Bacteriële morfologie en cytokinerespons tijdens de initiële

p r o e f s c h r i f t b e s p r e k i n g
Bacteriële morfologie en cytokinerespons
tijdens de initiële behandeling van gramnegatieve sepsis
Auteur
J. Buijs
Trefwoorden
β-lactamantibiotica, continu doseren, cytokines, endotoxine, filamenten, sferoplasten
Samenvatting
Op 30 mei 2008 promoveerde mw. drs. J. Buijs
aan de Radboud Universiteit te Nijmegen op het
proefschrift getiteld ‘Bacterial morphology and
cytokine responses during initial treatment of
Gram-negative sepsis’. Het onderzoek werd begeleid door promotor dhr. prof. dr. J.W.M. van der
Meer (afdeling Interne geneeskunde en Infectie-
ziekten, Universitair Medisch Centrum St Radboud te Nijmegen) en de copromotoren dhr. dr.
A.S.M. Dofferhoff, internist-infectioloog, en dhr.
dr. J.W. Mouton, medisch microbioloog, CanisiusWilhelmina Ziekenhuis te Nijmegen.
Inleiding
celdood, morfologische veranderingen aan de bacteriën gezien. Deze morfologisch afwijkende bacteriën worden sferoplasten en filamenten genoemd
(zie Figuur 1). Sferoplasten zijn afgeronde bacteriën,
die gevormd worden na PBP-2-blokkade. Filamenten zijn zeer lange, strengvormige bacteriën, die gevormd worden doordat PBP-3 geblokkeerd wordt,
waardoor het micro-organisme niet meer in staat is
zich in tweeën te scheiden (septeren) nadat de celmassa verdubbeld is. Er zijn ook b-lactamantibiotica
die PBP-1 blokkeren (penicilline-G), wat leidt tot
het snel in fragmenten uiteenvallen van de geëxposeerde bacterie zonder voorafgaande morfologische
veranderingen. Uit in-vitrostudies is gebleken dat
het aantal eenheden endotoxine per ‘colony forming unit’ (CFU) in Escherichia coli-filamenten en
E. coli-sferoplasten respectievelijk een factor 13,5x
en 5,36x hoger ligt vergeleken met staafvormige
E. coli-bacteriën.7
Al kort na de introductie van antibiotica ter behandeling van bacteriële infecties werd melding gemaakt
van soms optredende, ernstige klinische achteruitgang van patiënten onmiddellijk na de start van de
therapie.1,2 Enige jaren later werd duidelijk dat dit
verschijnsel mogelijk verklaard werd door de plotselinge vrijmaking van toxische componenten van
de bacterie, met name endotoxine (lipopolysaccharide; LPS), dat in de celwand van de gramnegatieve
bacterie in ruime mate aanwezig is.3 Dit endotoxine
stimuleert verschillende cellen van het immuunsysteem, hetgeen resulteert in de vorming van proinflammatoire cytokines, zoals TNF-a en IL-6.
Deze stoffen regisseren diverse biologische processen in het kader van de afweer tegen infecties. Hogere concentraties van deze cytokines zijn geassocieerd met een hoge mortaliteit van infectieziekten.4,5
b-lactamantibiotica binden en blokkeren receptoren
(‘penicillin binding proteins’; PBP) in het cytoplasmamembraan van de bacterie. Binnen de inmiddels
vrij grote groep van b-lactamantibiotica bestaan
belangrijke verschillen in de capaciteit tot endotoxinevrijmaking. Dit lijkt samen te hangen met de affiniteit van de individuele middelen voor een van de
verschillende PBP’s.6 Na blokkade van PBP’s door
b-lactamantibiotica worden, voorafgaand aan de
197
vol.
3
nr.
5 - 2008
(Tijdschr Infect 2008;3:197-200)
Dit proefschrift
De in-vitrostudies die beschreven zijn in dit proefschrift, tonen aan dat, wanneer E. coli- of Pseudomonas
aeruginosa-stammen blootgesteld worden aan PBP3-specifieke middelen, zoals aztreonam of ceftazidime, hoge endotoxineconcentraties worden vrijge-
t i j d s c h r i f t
v o o r
i n f e c t i e z i e k t e n
A
B
Figuur 1. A. Escherichia coli-sferoplasten (na toediening
van meropenem 0,5x de MIC) en B. E. coli-filamenten (na
toediening van ceftazidime 0,5x de MIC).
maakt. Opmerkelijk is de bevinding dat ceftazidime
alleen bij lage concentraties in staat is tot filamentinductie. Gedurende continue expositie van bacteriën
aan een concentratieniveau van 40x de minimaal inhiberende concentratie (MIC) en hoger treedt snelle
en effectieve bacteriolysis op in plaats van filamentvorming, hetgeen leidt tot beperkte hoeveelheden
endotoxine-inbouw in de celwand. Deze bevinding
wordt verklaard door de tweeledige concentratieafhankelijke affiniteit van ceftazidime voor PBP’s:
bij een voldoende hoge, continue concentratie wordt
een PBP-1-effect gezien, terwijl bij een lagere ceftazidimeconcentratie het PBP-3-effect overheerst.8
Naast ceftazidime is ook cefotaxim een b-lactamantibioticum met een dosisafhankelijke affiniteit voor
PBP-3 en PBP-1. Om het doseerniveau te bepalen
waarop deze middelen van PBP-3- naar PBP-1-effect
overschakelen, werden studies verricht bij 37 stammen E. coli, Klebsiella spp., P. aeruginosa en Acinetobacter spp., inclusief 14 ‘extended spectrum’ b-lactamase (ESBL)-positieve stammen. De concentratie
waarbij filamentvorming optrad, bleek te kunnen
variëren per bacteriefamilie, -genus of -stam, maar
treedt in het algemeen op bij concentraties ruim onder de MIC tot soms 100x de MIC.9 Inductie van
filamenten kon ook aangetoond worden bij absoluut
of relatief ongevoelige (ESBL-positieve) micro-organismen. Dit kan in de klinische praktijk leiden tot
bijkomende en onverwachte effecten tijdens de (empirische) behandeling van gramnegatieve infecties
met b-lactamantibiotica.
Teneinde de in-vivoconsequenties van deze bevindingen verder te exploreren, werden de effecten
van intramusculaire injecties van in vitro geproduceerde filament-, sferoplast- en staafvormige E.
coli-bacteriesuspensies in een neutropenemuismodel
bestudeerd. Hierbij bleek dat filamenten en sfero-
t i j d s c h r i f t
v o o r
i n f e c t i e z i e k t e n plasten in afwezigheid van het antibioticum binnen 24 uur weer staafvormen aannamen, en dat zij
blijkens kweek, endotoxine- en cytokinebepalingen,
weer even vitaal waren als bacteriën die tevoren niet
aan antibiotica blootgesteld waren. De morfologisch
veranderde bacteriën bleken wel slechter in staat tot
systemische verspreiding, wat mogelijk samenhangt
met een veranderde migratiecapaciteit. In deze studies kon een duidelijke relatie worden getoond tussen
lokale concentraties endotoxine, plasmaendotoxine
en de hoogte van de concentraties circulerende proinflammatoire cytokines TNF-α en IL-6.7
Door een modificatie in het model konden in de
neutropene muis onder invloed van ceftazidime
of meropenem filamenten en sferoplasten tot ontwikkeling worden gebracht. Significant verhoogde
concentraties van pro-inflammatoire cytokines
werden aangetoond bij behandeling met filamentinducerende antibiotica (aztreonam of ceftazidime),
vergeleken met controles. Bij toepassing van 2
verschillende sferoplastinducerende carbapenems
(meropenem en imipenem) werden lage cytokineconcentraties gezien, wat waarschijnlijk gunstiger is
voor de gastheer.
Daar de in-vitrostudies aantoonden dat filamentvorming afhankelijk was van het antibioticum, de dosering en het doseerregime was, werden verschillende
behandelschema’s van antibiotica met verschillende
PBP-affiniteit in het in vivo neutropenemuismodel
onderzocht. Bolusinjecties met ceftazidime en meropenem werden vergeleken met continue infusie in
de staartvene. Continue infusie met minimaal 80
mg/kg ceftazidime bleek bij E. coli-sepsis filamentvorming te voorkómen. Intraveneuze bolusinjecties
met ceftazidime bleken niet in staat filamentvorming te voorkomen, ondanks piekconcentraties van
het antibioticum in het serum van 486 mg/l (1.944x
MIC). Kennelijk is niet alleen de concentratie, maar
vooral ook de duur van expositie van het micro-organisme aan het antibioticum van belang.
Bij zowel E. coli- als bij P. aeruginosa-sepsis, en bij
toepassing van zowel ceftazidime als meropenem
werden significant hogere plasmacytokineconcentraties gevonden bij continu behandelde muizen (zie
Figuur 2 op pagina 199).10 Kennelijk wordt het immuunsysteem van de gastheer bij continue infusie
blootgesteld aan hogere concentraties vrijgemaakt endotoxine, waarschijnlijk door een effectievere bacteriolysis. De met bolusinjecties ceftazidime behandelde
muizen lieten filamenten in de dijspier zien in combinatie met lage systemische cytokineconcentraties.
Dit lijkt op het eerste gezicht in tegenspraak met de
vol.
3
nr.
5 - 2008
198
p r o e f s c h r i f t b e s p r e k i n g
ceftazidime continu
ceftazidime bolus
meropenem continu
meropenem bolus
log CFU /g spier
1,0x109
1,0x108
1,0x107
A
1,0x106
plasma TNF-α (pg/ml)
750
500
Conclusie
250
0
B
plasma IL-6 (pg/ml)
7.500
5.000
2.500
0
C
Figuur 2. A. De CFU in de spier, B. het gehalte TNF-α en
C. IL-6 in plasma 4 uur na continue of intermitterende
behandeling van E. coli-sepsis met ceftazidime of meropenem in neutropene muizen.
beschreven in-vitrogegevens. De relatieve onbereikbaarheid van het in de celwand gebonden endotoxine
in de filamenten in het infectiefocus zou echter een
verklaring kunnen vormen voor deze observatie. Op
grond van deze gegevens vermoeden wij dat aanvullende antibiotische behandeling van filamenten nadelig zou kunnen zijn, vanwege de mogelijkheid van
vrijmaking van hogere concentraties endotoxine. Dit
kan mogelijk leiden tot een weliswaar uitgestelde,
maar toegenomen endotoxine- en cytokinerespons
bij de gastheer.
199
De volgende studies werden dan ook gericht op het
blootstellen van reeds gevormde filamenten aan vervolgtherapie. Na tobramycine, een aminoglycoside,
werden de filamenten binnen een uur korter, wat
bleek te leiden tot minder hoge cytokinespiegels,
terwijl vervolgtherapie met een tweede dosis ceftazidime lange filamenten met hoge endotoxineconcentraties induceerde. Bij blootstelling van filamentvormige of staafvormige E. coli-bacteriën aan hoge
doseringen meropenem bleken de staafvormige
E. coli-bacteriën hoge cytokinespiegels te induceren,
in tegenstelling tot de filamenten. Kennelijk zijn de
intramusculaire filamenten nog gedurende enige
tijd beschermd tegen lysis door meropenem.
vol.
3
nr.
5 - 2008
Deze studies laten zien dat door b-lactamantibiotica geïnduceerde, morfologische veranderingen van
gramnegatieve bacteriën, een fenomeen dat zelfs bij
ESBL-vormende stammen met MIC’s tot zelfs >32
mg/l al vanaf concentraties van 0,2x MIC aangetoond
kan worden, negatieve effecten kunnen hebben op de
gastheer. Niet alleen de antibioticumkeuze, maar ook
de dosering, de doseerschema’s en de toepassing van
combinatietherapie hebben duidelijke invloeden op
de morfologie, de endotoxinevrijmaking en de immunologische respons van de gastheer. Continue infusie
van b-lactamantibiotica lijkt duidelijke voordelen te
bieden ten opzichte van intermitterende behandeling,
niet alleen bij de middelen die filamenten induceren
door PBP-3-binding, maar ook bij middelen die sferoplasten laten ontstaan. Naast het reeds bekende argument dat de concentratie van b-lactamantibiotica zo
lang mogelijk boven de MIC gehouden moet worden,
biedt deze bevinding een additioneel argument in het
voordeel van continu doseren. In hoeverre deze experimentele gegevens geëxtrapoleerd kunnen worden
naar de humane situatie, zal wellicht blijken uit aanvullende klinische data.
Toekomstig onderzoek zou zich vooral moeten richten op het meten van bacteriële en gastheerparameters
gedurende het verdere verloop van ernstige gramnegatieve infecties, met name ook door middel van het
verzamelen van directe parameters van effectiviteit.
Referenties
1. Farmer TW. Jarisch-Herxheimer reaction in early syphilis:
treatment with crystaline penicillin G. JAMA 1948;138:480-5.
2. Hopkin BD. A nasty shock from antibiotics? Lancet
1985;2:594.
t i j d s c h r i f t
v o o r
i n f e c t i e z i e k t e n
3. Leeson MC, Fujihara Y, Morrison DC. Evidence for lipopolyaccharide as the predominant pro-inflammatory mediator
in supernatants of antibiotic-treated bacteria. Infect Immun
1994;62:4975-80.
4. Mustafa MM, Mertsola J, Ramilo O, Saez-Llorens X, Risser
RC, McCracken GH Jr. Increased endotoxin and interleukin-1β
concentrations in cerebrospinal fluid of infants with coliform
meningitis and ventriculitis associated with intraventricular
gentamicin therapy. J Infect Dis 1989;160:891-5.
5. Dofferhoff AS, Esselink MT, De Vries-Hospers HG, Van Zanten A, Bom VJ, Weits J, et al. The release of endotoxin from
antibiotic-treated Escherichia coli and the production of
tumour necrosis factor by human monocytes. J Antimicrob
Chemother 1993;31:373-84.
6. Jackson JJ, Kropp H. Differences in mode of action of ßlactam antibiotics, influence on morphology, LPS release and
in-vivo antibiotic efficacy. J Endotox Res 1996;3:201-18.
7. Buijs J, Dofferhoff AS, Mouton JW, Van der Meer JW. Pathophysiology of in-vitro induced filaments, spheroplasts
and rod-shaped bacteria in neutropenic mice. Clin Microbiol
Infect 2006;12:1105-11.
8. Dofferhoff AS, Buijs J. The influence of antibiotic-induced
filament formation on the release of endotoxin from Gramnegative bacteria. J Endotox Res 1996;3:187-94.
9. Buijs J, Dofferhoff AS, Mouton JW, Wagenvoort JH, Van der
Meer JW. Concentration dependency of ß-lactam-induced fi-
t i j d s c h r i f t
v o o r
i n f e c t i e z i e k t e n lament formation in Gram-negative bacteria. Clin Microbiol
Infect 2008;14:344-9.
10. Buijs J, Dofferhoff AS, Mouton JW, Van der Meer JW.
Continuous administration of PBP-2 and PBP-3 specific ßlactams causes higher cytokine responses in murine Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli sepsis. J Antimicrob
Chemother 2007;59:926-33.
Ontvangen 31 augustus 2008, geaccepteerd 6 oktober 2008.
Correspondentieadres
Mw. dr. J. Buijs, internist
Atrium Medisch Centrum
Afdeling Interne Geneeskunde
H. Dunantstraat 5
6419 PC Heerlen
E-mailadres: [email protected]
Belangenconflict: geen gemeld.
Financiële ondersteuning: Stichting Wetenschappelijk
Onderzoek Interne Geneeskunde van het CanisiusWilhelmina Ziekenhuis.
vol.
3
nr.
5 - 2008
200