpen, alswel het remmen van de processen die de hermethylatie
bewerkstelligen. Toekomstige nieuwe inzichten in het DNA demethylatie proces
zou er ook toe kunnen leiden dat we nog efficiënter DNA demethylatie kunnen
verwijderen. Er is nog steeds een hoop onbekend hoe dit proces precies in zijn
werk gaat.
De methodes die in deze thesis worden beschreven zijn in principe bruikbaar
om de expressie van elk gen in het menselijke genoom te moduleren en dus
controle te krijgen over het hele genoom om ziekte te bestrijden. De protocollen
voor het reprogrammeren van de epigenetische code van target genen stelt
wetenschappers in staat om permanent de expressie van genen aan- of uit te
zetten met ‘single gen’ precisie. Ook draagt het overschrijven van epigenetische
codes bij om meer te weten te komen over epigenetische mechanismes.
225
10
Chapter 10
226