Susceptiliteitsbepaling van planktonische en

Susceptibiliteitsbepaling
van planktonische en
sessiele Burkholderia
cepacia complex cellen
Katrien De Visschere
Inleiding

Burkholderia cepacia complex:
17 nauw verwante species
 Gram-negatieve bacteriën
 Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij
mucoviscidosepatiënten
 Behandeling moeilijk door grote resistentie
 ≠ stammen vormen goed biofilms
→ verhoogde resistentie

Inleiding

Mucoviscidose
Autosomaal recessieve aandoening
 Ongeneeslijk
 Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar
→ o.a. problemen met luchtwegen en
spijsvertering
 Infectie met B. cepacia complex bacteriën:
→ “cepacia syndroom”: dodelijk
→ geleidelijk achteruitgang in longfunctie

Inleiding

Biofilms




Microbiële gemeenschap van sessiele cellen
Vastgehecht op een substraat, een oppervlak of aan elkaar
Ingebed in een extracellulaire matrix
Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere
resistentie tegen antimicrobiële agentia dan planktonische
cellen
Onderzoek

Wat?

Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen
(biofilms) van 33 ≠ Burkholderia cepacia complex stammen
t.o.v. 6 ≠ antibiotica bepalen
→ ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem, minocycline,
tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19)

Experimenten op “jonge” en “oude” culturen

Planktonische cellen



“Jonge” culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC)
“Oude” culturen: afdoding stationaire fase cultuur
Sessiele cellen


“Jonge” culturen: minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)
“Oude” culturen: afdoding mature biofilm
Onderzoek

Waarom?

Vergelijken groei-inhibitie bij “jonge” planktonische cellen
en biofilms door antibiotica

Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de
stationaire fase en mature biofilms door antibiotica
Methoden

“Jonge” planktonische cellen:








Verse reincultuur → kiemsuspensie (OD: 0,05) in MH 1x
→ 50x verdunnen
Kuipjes van antibiotica-microtiterplaat (96 kuipjes, bodem:
plat) vullen met MH 1x en verdunde kiemsuspensie
20u incubatie (37°C)
Absorptie in elk kuipje meten met VICTOR2TM
Bepaling minimaal inhiberende concentratie (MIC)
Kuipjes zonder groei → 100µL uitplaten (strijkplaatmethode)
Na 48u incubatie (37°C): groei nagaan
Bepaling minimaal bactericide concentratie (MBC)
Methoden

“Jonge” biofilms:








Verse reincultuur → startsuspensie in MH 1x
Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C)
Startsuspensie → werksuspensie (OD: 0,05)
Kuipjes van microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: rond) vullen
met MH 1x en werksuspensie (100µL)
4u incubatie (37°C)
3x spoelen met fysiologisch water
Kuipjes vullen met 100µL MH 2x
Antibiotica toevoegen (100µL)
Methoden

“Jonge” biofilms:






20u incubatie (37°C)
Spoelen met fysiologisch water
CellTiterBlue toevoegen (detectie levende cellen)
1u incubatie (37°C)
Fluorescentie meten met VICTOR2TM
Bepalen minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)
Methoden

Mature biofilms:










Verse reincultuur → kiemsuspensie in MH 1x
Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C)
Kiemsuspensie → startsuspensie (OD: 0,05)
Siliconeschijfjes in microtiterplaat (24 kuipjes) brengen
Kuipjes vullen met MH 1x en startsuspensie
4u incubatie (37°C)
3x spoelen met fysiologisch water
Kuipjes vullen met MH 1x
20u incubatie (37°C)
3x spoelen met fysiologisch water
Methoden

Mature biofilms:









Overbrengen in antibiotica-microtiterplaat
→concentraties antibiotica: 10 x MIC, tobramycine: 4 x MIC
20u incubatie (37°C)
3 x wassen met fysiologisch water
Schijfjes overbrengen in falconbuisjes
Buisjes 3 x vortexen en soniceren (cellen losmaken)
Kiemsuspensie wordt 7 maal 1:10 verdund
1mL per verdunning uitplaten (plaatgietmethode)
Kolonies tellen na 48u incubatie
Bepalen reducties in log(KVE)/schijfje
Resultaten: MIC

MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het
sputum van mucoviscidosepatiënten (KHCS)
MIC ≤ KHCS
MIC > KHCS
ceftazidime
63,7%
36,4%
ciprofloxacine
50,0%
50,0%
meropenem
63,6%
36,4%
minocycline
87,9%
12,1%
tobramycine
92,4%
7,6%
TMP-SMX (1-19)
21,2
78,8%
Resultaten: MBC


Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC?
mediaan
spreiding
ceftazidime
4
1 - 64
ciprofloxacine
2
1 - 32
meropenem
2-4
1 - 64
minocycline
32
1 - 512
tobramycine
2
1-4
TMP-SMX (1-19)
8
1 - 64
Grote spreiding MBC t.o.v. MIC
→ uitzondering: tobramycine (kleine spreiding)
MBIC vergeleken met MIC

Relatie MBIC vs. MIC:

De MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste
deel van de stammen
MBIC < 1/2 x MIC
1/2 x MIC  MBIC  2 x MIC
MBIC > 2 x MIC
ceftazidime
21,2%
75,8%
3,0%
ciprofloxacine
0,0%
84,8%
15,2%
meropenem
9,1%
78,8%
12,1%
minocycline
1,5%
77,3%
21,2%
tobramycine
6,1%
80,3%
13,6%
TMP-SMX (1-19)
9,1%
71,2%
29,7%
Reductie in aantal cellen bij mature
biofilms
TMP-SMX
tobramycine
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
groeicontrole
TMP-SMX
tobramycine
minocycline
meropenem
ciprofloxacine
ceftazidime
aantal cellen
(log(KVE)/schijfje)
B. pyrrocinia LMG 14191
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
groeicontrole
aantal cellen
(log(KVE)/schijfje)
B. multivorans LMG 13010
minocycline

meropenem

ciprofloxacine

De onderzochte antibiotica veroorzaken bij alle stammen
reductie
Mate van reductie: vertoont een grote variatie
Tobramycine is het meest werkzame antibioticum
→ met een paar uitzonderingen
Mate van biofilmvorming ↑,
cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑
ceftazidime

Conclusie

“Jonge culturen”
 MIC: vergelijking met klinisch haalbare
antibioticaconcentratie in het sputum van
mucoviscidosepatiënten:
 voor veel antibiotica is deze concentratie onvoldoende om
groei-inhibitie te veroorzaken

MBC: variabel t.o.v. MIC (uitzondering: tobramycine)

MBIC: vergelijkbaar met MIC
 bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 – 2] x MIC
Conclusie

“Oude” culturen

Reductie in aantal cellen bij mature biofilms:
→ vertoont een grote variatie
→ tobramycine is het meest werkzame antibioticum
→ mate van biofilmvorming ↑,
cellen die overblijven na behandeling met
antibiotica↑
Toekomstperspectieven

Experimenten op planktonische cellen in een
stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd
worden:

Antibioticaconcentraties: 10 x MIC, behalve
tobramycine: 4 x MIC

Met dank aan:
Prof. Nelis en Prof. Coenye
 Apr. E. Peeters
 Apr. B. Quartier


Zijn er nog vragen?