Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2011-2012
Beheersing van Rhizoctonia solani op sla door het bevorderen
van de bodemweerbaarheid
Pauline Deltour
Promotor: Prof. dr. ir. Monica Höfte
Copromotor: dr. ir. Soraya de Carvalho França
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de
bio-ingenieurswetenschappen: Landbouwkunde
i
De auteur, copromotor en promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.
Gent, juni 2012
De promotor:
Prof. Dr. ir. Monica Höfte
De co-promotor:
Dr. ir. Soraya de Carvalho França
De auteur:
Pauline Deltour
ii
Woord vooraf
Tjing tjing!
Geachte lezers, genodigden, snuisterende voorbijgangers,
Vooraleer u in dit werk duikt, wil ik u graag attent maken op het feit dat er twee glazen voor mij
staan. Deze dienen voor niets anders dan voor een dubbele proost.
Het glas in mijn linker hand hef ik op alle “Groten-van-het-Labo”.
Soraya, de denkoefening waarbij ik tracht me een betere begeleider in te denken dan jou is zwaarder
dan gelijk welke andere die ik doorploeterd heb voor deze thesis (en dat waren geen lichtgewichtjes).
Terwijl ik aan het ploeteren was, reikte je me vol geduld de hand (soms wel twee) zodat ik niet uit
evenwicht zou geraken. Ik sta nog steeds versteld van jouw immer aanwezige lach en hoop stiekem
naast de vele kneepjes van het onderzoek ook een tikkeltje van je oeverloos optimisme te hebben
opgestoken. Prof Höfte, bedankt om me na mijn laattijdige gedachtenverandering een kans te geven
om mijn thesis in jouw labo te maken en me hierbij te begeleiden met al jouw expertise. Sarah, jouw
doctoraat was de eerste baksteen waarop ik alles heb voortgebouwd. Ik ben een bofkont dat ik zo’n
handig vademecum voor mijn thesis onder de arm kon nemen! Hari, zonder jouw hulp zou de PLFA
analyse een veel groter karwei geweest zijn. Prof Boeckx ook bedankt voor het ter beschikking
stellen van uw labo voor onze proef. Liesbeth en andere, merci om de Sint-Katelijne-Waver serre
voor onze proef open te stellen en ons te helpen bij het oogsten, scoren, inwerken… Alle andere
Groten van het Labo, ook voor jullie hef ik het glas!
In mijn rechter hand houd ik het glas dat ik graag wil heffen op de “Groten-van-het-Hart”.
Mama, papa, jullie oren zijn wonderbaarlijk goed bestand tegen stormwinden vol gezaag. Mama,
bedankt om mijn thesis door te nemen en te filteren op taalblunders. Quinten, merci om mij te
voorzien mijn dagelijkse portie cynische opmerkingen en het zonder klagen aanhoren van de
grijsgedraaide cd van The Offspring die mijn bron van energie was voor de statistische analyses. Ben,
ik neem deze gelegenheid even ter harte om uw excel kennis te bezingen. Chers amis, ook al worden
niet al uw namen gespecifieerd, u bent onontbeerlijk geweest voor de productie van dit opus. Veel
onontbeerlijker dan dat dit hoopje papier op het eerste zicht kan laten uitschijnen of als deze
woorden dit kunnen. Silke, thesispartner in crime, voor jou maak ik zelfs een buiging door de knie.
Het was me een waar genoegen om met jou te kunnen labo-swingen, bodemmedia te laten
ontploffen, mijteninvasies te bestrijden of uren en uren potjes af te wassen.
Geachte lezers, genodigden en snuisterende voorbijgangers, ik nodig u uit om uw pad doorheen dit
werk verder te zetten en u onder te dompelen in de wereld van de sla, schimmels,
bodemorganismen en veel meer…
i
Lijst van afkortingen
AG
Anastomosis Groep
AUDPC
Area Under Disease Progress Curve
AWCD
Average Well Colour Development
BCA
Biological Contol Agents
DPC
Disease Progress Curve
ISG
Inter Specifieke Groepen
PC
Principale Component
PCA
Principal Components Analysis
PCG
Provinciaal Proefcentrum voor de Groententeelt Oost-Vlaanderen (Kruishoutem)
PDA
Potato Dextrose Agar
PDASM
Potato Dextrose Agar met 100mg l-1 streptomycine
PDASS
Potato Dextrose Agar met 100 mg l-1 streptomycine en 4 mg l-1 prochloraz
PLFA
Phospholipid Fatty Acid
PSKW
Proefcentrum voor Groententeelt te Sint-Katelijne-Waver
q. c.
Query coverage
RDD
Rhizoctonia Disease Decline
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
z. d.
Zonder datum
ii
Samenvatting
Bodemgebonden ziektes, zoals smet, vormen een voornaam probleem in de slateelt, zeker sinds de
afschaffing van het breedspectrum bodemontsmettingsmiddel methylbromide. Een mogelijk
alternatief voor de beheersing van smet is het versterken van de weerbaarheid van de bodem. In
deze thesis werd gezocht naar een methode om de weerbaarheid van de bodem tegenover
Rhizoctonia solani te evalueren, ontleden en versterken.
Het eerste luik van deze thesis handelt over de ontwikkeling van een biotest die het natuurlijk
inoculum en de weerbaarheid van de bodem tegenover R. solani opmeet. De test bestond uit de
meting van de snelheid van de symptoomontwikkeling op slabladschijfjes gelegd op het te testen
bodemoppervlak. Er werd gewerkt met bodems met een verschillende voorbehandeling: één
onbehandelde bodem, één die ontsmet was met Monam en één die behandeld was met Herbie.
Enkel in de onbehandelde bodem kon er een natuurlijk inoculum worden vastgesteld met de biotest.
Voor de analyse van de weerbaarheid werd er gekeken naar het effect van verschillende
inoculumconcentraties, het autoclaveren van de bodem en het toevoegen van boekweitmeel. De
biotest liet toe verschillen in symptoomontwikkeling te detecteren. Om de resultaten van de biotest
te valideren naar weerbaarheid toe moeten meerdere gronden verder getest worden.
In het tweede luik werd onderzoek verricht naar de mogelijkheid om met ligninerijke producten de
bodemweerbaarheid tegen R. solani te versterken. Eerder onderzoek had reeds de effectiviteit van
zuivere lignine en ligninerijke producten zoals vlasvezels en houtsnippers aangetoond (Van Beneden,
2009). Toegevoegd lignine zou volgens de lignine-melanine hypothese lignine-afbrekende
organismen stimuleren. De lignocellulose afbrekende enzymen zijn ook in staat melanine af te
breken. Scleroten bestaan voornamelijk uit melanine en de afbraak van deze molecule maakt
scleroten vatbaarder voor stress (Subbarao et al., 1999). Er werden drie producten getest: een
poeder van druivenpitten (Lignosol), een effluent van de papier industrie (Sappi-Out) en Miscanthus,
een houtachtig gras met hoge opbrengst.
Ten eerste werden de directe effecten van Lignosol op R. solani onder de loep genomen. Er werd
vastgesteld dat enkele chemische constituenten van Lignosol de groei van mycelium in vitro kunnen
beperken. Lignosol bleek tevens de kieming van scleroten van R. solani te kunnen bevorderen. Een
gestimuleerde kieming kan de antagonistische populatie bevorderen en de scleroten zelf afzwakken.
Ten tweede werd de effectiviteit van Lignosol en Sappi-Out geëvalueerd onder veldcondities. Er werd
0.5% van elk product ingebracht in de bouwvoor van een serre met eikenbladsla te Sint-KatelijneWaver. Zowel in de ziekte-incidentie als in de levensvatbaarheid van de scleroten werden geen
significante verschillen vastgesteld. De scleroten uit de behandelde bodems waren daarentegen wel
significant meer geparasiteerd. De beperkte effecten kunnen verklaard worden door de mogelijke
inertie van de grondsoort tegenover ligninebronnen, de lage toegepaste dosis of de te korte tijd
tussen het inwerken en het planten.
iii
In een laatste proef werden de veranderingen in de microbiële bodempopulatie na incorporatie van
Lignosol of Miscanthus gekarakteristeerd d.m.v. fosfolipiden vetzuuranalyse (PLFA) en metabolische
profilering (Biolog). Om een beter inzicht te krijgen in de bodemafhankelijkheid van de effectiviteit
van de ligninebronnen werd er gewerkt met een bodem waar ligninebronnen positieve resultaten
geven (PCG) en een bodem waar resultaten uit blijven (PSKW). De bodems werden in glazen potten
waarin scleroten waren begraven gedurende zowel twee als vier weken geïncubeerd. Uit de PLFA
analyse bleek na incorporatie van Lignosol de proportie aan schimmels en Gram negatieve bacteriën
toe te nemen in beide bodems. Dit bleek ook samen te gaan met een verhoogd en diverser
metabolisme van de schimmelpopulatie. De metabolische karakterisatie van de bacteriële
gemeenschap onthulde een populatie die een hoger verbruik had van de bronnen α-cyclodextrine,
glycogeen, D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside na toepassing van Lignosol of Miscanthus in PCG
bodem. Het toegenomen verbruik van deze bronnen zou mogelijks een indicator kunnen zijn voor
een goede werking van de ligninebronnen. De verschuivingen in de microbiële populatie na twee
weken waren intermediair aan deze na vier weken. De onbehandelde bodems van PCG en PSKW
waren slechts beperkt te onderscheiden aan de hand van de gebruikte analysemethoden. De bodem
van PCG (met hogere lignine-effectiviteit) leek een schimmelpopulatie te bezitten met een diverser
metabolisme en een bacteriële populatie die al een verhoogd verbruik van de bronnen
α-cyclodextrine, glycogeen, D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside had. Het totaal bodemleven
gekarakteriseerd aan de hand van het totaal geëxtraheerde PLFA’s was niet verschillend tussen beide
bodems. In PSKW bleken de PLFA’s proportioneel uit meer biomerkers voor schimmels en Gram
negatieve bacteriën te bestaan. Voor een betere karakterisatie van gronden met verschillende
lignine-effectiviteit en de effecten na incorporatie van ligninerijke bronnen dienen meer gronden
vergeleken te worden.
iv
Summary
Soilborne diseases like bottom rot, caused by Rhizoctonia solani, are one of the major problems in
lettuce cultivation, especially since the abolishment of methylbromide. Enhancing the soil
suppressiveness would be a possibility to cope with bottom rot. The research conducted in this thesis
aimed to find a method to measure the soil suppressiveness, to enhance it and to better understand
the underlying mechanisms.
The first part of this thesis consists of the search for a bioassay by which it would be possible to
measure the natural inoculum of R. solani in soil and the soil suppressiveness. Small plastic trays
were filled with soil and covered with lettuce leaf discs. The soil suppressiveness and natural
inoculum was evaluated by the speed of appearing symptoms. Soils from one greenhouse which was
fumigated in different ways were compared: Monam, Herbie and an untreated plot. It was only
possible to capture R. solani on the leaf discs from the untreated soil. To evaluate the test for its
capacity to measure soil suppressiveness, the soils were autoclaved, inoculated with different levels
and treated with buckwheat. It was possible to capture differences in soil and treatments. More soils
should be checked to link the results of the bioassay with the soil suppressiveness.
In the second part some lignin rich products were checked for their abilities to enhance soil
suppressiveness towards R. solani. Previous research showed already the effectiveness of pure lignin
and other lignin rich products like flax shives and wood fibers (Van Beneden, 2009). According the
lignin-melanin hypothesis, the lignin would stimulate lignin degraders, which are able to break down
melanin with the same enzymes as used for the breakdown of lignin. The cell wall of sclerotia of
R. solani consists out of melanin and the promoted melanin degradation makes the sclerotia more
vulnerable to stress (Subbarao et al., 1999). Three products were tested: a powder of grape seeds
(Lignosol), an effluent of the paper industry (Sappi-Out) and Miscanthus, a high yielding woody grass.
First, the direct effects of Lignosol on R. solani were investigated. Chemical substances seemed to
suppress the growth of the pathogen. Lignosol also appeared to stimulate the germination of the
sclerotia. Promoted germination can contribute to the soil suppressiveness by enhancing the
antagonistic population and the weakening of the sclerotia.
Secondly, the effectiveness of Lignosol and Sappi-out were evaluated in field circumstances. The soil
in a greenhouse with oak leaf lettuce was treated with 0.5% of these products. There were no
significant differences in the disease incidence and viability of the sclerotia, but treatments did
increase the amount of parasites retrieved from the sclerotia. The small effects could be due to the
inability of the soil to react to lignin rich products, the low doses applied and the short time between
the treatment and planting the lettuce.
v
The last experiment aimed to clarify the changes in the microbial community after incorporation of
1% Lignosol or Miscanthus in soil with PLFA extraction and CLPP (Community level Physiological
Profiling). The success of lignin rich products seemed to be soil dependent. Therefore two soils were
tested. One soil with high lignin effectiveness (PCG) and one with low lignin effectiveness (PSKW).
The treated soils were incubated in glass jars for two or four weeks. PLFA analyses revealed an
increase of fungi after treatment with Lignosol in both soils. This seemed to coincidence with a
higher and more divers metabolism of the fungal population. The bacterial population shifted after
treatment with Lignosol or Miscanthus in PCG soil to one with a higher use of the sources
α-cyclodextrin, glycogen, D-cellobiose and β-methyl-D-glucoside. The higher use of these sources
might be a good indicator for the lignin effectiveness. The size of the shifts in microbial community
after two weeks of incubation were half those of a four week incubation period. The untreated soils
of PCG and PSKW differentiated only in a limited extent. The PCG soil seemed to have a more active
and diverse fungal population and a bacterial community which had already a higher use of the
sources α-cyclodextrin, glycogen, D-cellobiose and β-methyl-D-glucoside. The size of the microbial
community, measured by total PLFA-C extracted, didn’t differed in these soils. The soil of PSKW had
a higher proportion of fungi and Gram negative bacteria. More soils need to be investigated and
compared to have a more clear and trustworthy characterization of the lignin effectiveness of soils.
vi
Inhoud
Woord vooraf ........................................................................................................................................... i
Lijst van afkortingen .................................................................................................................................ii
Samenvatting...........................................................................................................................................iii
Summary ..................................................................................................................................................v
1. Inleiding ............................................................................................................................................... 1
2. Literatuurstudie ................................................................................................................................... 3
2.1. Slateelt en smet ............................................................................................................................ 3
2.1.1. Inleiding ................................................................................................................................. 3
2.1.2. De teelt .................................................................................................................................. 3
2.1.3. Smet in de slateelt ................................................................................................................. 3
2.2 Rhizoctonia solani Kühn ................................................................................................................ 4
2.2.1. Omschrijving .......................................................................................................................... 4
2.2.2. De ontwikkeling van de ziekte ............................................................................................... 5
2.2.3. Scleroten................................................................................................................................ 6
2.2.4. Bestrijding.............................................................................................................................. 7
2.3. Bodemweerbaarheid .................................................................................................................. 10
2.3.1. Enkele begrippen en standaardconcepten.......................................................................... 10
2.3.2. Bodemweerbaarheid analyseren ........................................................................................ 13
2.3.3. Stimulatie van de bodemweerbaarheid met organische bodemsupplementen ................ 17
2.4. Lignine ........................................................................................................................................ 19
2.4.1. Eigenschappen en voorkomen ............................................................................................ 19
2.4.2. De lignine - melanine hypothese ......................................................................................... 19
3. Materiaal en methoden..................................................................................................................... 21
Deel A: De biotest .............................................................................................................................. 21
3.A.1. De proefopzet ..................................................................................................................... 21
3.A.2. Voorafgaande testen: analyse van de slatypes en het inoculumtype ................................ 22
3.A.3. Detectie van het natuurlijke inoculum van R. solani .......................................................... 23
3.A.4. Detectie van de bodemweerbaarheid ................................................................................ 23
Deel B: Effectiviteit van verschillende ligninerijke bodemsupplementen ........................................ 24
3.B.1. Directe effecten van Lignosol op R. solani .......................................................................... 24
3.B.2. Evaluatie van Lignosol en Sappi-Out onder veldomstandigheden...................................... 24
3.B.3. Potexperiment: bodemafhankelijke effectiviteit van Miscanthus en Lignosol incorporatie
op de overleving en parasitisme van scleroten van R. solani....................................................... 26
vii
4. Resultaten en bespreking .................................................................................................................. 28
Deel A: De Biotest.............................................................................................................................. 28
4.A.1. Inleiding ............................................................................................................................... 28
4.A.2. Voorafgaande testen: analyse van de slatypes en het inoculumtype ................................ 29
4.A.3. Detectie van het natuurlijk inoculum van R. solani ............................................................ 30
4.A.4. Detectie van de bodemweerbaarheid ................................................................................ 31
4.A.5. Bevindingen en voorstellen voor de verdere ontwikkeling van de biotest ........................ 35
Deel B: Effectiviteit van verschillende ligninerijke bodemsupplementen ........................................ 37
4.B.1. Inleiding ............................................................................................................................... 37
4.B.2. Directe effecten van Lignosol op R. solani .......................................................................... 37
4.B.3. Evaluatie van Lignosol en Sappi-Out onder veldomstandigheden...................................... 41
4.B.4. Potexperiment: Bodemafhankelijke effectiviteit van Miscanthus en Lignosol incorporatie
op de overleving en parasitisme van scleroten van R. solani....................................................... 44
5. Algemene conclusies ......................................................................................................................... 68
6. Referenties ........................................................................................................................................ 70
7. Bijlages............................................................................................................................................... 75
Bijlage 1: Koolstofbronnen van de Eco MicroPlates™ ....................................................................... 75
Bijlage 2: koolstofbronnen van de FF MicroPlates™ ......................................................................... 76
viii
1. Inleiding
De landbouwsector wordt net zoals andere sectoren vaak geplaagd met problemen. Het probleem
dat in deze thesis op tafel wordt gelegd, handelt over de grote verliezen die smet veroorzaakt bij de
Belgische slatelers. Smet is een aandoening die veroorzaakt wordt door o.a. Rhizoctonia solani,
waarbij de onderste bladeren wegrotten. Bij ernstige aantasting kan het volledig inzakken van de
krop optreden. Door de afschaffing van het bodemontsmettingsmiddel methylbromide, zitten de
telers nu met de handen in het haar. Het middel dat hen jarenlang toeliet deze ziekte te beheersen,
is nu een verboden product. Een volwaardige vervangstof biedt zich niet onmiddellijk aan. De
consument en distributiesector eisen daarenboven een zo residu arm mogelijk gewas en nieuwe
fungiciden passen niet direct in dat plaatje.
Om aan problemen het hoofd te bieden, behoort er een probleemanalyse te worden uitgevoerd. In
een probleemanalyse gaat men op zoek naar wat fout loopt en hoe datgene kan vermeden dan wel
verbeterd worden. Vaak durft men bij deze analyses naast al dat negatieve vergeten te kijken naar de
intrinsieke sterktes van de situatie. Waar ligt de kracht van waaruit we moeten vertrekken om te
evolueren naar het optimale?
Deze thesis vertrekt vanuit zo’n standpunt. Wanneer we met positieve bril kijken naar de
plantenteelt, zien we dat in sommige bodems de ziekte-incidentie van bodemgebonden pathogenen
lager ligt zonder dat er bijzondere verschillen in teelt en ziektebestrijding zijn (Weller et al., 2002). De
bodem lijkt de ziekte meer onder controle te houden. Voor R. solani werden reeds zulke verschillen
in de bodemweerbaarheid waargenomen in suikerbiet en bloemkool (Mendes et al., 2011; Anees et
al., 2010; Postma et al., 2010). De weerbaarheid van de bodem kan te wijten zijn aan zijn abiotische
factoren zoals bodemtextuur, structuur, lucht, water en aan de microbiële populatie die huist in de
bodem. Bacteriën, schimmels en andere bodembewoners kunnen optreden als concurrent of als
parasiet van de pathogeen of de resistentie van de plant induceren. Er wordt verondersteld dat het
microbieel leven de grootste bijdrage levert aan het ziekteonderdrukkend vermogen van de bodem,
maar het is niet duidelijk waar de natuurlijke weerbaarheid juist aan gelegen is (Bonanomi et al.,
2010). De weerbaarheid lijkt daarenboven beïnvloed te kunnen worden door cultuurtechnische
maatregelen, zoals door de toevoeging van organisch materiaal (Sneh et al., 1996). Men is naarstig
op zoek naar de mechanismen achter de bodemweerbaarheid en het onderzoek uitgevoerd voor
deze thesis tracht een bouwsteen hiervoor aan te leveren.
Het eerste luik van deze thesis had als doel om een biotest te ontwikkelen die op eenvoudige wijze
zou kunnen aantonen wat de inoculumdichtheid, dan wel de weerbaarheid van de bodem jegens
R. solani is.
1
Het tweede luik van deze thesis bevat de verdere uitwerking van een mogelijke beheersingsmethode
die gebruik maakt van de versterking van de bodemweerbaarheid tegenover R. solani op sla door
toevoeging van ligninerijke bronnen. Voorgaand onderzoek heeft aangetoond dat men R. solani kan
onderdrukken door toediening van zuivere lignine aan de bodem (Van Beneden et al., 2009). In deze
thesis werden twee ligninerijke bijproducten uit de industrie getest: een poeder van druivenpitten
uit de wijnindustrie (Lignosol) en een effluent uit de papierindustrie (Sappi-Out). Daarnaast werd ook
het effect van Miscanthus, een ligninerijk gewas, getest. Het eerste doel was de effectiviteit van deze
producten te testen op het afdoden van scleroten zowel onder labo als veld condities. Als tweede
doelstelling werd de ontleding van de werking van deze producten vooropgesteld. Het succes van
ligninetoevoeging bleek uit vorig onderzoek bodemafhankelijk en leek verklaard te kunnen worden
door verschuivingen in de microbiële bodempopulatie (Van Beneden, 2009). In deze thesis werd
onderzocht hoe de microbiële populatie verschilde tussen een bodem met hoge en een met lage
lignine-effectiviteit en hoe de microbiële populatie veranderde na incorporatie van de ligninerijke
producten. Daarnaast werden ook directere werkingsmechanismen van Lignosol onderzocht.
2
2. Literatuurstudie
2.1. Slateelt en smet
2.1.1. Inleiding
Sla (Lactuca sativa) is een van de populairste groenten en zijn marktaandeel in de tuinbouwsector in
België komt op de tweede plaats , na de nog populairdere tomaat. In ons land zijn de telers
voornamelijk gespecialiseerd in het telen van zware botersla. Het gemiddeld kropgewicht in België
ligt met 400 à 500 gram zo’n 200 gram hoger dan deze geproduceerd in andere Europese landen.
Door zijn gewicht en kwaliteit, die gewaarborgd wordt door de Flandria en Eurep-gap labels, is
Belgische sla tevens begeerd in het buitenland (Van Labeke, 2011-2012). Gedijend op de algemene
trend in de tuinbouw wordt ook de productie van sla gedwongen naar een grotere intensivering om
economisch haalbaar te blijven en hierdoor, samen met het zware slatype, neemt de ziektedruk toe
(Van Beneden et al., 2011).
2.1.2. De teelt
In Vlaanderen bedraagt de totale met sla beteelde oppervlakte zo’n 600 ha, waarvan ongeveer de
helft als beschermde teelt (NIS, 2008). Dat sla een van de voornaamste groentes op de markt is,
bewijst zijn omzetwaarde. Deze bedroeg in 2010 46.8 miljoen euro voor botersla, dat een aandeel
van 2/3 in de totale slateelt inneemt (VBT, 2010). Men teelt sla voornamelijk in monocultuur in
ongeveer 6 cycli per jaar en wisselt sporadisch af met tomaat in de zomer (Van Labeke, 2011-2012).
De teelt verloopt in twee fasen. Eerst worden de omhulde sla-zaden in perspotjes oppervlakkig
gezaaid en opgekweekt tot het 4 tot 6-bladstadium, meestal door gespecialiseerde bedrijven.
Vervolgens worden deze met perspotjes op de bodem geplaatst op het tuinbouwbedrijf zelf. Een
goed vlak gemaakte bodem moet plasvorming verhinderen en het plaatsen van de perspotjes boven
op de bodem zorgt voor uitgesteld contact van de bladeren met de bodem en zodoende beperking
van de aantasting door bodemgebonden pathogenen zoals R. solani.
Naargelang het seizoen zal de teelt een verschillende duur hebben. In de zomer kan men na één
maand reeds een volle krop bekomen, in de winter zal dat eerder drie maanden worden. Ook de
mogelijke uitdagingen gepaard gaande met de teelt kunnen variëren met het seizoen. Zo bleek uit
onderzoek van Van Beneden et al. (2009) dat de schimmels die smet veroorzaken verschillen per
seizoen (Tabel 1).
2.1.3. Smet in de slateelt
Een van de zorgen van de slateler zijn de verliezen omwille van smet, die tot 70% kunnen reiken. Het
is uit economische reden belangrijk de smet-aantasting te beperken (Scherwinski et al., 2008). Smet
is een ziekte waarbij de onderste bladeren wegrotten. De ziekte kan leiden tot ernstige
oogstverliezen die zowel kwantitatief en kwalitatief kunnen zijn. Door grote weggesneden delen
aantasting is er een hoger risico op lagere klassering en bij een ernstige aantasting kan er volledige
uitval van de krop optreden (Van Beneden et al., 2011).
3
Verschillende bodemgebonden pathogenen kunnen smet veroorzaken. R. solani, Sclerotinia spp.,
Botrytis cinerea en Pythium spp. vormen het vaakst de oorzaak van deze ziekte. Tabel 1 geeft een
beknopt overzicht van hun symptomen en infectiemethode. R. solani wordt verder in het werk nog
uitgebreid behandeld.
Tabel 1: Beknopt overzicht van de pathogenen die smet veroorzaken (Van Beneden, 2009; Höfte, 2010-2011)
Pathogeen
Rhizoctonia
solani
Symptomen
Eerst roestbruine letsels op de
onderste bladen
Verdere verwelking, tot hele krop
Soms licht bruin, gelig mycelium en
scleroten op bladen
Verwelking van de onderste bladeren
met natrot symptomen
Witte myceliumpluizen en
langwerpige scleroten op de bladen
Ziekteontwikkeling en Infectie
Infectie start vanuit
mycogenicaal gekiemde
scleroten of uit mycelium
Geen sporen
Seizoen
Voornamelijk in
de zomer, ook in
lente en herfst.
(warm en vochtig)
Scleroten kiemen
voornamelijk carpogenicaal.
Dus besmetting door
ascosporen, vaak uit de lucht.
Minder door mycelium uit
scleroten
Sclerotinia
minor
Analoog aan S. sclerotiorum, maar
met puntige kleine scleroten
Pythium spp.
Rot van de onderste bladeren,
slijmiger
Donker bruin rot
Grijze conidioforen als kussen over
de aangetaste bladeren
Soms zwarte gladde scleroten stevig
bevestigd aan het blad
Scleroten kiemen
mycogenicaal.
Trager dan S. sclerotorum,
maar steeds wederkerend
(onvoldoende onderzocht)
alle seizoenen,
minder in de
winter. Scleroten
hebben
koudeperiode en
vocht nodig om te
carpogenicaal te
kunnen kiemen
alle seizoenen,
minder in de winter
Sclerotinia
sclerotiorum
Botrytis
cinerea
Opportunistische infecties van
verzwakt weefsel, vaak de
verouderende onderste
bladeren
Infectie met conidosporen en
een zelden keer vanuit
scleroten
Lente, zomer,
herfst
Winter (koude en
vocht)
2.2 Rhizoctonia solani Kühn
2.2.1. Omschrijving
Een brede groep aan pathogene schimmels wordt samengebracht in het genus Rhizoctonia. Het zijn
basidiomyceten waarvan vaak enkel de anamorfe gekend is. Zij worden gekenmerkt door het typisch
loodrecht T-vormig splitsend mycelium. Dit kenmerk is door de afwezigheid van spoorvormende
structuren vaak het enige herkenningspunt (Figuur 1).
Het voornaamste soortencomplex is R. solani. Deze groep van bodemgebonden pathogenen kunnen
aanleiding geven tot tal van symptomen, gaande van smeul tot stengelrot, kanker, bladrot, etc. en
veroorzaakt overal ter wereld schade. R. solani heeft multinucleate cellen, terwijl bij het merendeel
van de Rhizoctonia soorten binucleate cellen terug te vinden zijn. De zelden teruggevonden
teleomorf van R. solani heet Thanatephorus cucumeris (A. B. Frank) Donk. (Agrios, 2005; Sneh et al.,
1996).
4
Figuur 1: Mycelium van Rhizoctonia solani
(http://tdl.wisc.edu/bp.php)
Het soortencomplex wordt onderverdeeld in verschillende anastomosis groepen (AG). Organismen
van dezelfde anastomosisgroep hebben hyfen die kunnen fuseren als ze elkaar ontmoeten. Dit is de
enige manier waarop er genetisch materiaal uitgewisseld wordt en zodoende zijn de verschillende
anastomosegroepen genetisch geïsoleerd. De verdeling in anastomosis groepen loopt niet volledig
gelijk met de verdeling in kenmerken als morfologie, virulentie, gastheer en andere fysiologische
kenmerken en wordt niet aanvaard als onderverdeling in soorten (Sneh et al., 1996). Er zijn 13
verschillende anastomosegroepen (Agrios, 2005).
De AG’s zijn vaak nog verder onderverdeeld naargelang de symptomen, gastheer en
cultuurkarakteristieken in intraspecifieke groepen (ISG) (Taheri et al., 2007; Sneh et al., 1996).
Fylogenetische analyse op basis van moleculaire technieken onthulde bijvoorbeeld zes ISG binnen
AG1 gaande van 1A tot 1F (Toda et al., 2004). Ook binnen de verschillende groepen kan er
naargelang het isolaat grote variabiliteit optreden in pathogeniteit en vatbaarheid voor fungiciden
(Fiddaman en Rossall, 1995). In Belgische slaserres zijn de groepen AG1-1B en AG4 HGI de meest
voorkomende AG’s. Daarnaast worden ook regelmatig AG2-1, AG2-1 Nt, AG3 en AG10
teruggevonden (Van Beneden et al., 2009).
2.2.2. De ontwikkeling van de ziekte
R. solani is een typische bodempathogeen. Scleroten en mycelium uit de bodem vormen de
voornaamste bron van infectie (Figuur 2). Het mycelium van R. solani is zeer groeikrachtig, zeker
onder optimale omstandigheden (15-18°C en matig natte bodems). Op het plantmateriaal vormt het
mycelium compacte opeenhopingen – infectiekussentjes – langs waar het mycelium intercellulair
binnen de plant groeit. Aangezien het necrotrofe karakter van de pathogeen overheerst, zal bij
ernstige infectie de plant ten onder gaan. De ziekte verspreidt zich door regen, irrigatiewater,
geïnfecteerd plant/zaaigoed en verplaatsing van besmette grond, bijv. door landbouwmachines.
Het sexuele deel van de cyclus is, zoals eerder vermeld, te verwaarlozen. R. solani overleeft als
scleroten of als mycelium, in de bodem of op plantenresten en onkruid. R. solani kan, bij afwezigheid
van een waardplant, ook overleven op saprofytische wijze. Eenmaal R. solani zich gevestigd heeft in
een bodem, zal zij daar niet weg te krijgen zijn (Agrios, 2005; Sneh et al., 1996).
5
Figuur 2: De ziektecyclus van Rhizoctonia solani (Agrios, 2005)
2.2.3. Scleroten
Scleroten zijn overlevingsstructuren die de pathogeen aanmaakt bij het optreden van stress. De
stress kan bijv. bestaan uit een belemmerde groei, koude of bij het ontmoeten van een andere hyfe.
Niet alle AG’s maken scleroten aan en er zijn grote verschillen in uiterlijk en grootte (Sneh et al.,
1996). Scleroten bestaan uit uniforme donkerkleurige consistente massa’s monilioide cellen met
celwanden die versterkt zijn met melanine. Melanine is een verzameling van ongedetermineerde
structuren opgebouwd uit polyaromatische stoffen. Bij schimmels is de voornaamste vorm DHN
melanine. In de celwand gaan de melaninemolecules allerlei interacties aan met o.a. proteïnen en
vormt zich zo een heus melaninecomplex (Butler et al., 2005). Scleroten van R. solani hebben geen
rind, maar bestaan uit individueel versterkte cellen. Scleroten van Botrytis en Sclerotinia spp.
daarentegen hebben wel een rind. Scleroten moeten de overleving van de pathogeen garanderen en
worden dus minimaal geschaad door abiotische omgevingsfactoren zoals water (in tekort en
overvloed), zuurstof, temperatuursextremen en pH. Aan extreme straling weten zij te weerstaan
door middel van de melanine die straling bijna absoluut absorbeert door de zwarte kleur en omzet in
warmte (Butler et al., 2005). De afwezigheid van een rind bij scleroten van R. solani heeft geen
impact op de overlevingsduur van scleroten die kan reiken tot 6 jaar (Coley-Smith en Cooke, 1971).
Voorgenoemde omgevingsparameters kunnen echter wel een impact vertonen op het doorbreken
van de dormantie van de scleroten.
Dat scleroten resistent zijn, betekent niet dat ze onverwoestbaar zijn. In de bodem leeft een heuse
samenleving van micro-organismen en sommige kunnen scleroten parasiteren, zoals
Trichoderma spp., of vertonen ander antagonistisch gedrag, zoals vele bacteriën. Er werd reeds
aangetoond dat het toevoegen van organisch materiaal aan de bodem negatief inwerkt op de
levensvatbaarheid van scleroten (Bonanomi et al., 2010; Sneh et al., 1996; Croteau en Zibilske, 1998).
6
Organisch materiaal stimuleert immers de bodempopulatie en dus ook de parasieten en
antagonisten. Organisch materiaal zorgt ook voor optimale omstandigheden voor R. solani, die een
facultatieve saprofyt is, en stimuleert bijgevolg ook het verval van scleroten op directe wijze door
uitgelokte kieming (Coley-Smith en Cooke, 1971). Scleroten beschermen zich extra, naast de celwand
uit melanine, door de productie van een donkerkleurig exudaat uit fenolen, carboxylzuren,
koolwaterstoffen, vetzuren en aminozuren dat antifungale en fytotoxische eigenschappen heeft
(Aliferis en Jabaji, 2010).
Scleroten kunnen twee soorten dormantie bezitten, endo- en ecodormantie. De eerstgenoemde
behoedt de scleroten voor kieming door factoren die uit de scleroot zelf bepaald worden. Dit zorgt
ervoor dat niet alle scleroten gelijktijdig kiemen en kans op afsterven lopen. R. solani is enkel
onderhevig aan de tweede vorm van dormantie, de ecodormantie, die ervoor zorgt dat scleroten
enkel kiemen in omstandigheden waarin groei mogelijk zou zijn. Hoewel scleroten sterk
gemelaniseerde celwanden bezitten, blijven zij permeabel voor moleculen en kunnen zodoende
signalen, zoals O2 en specifieke biochemische componenten bijv. wortelexudaten en stoffen uit
organisch materiaal ontvangen (Coley-Smith en Cooke, 1971). R. solani kan echter ook kiemen
zonder de aanwezigheid van uitwendige energiebronnen (Liu et al., 2011).
2.2.4. Bestrijding
R. solani is alomtegenwoordig. Omwille van zijn zeer breed gastheerspectrum, zijn overleving met
persistente scleroten en capaciteit om te overleven in diverse omstandigheden, is de bestrijding een
moeilijke zaak (Grosch et al., 2006). Een geïntegreerde aanpak dringt zich op waarbij chemische,
biologische en cultuurmaatregelen samen gehanteerd worden.
2.2.4.1. Cultuurmaatregelen
Het is voor een pathogeen veel gemakkelijker om grote schade te berokkenen in een systeem dat
verstoord is. Goede landbouwpraktijken vormen daarom een van de fundamenten om de ziektedruk
te verminderen. Wanneer bijvoorbeeld de drainage onvoldoende is, is het een goede zaak om deze
te optimaliseren aangezien Rhizoctonia van vochtige omstandigheden houdt. Hoewel het gebruikelijk
is in de slateelt om in monocultuur te werken, zou een vruchtwisselingsschema een gepaste
strategie zijn om het vermogen van het inoculum te verminderen. In sla worden vooral AG1-1B en
AG4 HGI gestimuleerd en een ander gewas zou andere groepen stimuleren. De diversificatie binnen
R. solani verhindert het uitgroeien van enkele stammen tot oncontroleerbaar hoge proporties, maar
zorgt niet voor eliminatie van het probleem (Agrios, 2005). Telers die enige vorm van rotatie
toepassen, bijvoorbeeld met bloemkool of preizaailingen, merken een afname in smetverliezen in
het daaropvolgend slagewas (De Storme, persoonlijke communicatie). Andere auteurs benadrukken
de mogelijkheid om via monocultuur een specifieke antagonistische populatie op te bouwen. Een
afname van de ziekte door R. solani werd reeds aangetoond in monoculturen van tarwe,
suikerbieten, aardappelen en bloemkool (Weller et al., 2002; Anees et al., 2010; Postma et al., 2010;
Sneh et al., 1996). Resistente variëteiten zijn niet voorhanden (Grosch et al., 2006; Sneh et al., 1996).
Het is extreem moeilijk om via veredeling tot resistente variëteiten te komen, door de hoge
diversiteit en het weinig specifiek parasitisme van de pathogeen. Er zijn echter wel verschillen in
tolerantie tegenover R. solani in sla waargenomen, maar deze kon via veredeling niet vastgelegd
worden (Leach en Garben, 1970). Tot slot dienen de slaplantjes zodanig geplant te worden dat hun
bladeren zo lang mogelijk de grond niet raken en in zo optimaal mogelijke conditie zijn (Agrios,
2005).
7
2.2.4.2. Chemische controle
Tot 2006 werd door telers frequent gebruik gemaakt van het bodembesmettingsmiddel
methylbromide. Het werkingsspectrum van dit uit de rekken genomen middel is zeer breed. Met een
enkele tweejaarlijkse behandeling slaagde men erin om onkruiden, aaltjes en pathogene schimmels
te onderdrukken. Door de beperkte fytotoxiciteit werd er amper schade berokkend aan het gewas.
De huidige fumigantia, zoals chloorpicrine, 1,3-D, dazomet en metam-natrium, werken niet zo
efficiënt tegenover bodemgebonden plagen en slagen er minder in de scleroten van R. solani te
doden. Daarenboven hangt ook voor deze producten de afschaffing boven het hoofd. Ontsmetten
door middel van solarisatie is enkel mogelijk in mediterrane streken en met stoom ontsmetten is
duur omwille van investerings- en energiekost.
Naast fumigantia zijn er ook producten op de markt die curatief symptomen kunnen bestrijden. Deze
fungiciden, waaronder Rovral, Internum, Rizolex en Signum baten enkel bij beperkte ziektedruk en
zijn niet in staat om de bron van de ziekte, namelijk scleroten en mycelium in de bodem, af te doden
(Fytoweb, z.d.). Daarenboven is sla een rauw gegeten bladgroente en is er dus een groot risico voor
residuen. Daarom wordt er ook vanuit de distributiesector druk uitgeoefend om het gebruik van
chemische middelen af te bouwen (Van Beneden et al., 2011).
2.2.4.3. Biologische controle
De bodempopulatie is allerminst een vreedzame samenleving. In de bodem wordt keihard geknokt
voor plaats en nutriënten en ontwikkelen organismen wapens om elkaar de dieperik in te sturen.
Wanneer een organisme zo’n bewapening heeft die effectief is tegen een pathogeen, zou deze
kunnen aangewend worden als biopesticide. De wapens zijn grosso modo onder te brengen in vier
categorieën: competitie, parasitisme, antibioticaproductie en aanmaak van biosurfactans. Er worden
ook organismen ontdekt met nieuwe wapens zoals bijv. het vermogen om het DNA van bacteriën te
wijzigen (de Boer et al., 2005). Naast het vermogen van micro-organismen om elkaar te schaden,
bezitten andere dan weer het vermogen om de resistentie van de plant te verhogen (Raaijmakers et
al., 2009). Hoewel er een heel breed spectrum is van bacteriën en schimmels met antagonistische of
plantengroei bevorderende activiteit, wordt maar een minimaal deel op commerciële basis gebruikt
als biopesticide (Fravel, 2005).
Ter bestrijding van R. solani in sla in België worden in de praktijk geen biologische middelen ingezet,
hoewel Trianum-P®, een product op basis van de parasitaire schimmel Trichoderma harzianum T22,
wel aangeprezen staat als werkzaam in sla (Van Beneden, 2009 & 2011; Fytoweb, z.d.). Tegen
S. sclerotiorum en S. minor kan men aan de slag gaan met Contans® (Coniothyrium minitans) en ook
tegen Botrytis cinera kan men biologisch behandelen met bijv. Prestop® (Gliocladium catenulatum)
(Fytoweb, z.d.).
Hoewel er geen commercieel beschikbare middelen zijn, wordt er veel onderzoek gedaan naar
biological control agents (BCA). De weg tot nieuwe commerciële producten is evenwel nog lang.
Verticillium biguttatum is een efficiënte mycoparasiet van R. solani AG3 op aardappel en zou
misschien ook werkzaam kunnen zijn tegen andere AG’s (Grosch et al., 2006). Ook aan het labo van
Fytopahtologie te Gent wordt er onderzoek gedaan op Verticilium tricorpus als biologische bestrijder
(Deketelaere, Tyvaert, persoonlijke communicatie). Enkele veel belovende bacteriën zijn isolaten van
8
Pseudomonas spp., Serratia plymuthica en Bacillus subtilis (Scherwinski et al., 2008; Fiddaman et al.,
2000; Faltin et al., 2004, D’Aes et al., 2011; Raaijmakers et al., 2006). Nieuwe BCA’s zouden ook uit
minder verwachte organismen ontwikkeld kunnen worden, zoals bijv. dubbelstrengig RNA-virus
“Rhizoctonia decline” dat de overlevingskracht en virulentie van R. solani aantast of een
mycoparasitair aaltje (Agrios, 2005).
Nieuwe BCA’s worden gezocht in bodems met verlaagde ziekte-incidentie, voornamelijk in de fylloen rhizosfeer. Ook endofytische organismen kunnen in aanmerking komen. Men tracht ook te
selecteren naar de stoffen die hun antagonistische werking kunnen verklaren zoals enzymen,
plantgroei stimulatoren, sideroforen…. Daarnaast focust onderzoek zich o.a. op het bepalen van de
optimale gemengde aanwending en ecologische voorwaarden (Fravel, 2005; Grosch et al., 2006). Een
biologisch systeem is steeds onderhevig aan hoge variabiliteit en zodoende schommelt ook de
effectiviteit van biologische bestrijdingsmiddelen. Men kan de variatie in werkingskracht proberen
uitvlakken door de omgevings- en ecologische voorwaarden zo dicht mogelijk tegen de optimaal
werkzame te brengen.
Het ontwikkelen van nieuwe commercieel beschikbare biologische middelen is een zeer langzaam
proces. Niet alleen verloopt de selectie naar nieuwe BCA’s moeizaam wegens inconsistentie van in
vitro en in vivo resultaten, ook is het vaak economisch moeilijk te verantwoorden. De te korte shelflife, de nichemarkten, de moeizame productie en de grote kost voor registratie zijn factoren die het
vaak niet rendabel maken om gevonden antagonisten ook effectief op de markt te brengen (Fravel,
2005).
Wanneer de definitie van biologische bestrijdingsmiddelen opengetrokken wordt, komen veel meer
mogelijkheden tevoorschijn. De stoffen die antagonisten produceren kunnen ook zonder het
organisme zelf aangewend worden als bijv. mycofungicide of plantresistentie-induceerder. Daarnaast
kunnen de antagonisten die reeds aanwezig zijn in de microbiële bodempopulatie gestimuleerd
worden door gebruik te maken van goede cultuurtechnieken of door toevoeging van
bodemsupplementen. Hierop is de aanwending van organische materialen en het hier verder
onderzochte lignine gebaseerd.
2.2.4.4. Geïntegreerde bestrijding
Sinds geruime tijd wordt er in de gewasbescherming de aandacht gevestigd op een geïntegreerde
aanpak. Verschillende beheersingsmethodes worden gecombineerd om een zo breed mogelijk
werkingsspectrum te beslaan. Door te meten wordt nattevingerwerk vermeden en kan minimale
behandeling bereikt worden (Bonanomi et al., 2010). Bij de geïntegreerde aanpak hoort ook het
bevorderen van de bodemweerbaarheid.
9
2.3. Bodemweerbaarheid
2.3.1. Enkele begrippen en standaardconcepten
Bodemweerbaarheid werd reeds door velen gedefinieerd, maar de definitie van Baker en Cook
(1974) kan beschouwd worden als de meest algemene. Deze luidt:
“soils in which the pathogen does not establish or persist, establishes but causes little
or no damage, or establishes and causes disease for a while but thereafter the disease is
less important, although the pathogen may persist in the soil.”
De definitie beschrijft de weerbaarheid tegenover de ziekte en tegenover de pathogeen.
Weerbaarheid tegenover de pathogeen wordt bekomen door de vermindering van de saprofytische
groei en de overleving van de pathogeen. De onderdrukking van de ziekte houdt, naast de
onderdrukking van de pathogeen, ook de afweer van de plant, de vermindering van parasitair
groeiende pathogenen en hun pathogeniteit in (Weller et al., 2002; Termorshuizen en Jeger, 2008;
Sneh et al., 1996). De onderdrukking van de pathogeen draagt bij tot de onderdrukking van de ziekte,
maar vormt geen voldoende voorwaarde voor ziekteonderdrukking (Termorshuizen en Jeger, 2008).
De weerbaarheid die bodems hebben tegenover pathogenen en ziektes kan zowel aan hun fysischchemische als aan hun biologische eigenschappen gelegen zijn. Bodems verliezen hun weerbaarheid
grotendeels na gamma bestraling of autoclavering. De gesteriliseerde bodems kunnen deze weer
gedeeltelijk herinstalleren door inoculatie met een fractie niet-geautoclaveerde bodem. Omwille van
die redenen wordt aanvaard dat de weerbaarheid voornamelijk te danken is aan de aanwezige
micro-organismen en dat de fysisch, chemische factoren er minder toe doen (Thuerig et al., 2009;
Mendes et al., 2011; Postma et al., 2010). De fysisch-chemische factoren kunnen natuurlijk de
bodempopulatie beïnvloeden en op die wijze een aanzienlijke impact hebben (Figuur 3) (Weller et
al., 2002; Mazzola, 2004).
Een bodem die weerbaarheid vertoont tegenover een pathogeen, doet dat niet per se voor alle
pathogenen. Men kan onderscheid maken tussen specifieke en algemene bodemweerbaarheid
(Bonanomi et al., 2010; Termorshuizen en Jeger, 2008; Weller et al., 2002). Algemene of niet
specifieke weerbaarheid wordt ook biologische buffering van bodems genoemd. Zij is eigen aan de
bodem en zijn geschiedenis en is niet overzetbaar naar minder weerbare bodems. Algemene
bodemweerbaarheid wordt bevorderd door het toevoegen van organisch materiaal, door goede
cultuurpraktijken en vruchtbaarheid van de bodem. Het voornaamste werkingsmechanisme berust
op fungistasis. Fungistasis is een mechanisme waarbij schimmelpropagules verhinderd worden te
kiemen of te groeien. Vaak wordt deze bereikt door een tekort aan nutriënten door hoge
metabolische activiteit in de bodem of door secundaire metabolieten met antifungale werking
(Termorshuizen en Jeger, 2008; Garbeva et al., 2011). Fungistasis heeft in feite een duaal effect.
Enerzijds onderdrukt fungistasis de pathogenen, anderzijds bevordert het de overlevingscapaciteit
van de pathogeen (Garbeva et al., 2011).
10
Via specifieke bodemweerbaarheid worden enkele specifieke pathogenen onderdrukt. Specifieke
groepen van micro-organismen die actief zijn tegen een zeker stadium in de levenscyclus van de
pathogeen zorgen hiervoor. Deze vorm van weerbaarheid kan wel overgezet worden naar andere
bodems (Weller et al., 2002). Amensalisme, parasitisme, predatie en competitie vormen de
voornaamste mechanismen van specifieke bodemweerbaarheid (Termorshuizen en Jeger, 2008).
Figuur 3: De niveaus van bodemweerbaarheid tegenover een pathogeen na verschillende bodembehandelingen. Een
gesteriliseerde bodem bezit enkel de weerstand door abiotische factoren (gespikkeld deel). De algemene
bodemweerbaarheid (zwart deel) wordt voornamelijk verzorgd door organismen die snel de bodem weer zullen koloniseren
na ontsmetting. Een onbehandelde bodem geniet boven deze eerste twee factoren ook van de specifieke weerstand (wit)
(Termorshuizen en Jeger, 2008).
Uiteraard sluit de ene vorm van weerbaarheid de andere niet uit. Er bestaat er een continuüm
gaande van bodems met bijna uitsluitend specifieke weerbaarheid tot bodems met enkel de
algemene vorm. Bodems kunnen ook verschillende intensiteit van weerbaarheid bezitten (Weller et
al., 2002).
De weerbaarheid van de bodem is niet uniform in tijd en ruimte. In de rhizosfeer van de plant kan
zich een totaal andere populatie van organismen bevinden. De plant wapent zich tegen
bodempathogenen door rondom haar wortels een specifieke bodempopulatie te scheppen.
Daarnaast bezit de rhizosfeer ook een aandeel organismen die eigen zijn aan de bodem zonder
invloed van de plant (Termorshuizen en Jeger, 2008). De bodempopulatie varieert ook naar gelang
het seizoen, het groeistadium van de plant en de beschikbaarheid van koolstof en stikstof
(Scherwinski et al., 2008).
Onderstaand schema (Figuur 4) kan helpen om het overzicht van verschillende vormen van de
weerbaarheid
te bewaren. Dit is echter een vereenvoudiging van de werkelijke
weerbaarheidsystemen en veel uitzonderingen en overlappingen kunnen voorkomen.
11
Figuur 4: Schema van de biologische component van bodemweerbaarheid
Hornby (1983) deelt weerbare bodems in twee types. Enerzijds heb je de bodems met ‘Longstanding
suppressiveness’. Deze bestaat uit de biologische toestand die van nature aanwezig is in de bodem,
ook zonder de aanwezigheid van het gewas. ‘Induced suppression’ anderzijds wordt geïnitieerd door
de aanwezigheid van het gewas, zeker bij monocultuur. In sommige velden met monocultuur wordt
na een ernstige uitbraak van de ziekte de weerbaarheid van de bodem geïnduceerd. De ziekte neemt
in het volgende gewas dan ook af. Dit fenomeen staat bekend onder de naam Rhizoctonia Disease
Decline (RDD). Het mechanisme van RDD kan berusten op veranderende abiotische factoren zoals de
temperatuur, neerslag en instraling, maar is veel waarschijnlijker te verklaren door biologische
factoren. Er zijn verschillende verklaringen. Allereerst kan de propagule densiteit afnemen. R. solani
kan zijn kwaliteiten als pathogeen verliezen door verlies aan pathogeniteit of door het vermogen om
nieuwe propagules aan te maken te verliezen. De afname van de levensvatbaarheid van de
aanwezige propagules is een andere optie. De aanwezigheid van de pathogeen, een geschikte
gastheerplant en antagonisten lijken een noodzaak voor het optreden van RDD (Hyakumachii, 1996).
De bodempopulatie wordt continu opnieuw samengesteld door de inwerking van
selectiemechanismen. Ruwweg kan men selectiestrategieën van organismen in twee groepen
splitsen. R-selectie promoveert die organismen die zich rijkelijk voortplanten en in onstabiele
omgevingen de bovenhand houden. Onder K-selectie vallen de organismen die meer investeren in
minder nageslacht en de omgeving kunnen koloniseren door middel van competitie (MacArthur en
Wilson, 1963). R. solani is duidelijk een pathogeen die bij K-selectie bevoordeeld wordt. Pathogenen
die overleven op basis van r-selectie, zoals Pythium spp. zijn gemakkelijker te controleren d.m.v. de
algemene weerstand van de bodem. R. solani lijkt maar zeer beperkt onderdrukt te worden door de
algemene weerbaarheid (Termorshuizen en Jeger, 2008).
12
De bodem vormt een heel complex kluwen van verschillende actoren zoals bacteriën, schimmels en
planten met allemaal interacties zodat deze zeer moeilijk, haast onmogelijk, in kaart te brengen zijn
(de Boer et al., 2005; Weller et al., 2002). Brede, systeemoverspannende methoden zijn nodig om de
factoren te kunnen bepalen die het meest bijdragen aan de weerbaarheid. Aan de hand van deze zou
de weerbaarheid van de bodem kunnen geschat worden en deze informatie gebruikt voor het beheer
van bodems (Mazzola, 2004).
2.3.2. Bodemweerbaarheid analyseren
Om de bodemweerbaarheid te schatten meten wetenschappers allerhande parameters. Men kan
deze parameters opsplitsen in twee groepen: chemisch/fysische en microbiologische. De
microbiologische zijn door de band genomen veel krachtiger te correleren met bodemweerbaarheid
en worden dus het meest opgemeten (Bonanomi et al., 2010). Al poneert Van der Wurff (2010) dat
bij Verticilium dahlia slechts 40% van de bodemweerbaarheid te wijten is aan biologische factoren.
Hij blijft een enkeling in de literatuur die zo’n verhouding verdedigt.
2.3.2.1. Chemisch/ fysische parameters
Hoewel chemische parameters vaak een zeer beperkte correlatie vertonen, varieert de correlatie
tussen verschillende pathosystemen. Gemeten parameters hebben betrekking op de minerale
samenstelling (K, Ca, P, EC), de aanwezigheid van stikstof in allerlei vormen (ammonium, ammoniak,
nitraten, C/N ratio en totaal N), pH en % organische stof. De C/N ratio wordt vaak gebruikt in relatie
met de aanwending van organisch materiaal (zie paragraaf 2.3.3). Op R. solani heeft enkel de pH, het
ammonium en nitraat gehalte een (negatieve) correlatie met onderdrukkend vermogen (Bonanomi
et al., 2010). Liu et al. (2011) noteerden onder de onderzochte bodems enkel bij deze met lage pH
een goede weerbaarheid.
De fysische parameters die vaak in correlatie met weerbaarheid worden gebracht, bestaan uit
structuur, bodemdichtheid, textuur en waterverzadigdheid. Het aantal en de grootte van niet
waterverzadigde poriën is een van de voornaamste criteria voor de verspreiding van de pathogeen
(Raaijmakers et al., 2009; Postma et al., 2010).
Nerey et al. (2010) bemerkten bij gesteriliseerde bodems verschillen in de weerbaarheid tegenover
R. solani op bonen. De verschillen zouden dus te wijten zijn aan abiotische factoren. Ook al legt men
in de literatuur een grotere nadruk op biologische parameters, dient het belang van de abiotische
niet onderschat te worden. Het vermogen van een enkele parameter om te correleren met de
bodemweerbaarheid kan laag zijn omdat de weerbaarheid bepaald wordt door een samenspel van
verschillende factoren.
2.3.2.2. Microbiologische parameters
De diversiteit van de microbiële gemeenschap en zijn capaciteiten weerspiegelen zich in een bijna
even breed spectrum aan analysemethoden. De algemene microbiële activiteit kan geschat worden
aan de hand van de algemene respiratie van het substraat of FDA-analyse (Fluorescein diacetaat
activiteit). Bij de laatstgenoemde techniek wordt de hydrolyse van niet specifieke enzymen zoals
lysases, proteases en esterases gemeten. De analyse van de algemene respiratie toont de intensiteit
van het aeroob metabolisme (Bonanomi et al., 2010). De totale respiratie is de beste maat voor de
algemene weerbaarheid (Hoitink en Boehm, 1999).
13
Het totaal metabolisme geeft info over de intensiteit van activiteit in de bodem, maar het loont ook
om te kijken welke activiteiten optreden. De analyse van specifieke enzymatische activiteit kan
informatie verstrekken over de afbraak van bijv. organisch materiaal, fungiciden, zware metalen of
lignine. Bij de zoektocht naar BCA’s, is een analyse van het enzymatisch vermogen ook belangrijk.
Grosch et al. (2006) nam waar dat de bacteriële stammen met de hoogste activiteit tegenover
R. solani voornamelijk veel glucanolytische en proteolytische enzymen produceerden en slechts
sommigen chitinases. De enzymatische karakteristieken van individuele organismen kunnen
opgeschaald worden naar de karakteristieken van een microbiële populatie die weerbaarheid
ondersteunt. Een bodempopulatie met hoge productie aan β-glucanase, chitinase en proteases zou
bijgevolg agressiever zijn ten opzichte van pathogene schimmels (Grosch et al., 2006; de Boer et al.,
2005). De enzymen β-glucosidase, dehydrogenase, fosfatase, urease, ATP- en NGA- glucosaminase
vertonen elk positieve correlaties met bodemweerbaarheid (Bonanomi et al., 2010). Deze enzymen
kunnen verband houden met de afbraak van celwanden of met het blokkeren van virulentiefactoren
van pathogenen (Raaijmakers et al., 2009). De enzymen die melanine kunnen afbreken vormen ook
een belangrijke groep enzymen. Mn-peroxidase en laccase zijn de voornaamste (de Boer et al.,
2005).
De volledige bodempopulatie produceert een amalgaam aan verschillende enzymen. Via de methode
ontwikkeld door Biolog kan een profiel van het metabolisch vermogen van een populatie worden
verkregen. Het profiel wordt gecreëerd aan de hand van het verbruik van verschillende
koolstofbronnen (Preston-Mafham et al., 2002). Via PLFA (phospholipid fatty acid analysis) kan de
samenstelling van de microbiële populatie in grote groepen (Gram -, Gram +, schimmels en
Actinomyceten) ontleed worden. Het totaal aan geëxtraheerde fosfolipiden is een maat voor de
totale microbiële biomassa (Zelles, 1997 en 1999). DNA gebaseerde methoden, zoals T-RFLP (PérezPiqueres et al., 2005) en DNA arrays (bijv. PhyloChip een 16S rDNAn oligonucleotide microarray)
zouden eventueel een alternatief voor PLFA-analyse kunnen vormen (Mendes et al., 2011). Deze
kunnen niet in cultuur te brengen organismen detecteren, maar dit zijn veelal dure technieken. Veel
mogelijkheden zijn in de praktijk nog beperkt door de gelimiteerde beschikbaarheid van primers. Met
genetische methoden kan men zowel naar de samenstelling van de populatie kijken (primers
gebaseerd op rRNA) als de functionaliteit (primers van functionele genen) (Mazzola, 2004).
Parameters die zich beperken tot de samenstelling van de populatie zonder de enzymatische
karakteristieken te betrekken hebben vaak een ontoereikend vermogen tot het schatten van de
bodemweerbaarheid (Bonanomi et al., 2010).
De aanwezigheid van specifiek onderdrukkende organismen zoals fluorescente Pseudomona spp.,
Actinomyceten en Trichoderma spp. of andere mycoparasitaire schimmels is eveneens
determinerend voor een weerbare bodem (Bonanomi et al., 2010). Deze kunnen via klassieke
cultuurgebaseerde methoden, zoals isolatie, uitplating en duale cultuurtesten voor antagonisme
geanalyseerd worden. De meest significant te detecteren antagonisten worden hieronder verder
behandeld.
14
Trichoderma spp.
Trichoderma (Figuur 5) zijn goed bestudeerde bodemgebonden ascomyceten met een breed
nutsspectrum. Ze worden ingezet voor de productie van cellulase voor o.a. de biobrandstofindustrie,
voor de veilige productie van enzymen en antibiotica en als modelorganisme. Daarnaast worden zij
wegens hun mycoparasiterend vermogen als biofungicide ingeschakeld.
Van het genus Trichoderma (Telemorf: Hypocrea) waren er in 2006 zo’n 100-tal soorten vastgesteld,
maar wegens foute identificaties en gebruik van verschillende identificatietechnieken bestaat er nog
veel verwarring (Druzhinina et al., 2006). Drie voorname soorten zijn echter duidelijk
gekarakteriseerd wegens hun gekend genoom: de voor de industrie belangrijke T. reesei, die wordt
aangewend voor de productie van cellulase en heterologe enzymen en de mycoparasieten
T. atroviride en T. virens (Schuster en Schmoll, 2010). De voornaamste commercieel uitgebrachte
mycoparasiet is T. harzianum. Er zijn echter nog andere specifieke parasieten van R. solani zoals
Trichoderma hamatum (Harman et al., 2004).
Het succes van Trichoderma is te danken aan hun groot vermogen om de omgeving te koloniseren.
Dit doen ze door efficiënt gebruik te maken van het aanwezige celluloseachtig substraat en de
secretie van enzymen en metabolieten. De secreties bestaan uit een heus gamma lytische en
proteolytische enzymen, ABC transporter membranen, secundaire metabolieten en vluchtige
organische stoffen die via een complex mechanisme van signaaltransductie gereguleerd worden.
Trichoderma parasiteert in 5 fases. Eerst groeit hij op chemotrofe wijze richting gastheer (1) om zich
dan bij aankomst rondom de hyfe van de gastheer te winden en appressoria aan te maken (2).
Vervolgens worden celwanddegraderende enzymen geproduceerd (3) en na voldoende afbraak kan
Trichoderma de gastheer penetreren (4). Uiteindelijk zal Trichoderma de hyfale inhoud degraderen
en zal de geparasiteerde schimmel afsterven (5) (Schuster en Schmoll, 2010; Vinale et al., 2009; de
Boer et al., 2005).
Het parasitisme van T. virens is verschillend tussen scleroten met rind (zols Sclerotinia spp.) en
R. solani die scleroten bezit met uniforme opbouw. Bij R. solani groeide het parasiterend mycelium
intercellulair, maar uniform doorheen de scleroot, terwijl bij Sclerotinia ze een mat vormde net onder
de rind. Na de intercellulaire invasie van de scleroot van R. solani penetreert T. virens ook de
individuele cellen. Door het overleven van enkele cellen kan de scleroot van R. solani zijn
levensvatbaarheid gemakkelijk behouden (Liu et al., 2010).
Trichoderma beperkt zich niet tot bilaterale acties van micro-organisme tot micro-organisme, maar
treedt ook op in de plant-pathogeen interacties als opportunistische plant symbiont die de
gezondheid van de plant versterkt. Dit gebeurt door het stimuleren van de systemische weerstand
van de plant en door het verbeteren van de wortelgroei (Schuster en Schmoll, 2010).
15
A
B
Figuur 5: A: Uitgeplaatte Trichoderma spp. Vanuit geparasiteerde scleroten van R. solani AG1-1B. De witte puntjes zijn
Fusarium (eigen foto). B: microscopisch beeld van Trichoderma die zich bij parasiterende actie wikkelt omheen een hyfe
van R. solani (RSF, 2011)
Actinomyceten
Deze bacteriën vormen door hun pseudo-hyfale groei de tussenvorm van bacteriën en schimmels.
Door de groei als kettingen van bacteriën kunnen Actinomyceten, net als schimmels, vlotter bodems
koloniseren. Wanneer de pH van de bodem eerder alkalisch wordt, worden zij tegenover schimmels
bevoordeeld (de Boer et al., 2005).
Streptomyces is het voornaamste genus en wordt regelmatig gerapporteerd als antagonistische
bacterie tegenover R. solani (Postma et al., 2010). Actinomyceten zijn in staat om antibiotische
componenten en celwanddegraderende stoffen te produceren (Tuitert et al., 1998; Mazzola et al.,
2001; Sneh et al., 1996). Sommige Actinomyceten bewerkstelligen ziekteonderdrukking ook langs
endofytische wijze. S. griseoviridis K61 wordt onder de naam Mycostop als biologisch
bestrijdingsmiddel gebruikt voor bodemgebonden pathogenen (Fravel, 2005; fytoweb). De
aanwezigheid van Actinomyceten wordt vaak gecorreleerd met een hogere weerbaarheid van de
bodem (Van Beneden, 2009; Postma et al., 2010). Er zijn ook Actinomyceten die een pathogeen voor
planten vormen (Weller et al., 2002).
Andere bacteriële groepen
In bodems die hogere weerbaarheid vertonen tegenover R. solani op suikerbiet vormen γ- en
β-Proteobacteria en Firmicutes de meest gedetecteerde groepen (Mendes et al., 2011). Bij de eerste
groep behoren o.a. de fluorescerende Pseudomonas die rijkelijk onderzocht worden naar hun
potentie als BCA. Ook de Burkhorderiaceae en Xanthomanodales bevatten organismen met een grote
rol in de bodemweerbaarheid. Onder de Firmicutes zijn het de (sporenvormende) Lactoballici die de
weerbaarheid van de bodem uitmaken (Mendes et al., 2011). In Nederland beschouwt men
kleigronden als gronden met grotere weerstand tegen R. solani in bloemkool. De antagonistische
bacterie Lysobacter, die alleen in Nederlandse polders terug te vinden is, lijkt hiervoor te zorgen
(Postma et al., 2010).
Het is belangrijk om in te zien dat geen enkele geïsoleerd organisme of variabele voldoende is om de
weerstand tegenover R. solani te verklaren (Postma et al., 2010). Tot op heden is er geen tool
beschikbaar om de bodemweerbaarheid (zij het algemeen of specifiek) tegenover R. solani te
bepalen. Scheuerell et al. (2005) en Termorshuizen et al. (2006) benadrukken de moeilijkheid om
voor R. solani het specifiek onderdrukkingsvermogen van de bodem te bepalen omwille van de grote
variabiliteit in pathogeniteit van R. solani.
16
2.3.3. Stimulatie van de bodemweerbaarheid met organische bodemsupplementen
Ter verbetering van de bodemweerbaarheid wordt vaak beroep gedaan op organische
bodemsupplementen. Voor de beheersing van R. solani worden zowel compost, chitinebronnen, als
niet gecomposteerd plantaardig materiaal en afvalmaterialen gebruikt. Organische stof kan bijdragen
aan de weerstand van de bodem, maar werkt vaak heel pathogeenspecifiek en heeft een variabele
werking naargelang de tijd van afbraak, de kwaliteit van het product en de aanwezige microbiële
populatie (Bonanomi et al., 2010). Ondanks het inconsistente ziekteonderdrukkend vermogen van
organisch materiaal, wordt in ongeveer 50% van de gevallen een merkbare verbetering van de
ziekteonderdrukking waargenomen (Bonanomi et al., 2010; Termorshuizen et al., 2006). De
variabiliteit in werkzaamheid zorgt voor een praktische beperking om deze aan te wenden als
ziektebeperkend medium.
2.3.3.1. Compost
Compost wordt verkregen door organisch materiaal op aerobe wijze af te breken. Organisch
materiaal wordt omgezet tot chemisch stabiele moleculen. Aanwezige pathogenen en onkruidzaden
worden afgedood door de hoge temperaturen tijdens het composteringsproces. Compost is een heel
heterogeen product door het verschil in startmateriaal, composteringsmethode en leeftijd van de
compost (Tuitert et al., 1998; Hoitink en Boehm, 1999). Rijpe compost heeft weinig snel afbreekbaar
materiaal en een stabiele microbiële populatie. De aanwezigheid van vele BCA’s, zoals Trichoderma
spp. verbetert de kwaliteit van de compost. Hoewel de aanwezigheid van BCA’s bevorderlijk is,
verbetert compost voornamelijk de algemene bodemweerbaarheid door de verhoging van de
microbiële activiteit (Scheuerell en Mahaffee, 2005; Termorshuizen en Jeger, 2008; Pérez-Piqueres et
al., 2006).
In slechts 20% van onderzochte gevallen draagt compost werkelijk bij aan de onderdrukking van
R. solani. Een vrij nauw spectrum van BCA’s bestrijdt R. solani en meerdere van deze moeten
aanwezig zijn in de compost om bij te kunnen dragen aan de weerbaarheid. Compost die gemaakt is
van lignocellulose-rijk materiaal had een hoger aandeel aan Trichoderma spp. en had het vaakst
positieve effecten (Hoitink en Boehm, 1999).
In de tuinbouw wordt getest met de gecombineerde toediening van een compostextract en Trianum.
Het compostextract zou de bodempopulatie moeten versterken en Trianum de specifieke
weerbaarheid door de aanlevering van de mycoparasiet Trichoderma. De eerste resultaten lijken
succesvol (Boonekamp, 2011).
2.3.3.2. Chitine
De celwand van schimmels is opgebouwd uit chitine. Mycofage organismen en chitinolytische
bacteriën worden gestimuleerd door toevoeging van chitine en kunnen bodempathogene schimmels
onderdrukken. De methode heeft echter te kampen met enkele beperkingen. Chitine is een stof met
erg lage C/N, waardoor er een overbemestingseffect optreedt en het risico op uitspoeling toeneemt.
Het hoog gehalte aan beschikbare stikstof werkt sommige pathogenen in de hand en de hele
populatie van bodemorganismen schuift op naar minder competitieve soorten (Verstegen, 2010).
17
2.3.3.3. Groenbemesters en dierlijke mest
Er bestaan veel verschillende groenbemesters en vormen van dierlijke mest. Door hun verschillende
eigenschappen kunnen ze totaal uiteenlopende effecten hebben op ziekteonderdrukking.
De C/N ratio van organische bodemsupplementen wordt vaak aangehaald als parameter, maar geeft
slechts een beperkt inzicht in de weerbaarheid. Een hoge C/N put de beschikbare N-voorraad uit
wegens N-fixatie en zorgt ervoor dat pathogenen minder kunnen groeien. De plant kan evenwel
lijden onder een N-tekort (Hodge, 2004). Gewasresten en mest met lage C/N kunnen een hoger
gehalte aan giftig ammonium en nitraten geven bij de afbraak. Deze stoffen kunnen de scleroten van
o.a. Verticilium dahliae afdoden. Het effect is zeer variabel tussen verschillende bodemtypes (Tenuta
en Lazarovits, 2004). Stikstoffixeerders vormen een extra bron van N in de bodem en dit verhoogt de
ziekte-incidentie van R. solani (Rothrock et al., 1995). Hoge N-gehaltes stimuleren de saprofytische
groei (Papavizas en Davey, 1961).
Wegens het sterk saprofytisch en competitief vermogen van R. solani, werkt vers ondergewerkt
plantenmateriaal vaak net stimulerend voor R. solani. Pythium is daarentegen heel agressief in de
primaire groei op dit nieuw substraat, maar wordt vlug weggeconcurreerd en wordt dus met betere
resultaten onderdrukt door vers plantenmateriaal (Bonanomi et al., 2010). Pathogenen met een
beperkt saprofytisch vermogen, worden met grotere consistentie onderdrukt door vers plantaardig
materiaal. De in de bodem aanwezige propagules kiemen, maar sterven snel af door gebrek aan
gastheer. Goed management met gepaste wachttijden is noodzakelijk (Bonanomi et al., 2010).
Hoge gehaltes aan cellulose in groenbemesters en oogstresten kunnen inhiberend werken op de
productie van celwandafbrekende enzymen door Trichoderma spp.. Hiermee verliezen zij hun
parasiterend vermogen en profiteert R. solani van deze beschikbare cellulose (Hoitink en Boehm,
1999).
Vele onderzoeken toonden een positief onderdrukkend effect op R. solani aan na toevoeging van o.a.
luzerne, timothee, sorgum, boekweit, mais en haver (Croteau en Zibilske, 1998). De tegenstrijdigheid
in de werking van groenbemesters kan verklaard worden door de sterke bodemafhankelijkheid van
de werking.
2.3.3.4. Turf
Turf is een frequent gebruikt medium in de tuinbouw. Het heeft een zeer klein ziekteonderdrukkend
vermogen door het lage gehalte aan gemakkelijk afbreekbaar organische moleculen, cellulose en
koolwaterstoffen en geen stabiele microbiële populatie. Deze lage gehaltes geven aanleiding tot een
bacteriële gemeenschap die overheerst wordt door Gram positieve bacteriën, dewelke minder
machtig zijn tot het onderdrukken van ziektes (Hoitink en Boehm, 1999).
2.3.3.5. Industriële bijproducten
Het gebruik van organisch afval is vaak te vergelijken met groenbemesters wegens de beperkte
afbraak van het product. Afvalstoffen kunnen een heus gamma aan uiteenlopende samenstellingen
hebben. Landbouwgronden fungeren vaak als afzet voor deze producten die vaak zonder bewerking
of onderzoek aangewend worden. Op zo’n manier kunnen zij de bodem ernstig vervuilen. Dit neemt
niet weg dat, met juiste behandeling, er een groot potentieel schuilt in het gebruik van industriële
bijproducten (Bonanomi et al., 2010).
18
2.4. Lignine
2.4.1. Eigenschappen en voorkomen
Lignine is een heteropolymeer bestaande uit herhaalde entiteiten van de fenolische monomeren
p-coumaryl alcahol, coniferyl alcohol en sinapyl alcohol. Deze eenheden worden in verschillende
combinaties aan elkaar gesynthetiseerd en worden op rigide wijze verbonden met de
(hemi)cellulose-fractie uit planten. De sterke binding maakt de (hemi)cellulosefractie onbereikbaar
voor celluloseafbrekende organismen. Pas na tussenkomst van organismen met lignocellulotische
eigenschappen, vaak schimmels, komt de cellulose ter beschikking van andere organismen. Het
lignocellulosecomplex geeft rigiditeit aan de plant waardoor zij op land kan groeien (DeAngelis et al.,
2011; Bugg et al., 2011; Thevenot et al., 2010).
2.4.2. De lignine - melanine hypothese
Lignine is een moeilijk afbreekbare molecule en slechts weinig organismen zijn in staat om lignine af
te breken. De voornaamste organismen die deze eigenschap bezitten zijn witrotschimmels. Dit zijn
basidiomyceten die vaak parasiteren op bomen. Hun naam berust dan ook op de eigenschap om
lignine af te breken en hierdoor het hout te verbleken (Höfte, 2010-2011).
Nu blijken de enzymen voor de afbraak van lignine en melanine gelijkaardig te zijn. Witrotters
kunnen dus van belang zijn in de afbraak van fungaal melanine. Het voornaamste geproduceerde
enzym dat de afbraak van melanine bewerkstelligt, is Mn-peroxidase, in wetenschappelijke
spreektaal vaak melaninase genoemd. Koper-afhankelijke laccase, haem-afhankelijk peroxidase en
versatiele peroxidases zijn andere ligninolytische enzymen (Baldrian en Snajdr, 2006; Bugg et al.,
2011). Door witrotters te stimuleren, zou de afbraak van melanine in scleroten bevorderd worden en
zouden scleroten zo meer vatbaar worden voor biologische en abiotische stress.
De hypothese werd voor het eerst voorgesteld door Subbarao et al. (1999). Hij nam een verminderde
infectie door Verticilium dahlia in bloemkool waar na incorporatie van oogstresten van broccoli. De
incorporatie van dit ligninerijk gewas werd geassocieerd met een verschuiving in de microbiële
populatie, die de levensvatbaarheid van de microscleroten zou aantasten. Een deel van deze
verschuiving omvatte een toename aan schimmels die betrokken zijn bij de lignineafbraak. In het
labo van Fytopathologie (UGent) werd ook ondersteunende bewijskracht teruggevonden. Er werd
aangetoond dat de incorporatie van Kraft Pine Lignine (een duur zijproduct van de papierindustrie
bestaande uit zuivere lignine) in de bodem de levensvatbaarheid van de (micro)scleroten van
Verticillium longisporum en R. solani kan verminderen. Het effect op de scleroten van R. solani was
vergezeld van een stijging in de activiteit van het enzym Mn-peroxidase in de bodem (Debode et al.,
2005; Van Beneden et al., 2010b). Ook op S. sclerotiorum werd reeds een negatief effect op de
levensvatbaarheid van de scleroten waargenomen wanneer de grond met Kraft Pine lignine en
Contans® samen behandeld werd (Van Beneden et al., 2010a).
19
Phanaerochaete chrysosporium is een van de meest bestudeerde witrotters. Om melanine afbraak te
stimuleren, zou men zowel witrotters kunnen toedienen aan de bodem als hun overlevingskansen
verhogen. Dit laatste kan bewerkstelligd worden door de toevoeging van ligninebronnen. Aangezien
het een lange weg is om BCA’s te commercialiseren (zie paragraaf 2.2.4.3), en witrotters vaak al
alomtegenwoordig zijn in bodems, zijn inoculaties vaak overbodig. Het stimuleren van de witrotters
vormt echter geen oplossing op korte termijn. Het toedienen van ligninebronnen is een toepassing
die pas na jaren tot een evenwicht zou moeten leiden tussen een minimaal sclerotenaantal en
respectievelijke aanwezigheid van aanvallende witrotters (Butler et al., 2005).
Witrotters zijn niet de enige bodemorganismen die lignine enzymatisch kunnen afbreken. Bugg et al.
(2011) en DeAngelis et al. (2011) benadrukken het belang van bacteriën voor de afbraak van lignine.
Bacteriën produceren een breder spectrum aan lignine afbrekende enzymen. De afbraak door
bacteriën gebeurt vaak in een samenwerkingsverband tussen bacteriën en witrotters en in situaties
waarin schimmelgroei onderdrukt wordt, zoals bij zuurstofloosheid (de Boer et al., 2005; De Angelis
et al., 2011; Vicuña et al., 1993). Actinomyceten bezitten naast een parasiterend vermogen ook
peroxidases die de beschikbaarheid van lignine stimuleren (Kirby, 2006; Bugg et al., 2011). Zij zijn
voornamelijk goed in de afbraak van de ligninefractie in grassen (de Boer et al., 2005). Sommige
ascomyceten waaronder Penicillium chrysogenum en Fusarium oxisporum bezitten ook
ligninolytische eigenschappen (Falcon et al., 2005). Daarnaast kan ook de indirecte werking van
enzymen afbraak van lignine of melanine veroorzaken. Melanine wordt aangetast door H2O2. Dit is
een nevenproduct van het enzym glucose-oxidase dat geproduceerd wordt door bijvoorbeeld
Aspergillus niger (Butler et al., 2005). De brede samenstelling van de populatie met ligninolytische
eigenschappen benadrukt de nood om breder te kijken naar de lignine-melanine hypothese dan
louter via witrotters en Mn-peroxidase.
Eerdere experimenten waarbij lignine aan de bodem werd toegevoegd, toonden aan dat vooral
schimmels, Gram negatieve bacteriën en Actinomyceten gestimuleerd worden. Die organismen zijn
samen met Trichoderma spp. voorname antagonisten van R. solani (Postma et al., 2010; Bonanomi et
al., 2010; Van Beneden et al., 2010b). Zowel de directe effecten van lignine op de groei van
antagonisten als de indirecte (gestimuleerde groei door hogere aanwezigheid van makkelijk
parasiteerbare scleroten) zijn nog verder uit te klaren (Van Beneden et al., 2010b).
20
3. Materiaal en methoden
Deel A: De biotest
3.A.1. De proefopzet
Er werd gewerkt met bodem uit de serre van Marc Cools (Passendale) die behandeld was met ofwel
Monam ofwel Herbie 25 (2.3 kg m-2) of die onbehandeld was. De bodem werd verzameld op 16
september, 16 dagen na het uitplanten van de slaplantjes. R. solani houdt zich vooral op in de
bovenste 10 cm van de bodem (Budge et al., 2009) en daarom werden enkele kroppen sla verwijderd
en werd de bodem tot 15 cm verzameld onder en tussen de wortels. De bodem werd op 15 juli
behandeld met Herbie en was tot daags voor uitplanten afgedekt met een plastiek zeil. De
behandeling met Monam vond plaats op 18 augustus. Tussen het verzamelen en het gebruik werden
de bodems in een gekoelde (7°C) en donkere ruimte bewaard.
Voor alle biotesten werden plastieken bakjes van 16x11.5x6 cm gevuld met 400 ml bodem. Het
vochtpercentage van de bodem werd naar het voorbeeld van Van Beneden (2009) gebracht tot
16.5% (w/w). Op het oppervlak van de gevulde bakjes werden ofwel zes vierkante slabladschijfjes
gelegd ofwel drie rijen van kleine ronde slabladschijfjes (Figuur 6). De bakjes werden op gesloten
wijze geïncubeerd in een groeikamer op 18-25°C, met 16/8 als lichtregime.
A
B
Figuur 6: Illustratie van de biotest. A: De gesloten bakjes in de groeikamer vlak na opzet. B: test 3.A.4.2
De opbouw met rijen van kleine ronde slabladschijfjes werd gebruikt om de spreiding en de
groeisnelheid van de pathogeen te schatten. De afgelegde afstand van R. solani werd geëvalueerd
aan de hand van de afstand van de verrotting in de rijen bladschijfjes. In de biotesten met vierkante
slabladjes werd het vermogen van de pathogeen bepaald via scoring van aangetaste oppervlakte van
de slabladschijfjes. Na het opzetten van de proef werden dagelijks scores toegekend aan de
slaschijfjes op basis van het per
