Beheersing van Rhizoctonia solani op sla door het bevorderen van

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2011-2012
Beheersing van Rhizoctonia solani op sla door het bevorderen
van de bodemweerbaarheid
Pauline Deltour
Promotor: Prof. dr. ir. Monica Höfte
Copromotor: dr. ir. Soraya de Carvalho França
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de
bio-ingenieurswetenschappen: Landbouwkunde
i
De auteur, copromotor en promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.
Gent, juni 2012
De promotor:
Prof. Dr. ir. Monica Höfte
De co-promotor:
Dr. ir. Soraya de Carvalho França
De auteur:
Pauline Deltour
ii
Woord vooraf
Tjing tjing!
Geachte lezers, genodigden, snuisterende voorbijgangers,
Vooraleer u in dit werk duikt, wil ik u graag attent maken op het feit dat er twee glazen voor mij
staan. Deze dienen voor niets anders dan voor een dubbele proost.
Het glas in mijn linker hand hef ik op alle “Groten-van-het-Labo”.
Soraya, de denkoefening waarbij ik tracht me een betere begeleider in te denken dan jou is zwaarder
dan gelijk welke andere die ik doorploeterd heb voor deze thesis (en dat waren geen lichtgewichtjes).
Terwijl ik aan het ploeteren was, reikte je me vol geduld de hand (soms wel twee) zodat ik niet uit
evenwicht zou geraken. Ik sta nog steeds versteld van jouw immer aanwezige lach en hoop stiekem
naast de vele kneepjes van het onderzoek ook een tikkeltje van je oeverloos optimisme te hebben
opgestoken. Prof Höfte, bedankt om me na mijn laattijdige gedachtenverandering een kans te geven
om mijn thesis in jouw labo te maken en me hierbij te begeleiden met al jouw expertise. Sarah, jouw
doctoraat was de eerste baksteen waarop ik alles heb voortgebouwd. Ik ben een bofkont dat ik zo’n
handig vademecum voor mijn thesis onder de arm kon nemen! Hari, zonder jouw hulp zou de PLFA
analyse een veel groter karwei geweest zijn. Prof Boeckx ook bedankt voor het ter beschikking
stellen van uw labo voor onze proef. Liesbeth en andere, merci om de Sint-Katelijne-Waver serre
voor onze proef open te stellen en ons te helpen bij het oogsten, scoren, inwerken… Alle andere
Groten van het Labo, ook voor jullie hef ik het glas!
In mijn rechter hand houd ik het glas dat ik graag wil heffen op de “Groten-van-het-Hart”.
Mama, papa, jullie oren zijn wonderbaarlijk goed bestand tegen stormwinden vol gezaag. Mama,
bedankt om mijn thesis door te nemen en te filteren op taalblunders. Quinten, merci om mij te
voorzien mijn dagelijkse portie cynische opmerkingen en het zonder klagen aanhoren van de
grijsgedraaide cd van The Offspring die mijn bron van energie was voor de statistische analyses. Ben,
ik neem deze gelegenheid even ter harte om uw excel kennis te bezingen. Chers amis, ook al worden
niet al uw namen gespecifieerd, u bent onontbeerlijk geweest voor de productie van dit opus. Veel
onontbeerlijker dan dat dit hoopje papier op het eerste zicht kan laten uitschijnen of als deze
woorden dit kunnen. Silke, thesispartner in crime, voor jou maak ik zelfs een buiging door de knie.
Het was me een waar genoegen om met jou te kunnen labo-swingen, bodemmedia te laten
ontploffen, mijteninvasies te bestrijden of uren en uren potjes af te wassen.
Geachte lezers, genodigden en snuisterende voorbijgangers, ik nodig u uit om uw pad doorheen dit
werk verder te zetten en u onder te dompelen in de wereld van de sla, schimmels,
bodemorganismen en veel meer…
i
Lijst van afkortingen
AG
Anastomosis Groep
AUDPC
Area Under Disease Progress Curve
AWCD
Average Well Colour Development
BCA
Biological Contol Agents
DPC
Disease Progress Curve
ISG
Inter Specifieke Groepen
PC
Principale Component
PCA
Principal Components Analysis
PCG
Provinciaal Proefcentrum voor de Groententeelt Oost-Vlaanderen (Kruishoutem)
PDA
Potato Dextrose Agar
PDASM
Potato Dextrose Agar met 100mg l-1 streptomycine
PDASS
Potato Dextrose Agar met 100 mg l-1 streptomycine en 4 mg l-1 prochloraz
PLFA
Phospholipid Fatty Acid
PSKW
Proefcentrum voor Groententeelt te Sint-Katelijne-Waver
q. c.
Query coverage
RDD
Rhizoctonia Disease Decline
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
z. d.
Zonder datum
ii
Samenvatting
Bodemgebonden ziektes, zoals smet, vormen een voornaam probleem in de slateelt, zeker sinds de
afschaffing van het breedspectrum bodemontsmettingsmiddel methylbromide. Een mogelijk
alternatief voor de beheersing van smet is het versterken van de weerbaarheid van de bodem. In
deze thesis werd gezocht naar een methode om de weerbaarheid van de bodem tegenover
Rhizoctonia solani te evalueren, ontleden en versterken.
Het eerste luik van deze thesis handelt over de ontwikkeling van een biotest die het natuurlijk
inoculum en de weerbaarheid van de bodem tegenover R. solani opmeet. De test bestond uit de
meting van de snelheid van de symptoomontwikkeling op slabladschijfjes gelegd op het te testen
bodemoppervlak. Er werd gewerkt met bodems met een verschillende voorbehandeling: één
onbehandelde bodem, één die ontsmet was met Monam en één die behandeld was met Herbie.
Enkel in de onbehandelde bodem kon er een natuurlijk inoculum worden vastgesteld met de biotest.
Voor de analyse van de weerbaarheid werd er gekeken naar het effect van verschillende
inoculumconcentraties, het autoclaveren van de bodem en het toevoegen van boekweitmeel. De
biotest liet toe verschillen in symptoomontwikkeling te detecteren. Om de resultaten van de biotest
te valideren naar weerbaarheid toe moeten meerdere gronden verder getest worden.
In het tweede luik werd onderzoek verricht naar de mogelijkheid om met ligninerijke producten de
bodemweerbaarheid tegen R. solani te versterken. Eerder onderzoek had reeds de effectiviteit van
zuivere lignine en ligninerijke producten zoals vlasvezels en houtsnippers aangetoond (Van Beneden,
2009). Toegevoegd lignine zou volgens de lignine-melanine hypothese lignine-afbrekende
organismen stimuleren. De lignocellulose afbrekende enzymen zijn ook in staat melanine af te
breken. Scleroten bestaan voornamelijk uit melanine en de afbraak van deze molecule maakt
scleroten vatbaarder voor stress (Subbarao et al., 1999). Er werden drie producten getest: een
poeder van druivenpitten (Lignosol), een effluent van de papier industrie (Sappi-Out) en Miscanthus,
een houtachtig gras met hoge opbrengst.
Ten eerste werden de directe effecten van Lignosol op R. solani onder de loep genomen. Er werd
vastgesteld dat enkele chemische constituenten van Lignosol de groei van mycelium in vitro kunnen
beperken. Lignosol bleek tevens de kieming van scleroten van R. solani te kunnen bevorderen. Een
gestimuleerde kieming kan de antagonistische populatie bevorderen en de scleroten zelf afzwakken.
Ten tweede werd de effectiviteit van Lignosol en Sappi-Out geëvalueerd onder veldcondities. Er werd
0.5% van elk product ingebracht in de bouwvoor van een serre met eikenbladsla te Sint-KatelijneWaver. Zowel in de ziekte-incidentie als in de levensvatbaarheid van de scleroten werden geen
significante verschillen vastgesteld. De scleroten uit de behandelde bodems waren daarentegen wel
significant meer geparasiteerd. De beperkte effecten kunnen verklaard worden door de mogelijke
inertie van de grondsoort tegenover ligninebronnen, de lage toegepaste dosis of de te korte tijd
tussen het inwerken en het planten.
iii
In een laatste proef werden de veranderingen in de microbiële bodempopulatie na incorporatie van
Lignosol of Miscanthus gekarakteristeerd d.m.v. fosfolipiden vetzuuranalyse (PLFA) en metabolische
profilering (Biolog). Om een beter inzicht te krijgen in de bodemafhankelijkheid van de effectiviteit
van de ligninebronnen werd er gewerkt met een bodem waar ligninebronnen positieve resultaten
geven (PCG) en een bodem waar resultaten uit blijven (PSKW). De bodems werden in glazen potten
waarin scleroten waren begraven gedurende zowel twee als vier weken geïncubeerd. Uit de PLFA
analyse bleek na incorporatie van Lignosol de proportie aan schimmels en Gram negatieve bacteriën
toe te nemen in beide bodems. Dit bleek ook samen te gaan met een verhoogd en diverser
metabolisme van de schimmelpopulatie. De metabolische karakterisatie van de bacteriële
gemeenschap onthulde een populatie die een hoger verbruik had van de bronnen α-cyclodextrine,
glycogeen, D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside na toepassing van Lignosol of Miscanthus in PCG
bodem. Het toegenomen verbruik van deze bronnen zou mogelijks een indicator kunnen zijn voor
een goede werking van de ligninebronnen. De verschuivingen in de microbiële populatie na twee
weken waren intermediair aan deze na vier weken. De onbehandelde bodems van PCG en PSKW
waren slechts beperkt te onderscheiden aan de hand van de gebruikte analysemethoden. De bodem
van PCG (met hogere lignine-effectiviteit) leek een schimmelpopulatie te bezitten met een diverser
metabolisme en een bacteriële populatie die al een verhoogd verbruik van de bronnen
α-cyclodextrine, glycogeen, D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside had. Het totaal bodemleven
gekarakteriseerd aan de hand van het totaal geëxtraheerde PLFA’s was niet verschillend tussen beide
bodems. In PSKW bleken de PLFA’s proportioneel uit meer biomerkers voor schimmels en Gram
negatieve bacteriën te bestaan. Voor een betere karakterisatie van gronden met verschillende
lignine-effectiviteit en de effecten na incorporatie van ligninerijke bronnen dienen meer gronden
vergeleken te worden.
iv
Summary
Soilborne diseases like bottom rot, caused by Rhizoctonia solani, are one of the major problems in
lettuce cultivation, especially since the abolishment of methylbromide. Enhancing the soil
suppressiveness would be a possibility to cope with bottom rot. The research conducted in this thesis
aimed to find a method to measure the soil suppressiveness, to enhance it and to better understand
the underlying mechanisms.
The first part of this thesis consists of the search for a bioassay by which it would be possible to
measure the natural inoculum of R. solani in soil and the soil suppressiveness. Small plastic trays
were filled with soil and covered with lettuce leaf discs. The soil suppressiveness and natural
inoculum was evaluated by the speed of appearing symptoms. Soils from one greenhouse which was
fumigated in different ways were compared: Monam, Herbie and an untreated plot. It was only
possible to capture R. solani on the leaf discs from the untreated soil. To evaluate the test for its
capacity to measure soil suppressiveness, the soils were autoclaved, inoculated with different levels
and treated with buckwheat. It was possible to capture differences in soil and treatments. More soils
should be checked to link the results of the bioassay with the soil suppressiveness.
In the second part some lignin rich products were checked for their abilities to enhance soil
suppressiveness towards R. solani. Previous research showed already the effectiveness of pure lignin
and other lignin rich products like flax shives and wood fibers (Van Beneden, 2009). According the
lignin-melanin hypothesis, the lignin would stimulate lignin degraders, which are able to break down
melanin with the same enzymes as used for the breakdown of lignin. The cell wall of sclerotia of
R. solani consists out of melanin and the promoted melanin degradation makes the sclerotia more
vulnerable to stress (Subbarao et al., 1999). Three products were tested: a powder of grape seeds
(Lignosol), an effluent of the paper industry (Sappi-Out) and Miscanthus, a high yielding woody grass.
First, the direct effects of Lignosol on R. solani were investigated. Chemical substances seemed to
suppress the growth of the pathogen. Lignosol also appeared to stimulate the germination of the
sclerotia. Promoted germination can contribute to the soil suppressiveness by enhancing the
antagonistic population and the weakening of the sclerotia.
Secondly, the effectiveness of Lignosol and Sappi-out were evaluated in field circumstances. The soil
in a greenhouse with oak leaf lettuce was treated with 0.5% of these products. There were no
significant differences in the disease incidence and viability of the sclerotia, but treatments did
increase the amount of parasites retrieved from the sclerotia. The small effects could be due to the
inability of the soil to react to lignin rich products, the low doses applied and the short time between
the treatment and planting the lettuce.
v
The last experiment aimed to clarify the changes in the microbial community after incorporation of
1% Lignosol or Miscanthus in soil with PLFA extraction and CLPP (Community level Physiological
Profiling). The success of lignin rich products seemed to be soil dependent. Therefore two soils were
tested. One soil with high lignin effectiveness (PCG) and one with low lignin effectiveness (PSKW).
The treated soils were incubated in glass jars for two or four weeks. PLFA analyses revealed an
increase of fungi after treatment with Lignosol in both soils. This seemed to coincidence with a
higher and more divers metabolism of the fungal population. The bacterial population shifted after
treatment with Lignosol or Miscanthus in PCG soil to one with a higher use of the sources
α-cyclodextrin, glycogen, D-cellobiose and β-methyl-D-glucoside. The higher use of these sources
might be a good indicator for the lignin effectiveness. The size of the shifts in microbial community
after two weeks of incubation were half those of a four week incubation period. The untreated soils
of PCG and PSKW differentiated only in a limited extent. The PCG soil seemed to have a more active
and diverse fungal population and a bacterial community which had already a higher use of the
sources α-cyclodextrin, glycogen, D-cellobiose and β-methyl-D-glucoside. The size of the microbial
community, measured by total PLFA-C extracted, didn’t differed in these soils. The soil of PSKW had
a higher proportion of fungi and Gram negative bacteria. More soils need to be investigated and
compared to have a more clear and trustworthy characterization of the lignin effectiveness of soils.
vi
Inhoud
Woord vooraf ........................................................................................................................................... i
Lijst van afkortingen .................................................................................................................................ii
Samenvatting...........................................................................................................................................iii
Summary ..................................................................................................................................................v
1. Inleiding ............................................................................................................................................... 1
2. Literatuurstudie ................................................................................................................................... 3
2.1. Slateelt en smet ............................................................................................................................ 3
2.1.1. Inleiding ................................................................................................................................. 3
2.1.2. De teelt .................................................................................................................................. 3
2.1.3. Smet in de slateelt ................................................................................................................. 3
2.2 Rhizoctonia solani Kühn ................................................................................................................ 4
2.2.1. Omschrijving .......................................................................................................................... 4
2.2.2. De ontwikkeling van de ziekte ............................................................................................... 5
2.2.3. Scleroten................................................................................................................................ 6
2.2.4. Bestrijding.............................................................................................................................. 7
2.3. Bodemweerbaarheid .................................................................................................................. 10
2.3.1. Enkele begrippen en standaardconcepten.......................................................................... 10
2.3.2. Bodemweerbaarheid analyseren ........................................................................................ 13
2.3.3. Stimulatie van de bodemweerbaarheid met organische bodemsupplementen ................ 17
2.4. Lignine ........................................................................................................................................ 19
2.4.1. Eigenschappen en voorkomen ............................................................................................ 19
2.4.2. De lignine - melanine hypothese ......................................................................................... 19
3. Materiaal en methoden..................................................................................................................... 21
Deel A: De biotest .............................................................................................................................. 21
3.A.1. De proefopzet ..................................................................................................................... 21
3.A.2. Voorafgaande testen: analyse van de slatypes en het inoculumtype ................................ 22
3.A.3. Detectie van het natuurlijke inoculum van R. solani .......................................................... 23
3.A.4. Detectie van de bodemweerbaarheid ................................................................................ 23
Deel B: Effectiviteit van verschillende ligninerijke bodemsupplementen ........................................ 24
3.B.1. Directe effecten van Lignosol op R. solani .......................................................................... 24
3.B.2. Evaluatie van Lignosol en Sappi-Out onder veldomstandigheden...................................... 24
3.B.3. Potexperiment: bodemafhankelijke effectiviteit van Miscanthus en Lignosol incorporatie
op de overleving en parasitisme van scleroten van R. solani....................................................... 26
vii
4. Resultaten en bespreking .................................................................................................................. 28
Deel A: De Biotest.............................................................................................................................. 28
4.A.1. Inleiding ............................................................................................................................... 28
4.A.2. Voorafgaande testen: analyse van de slatypes en het inoculumtype ................................ 29
4.A.3. Detectie van het natuurlijk inoculum van R. solani ............................................................ 30
4.A.4. Detectie van de bodemweerbaarheid ................................................................................ 31
4.A.5. Bevindingen en voorstellen voor de verdere ontwikkeling van de biotest ........................ 35
Deel B: Effectiviteit van verschillende ligninerijke bodemsupplementen ........................................ 37
4.B.1. Inleiding ............................................................................................................................... 37
4.B.2. Directe effecten van Lignosol op R. solani .......................................................................... 37
4.B.3. Evaluatie van Lignosol en Sappi-Out onder veldomstandigheden...................................... 41
4.B.4. Potexperiment: Bodemafhankelijke effectiviteit van Miscanthus en Lignosol incorporatie
op de overleving en parasitisme van scleroten van R. solani....................................................... 44
5. Algemene conclusies ......................................................................................................................... 68
6. Referenties ........................................................................................................................................ 70
7. Bijlages............................................................................................................................................... 75
Bijlage 1: Koolstofbronnen van de Eco MicroPlates™ ....................................................................... 75
Bijlage 2: koolstofbronnen van de FF MicroPlates™ ......................................................................... 76
viii
1. Inleiding
De landbouwsector wordt net zoals andere sectoren vaak geplaagd met problemen. Het probleem
dat in deze thesis op tafel wordt gelegd, handelt over de grote verliezen die smet veroorzaakt bij de
Belgische slatelers. Smet is een aandoening die veroorzaakt wordt door o.a. Rhizoctonia solani,
waarbij de onderste bladeren wegrotten. Bij ernstige aantasting kan het volledig inzakken van de
krop optreden. Door de afschaffing van het bodemontsmettingsmiddel methylbromide, zitten de
telers nu met de handen in het haar. Het middel dat hen jarenlang toeliet deze ziekte te beheersen,
is nu een verboden product. Een volwaardige vervangstof biedt zich niet onmiddellijk aan. De
consument en distributiesector eisen daarenboven een zo residu arm mogelijk gewas en nieuwe
fungiciden passen niet direct in dat plaatje.
Om aan problemen het hoofd te bieden, behoort er een probleemanalyse te worden uitgevoerd. In
een probleemanalyse gaat men op zoek naar wat fout loopt en hoe datgene kan vermeden dan wel
verbeterd worden. Vaak durft men bij deze analyses naast al dat negatieve vergeten te kijken naar de
intrinsieke sterktes van de situatie. Waar ligt de kracht van waaruit we moeten vertrekken om te
evolueren naar het optimale?
Deze thesis vertrekt vanuit zo’n standpunt. Wanneer we met positieve bril kijken naar de
plantenteelt, zien we dat in sommige bodems de ziekte-incidentie van bodemgebonden pathogenen
lager ligt zonder dat er bijzondere verschillen in teelt en ziektebestrijding zijn (Weller et al., 2002). De
bodem lijkt de ziekte meer onder controle te houden. Voor R. solani werden reeds zulke verschillen
in de bodemweerbaarheid waargenomen in suikerbiet en bloemkool (Mendes et al., 2011; Anees et
al., 2010; Postma et al., 2010). De weerbaarheid van de bodem kan te wijten zijn aan zijn abiotische
factoren zoals bodemtextuur, structuur, lucht, water en aan de microbiële populatie die huist in de
bodem. Bacteriën, schimmels en andere bodembewoners kunnen optreden als concurrent of als
parasiet van de pathogeen of de resistentie van de plant induceren. Er wordt verondersteld dat het
microbieel leven de grootste bijdrage levert aan het ziekteonderdrukkend vermogen van de bodem,
maar het is niet duidelijk waar de natuurlijke weerbaarheid juist aan gelegen is (Bonanomi et al.,
2010). De weerbaarheid lijkt daarenboven beïnvloed te kunnen worden door cultuurtechnische
maatregelen, zoals door de toevoeging van organisch materiaal (Sneh et al., 1996). Men is naarstig
op zoek naar de mechanismen achter de bodemweerbaarheid en het onderzoek uitgevoerd voor
deze thesis tracht een bouwsteen hiervoor aan te leveren.
Het eerste luik van deze thesis had als doel om een biotest te ontwikkelen die op eenvoudige wijze
zou kunnen aantonen wat de inoculumdichtheid, dan wel de weerbaarheid van de bodem jegens
R. solani is.
1
Het tweede luik van deze thesis bevat de verdere uitwerking van een mogelijke beheersingsmethode
die gebruik maakt van de versterking van de bodemweerbaarheid tegenover R. solani op sla door
toevoeging van ligninerijke bronnen. Voorgaand onderzoek heeft aangetoond dat men R. solani kan
onderdrukken door toediening van zuivere lignine aan de bodem (Van Beneden et al., 2009). In deze
thesis werden twee ligninerijke bijproducten uit de industrie getest: een poeder van druivenpitten
uit de wijnindustrie (Lignosol) en een effluent uit de papierindustrie (Sappi-Out). Daarnaast werd ook
het effect van Miscanthus, een ligninerijk gewas, getest. Het eerste doel was de effectiviteit van deze
producten te testen op het afdoden van scleroten zowel onder labo als veld condities. Als tweede
doelstelling werd de ontleding van de werking van deze producten vooropgesteld. Het succes van
ligninetoevoeging bleek uit vorig onderzoek bodemafhankelijk en leek verklaard te kunnen worden
door verschuivingen in de microbiële bodempopulatie (Van Beneden, 2009). In deze thesis werd
onderzocht hoe de microbiële populatie verschilde tussen een bodem met hoge en een met lage
lignine-effectiviteit en hoe de microbiële populatie veranderde na incorporatie van de ligninerijke
producten. Daarnaast werden ook directere werkingsmechanismen van Lignosol onderzocht.
2
2. Literatuurstudie
2.1. Slateelt en smet
2.1.1. Inleiding
Sla (Lactuca sativa) is een van de populairste groenten en zijn marktaandeel in de tuinbouwsector in
België komt op de tweede plaats , na de nog populairdere tomaat. In ons land zijn de telers
voornamelijk gespecialiseerd in het telen van zware botersla. Het gemiddeld kropgewicht in België
ligt met 400 à 500 gram zo’n 200 gram hoger dan deze geproduceerd in andere Europese landen.
Door zijn gewicht en kwaliteit, die gewaarborgd wordt door de Flandria en Eurep-gap labels, is
Belgische sla tevens begeerd in het buitenland (Van Labeke, 2011-2012). Gedijend op de algemene
trend in de tuinbouw wordt ook de productie van sla gedwongen naar een grotere intensivering om
economisch haalbaar te blijven en hierdoor, samen met het zware slatype, neemt de ziektedruk toe
(Van Beneden et al., 2011).
2.1.2. De teelt
In Vlaanderen bedraagt de totale met sla beteelde oppervlakte zo’n 600 ha, waarvan ongeveer de
helft als beschermde teelt (NIS, 2008). Dat sla een van de voornaamste groentes op de markt is,
bewijst zijn omzetwaarde. Deze bedroeg in 2010 46.8 miljoen euro voor botersla, dat een aandeel
van 2/3 in de totale slateelt inneemt (VBT, 2010). Men teelt sla voornamelijk in monocultuur in
ongeveer 6 cycli per jaar en wisselt sporadisch af met tomaat in de zomer (Van Labeke, 2011-2012).
De teelt verloopt in twee fasen. Eerst worden de omhulde sla-zaden in perspotjes oppervlakkig
gezaaid en opgekweekt tot het 4 tot 6-bladstadium, meestal door gespecialiseerde bedrijven.
Vervolgens worden deze met perspotjes op de bodem geplaatst op het tuinbouwbedrijf zelf. Een
goed vlak gemaakte bodem moet plasvorming verhinderen en het plaatsen van de perspotjes boven
op de bodem zorgt voor uitgesteld contact van de bladeren met de bodem en zodoende beperking
van de aantasting door bodemgebonden pathogenen zoals R. solani.
Naargelang het seizoen zal de teelt een verschillende duur hebben. In de zomer kan men na één
maand reeds een volle krop bekomen, in de winter zal dat eerder drie maanden worden. Ook de
mogelijke uitdagingen gepaard gaande met de teelt kunnen variëren met het seizoen. Zo bleek uit
onderzoek van Van Beneden et al. (2009) dat de schimmels die smet veroorzaken verschillen per
seizoen (Tabel 1).
2.1.3. Smet in de slateelt
Een van de zorgen van de slateler zijn de verliezen omwille van smet, die tot 70% kunnen reiken. Het
is uit economische reden belangrijk de smet-aantasting te beperken (Scherwinski et al., 2008). Smet
is een ziekte waarbij de onderste bladeren wegrotten. De ziekte kan leiden tot ernstige
oogstverliezen die zowel kwantitatief en kwalitatief kunnen zijn. Door grote weggesneden delen
aantasting is er een hoger risico op lagere klassering en bij een ernstige aantasting kan er volledige
uitval van de krop optreden (Van Beneden et al., 2011).
3
Verschillende bodemgebonden pathogenen kunnen smet veroorzaken. R. solani, Sclerotinia spp.,
Botrytis cinerea en Pythium spp. vormen het vaakst de oorzaak van deze ziekte. Tabel 1 geeft een
beknopt overzicht van hun symptomen en infectiemethode. R. solani wordt verder in het werk nog
uitgebreid behandeld.
Tabel 1: Beknopt overzicht van de pathogenen die smet veroorzaken (Van Beneden, 2009; Höfte, 2010-2011)
Pathogeen
Rhizoctonia
solani
Symptomen
 Eerst roestbruine letsels op de
onderste bladen
 Verdere verwelking, tot hele krop
 Soms licht bruin, gelig mycelium en
scleroten op bladen
 Verwelking van de onderste bladeren
met natrot symptomen
 Witte myceliumpluizen en
langwerpige scleroten op de bladen
Ziekteontwikkeling en Infectie
 Infectie start vanuit
mycogenicaal gekiemde
scleroten of uit mycelium
 Geen sporen
Seizoen
 Voornamelijk in
de zomer, ook in
lente en herfst.
(warm en vochtig)
 Scleroten kiemen
voornamelijk carpogenicaal.
Dus besmetting door
ascosporen, vaak uit de lucht.
Minder door mycelium uit
scleroten
Sclerotinia
minor
 Analoog aan S. sclerotiorum, maar
met puntige kleine scleroten
Pythium spp.
 Rot van de onderste bladeren,
slijmiger
 Donker bruin rot
 Grijze conidioforen als kussen over
de aangetaste bladeren
 Soms zwarte gladde scleroten stevig
bevestigd aan het blad
 Scleroten kiemen
mycogenicaal.
 Trager dan S. sclerotorum,
maar steeds wederkerend
(onvoldoende onderzocht)
 alle seizoenen,
minder in de
winter. Scleroten
hebben
koudeperiode en
vocht nodig om te
carpogenicaal te
kunnen kiemen
 alle seizoenen,
minder in de winter
Sclerotinia
sclerotiorum
Botrytis
cinerea
 Opportunistische infecties van
verzwakt weefsel, vaak de
verouderende onderste
bladeren
 Infectie met conidosporen en
een zelden keer vanuit
scleroten
 Lente, zomer,
herfst
 Winter (koude en
vocht)
2.2 Rhizoctonia solani Kühn
2.2.1. Omschrijving
Een brede groep aan pathogene schimmels wordt samengebracht in het genus Rhizoctonia. Het zijn
basidiomyceten waarvan vaak enkel de anamorfe gekend is. Zij worden gekenmerkt door het typisch
loodrecht T-vormig splitsend mycelium. Dit kenmerk is door de afwezigheid van spoorvormende
structuren vaak het enige herkenningspunt (Figuur 1).
Het voornaamste soortencomplex is R. solani. Deze groep van bodemgebonden pathogenen kunnen
aanleiding geven tot tal van symptomen, gaande van smeul tot stengelrot, kanker, bladrot, etc. en
veroorzaakt overal ter wereld schade. R. solani heeft multinucleate cellen, terwijl bij het merendeel
van de Rhizoctonia soorten binucleate cellen terug te vinden zijn. De zelden teruggevonden
teleomorf van R. solani heet Thanatephorus cucumeris (A. B. Frank) Donk. (Agrios, 2005; Sneh et al.,
1996).
4
Figuur 1: Mycelium van Rhizoctonia solani
(http://tdl.wisc.edu/bp.php)
Het soortencomplex wordt onderverdeeld in verschillende anastomosis groepen (AG). Organismen
van dezelfde anastomosisgroep hebben hyfen die kunnen fuseren als ze elkaar ontmoeten. Dit is de
enige manier waarop er genetisch materiaal uitgewisseld wordt en zodoende zijn de verschillende
anastomosegroepen genetisch geïsoleerd. De verdeling in anastomosis groepen loopt niet volledig
gelijk met de verdeling in kenmerken als morfologie, virulentie, gastheer en andere fysiologische
kenmerken en wordt niet aanvaard als onderverdeling in soorten (Sneh et al., 1996). Er zijn 13
verschillende anastomosegroepen (Agrios, 2005).
De AG’s zijn vaak nog verder onderverdeeld naargelang de symptomen, gastheer en
cultuurkarakteristieken in intraspecifieke groepen (ISG) (Taheri et al., 2007; Sneh et al., 1996).
Fylogenetische analyse op basis van moleculaire technieken onthulde bijvoorbeeld zes ISG binnen
AG1 gaande van 1A tot 1F (Toda et al., 2004). Ook binnen de verschillende groepen kan er
naargelang het isolaat grote variabiliteit optreden in pathogeniteit en vatbaarheid voor fungiciden
(Fiddaman en Rossall, 1995). In Belgische slaserres zijn de groepen AG1-1B en AG4 HGI de meest
voorkomende AG’s. Daarnaast worden ook regelmatig AG2-1, AG2-1 Nt, AG3 en AG10
teruggevonden (Van Beneden et al., 2009).
2.2.2. De ontwikkeling van de ziekte
R. solani is een typische bodempathogeen. Scleroten en mycelium uit de bodem vormen de
voornaamste bron van infectie (Figuur 2). Het mycelium van R. solani is zeer groeikrachtig, zeker
onder optimale omstandigheden (15-18°C en matig natte bodems). Op het plantmateriaal vormt het
mycelium compacte opeenhopingen – infectiekussentjes – langs waar het mycelium intercellulair
binnen de plant groeit. Aangezien het necrotrofe karakter van de pathogeen overheerst, zal bij
ernstige infectie de plant ten onder gaan. De ziekte verspreidt zich door regen, irrigatiewater,
geïnfecteerd plant/zaaigoed en verplaatsing van besmette grond, bijv. door landbouwmachines.
Het sexuele deel van de cyclus is, zoals eerder vermeld, te verwaarlozen. R. solani overleeft als
scleroten of als mycelium, in de bodem of op plantenresten en onkruid. R. solani kan, bij afwezigheid
van een waardplant, ook overleven op saprofytische wijze. Eenmaal R. solani zich gevestigd heeft in
een bodem, zal zij daar niet weg te krijgen zijn (Agrios, 2005; Sneh et al., 1996).
5
Figuur 2: De ziektecyclus van Rhizoctonia solani (Agrios, 2005)
2.2.3. Scleroten
Scleroten zijn overlevingsstructuren die de pathogeen aanmaakt bij het optreden van stress. De
stress kan bijv. bestaan uit een belemmerde groei, koude of bij het ontmoeten van een andere hyfe.
Niet alle AG’s maken scleroten aan en er zijn grote verschillen in uiterlijk en grootte (Sneh et al.,
1996). Scleroten bestaan uit uniforme donkerkleurige consistente massa’s monilioide cellen met
celwanden die versterkt zijn met melanine. Melanine is een verzameling van ongedetermineerde
structuren opgebouwd uit polyaromatische stoffen. Bij schimmels is de voornaamste vorm DHN
melanine. In de celwand gaan de melaninemolecules allerlei interacties aan met o.a. proteïnen en
vormt zich zo een heus melaninecomplex (Butler et al., 2005). Scleroten van R. solani hebben geen
rind, maar bestaan uit individueel versterkte cellen. Scleroten van Botrytis en Sclerotinia spp.
daarentegen hebben wel een rind. Scleroten moeten de overleving van de pathogeen garanderen en
worden dus minimaal geschaad door abiotische omgevingsfactoren zoals water (in tekort en
overvloed), zuurstof, temperatuursextremen en pH. Aan extreme straling weten zij te weerstaan
door middel van de melanine die straling bijna absoluut absorbeert door de zwarte kleur en omzet in
warmte (Butler et al., 2005). De afwezigheid van een rind bij scleroten van R. solani heeft geen
impact op de overlevingsduur van scleroten die kan reiken tot 6 jaar (Coley-Smith en Cooke, 1971).
Voorgenoemde omgevingsparameters kunnen echter wel een impact vertonen op het doorbreken
van de dormantie van de scleroten.
Dat scleroten resistent zijn, betekent niet dat ze onverwoestbaar zijn. In de bodem leeft een heuse
samenleving van micro-organismen en sommige kunnen scleroten parasiteren, zoals
Trichoderma spp., of vertonen ander antagonistisch gedrag, zoals vele bacteriën. Er werd reeds
aangetoond dat het toevoegen van organisch materiaal aan de bodem negatief inwerkt op de
levensvatbaarheid van scleroten (Bonanomi et al., 2010; Sneh et al., 1996; Croteau en Zibilske, 1998).
6
Organisch materiaal stimuleert immers de bodempopulatie en dus ook de parasieten en
antagonisten. Organisch materiaal zorgt ook voor optimale omstandigheden voor R. solani, die een
facultatieve saprofyt is, en stimuleert bijgevolg ook het verval van scleroten op directe wijze door
uitgelokte kieming (Coley-Smith en Cooke, 1971). Scleroten beschermen zich extra, naast de celwand
uit melanine, door de productie van een donkerkleurig exudaat uit fenolen, carboxylzuren,
koolwaterstoffen, vetzuren en aminozuren dat antifungale en fytotoxische eigenschappen heeft
(Aliferis en Jabaji, 2010).
Scleroten kunnen twee soorten dormantie bezitten, endo- en ecodormantie. De eerstgenoemde
behoedt de scleroten voor kieming door factoren die uit de scleroot zelf bepaald worden. Dit zorgt
ervoor dat niet alle scleroten gelijktijdig kiemen en kans op afsterven lopen. R. solani is enkel
onderhevig aan de tweede vorm van dormantie, de ecodormantie, die ervoor zorgt dat scleroten
enkel kiemen in omstandigheden waarin groei mogelijk zou zijn. Hoewel scleroten sterk
gemelaniseerde celwanden bezitten, blijven zij permeabel voor moleculen en kunnen zodoende
signalen, zoals O2 en specifieke biochemische componenten bijv. wortelexudaten en stoffen uit
organisch materiaal ontvangen (Coley-Smith en Cooke, 1971). R. solani kan echter ook kiemen
zonder de aanwezigheid van uitwendige energiebronnen (Liu et al., 2011).
2.2.4. Bestrijding
R. solani is alomtegenwoordig. Omwille van zijn zeer breed gastheerspectrum, zijn overleving met
persistente scleroten en capaciteit om te overleven in diverse omstandigheden, is de bestrijding een
moeilijke zaak (Grosch et al., 2006). Een geïntegreerde aanpak dringt zich op waarbij chemische,
biologische en cultuurmaatregelen samen gehanteerd worden.
2.2.4.1. Cultuurmaatregelen
Het is voor een pathogeen veel gemakkelijker om grote schade te berokkenen in een systeem dat
verstoord is. Goede landbouwpraktijken vormen daarom een van de fundamenten om de ziektedruk
te verminderen. Wanneer bijvoorbeeld de drainage onvoldoende is, is het een goede zaak om deze
te optimaliseren aangezien Rhizoctonia van vochtige omstandigheden houdt. Hoewel het gebruikelijk
is in de slateelt om in monocultuur te werken, zou een vruchtwisselingsschema een gepaste
strategie zijn om het vermogen van het inoculum te verminderen. In sla worden vooral AG1-1B en
AG4 HGI gestimuleerd en een ander gewas zou andere groepen stimuleren. De diversificatie binnen
R. solani verhindert het uitgroeien van enkele stammen tot oncontroleerbaar hoge proporties, maar
zorgt niet voor eliminatie van het probleem (Agrios, 2005). Telers die enige vorm van rotatie
toepassen, bijvoorbeeld met bloemkool of preizaailingen, merken een afname in smetverliezen in
het daaropvolgend slagewas (De Storme, persoonlijke communicatie). Andere auteurs benadrukken
de mogelijkheid om via monocultuur een specifieke antagonistische populatie op te bouwen. Een
afname van de ziekte door R. solani werd reeds aangetoond in monoculturen van tarwe,
suikerbieten, aardappelen en bloemkool (Weller et al., 2002; Anees et al., 2010; Postma et al., 2010;
Sneh et al., 1996). Resistente variëteiten zijn niet voorhanden (Grosch et al., 2006; Sneh et al., 1996).
Het is extreem moeilijk om via veredeling tot resistente variëteiten te komen, door de hoge
diversiteit en het weinig specifiek parasitisme van de pathogeen. Er zijn echter wel verschillen in
tolerantie tegenover R. solani in sla waargenomen, maar deze kon via veredeling niet vastgelegd
worden (Leach en Garben, 1970). Tot slot dienen de slaplantjes zodanig geplant te worden dat hun
bladeren zo lang mogelijk de grond niet raken en in zo optimaal mogelijke conditie zijn (Agrios,
2005).
7
2.2.4.2. Chemische controle
Tot 2006 werd door telers frequent gebruik gemaakt van het bodembesmettingsmiddel
methylbromide. Het werkingsspectrum van dit uit de rekken genomen middel is zeer breed. Met een
enkele tweejaarlijkse behandeling slaagde men erin om onkruiden, aaltjes en pathogene schimmels
te onderdrukken. Door de beperkte fytotoxiciteit werd er amper schade berokkend aan het gewas.
De huidige fumigantia, zoals chloorpicrine, 1,3-D, dazomet en metam-natrium, werken niet zo
efficiënt tegenover bodemgebonden plagen en slagen er minder in de scleroten van R. solani te
doden. Daarenboven hangt ook voor deze producten de afschaffing boven het hoofd. Ontsmetten
door middel van solarisatie is enkel mogelijk in mediterrane streken en met stoom ontsmetten is
duur omwille van investerings- en energiekost.
Naast fumigantia zijn er ook producten op de markt die curatief symptomen kunnen bestrijden. Deze
fungiciden, waaronder Rovral, Internum, Rizolex en Signum baten enkel bij beperkte ziektedruk en
zijn niet in staat om de bron van de ziekte, namelijk scleroten en mycelium in de bodem, af te doden
(Fytoweb, z.d.). Daarenboven is sla een rauw gegeten bladgroente en is er dus een groot risico voor
residuen. Daarom wordt er ook vanuit de distributiesector druk uitgeoefend om het gebruik van
chemische middelen af te bouwen (Van Beneden et al., 2011).
2.2.4.3. Biologische controle
De bodempopulatie is allerminst een vreedzame samenleving. In de bodem wordt keihard geknokt
voor plaats en nutriënten en ontwikkelen organismen wapens om elkaar de dieperik in te sturen.
Wanneer een organisme zo’n bewapening heeft die effectief is tegen een pathogeen, zou deze
kunnen aangewend worden als biopesticide. De wapens zijn grosso modo onder te brengen in vier
categorieën: competitie, parasitisme, antibioticaproductie en aanmaak van biosurfactans. Er worden
ook organismen ontdekt met nieuwe wapens zoals bijv. het vermogen om het DNA van bacteriën te
wijzigen (de Boer et al., 2005). Naast het vermogen van micro-organismen om elkaar te schaden,
bezitten andere dan weer het vermogen om de resistentie van de plant te verhogen (Raaijmakers et
al., 2009). Hoewel er een heel breed spectrum is van bacteriën en schimmels met antagonistische of
plantengroei bevorderende activiteit, wordt maar een minimaal deel op commerciële basis gebruikt
als biopesticide (Fravel, 2005).
Ter bestrijding van R. solani in sla in België worden in de praktijk geen biologische middelen ingezet,
hoewel Trianum-P®, een product op basis van de parasitaire schimmel Trichoderma harzianum T22,
wel aangeprezen staat als werkzaam in sla (Van Beneden, 2009 & 2011; Fytoweb, z.d.). Tegen
S. sclerotiorum en S. minor kan men aan de slag gaan met Contans® (Coniothyrium minitans) en ook
tegen Botrytis cinera kan men biologisch behandelen met bijv. Prestop® (Gliocladium catenulatum)
(Fytoweb, z.d.).
Hoewel er geen commercieel beschikbare middelen zijn, wordt er veel onderzoek gedaan naar
biological control agents (BCA). De weg tot nieuwe commerciële producten is evenwel nog lang.
Verticillium biguttatum is een efficiënte mycoparasiet van R. solani AG3 op aardappel en zou
misschien ook werkzaam kunnen zijn tegen andere AG’s (Grosch et al., 2006). Ook aan het labo van
Fytopahtologie te Gent wordt er onderzoek gedaan op Verticilium tricorpus als biologische bestrijder
(Deketelaere, Tyvaert, persoonlijke communicatie). Enkele veel belovende bacteriën zijn isolaten van
8
Pseudomonas spp., Serratia plymuthica en Bacillus subtilis (Scherwinski et al., 2008; Fiddaman et al.,
2000; Faltin et al., 2004, D’Aes et al., 2011; Raaijmakers et al., 2006). Nieuwe BCA’s zouden ook uit
minder verwachte organismen ontwikkeld kunnen worden, zoals bijv. dubbelstrengig RNA-virus
“Rhizoctonia decline” dat de overlevingskracht en virulentie van R. solani aantast of een
mycoparasitair aaltje (Agrios, 2005).
Nieuwe BCA’s worden gezocht in bodems met verlaagde ziekte-incidentie, voornamelijk in de fylloen rhizosfeer. Ook endofytische organismen kunnen in aanmerking komen. Men tracht ook te
selecteren naar de stoffen die hun antagonistische werking kunnen verklaren zoals enzymen,
plantgroei stimulatoren, sideroforen…. Daarnaast focust onderzoek zich o.a. op het bepalen van de
optimale gemengde aanwending en ecologische voorwaarden (Fravel, 2005; Grosch et al., 2006). Een
biologisch systeem is steeds onderhevig aan hoge variabiliteit en zodoende schommelt ook de
effectiviteit van biologische bestrijdingsmiddelen. Men kan de variatie in werkingskracht proberen
uitvlakken door de omgevings- en ecologische voorwaarden zo dicht mogelijk tegen de optimaal
werkzame te brengen.
Het ontwikkelen van nieuwe commercieel beschikbare biologische middelen is een zeer langzaam
proces. Niet alleen verloopt de selectie naar nieuwe BCA’s moeizaam wegens inconsistentie van in
vitro en in vivo resultaten, ook is het vaak economisch moeilijk te verantwoorden. De te korte shelflife, de nichemarkten, de moeizame productie en de grote kost voor registratie zijn factoren die het
vaak niet rendabel maken om gevonden antagonisten ook effectief op de markt te brengen (Fravel,
2005).
Wanneer de definitie van biologische bestrijdingsmiddelen opengetrokken wordt, komen veel meer
mogelijkheden tevoorschijn. De stoffen die antagonisten produceren kunnen ook zonder het
organisme zelf aangewend worden als bijv. mycofungicide of plantresistentie-induceerder. Daarnaast
kunnen de antagonisten die reeds aanwezig zijn in de microbiële bodempopulatie gestimuleerd
worden door gebruik te maken van goede cultuurtechnieken of door toevoeging van
bodemsupplementen. Hierop is de aanwending van organische materialen en het hier verder
onderzochte lignine gebaseerd.
2.2.4.4. Geïntegreerde bestrijding
Sinds geruime tijd wordt er in de gewasbescherming de aandacht gevestigd op een geïntegreerde
aanpak. Verschillende beheersingsmethodes worden gecombineerd om een zo breed mogelijk
werkingsspectrum te beslaan. Door te meten wordt nattevingerwerk vermeden en kan minimale
behandeling bereikt worden (Bonanomi et al., 2010). Bij de geïntegreerde aanpak hoort ook het
bevorderen van de bodemweerbaarheid.
9
2.3. Bodemweerbaarheid
2.3.1. Enkele begrippen en standaardconcepten
Bodemweerbaarheid werd reeds door velen gedefinieerd, maar de definitie van Baker en Cook
(1974) kan beschouwd worden als de meest algemene. Deze luidt:
“soils in which the pathogen does not establish or persist, establishes but causes little
or no damage, or establishes and causes disease for a while but thereafter the disease is
less important, although the pathogen may persist in the soil.”
De definitie beschrijft de weerbaarheid tegenover de ziekte en tegenover de pathogeen.
Weerbaarheid tegenover de pathogeen wordt bekomen door de vermindering van de saprofytische
groei en de overleving van de pathogeen. De onderdrukking van de ziekte houdt, naast de
onderdrukking van de pathogeen, ook de afweer van de plant, de vermindering van parasitair
groeiende pathogenen en hun pathogeniteit in (Weller et al., 2002; Termorshuizen en Jeger, 2008;
Sneh et al., 1996). De onderdrukking van de pathogeen draagt bij tot de onderdrukking van de ziekte,
maar vormt geen voldoende voorwaarde voor ziekteonderdrukking (Termorshuizen en Jeger, 2008).
De weerbaarheid die bodems hebben tegenover pathogenen en ziektes kan zowel aan hun fysischchemische als aan hun biologische eigenschappen gelegen zijn. Bodems verliezen hun weerbaarheid
grotendeels na gamma bestraling of autoclavering. De gesteriliseerde bodems kunnen deze weer
gedeeltelijk herinstalleren door inoculatie met een fractie niet-geautoclaveerde bodem. Omwille van
die redenen wordt aanvaard dat de weerbaarheid voornamelijk te danken is aan de aanwezige
micro-organismen en dat de fysisch, chemische factoren er minder toe doen (Thuerig et al., 2009;
Mendes et al., 2011; Postma et al., 2010). De fysisch-chemische factoren kunnen natuurlijk de
bodempopulatie beïnvloeden en op die wijze een aanzienlijke impact hebben (Figuur 3) (Weller et
al., 2002; Mazzola, 2004).
Een bodem die weerbaarheid vertoont tegenover een pathogeen, doet dat niet per se voor alle
pathogenen. Men kan onderscheid maken tussen specifieke en algemene bodemweerbaarheid
(Bonanomi et al., 2010; Termorshuizen en Jeger, 2008; Weller et al., 2002). Algemene of niet
specifieke weerbaarheid wordt ook biologische buffering van bodems genoemd. Zij is eigen aan de
bodem en zijn geschiedenis en is niet overzetbaar naar minder weerbare bodems. Algemene
bodemweerbaarheid wordt bevorderd door het toevoegen van organisch materiaal, door goede
cultuurpraktijken en vruchtbaarheid van de bodem. Het voornaamste werkingsmechanisme berust
op fungistasis. Fungistasis is een mechanisme waarbij schimmelpropagules verhinderd worden te
kiemen of te groeien. Vaak wordt deze bereikt door een tekort aan nutriënten door hoge
metabolische activiteit in de bodem of door secundaire metabolieten met antifungale werking
(Termorshuizen en Jeger, 2008; Garbeva et al., 2011). Fungistasis heeft in feite een duaal effect.
Enerzijds onderdrukt fungistasis de pathogenen, anderzijds bevordert het de overlevingscapaciteit
van de pathogeen (Garbeva et al., 2011).
10
Via specifieke bodemweerbaarheid worden enkele specifieke pathogenen onderdrukt. Specifieke
groepen van micro-organismen die actief zijn tegen een zeker stadium in de levenscyclus van de
pathogeen zorgen hiervoor. Deze vorm van weerbaarheid kan wel overgezet worden naar andere
bodems (Weller et al., 2002). Amensalisme, parasitisme, predatie en competitie vormen de
voornaamste mechanismen van specifieke bodemweerbaarheid (Termorshuizen en Jeger, 2008).
Figuur 3: De niveaus van bodemweerbaarheid tegenover een pathogeen na verschillende bodembehandelingen. Een
gesteriliseerde bodem bezit enkel de weerstand door abiotische factoren (gespikkeld deel). De algemene
bodemweerbaarheid (zwart deel) wordt voornamelijk verzorgd door organismen die snel de bodem weer zullen koloniseren
na ontsmetting. Een onbehandelde bodem geniet boven deze eerste twee factoren ook van de specifieke weerstand (wit)
(Termorshuizen en Jeger, 2008).
Uiteraard sluit de ene vorm van weerbaarheid de andere niet uit. Er bestaat er een continuüm
gaande van bodems met bijna uitsluitend specifieke weerbaarheid tot bodems met enkel de
algemene vorm. Bodems kunnen ook verschillende intensiteit van weerbaarheid bezitten (Weller et
al., 2002).
De weerbaarheid van de bodem is niet uniform in tijd en ruimte. In de rhizosfeer van de plant kan
zich een totaal andere populatie van organismen bevinden. De plant wapent zich tegen
bodempathogenen door rondom haar wortels een specifieke bodempopulatie te scheppen.
Daarnaast bezit de rhizosfeer ook een aandeel organismen die eigen zijn aan de bodem zonder
invloed van de plant (Termorshuizen en Jeger, 2008). De bodempopulatie varieert ook naar gelang
het seizoen, het groeistadium van de plant en de beschikbaarheid van koolstof en stikstof
(Scherwinski et al., 2008).
Onderstaand schema (Figuur 4) kan helpen om het overzicht van verschillende vormen van de
weerbaarheid
te bewaren. Dit is echter een vereenvoudiging van de werkelijke
weerbaarheidsystemen en veel uitzonderingen en overlappingen kunnen voorkomen.
11
Figuur 4: Schema van de biologische component van bodemweerbaarheid
Hornby (1983) deelt weerbare bodems in twee types. Enerzijds heb je de bodems met ‘Longstanding
suppressiveness’. Deze bestaat uit de biologische toestand die van nature aanwezig is in de bodem,
ook zonder de aanwezigheid van het gewas. ‘Induced suppression’ anderzijds wordt geïnitieerd door
de aanwezigheid van het gewas, zeker bij monocultuur. In sommige velden met monocultuur wordt
na een ernstige uitbraak van de ziekte de weerbaarheid van de bodem geïnduceerd. De ziekte neemt
in het volgende gewas dan ook af. Dit fenomeen staat bekend onder de naam Rhizoctonia Disease
Decline (RDD). Het mechanisme van RDD kan berusten op veranderende abiotische factoren zoals de
temperatuur, neerslag en instraling, maar is veel waarschijnlijker te verklaren door biologische
factoren. Er zijn verschillende verklaringen. Allereerst kan de propagule densiteit afnemen. R. solani
kan zijn kwaliteiten als pathogeen verliezen door verlies aan pathogeniteit of door het vermogen om
nieuwe propagules aan te maken te verliezen. De afname van de levensvatbaarheid van de
aanwezige propagules is een andere optie. De aanwezigheid van de pathogeen, een geschikte
gastheerplant en antagonisten lijken een noodzaak voor het optreden van RDD (Hyakumachii, 1996).
De bodempopulatie wordt continu opnieuw samengesteld door de inwerking van
selectiemechanismen. Ruwweg kan men selectiestrategieën van organismen in twee groepen
splitsen. R-selectie promoveert die organismen die zich rijkelijk voortplanten en in onstabiele
omgevingen de bovenhand houden. Onder K-selectie vallen de organismen die meer investeren in
minder nageslacht en de omgeving kunnen koloniseren door middel van competitie (MacArthur en
Wilson, 1963). R. solani is duidelijk een pathogeen die bij K-selectie bevoordeeld wordt. Pathogenen
die overleven op basis van r-selectie, zoals Pythium spp. zijn gemakkelijker te controleren d.m.v. de
algemene weerstand van de bodem. R. solani lijkt maar zeer beperkt onderdrukt te worden door de
algemene weerbaarheid (Termorshuizen en Jeger, 2008).
12
De bodem vormt een heel complex kluwen van verschillende actoren zoals bacteriën, schimmels en
planten met allemaal interacties zodat deze zeer moeilijk, haast onmogelijk, in kaart te brengen zijn
(de Boer et al., 2005; Weller et al., 2002). Brede, systeemoverspannende methoden zijn nodig om de
factoren te kunnen bepalen die het meest bijdragen aan de weerbaarheid. Aan de hand van deze zou
de weerbaarheid van de bodem kunnen geschat worden en deze informatie gebruikt voor het beheer
van bodems (Mazzola, 2004).
2.3.2. Bodemweerbaarheid analyseren
Om de bodemweerbaarheid te schatten meten wetenschappers allerhande parameters. Men kan
deze parameters opsplitsen in twee groepen: chemisch/fysische en microbiologische. De
microbiologische zijn door de band genomen veel krachtiger te correleren met bodemweerbaarheid
en worden dus het meest opgemeten (Bonanomi et al., 2010). Al poneert Van der Wurff (2010) dat
bij Verticilium dahlia slechts 40% van de bodemweerbaarheid te wijten is aan biologische factoren.
Hij blijft een enkeling in de literatuur die zo’n verhouding verdedigt.
2.3.2.1. Chemisch/ fysische parameters
Hoewel chemische parameters vaak een zeer beperkte correlatie vertonen, varieert de correlatie
tussen verschillende pathosystemen. Gemeten parameters hebben betrekking op de minerale
samenstelling (K, Ca, P, EC), de aanwezigheid van stikstof in allerlei vormen (ammonium, ammoniak,
nitraten, C/N ratio en totaal N), pH en % organische stof. De C/N ratio wordt vaak gebruikt in relatie
met de aanwending van organisch materiaal (zie paragraaf 2.3.3). Op R. solani heeft enkel de pH, het
ammonium en nitraat gehalte een (negatieve) correlatie met onderdrukkend vermogen (Bonanomi
et al., 2010). Liu et al. (2011) noteerden onder de onderzochte bodems enkel bij deze met lage pH
een goede weerbaarheid.
De fysische parameters die vaak in correlatie met weerbaarheid worden gebracht, bestaan uit
structuur, bodemdichtheid, textuur en waterverzadigdheid. Het aantal en de grootte van niet
waterverzadigde poriën is een van de voornaamste criteria voor de verspreiding van de pathogeen
(Raaijmakers et al., 2009; Postma et al., 2010).
Nerey et al. (2010) bemerkten bij gesteriliseerde bodems verschillen in de weerbaarheid tegenover
R. solani op bonen. De verschillen zouden dus te wijten zijn aan abiotische factoren. Ook al legt men
in de literatuur een grotere nadruk op biologische parameters, dient het belang van de abiotische
niet onderschat te worden. Het vermogen van een enkele parameter om te correleren met de
bodemweerbaarheid kan laag zijn omdat de weerbaarheid bepaald wordt door een samenspel van
verschillende factoren.
2.3.2.2. Microbiologische parameters
De diversiteit van de microbiële gemeenschap en zijn capaciteiten weerspiegelen zich in een bijna
even breed spectrum aan analysemethoden. De algemene microbiële activiteit kan geschat worden
aan de hand van de algemene respiratie van het substraat of FDA-analyse (Fluorescein diacetaat
activiteit). Bij de laatstgenoemde techniek wordt de hydrolyse van niet specifieke enzymen zoals
lysases, proteases en esterases gemeten. De analyse van de algemene respiratie toont de intensiteit
van het aeroob metabolisme (Bonanomi et al., 2010). De totale respiratie is de beste maat voor de
algemene weerbaarheid (Hoitink en Boehm, 1999).
13
Het totaal metabolisme geeft info over de intensiteit van activiteit in de bodem, maar het loont ook
om te kijken welke activiteiten optreden. De analyse van specifieke enzymatische activiteit kan
informatie verstrekken over de afbraak van bijv. organisch materiaal, fungiciden, zware metalen of
lignine. Bij de zoektocht naar BCA’s, is een analyse van het enzymatisch vermogen ook belangrijk.
Grosch et al. (2006) nam waar dat de bacteriële stammen met de hoogste activiteit tegenover
R. solani voornamelijk veel glucanolytische en proteolytische enzymen produceerden en slechts
sommigen chitinases. De enzymatische karakteristieken van individuele organismen kunnen
opgeschaald worden naar de karakteristieken van een microbiële populatie die weerbaarheid
ondersteunt. Een bodempopulatie met hoge productie aan β-glucanase, chitinase en proteases zou
bijgevolg agressiever zijn ten opzichte van pathogene schimmels (Grosch et al., 2006; de Boer et al.,
2005). De enzymen β-glucosidase, dehydrogenase, fosfatase, urease, ATP- en NGA- glucosaminase
vertonen elk positieve correlaties met bodemweerbaarheid (Bonanomi et al., 2010). Deze enzymen
kunnen verband houden met de afbraak van celwanden of met het blokkeren van virulentiefactoren
van pathogenen (Raaijmakers et al., 2009). De enzymen die melanine kunnen afbreken vormen ook
een belangrijke groep enzymen. Mn-peroxidase en laccase zijn de voornaamste (de Boer et al.,
2005).
De volledige bodempopulatie produceert een amalgaam aan verschillende enzymen. Via de methode
ontwikkeld door Biolog kan een profiel van het metabolisch vermogen van een populatie worden
verkregen. Het profiel wordt gecreëerd aan de hand van het verbruik van verschillende
koolstofbronnen (Preston-Mafham et al., 2002). Via PLFA (phospholipid fatty acid analysis) kan de
samenstelling van de microbiële populatie in grote groepen (Gram -, Gram +, schimmels en
Actinomyceten) ontleed worden. Het totaal aan geëxtraheerde fosfolipiden is een maat voor de
totale microbiële biomassa (Zelles, 1997 en 1999). DNA gebaseerde methoden, zoals T-RFLP (PérezPiqueres et al., 2005) en DNA arrays (bijv. PhyloChip een 16S rDNAn oligonucleotide microarray)
zouden eventueel een alternatief voor PLFA-analyse kunnen vormen (Mendes et al., 2011). Deze
kunnen niet in cultuur te brengen organismen detecteren, maar dit zijn veelal dure technieken. Veel
mogelijkheden zijn in de praktijk nog beperkt door de gelimiteerde beschikbaarheid van primers. Met
genetische methoden kan men zowel naar de samenstelling van de populatie kijken (primers
gebaseerd op rRNA) als de functionaliteit (primers van functionele genen) (Mazzola, 2004).
Parameters die zich beperken tot de samenstelling van de populatie zonder de enzymatische
karakteristieken te betrekken hebben vaak een ontoereikend vermogen tot het schatten van de
bodemweerbaarheid (Bonanomi et al., 2010).
De aanwezigheid van specifiek onderdrukkende organismen zoals fluorescente Pseudomona spp.,
Actinomyceten en Trichoderma spp. of andere mycoparasitaire schimmels is eveneens
determinerend voor een weerbare bodem (Bonanomi et al., 2010). Deze kunnen via klassieke
cultuurgebaseerde methoden, zoals isolatie, uitplating en duale cultuurtesten voor antagonisme
geanalyseerd worden. De meest significant te detecteren antagonisten worden hieronder verder
behandeld.
14
Trichoderma spp.
Trichoderma (Figuur 5) zijn goed bestudeerde bodemgebonden ascomyceten met een breed
nutsspectrum. Ze worden ingezet voor de productie van cellulase voor o.a. de biobrandstofindustrie,
voor de veilige productie van enzymen en antibiotica en als modelorganisme. Daarnaast worden zij
wegens hun mycoparasiterend vermogen als biofungicide ingeschakeld.
Van het genus Trichoderma (Telemorf: Hypocrea) waren er in 2006 zo’n 100-tal soorten vastgesteld,
maar wegens foute identificaties en gebruik van verschillende identificatietechnieken bestaat er nog
veel verwarring (Druzhinina et al., 2006). Drie voorname soorten zijn echter duidelijk
gekarakteriseerd wegens hun gekend genoom: de voor de industrie belangrijke T. reesei, die wordt
aangewend voor de productie van cellulase en heterologe enzymen en de mycoparasieten
T. atroviride en T. virens (Schuster en Schmoll, 2010). De voornaamste commercieel uitgebrachte
mycoparasiet is T. harzianum. Er zijn echter nog andere specifieke parasieten van R. solani zoals
Trichoderma hamatum (Harman et al., 2004).
Het succes van Trichoderma is te danken aan hun groot vermogen om de omgeving te koloniseren.
Dit doen ze door efficiënt gebruik te maken van het aanwezige celluloseachtig substraat en de
secretie van enzymen en metabolieten. De secreties bestaan uit een heus gamma lytische en
proteolytische enzymen, ABC transporter membranen, secundaire metabolieten en vluchtige
organische stoffen die via een complex mechanisme van signaaltransductie gereguleerd worden.
Trichoderma parasiteert in 5 fases. Eerst groeit hij op chemotrofe wijze richting gastheer (1) om zich
dan bij aankomst rondom de hyfe van de gastheer te winden en appressoria aan te maken (2).
Vervolgens worden celwanddegraderende enzymen geproduceerd (3) en na voldoende afbraak kan
Trichoderma de gastheer penetreren (4). Uiteindelijk zal Trichoderma de hyfale inhoud degraderen
en zal de geparasiteerde schimmel afsterven (5) (Schuster en Schmoll, 2010; Vinale et al., 2009; de
Boer et al., 2005).
Het parasitisme van T. virens is verschillend tussen scleroten met rind (zols Sclerotinia spp.) en
R. solani die scleroten bezit met uniforme opbouw. Bij R. solani groeide het parasiterend mycelium
intercellulair, maar uniform doorheen de scleroot, terwijl bij Sclerotinia ze een mat vormde net onder
de rind. Na de intercellulaire invasie van de scleroot van R. solani penetreert T. virens ook de
individuele cellen. Door het overleven van enkele cellen kan de scleroot van R. solani zijn
levensvatbaarheid gemakkelijk behouden (Liu et al., 2010).
Trichoderma beperkt zich niet tot bilaterale acties van micro-organisme tot micro-organisme, maar
treedt ook op in de plant-pathogeen interacties als opportunistische plant symbiont die de
gezondheid van de plant versterkt. Dit gebeurt door het stimuleren van de systemische weerstand
van de plant en door het verbeteren van de wortelgroei (Schuster en Schmoll, 2010).
15
A
B
Figuur 5: A: Uitgeplaatte Trichoderma spp. Vanuit geparasiteerde scleroten van R. solani AG1-1B. De witte puntjes zijn
Fusarium (eigen foto). B: microscopisch beeld van Trichoderma die zich bij parasiterende actie wikkelt omheen een hyfe
van R. solani (RSF, 2011)
Actinomyceten
Deze bacteriën vormen door hun pseudo-hyfale groei de tussenvorm van bacteriën en schimmels.
Door de groei als kettingen van bacteriën kunnen Actinomyceten, net als schimmels, vlotter bodems
koloniseren. Wanneer de pH van de bodem eerder alkalisch wordt, worden zij tegenover schimmels
bevoordeeld (de Boer et al., 2005).
Streptomyces is het voornaamste genus en wordt regelmatig gerapporteerd als antagonistische
bacterie tegenover R. solani (Postma et al., 2010). Actinomyceten zijn in staat om antibiotische
componenten en celwanddegraderende stoffen te produceren (Tuitert et al., 1998; Mazzola et al.,
2001; Sneh et al., 1996). Sommige Actinomyceten bewerkstelligen ziekteonderdrukking ook langs
endofytische wijze. S. griseoviridis K61 wordt onder de naam Mycostop als biologisch
bestrijdingsmiddel gebruikt voor bodemgebonden pathogenen (Fravel, 2005; fytoweb). De
aanwezigheid van Actinomyceten wordt vaak gecorreleerd met een hogere weerbaarheid van de
bodem (Van Beneden, 2009; Postma et al., 2010). Er zijn ook Actinomyceten die een pathogeen voor
planten vormen (Weller et al., 2002).
Andere bacteriële groepen
In bodems die hogere weerbaarheid vertonen tegenover R. solani op suikerbiet vormen γ- en
β-Proteobacteria en Firmicutes de meest gedetecteerde groepen (Mendes et al., 2011). Bij de eerste
groep behoren o.a. de fluorescerende Pseudomonas die rijkelijk onderzocht worden naar hun
potentie als BCA. Ook de Burkhorderiaceae en Xanthomanodales bevatten organismen met een grote
rol in de bodemweerbaarheid. Onder de Firmicutes zijn het de (sporenvormende) Lactoballici die de
weerbaarheid van de bodem uitmaken (Mendes et al., 2011). In Nederland beschouwt men
kleigronden als gronden met grotere weerstand tegen R. solani in bloemkool. De antagonistische
bacterie Lysobacter, die alleen in Nederlandse polders terug te vinden is, lijkt hiervoor te zorgen
(Postma et al., 2010).
Het is belangrijk om in te zien dat geen enkele geïsoleerd organisme of variabele voldoende is om de
weerstand tegenover R. solani te verklaren (Postma et al., 2010). Tot op heden is er geen tool
beschikbaar om de bodemweerbaarheid (zij het algemeen of specifiek) tegenover R. solani te
bepalen. Scheuerell et al. (2005) en Termorshuizen et al. (2006) benadrukken de moeilijkheid om
voor R. solani het specifiek onderdrukkingsvermogen van de bodem te bepalen omwille van de grote
variabiliteit in pathogeniteit van R. solani.
16
2.3.3. Stimulatie van de bodemweerbaarheid met organische bodemsupplementen
Ter verbetering van de bodemweerbaarheid wordt vaak beroep gedaan op organische
bodemsupplementen. Voor de beheersing van R. solani worden zowel compost, chitinebronnen, als
niet gecomposteerd plantaardig materiaal en afvalmaterialen gebruikt. Organische stof kan bijdragen
aan de weerstand van de bodem, maar werkt vaak heel pathogeenspecifiek en heeft een variabele
werking naargelang de tijd van afbraak, de kwaliteit van het product en de aanwezige microbiële
populatie (Bonanomi et al., 2010). Ondanks het inconsistente ziekteonderdrukkend vermogen van
organisch materiaal, wordt in ongeveer 50% van de gevallen een merkbare verbetering van de
ziekteonderdrukking waargenomen (Bonanomi et al., 2010; Termorshuizen et al., 2006). De
variabiliteit in werkzaamheid zorgt voor een praktische beperking om deze aan te wenden als
ziektebeperkend medium.
2.3.3.1. Compost
Compost wordt verkregen door organisch materiaal op aerobe wijze af te breken. Organisch
materiaal wordt omgezet tot chemisch stabiele moleculen. Aanwezige pathogenen en onkruidzaden
worden afgedood door de hoge temperaturen tijdens het composteringsproces. Compost is een heel
heterogeen product door het verschil in startmateriaal, composteringsmethode en leeftijd van de
compost (Tuitert et al., 1998; Hoitink en Boehm, 1999). Rijpe compost heeft weinig snel afbreekbaar
materiaal en een stabiele microbiële populatie. De aanwezigheid van vele BCA’s, zoals Trichoderma
spp. verbetert de kwaliteit van de compost. Hoewel de aanwezigheid van BCA’s bevorderlijk is,
verbetert compost voornamelijk de algemene bodemweerbaarheid door de verhoging van de
microbiële activiteit (Scheuerell en Mahaffee, 2005; Termorshuizen en Jeger, 2008; Pérez-Piqueres et
al., 2006).
In slechts 20% van onderzochte gevallen draagt compost werkelijk bij aan de onderdrukking van
R. solani. Een vrij nauw spectrum van BCA’s bestrijdt R. solani en meerdere van deze moeten
aanwezig zijn in de compost om bij te kunnen dragen aan de weerbaarheid. Compost die gemaakt is
van lignocellulose-rijk materiaal had een hoger aandeel aan Trichoderma spp. en had het vaakst
positieve effecten (Hoitink en Boehm, 1999).
In de tuinbouw wordt getest met de gecombineerde toediening van een compostextract en Trianum.
Het compostextract zou de bodempopulatie moeten versterken en Trianum de specifieke
weerbaarheid door de aanlevering van de mycoparasiet Trichoderma. De eerste resultaten lijken
succesvol (Boonekamp, 2011).
2.3.3.2. Chitine
De celwand van schimmels is opgebouwd uit chitine. Mycofage organismen en chitinolytische
bacteriën worden gestimuleerd door toevoeging van chitine en kunnen bodempathogene schimmels
onderdrukken. De methode heeft echter te kampen met enkele beperkingen. Chitine is een stof met
erg lage C/N, waardoor er een overbemestingseffect optreedt en het risico op uitspoeling toeneemt.
Het hoog gehalte aan beschikbare stikstof werkt sommige pathogenen in de hand en de hele
populatie van bodemorganismen schuift op naar minder competitieve soorten (Verstegen, 2010).
17
2.3.3.3. Groenbemesters en dierlijke mest
Er bestaan veel verschillende groenbemesters en vormen van dierlijke mest. Door hun verschillende
eigenschappen kunnen ze totaal uiteenlopende effecten hebben op ziekteonderdrukking.
De C/N ratio van organische bodemsupplementen wordt vaak aangehaald als parameter, maar geeft
slechts een beperkt inzicht in de weerbaarheid. Een hoge C/N put de beschikbare N-voorraad uit
wegens N-fixatie en zorgt ervoor dat pathogenen minder kunnen groeien. De plant kan evenwel
lijden onder een N-tekort (Hodge, 2004). Gewasresten en mest met lage C/N kunnen een hoger
gehalte aan giftig ammonium en nitraten geven bij de afbraak. Deze stoffen kunnen de scleroten van
o.a. Verticilium dahliae afdoden. Het effect is zeer variabel tussen verschillende bodemtypes (Tenuta
en Lazarovits, 2004). Stikstoffixeerders vormen een extra bron van N in de bodem en dit verhoogt de
ziekte-incidentie van R. solani (Rothrock et al., 1995). Hoge N-gehaltes stimuleren de saprofytische
groei (Papavizas en Davey, 1961).
Wegens het sterk saprofytisch en competitief vermogen van R. solani, werkt vers ondergewerkt
plantenmateriaal vaak net stimulerend voor R. solani. Pythium is daarentegen heel agressief in de
primaire groei op dit nieuw substraat, maar wordt vlug weggeconcurreerd en wordt dus met betere
resultaten onderdrukt door vers plantenmateriaal (Bonanomi et al., 2010). Pathogenen met een
beperkt saprofytisch vermogen, worden met grotere consistentie onderdrukt door vers plantaardig
materiaal. De in de bodem aanwezige propagules kiemen, maar sterven snel af door gebrek aan
gastheer. Goed management met gepaste wachttijden is noodzakelijk (Bonanomi et al., 2010).
Hoge gehaltes aan cellulose in groenbemesters en oogstresten kunnen inhiberend werken op de
productie van celwandafbrekende enzymen door Trichoderma spp.. Hiermee verliezen zij hun
parasiterend vermogen en profiteert R. solani van deze beschikbare cellulose (Hoitink en Boehm,
1999).
Vele onderzoeken toonden een positief onderdrukkend effect op R. solani aan na toevoeging van o.a.
luzerne, timothee, sorgum, boekweit, mais en haver (Croteau en Zibilske, 1998). De tegenstrijdigheid
in de werking van groenbemesters kan verklaard worden door de sterke bodemafhankelijkheid van
de werking.
2.3.3.4. Turf
Turf is een frequent gebruikt medium in de tuinbouw. Het heeft een zeer klein ziekteonderdrukkend
vermogen door het lage gehalte aan gemakkelijk afbreekbaar organische moleculen, cellulose en
koolwaterstoffen en geen stabiele microbiële populatie. Deze lage gehaltes geven aanleiding tot een
bacteriële gemeenschap die overheerst wordt door Gram positieve bacteriën, dewelke minder
machtig zijn tot het onderdrukken van ziektes (Hoitink en Boehm, 1999).
2.3.3.5. Industriële bijproducten
Het gebruik van organisch afval is vaak te vergelijken met groenbemesters wegens de beperkte
afbraak van het product. Afvalstoffen kunnen een heus gamma aan uiteenlopende samenstellingen
hebben. Landbouwgronden fungeren vaak als afzet voor deze producten die vaak zonder bewerking
of onderzoek aangewend worden. Op zo’n manier kunnen zij de bodem ernstig vervuilen. Dit neemt
niet weg dat, met juiste behandeling, er een groot potentieel schuilt in het gebruik van industriële
bijproducten (Bonanomi et al., 2010).
18
2.4. Lignine
2.4.1. Eigenschappen en voorkomen
Lignine is een heteropolymeer bestaande uit herhaalde entiteiten van de fenolische monomeren
p-coumaryl alcahol, coniferyl alcohol en sinapyl alcohol. Deze eenheden worden in verschillende
combinaties aan elkaar gesynthetiseerd en worden op rigide wijze verbonden met de
(hemi)cellulose-fractie uit planten. De sterke binding maakt de (hemi)cellulosefractie onbereikbaar
voor celluloseafbrekende organismen. Pas na tussenkomst van organismen met lignocellulotische
eigenschappen, vaak schimmels, komt de cellulose ter beschikking van andere organismen. Het
lignocellulosecomplex geeft rigiditeit aan de plant waardoor zij op land kan groeien (DeAngelis et al.,
2011; Bugg et al., 2011; Thevenot et al., 2010).
2.4.2. De lignine - melanine hypothese
Lignine is een moeilijk afbreekbare molecule en slechts weinig organismen zijn in staat om lignine af
te breken. De voornaamste organismen die deze eigenschap bezitten zijn witrotschimmels. Dit zijn
basidiomyceten die vaak parasiteren op bomen. Hun naam berust dan ook op de eigenschap om
lignine af te breken en hierdoor het hout te verbleken (Höfte, 2010-2011).
Nu blijken de enzymen voor de afbraak van lignine en melanine gelijkaardig te zijn. Witrotters
kunnen dus van belang zijn in de afbraak van fungaal melanine. Het voornaamste geproduceerde
enzym dat de afbraak van melanine bewerkstelligt, is Mn-peroxidase, in wetenschappelijke
spreektaal vaak melaninase genoemd. Koper-afhankelijke laccase, haem-afhankelijk peroxidase en
versatiele peroxidases zijn andere ligninolytische enzymen (Baldrian en Snajdr, 2006; Bugg et al.,
2011). Door witrotters te stimuleren, zou de afbraak van melanine in scleroten bevorderd worden en
zouden scleroten zo meer vatbaar worden voor biologische en abiotische stress.
De hypothese werd voor het eerst voorgesteld door Subbarao et al. (1999). Hij nam een verminderde
infectie door Verticilium dahlia in bloemkool waar na incorporatie van oogstresten van broccoli. De
incorporatie van dit ligninerijk gewas werd geassocieerd met een verschuiving in de microbiële
populatie, die de levensvatbaarheid van de microscleroten zou aantasten. Een deel van deze
verschuiving omvatte een toename aan schimmels die betrokken zijn bij de lignineafbraak. In het
labo van Fytopathologie (UGent) werd ook ondersteunende bewijskracht teruggevonden. Er werd
aangetoond dat de incorporatie van Kraft Pine Lignine (een duur zijproduct van de papierindustrie
bestaande uit zuivere lignine) in de bodem de levensvatbaarheid van de (micro)scleroten van
Verticillium longisporum en R. solani kan verminderen. Het effect op de scleroten van R. solani was
vergezeld van een stijging in de activiteit van het enzym Mn-peroxidase in de bodem (Debode et al.,
2005; Van Beneden et al., 2010b). Ook op S. sclerotiorum werd reeds een negatief effect op de
levensvatbaarheid van de scleroten waargenomen wanneer de grond met Kraft Pine lignine en
Contans® samen behandeld werd (Van Beneden et al., 2010a).
19
Phanaerochaete chrysosporium is een van de meest bestudeerde witrotters. Om melanine afbraak te
stimuleren, zou men zowel witrotters kunnen toedienen aan de bodem als hun overlevingskansen
verhogen. Dit laatste kan bewerkstelligd worden door de toevoeging van ligninebronnen. Aangezien
het een lange weg is om BCA’s te commercialiseren (zie paragraaf 2.2.4.3), en witrotters vaak al
alomtegenwoordig zijn in bodems, zijn inoculaties vaak overbodig. Het stimuleren van de witrotters
vormt echter geen oplossing op korte termijn. Het toedienen van ligninebronnen is een toepassing
die pas na jaren tot een evenwicht zou moeten leiden tussen een minimaal sclerotenaantal en
respectievelijke aanwezigheid van aanvallende witrotters (Butler et al., 2005).
Witrotters zijn niet de enige bodemorganismen die lignine enzymatisch kunnen afbreken. Bugg et al.
(2011) en DeAngelis et al. (2011) benadrukken het belang van bacteriën voor de afbraak van lignine.
Bacteriën produceren een breder spectrum aan lignine afbrekende enzymen. De afbraak door
bacteriën gebeurt vaak in een samenwerkingsverband tussen bacteriën en witrotters en in situaties
waarin schimmelgroei onderdrukt wordt, zoals bij zuurstofloosheid (de Boer et al., 2005; De Angelis
et al., 2011; Vicuña et al., 1993). Actinomyceten bezitten naast een parasiterend vermogen ook
peroxidases die de beschikbaarheid van lignine stimuleren (Kirby, 2006; Bugg et al., 2011). Zij zijn
voornamelijk goed in de afbraak van de ligninefractie in grassen (de Boer et al., 2005). Sommige
ascomyceten waaronder Penicillium chrysogenum en Fusarium oxisporum bezitten ook
ligninolytische eigenschappen (Falcon et al., 2005). Daarnaast kan ook de indirecte werking van
enzymen afbraak van lignine of melanine veroorzaken. Melanine wordt aangetast door H2O2. Dit is
een nevenproduct van het enzym glucose-oxidase dat geproduceerd wordt door bijvoorbeeld
Aspergillus niger (Butler et al., 2005). De brede samenstelling van de populatie met ligninolytische
eigenschappen benadrukt de nood om breder te kijken naar de lignine-melanine hypothese dan
louter via witrotters en Mn-peroxidase.
Eerdere experimenten waarbij lignine aan de bodem werd toegevoegd, toonden aan dat vooral
schimmels, Gram negatieve bacteriën en Actinomyceten gestimuleerd worden. Die organismen zijn
samen met Trichoderma spp. voorname antagonisten van R. solani (Postma et al., 2010; Bonanomi et
al., 2010; Van Beneden et al., 2010b). Zowel de directe effecten van lignine op de groei van
antagonisten als de indirecte (gestimuleerde groei door hogere aanwezigheid van makkelijk
parasiteerbare scleroten) zijn nog verder uit te klaren (Van Beneden et al., 2010b).
20
3. Materiaal en methoden
Deel A: De biotest
3.A.1. De proefopzet
Er werd gewerkt met bodem uit de serre van Marc Cools (Passendale) die behandeld was met ofwel
Monam ofwel Herbie 25 (2.3 kg m-2) of die onbehandeld was. De bodem werd verzameld op 16
september, 16 dagen na het uitplanten van de slaplantjes. R. solani houdt zich vooral op in de
bovenste 10 cm van de bodem (Budge et al., 2009) en daarom werden enkele kroppen sla verwijderd
en werd de bodem tot 15 cm verzameld onder en tussen de wortels. De bodem werd op 15 juli
behandeld met Herbie en was tot daags voor uitplanten afgedekt met een plastiek zeil. De
behandeling met Monam vond plaats op 18 augustus. Tussen het verzamelen en het gebruik werden
de bodems in een gekoelde (7°C) en donkere ruimte bewaard.
Voor alle biotesten werden plastieken bakjes van 16x11.5x6 cm gevuld met 400 ml bodem. Het
vochtpercentage van de bodem werd naar het voorbeeld van Van Beneden (2009) gebracht tot
16.5% (w/w). Op het oppervlak van de gevulde bakjes werden ofwel zes vierkante slabladschijfjes
gelegd ofwel drie rijen van kleine ronde slabladschijfjes (Figuur 6). De bakjes werden op gesloten
wijze geïncubeerd in een groeikamer op 18-25°C, met 16/8 als lichtregime.
A
B
Figuur 6: Illustratie van de biotest. A: De gesloten bakjes in de groeikamer vlak na opzet. B: test 3.A.4.2
De opbouw met rijen van kleine ronde slabladschijfjes werd gebruikt om de spreiding en de
groeisnelheid van de pathogeen te schatten. De afgelegde afstand van R. solani werd geëvalueerd
aan de hand van de afstand van de verrotting in de rijen bladschijfjes. In de biotesten met vierkante
slabladjes werd het vermogen van de pathogeen bepaald via scoring van aangetaste oppervlakte van
de slabladschijfjes. Na het opzetten van de proef werden dagelijks scores toegekend aan de
slaschijfjes op basis van het percentage bruinverkleuring van het blad (0: geen symptomen; 1: 0-25%
oppervlakte met symptomen; 2: 25-50%; 3: 50-75%; 4: 75-100%; 5: volledig rot). De
symptoomscores ( ) vormden de basis van de verdere analyse. Om de statistische kracht te
behouden werd geopteerd om de individuele scores van de slabladjes niet verder te verwerken tot
]
een ziekte-index, maar als individuele entiteiten te behandelen (De ziekte-index = ∑ [
). Symptomen die afweken van de normale schade door R. solani, zoals verbleking of
verschrompeling, werden buiten beschouwing gelaten. Echter, soms waren de symptomen niet met
21
zekerheid toe te kennen aan R. solani. Ter bevestiging van de relatie tussen de symptomen en
R. solani werden isolaties uitgevoerd uit de symptomen van de slabladjes. Bij de opening van de
bakjes voor evaluatie werd telkens het overtollig vocht van het deksel geklopt.
De curve die bekomen werd wanneer de symptoomscores uitgezet worden tegenover de tijd, heet
de Disease Progress Curve (DPC). Voor de vergelijking van de resultaten werd de oppervlakte onder
de DPC berekend: de AUDPC (Area Under Disease Progress Curve; AUDPC = ∑ [
]
Om waarden met verschillende meetduur te vergelijken, werd er gewerkt met de relatieve AUDCP.
Deze bekomt men door de AUDPC te delen door (t x 5) (Vidhyasekaran, 2004). Voor de biotest die
niet met scores werkte maar met de afstand van het mycelium werden de statistische analyses ook
uitgevoerd aan de hand van de oppervlakte onder de curve (voor het gemak ook AUDPC genoemd).
De statische analyses werden uitgevoerd met S-plus 8.2 voor Windows. Voor het bepalen van de
normaliteit werd beroep gedaan op de Kolmogorov-Smirnov test en homoscedasticiteit werd
bepaald aan de hand van de Modified Levene test. Wanneer deze aantoonden dat de verdeling
normaal was en de varianties gelijk waren, werden de resultaten vergeleken met one way ANOVA
(Bonferroni, p=0.05). Wanneer er aan de voorwaarden voor parametrische test niet voldaan was,
werd er gebruik gemaakt van de Wilcoxon rank sum test (p=0.05).
3.A.2. Voorafgaande testen: analyse van de slatypes en het inoculumtype
Enkele kleine testen werden vooraf opgezet om het verschil in vatbaarheid tussen verschillende
slatypes te vergelijken. Hiervoor werd één bakje met bodem uit de onbehandelde plot half bekleed
met botersla (cv: Garda) en half met eikenbladslaschijfjes (cv: Kitona). De slaplantjes werden
geschonken door het proefcentrum in Sint-Katelijne-Waver en waren in het 8 bladstadium. Er
werden twee tarwekorrels die besmet waren met R. solani AG 1-1B (S014-2-2) onder elk slabladje
begraven.
In een tweede voorafgaande test werd het type inoculum getest. Bakjes met bodem uit de
onbehandelde plot met 0, 50 en 70% zand, waarbij onder de linker helft slabladschijfjes het tarweinoculum vervangen was door twee scleroten AG1-1B, werden getest. In onderstaande alinea’s
wordt beknopt de aanmaak van de inoculumbronnen beschreven.
3.A.2.1. De aanmaak van korrel-inoculum
Enkele tarwekorrels werden overnacht te week gezet in water. Overtollig water werd afgegoten en
de korrels verdeeld over erlenmeyers die vervolgens afgedekt werden met aluminiumfolie.
Gedurende twee opeenvolgende dagen werden deze geautoclaveerd (21 min). Na inoculatie met drie
plugs van een vijf dagen oude R. solani kolonie op PDA, werden de graankorrels gedurende twee
weken geïncubeerd op kamertemperatuur. Voor het korrel inoculum werd gebruik gemaakt van
zowel AG1-1B, isolaat S1014-2-2 als AG 4 HGI, isolaat S1010-1-1. Buiten deze isolaten werden geen
andere gebruikt voor alle hiernavolgend beschreven testen.
3.A.2.2. De aanmaak van scleroten
Voor de aanmaak van scleroten werd gebruik gemaakt van de methode zoals die beschreven werd
door Manning et al. (1970). Een PDA petriplaat met een zeven dagen oude cultuur van R. solani werd
kort en krachtig gemixt in een scheutje steriel water van ongeveer 25 ml. De gemixte suspensie werd
22
met dunne laagjes over verse PDA petriplaatjes verdeeld. Na 14 dagen waren de scleroten volgroeid
en reeds met melanine verhard. Scleroten werden enkel aangemaakt voor AG1-1B, isolaat S1014-2-2.
3.A.3. Detectie van het natuurlijke inoculum van R. solani
De bodems (Monam, Herbie en onbehandeld (controle)) werden verdeeld in de bakjes en bedekt
met zes vierkante slabladschijfjes (botersla, 8 bladstadium, cv: Gardia). Er werd gewerkt met 0%, 50%
en 70% zand vermengd in de bodem. Het vochtpercentage van het bodem/zand mengsel werd
gebracht tot 16.5% (w/w). Bij de bodems zonder zandmenging, lag dit vochtpercentage hoger
(Controle: 19%, Monam: 18%, Herbie: 22%). Per behandeling werden 12 herhalingen aangemaakt
(2 bakjes met 6 slabladschijfjes).
Uit de slabladschijfjes met symptomen werd R. solani geïsoleerd. De isolaten van R. solani werden
gedurende 10 dagen geïncubeerd in PDB, waarna de myceliummatten tot poeder werden vermalen
in vloeibare stikstof. Het DNA werd geëxtraheerd volgens het protocol van de kit Dneasy Plant Mini
Kit (Qiagen). De concentratie van het DNA uit de extractie werd bepaald met de nanodroptechniek
en voor alle stalen gelijkgesteld aan 10 ng ml-1. Na PCR van het rDNA met primers ITS4 en ITS5
volgens de methode beschreven in Pannecoucke et al. (2008), controle op agarosegel en opzuivering,
werd het PCR product opgestuurd voor sequentiebepaling.
3.A.4. Detectie van de bodemweerbaarheid
3.A.4.1. Detectie van de verschillen in bodemweerbaarheid door verschillen in
voorbehandeling van gronden, autoclavering en inoculumconcentratie
De helft van de bodems werd geautoclaveerd (tweemaal, gedurende 1h) om verschillen in
weerbaarheid na sterilisatie van de bodem op te meten. Er werd gewerkt met twee
inoculumconcentraties: een lage en hoge concentratie. Er werd ook niet geïncouleerd als controle.
De lage concentratie bestond uit één met R. solani AG 1-1B geïnfecteerde tarwekorrel die in kleine
stukjes gekapt was, en de hoge uit tien fijngehakte korrels per bakje met 400ml bodem. Deze
concentraties komen respectievelijk overeen met 0.25 en 2.5 korrel 100ml-1 bodem. Er werd 300ml
bodem intensief vermengd met het inoculum, in het bakje gedaan en afgedekt met 100ml niet
geïnfesteerde bodem. De afdeklaag werd aangebracht om extra variabiliteit door het inoculum aan
het oppervlak te vermijden. Per behandeling (grondsoort-inoculumdensiteit-autoclavering) werden
12 herhalingen aangemaakt (2 bakjes met telkens 6 slabladschijfjes). De bodem was gedurende vier
dagen gedroogd op kamertemperatuur en er werd eikenbladsla (cv: Kitona, 15 bladstadium)
gebruikt. De met Herbie behandelde bodem had zelfs na de droogperiode nog steeds een te hoog
vochtpercentage (niet geautoclaveerd: 20.8% en geautoclaveerd: 18.1%).
3.A.4.2. Bepaling van de ideale inoculumconcentratie
Cirkelvormige slaschijfjes (Botersla, 8 bladstadium, cv: Gardia) werden op drie rijen van acht geschikt
op het bodemoppervlak. Er werd 100ml monambodem vermengd met de inoculatieconcentraties: 0;
0.25; 0.5; 1; 2 en 4 fijngehakte tarwekorrels met R. solani AG1-1B 100ml-1 bodem. De bodem (100ml)
werd intensief vermengd met het inoculum en aan het bovenuiteinde van de bakjes geplaatst. De
rest van de bakjes werd gevuld met 300 ml van een mengsel met 70% zand en 30% potgrond, dat
twee maal gedurende één uur geautoclaveerd was en op 16.5% vocht was gebracht. Voorgaande
testen toonden aan dat dit zand/potgrondmengsel zeer bevorderlijk is voor R. solani. Dit
zand/potgrondmengsel werd gebruikt om de invloed van de grond op de inoculumconcentratie te
beperken.
23
3.A.4.3. Verhoging van het vermogen van het inoculum door toevoeging van boekweitmeel
De bodems (Controle, Monam en Herbie) werden vermengd met 2% (w/v) boekweitmeel. Er werd
geïnoculeerd met 0 en 0.25 versneden korrel 100 ml-1 bodem (R. solani AG1-1B). Ter controle werd
de helft van de bakjes niet vermengd met boekweitmeel. De zes vierkante slabladschijfjes werden
versneden uit boterslaplantjes in het 12-bladstadium (cv: Gardia).
Deel B: Effectiviteit van verschillende ligninerijke bodemsupplementen
3.B.1. Directe effecten van Lignosol op R. solani
3.B.1.1. Direct effect van Lignosol op de groei van R. solaniin labo condities
Een plug van een zes dagen oude cultuur van R. solani AG1-1B (isolaat: S014-2-2) en AG4 HGI (isolaat:
S010-1-1) werd uitgeplaat op Potato Dextose Agar (PDA) waarin voor de autoclavering verschillende
concentraties Lignosol waren toegevoegd: 0.1%; 1% en 5% (w/v). Als controle werd zuivere PDA
gebruikt. Na één en twee dagen incubatie op kamertemperatuur werd de groei opgemeten via de
diameter van de kolonie.
In een daaropvolgend experiment werden dezelfde isolaten van R. solani uitgeplaat op PDA waar pas
na autoclavering een extract van Lignosol werd toegevoegd. Dit extract werd bereid door dezelfde
concentraties aan Lignosol (0%; 0.1%; 1%; 5%) aan steriel water toe te voegen en dit waterLignosolmengsel voor 60 minuten op kamertemperatuur hevig te schudden. Per 200 ml medium
werd 50 ml van het gefilterd extract toegevoegd. Omwille van de hoge concentratie grove deeltjes in
de hoogste concentratie, was het niet mogelijk 50 ml te recupereren. De resultaten kunnen omwille
van deze reden afwijken.
3.B.1.2. Direct effect van Lignosol op de kieming van scleroten van R. solani
Er werden oplossingen van 0; 0.1; 1 en 5 % (w/v) Lignosol in steriel water bereid. De helft daarvan
werd als Lignosol-wateroplossing geautoclaveerd, de andere helft niet. Scleroten van R. solani
(AG1-1B, 15 dagen oud) werden toegevoegd in plastieken kokerplaatjes en voorzien van 1.5 ml
oplossing per kokertje (drie herhalingen per concentratie). Op afgesloten wijze werden de
kokerplaatjes gedurende twee dagen zachtjes te schudden gezet op kamertemperatuur. Na twee
dagen incubatie werden de scleroten, na twee minuten wassen in 1% H2O2 en drogen op steriel
filterpapier, doorgesneden en uitgeplaat op PDASM (PDA met 100mg l-1 streptomycine).
3.B.1.3. Direct effect van Lignosol op de kieming van scleroten van R. solani in de bodem
De biotest uit deel A werd opnieuw gebruikt. Er werd per bakje 400g bodem uit een serre van het
proefcentrum te Kruishoutem (PCG) gebruikt en vermengd met 0; 0.1; 1 of 4% (w/v) Lignosol. De
bodem werd gebracht op 16.5% vochtgehalte. Zes vierkante slabladschijfjes (botersla, 6-bladstadium,
cv: Gardia) werden in twee rijen op het bodemoppervlak geschikt. Aan de kop van het bakje werden
op halve diepte vier scleroten van R. solani AG1-1B (S1014-2-2) begraven. De bakjes werden afgedekt
met een doorzichtig deksel en geïncubeerd in de groeikamer (18-25°C, 16/8 lichtregime).
3.B.2. Evaluatie van Lignosol en Sappi-Out onder veldomstandigheden
Eén serrebeuk (Muilshoek, Sint-Katelijne-Waver) werd onderverdeeld in twaalf plots met drie
behandelingen (Controle, Sappi-Out en Lignosol, in random volgorde naast elkaar) en vier
herhalingen (in de lengte van de beuk). De afmeting van één plot bedroeg 1.6 m op 5 m en elke plot
bevatte zes rijen eikenbladsla (cv: Kitona) met ongeveer 17 kroppen per rij. Voor de behandeling met
24
Sappi-Out werd er 80L van het effluent toegevoegd per plot. De toepassing geschiedde in 2 beurten
om de bodem tijd te geven om het water op te nemen. Er werd 5.6 kg Lignosolpoeder verspreid over
de oppervlakte van de plot (0.5% voor bouwvoor van 10 cm). Na het inharken van het poeder werd
80L water toegevoegd. De onbehandelde plots die dienden als controle kregen dezelfde hoeveelheid
water voorgeschoteld. Op de Sappi-Out-plots werd ongeveer 1.7 g lignine m-2 toegevoegd en op de
Lignosol-plots 316 g lignine m-2 (720g Lignosol m-2). Om te verhinderen dat er afwijkingen aan de
randen van de plots zouden optreden, werden deze ook met water besproeid.
Vijf dagen later (13/9/2011) werden de slaplantjes
uitgeplant in de serre. ’s Anderendaags werden nylon
zakjes (maaswijdte 250 µm) met acht scleroten per
zakje in de grond gebracht. Per plot werden vier nylon
zakjes op ongeveer 5 cm diepte, afwisselend tussen
de 2e en 4e rij sla en op minstens 1 m afstand van het
begin en einde van de plot begraven (Figuur 7). Per
plot werden ook twee nylon zakjes met vier
geïnfecteerde tarwekorrels op analoge wijze
begraven. Het inoculum bestond uitsluitend uit
AG1-1B (S014-2-2, 15 dagen oude cultuur). De sla Figuur 7: Nylon zakjes met korrels en scleroten van
werd behandeld tegen Bremia en knagende insecten. R. solani in de serre met pas geplante slaplantjes.
Op 27 oktober was de sla oogstrijp. Per plot werden ongeveer 30 volledig volgroeide planten
gescoord op smetaantasting (0: geen smetsymptomen, 1: lichte aantasting van de buitenste
bladeren, 2: ernstige aantasting met groot kwalitatief en kwantitatief verlies van de krop, 3: volledig
ingezakte krop). Er werd getracht om op basis van visuele symptomen de verantwoordelijke
pathogeen vast te stellen (R. solani, B. cinerea, Sclerotinia spp.). Het kropgewicht werd geanalyseerd
aan de hand van het gemiddeld gewicht van 30 kroppen per plot. De nylon zakjes met scleroten en
graankorrels werden opgegraven. Daags nadien werden de scleroten en korrels doorgesneden. De
ene helft werd uitgeplaat op PDA met 100 mg l-1 streptomycine (PDASM) en de andere op PDA met
100 mg l-1 streptomycine en 4 mg l-1 prochloraz (Sporgon WP, BASF Belgium S.A.) (PDASS). De
scleroten werden eerst gedurende twee minuten in H2O2 (1%) gewassen. Daarna werden ze
gewassen in steriel water en gedroogd op steriel filter papier. Bij de uitplating werd geëvalueerd of
de scleroten nog levensvatbaar waren aan de hand van de groei van mycelium van R. solani op de
media PDASM en PDASS. Op basis van morfologische eigenschappen van de organismen op PDASM
werden de parasieten van de scleroten vastgesteld (Bacteriën, Trichoderma spp, Fusarium,
Mucorales of andere). Uit sommige symptomen van de sla werd ter controle de veroorzakende
schimmel geïsoleerd.
Vlak na de behandeling met Sappi-Out en Lignosol in de serre, werd op gerandomiseerde wijze met
een boor tot 12 cm diep stalen van de bodem genomen. De verzamelde bodem werd twee dagen
later, na gekoelde bewaring (7°C), grondig gemengd en op 16.5% (w/w) vocht gebracht. Per staal
werd 200 g bodem in een geautoclaveerde glazen bokaal gebracht. In iedere bokaal werden
vervolgens vijf nylon zakjes met elk vier scleroten (11 dagen oude cultuur) begraven zodat zij noch de
bodem of kanten raakten. De bokalen werden gedurende vier weken in het donker geïncubeerd op
25
22°C. Na vier weken werden de zakjes weer opgegraven en de helften van de scleroten uitgeplaat op
de selectieve media PDASM en PDASS.
Er werd voor de statistische analyse gebruik gemaakt van S-plus 8.2 voor Windows. Om de
levensvatbaarheid van de scleroten en parasiterende organismen te analyseren, werd er wanneer er
aan de voorwaarde voor parametrische testen voldaan was, een ANOVA analyse uitgevoerd
(Bonferroni, p=0.05). Wanneer geen parametrische condities teruggevonden werden, werden de
data geanalyseerd met een Wald test voor binaire data. De smet scores en het gewicht van de sla
werden vergeleken met One way ANOVA (Bonferroni, p=0.05).
3.B.3. Potexperiment: bodemafhankelijke effectiviteit van Miscanthus en Lignosol
incorporatie op de overleving en parasitisme van scleroten van R. solani
Er werd gewerkt met gronden van PSKW en PCG. Geautoclaveerde glazen bokalen werden gevuld
met 200g bodem (16.5% (w/w) vocht) waarbij ofwel 1% (w/w) Lignosol of 1% (w/w) Miscanthus werd
toegevoegd. Als controle werd onbehandelde bodem in de bokalen gedaan. In de bokalen werden
vijf nylon zakjes (maaswijdte 250µm) met vier scleroten van R. solani AG1-1B (S1014-2-2, 14 dagen
oude cultuur) begraven. De potten werden op gesloten wijze in de incubator op 22°C gebracht. De
stalen werden gedurende zowel twee weken als vier weken geïncubeerd. Er waren drie herhalingen
per behandeling. Zowel op de stalen na twee als na vier weken incubatie werden drie analyses
uitgevoerd: de selectieve uitplating van scleroten, een metabolische profilering van de microbiële
bodempopulatie (Biolog) en een PLFA analyse.
Selectieve uitplating van de scleroten
De begraven scleroten werden weer opgegraven. Na wassen en doorsnijden werden ze uitgeplaat op
de selectieve media PDASM en PDASS zoals beschreven in paragraaf 3.B.2.
Metabolische fingerprinting
Het metabolisch profiel, de intensiteit en diversiteit van de microbiële bodempopulatie (bacteriën en
schimmels) werd onderzocht met Biolog MicroPlates™(Garland en Mills, 1991). Aan de hand van 96well plates met verschillende koolstofbronnen wordt hiermee het metabolisme van een toegevoegde
microbiële populatie geanalyseerd. De organismen werden geëxtraheerd uit de bodem (5 g bodem
opgelost in 50ml fosfaatbuffer (0.5M, pH 7)). De oplossing werd gedurende 10 minuten intensief
geschud en een half uurtje te rusten gezet om de grove brokken te laten bezinken. De stalen werden
dan tweemaal verdund tot een uiteindelijke concentratie van 10-3g bodem ml-1. Bij elke koolstofbron
werd 150µl van de extractie toegevoegd. Als de organismen uit het bodemextract in staat waren om
de koolstofbron te benutten, werd een tetrazolium kleurstof door reductie omgezet in het gekleurde
formazan. De kleurverandering werd gedurende één week dagelijks opgemeten met een
spectrofotometer. Voor de schimmels werd gewerkt met FF MicroPlates™. In deze platen werd een
andere, voor schimmels omzetbare vorm van tetrazolium gebruikt. De bacteriële populatie werd
onderzocht met Eco MicroPlates™. De FF Microplates™ werden gelezen op absorbantie golflengte
490nm, de Eco MicroPlates™ op 590nm. Om bacteriële groei in de FF Microplates™ te verhinderen,
werd 50 µg ml-1 oxytocine toegevoegd (Preston-Mafham et al., 2002).
26
De absorbanties werden gecorrigeerd tegenover de absorbantie van het staal met zuiver water. Per
profiel werd de gemiddelde verkleuring (Average Well Colour Development) berekend. Voor de
verwerking in PCA werd gebruik gemaakt van de genormaliseerde absorbanties, die berekend
werden door de absorbanties te delen door de bijhorende AWCD. Voor de analyse van de diversiteit
werden Lorenz-curves opgesteld en bijhorende Gini-coëfficiënten berekend (Harch et al. 1997).
PLFA extractie en kwantificering
Als laatste werden bodemstalen genomen om de aanwezige bodempopulatie te analyseren met PLFA
(Phospholipid fatty acid). De stalen werden na de incubatieperiode van twee of vier weken bewaard
in de diepvries op -20°C. Vervolgens werd de PLFA extractie uitgevoerd volgens het protocol uit het
lab van Prof P. Boeckx (Isofys, Ghent University), beschreven door Van Beneden (2009). De PLFA’s
aanwezig in de bodem werden gekwantificeerd aan de hand van GC-c-IRMS (capillary gas
chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry).
Voor de analyse dienen enkel de PLFA’s weerhouden te worden die een voldoende groot aandeel
hebben. Normaal worden alle PLFA-biomerkers met een aandeel beneden 1% niet weerhouden,
maar in voorliggend werk werd een strenger criterium van 5% gehanteerd. Daarnaast werden ook de
biomerkers die een grote variabiliteit hadden die niet te wijten was aan de behandeling geweerd uit
de analyse (Roobroeck, persoonlijke communicatie). De nomenclatuur van de vetzuren is analoog als
deze gehanteerd door Van Beneden (2009). Het totaal microbieel leven werd geschat a.d.h.v. de
totale concentratie geëxtraheerde PLFA’s in µmol C g-1 bodemstaal. De populatiesamenstelling werd
geanalyseerd met de proporties van de weerhouden biomerkers.
Statistische analyse
De overleving van de scleroten en het parasitisme werden door het gebrek aan normaal verdeelde
data geanalyseerd met niet-parametrische statistiek (Wald test). Het verbruik van specifieke
koolstofbronnen, de AWCD, de Gini-coëficiënten en de PLFA-C biomerkerproporties werden
geanalyseerd met one-way ANOVA (Bonferroni, p=0.05). De koolstofbronnen uit de metabolische
profilering die de voornaamste bron van variantie bevatten, werden geïdentificeerd met principal
components analyse (PCA). Dezelfde techniek werd gehanteerd op de molaire-C proporties van de
PLFA-biomerkers. Multivariate analyse van de variantie (MANOVA) met de weerhouden PCA –scores
als afhankelijke variabelen en grondsoort en behandeling als vaste factoren werd uitgevoerd om na
te gaan of de verschillen in fysiologisch profiel of PLFA proporties te wijten waren aan de grondsoort,
de behandeling of de interactie. Er werd gebruik gemaakt van S-plus 8.2 voor Windows.
27
4. Resultaten en bespreking
Deel A: De Biotest
4.A.1. Inleiding
Het risico op grote verliezen door smet verhoogt naarmate de natuurlijke densiteit van R. solani
groter is en naarmate de bodem minder capaciteit bezit om de pathogeen te onderdrukken
(Raaijmakers et al., 2009). De hieronder beschreven reeks experimenten had als doel om een biotest
te creëren die voor bodems kan bepalen wat de aanwezige densiteit van R. solani is, en wat de
weerstand is van de bodem jegens deze pathogeen. Herhaaldelijk wordt in artikels de vraag naar zo’n
test benadrukt (Grosch et al., 2011) en ook vanuit de sector is er grote interesse naar een
betrouwbare test. Aangezien door Van Beneden et al. (2009) werd aangetoond dat AG1-1B een van
de voornaamste anastomosisgroepen is in Belgische slabedrijven (naast AG4 HGI) en deze AG geen
smeul bij kiemlingen veroorzaakt, werd getracht een betrouwbare test op te zetten met stukjes
slablad. Biotesten met slabladschijfjes werden reeds uitgevoerd voor het testen van antagonistische
bacteriën van R. solani (Fiddaman et al., 2000; Faltin et al., 2004).
Voor de ontwikkeling van de biotest werd gebruik gemaakt van bodem uit een sla-serre in
Passendale. In die serre werd reeds gedurende 15 jaar sla geteeld in monocultuur en deze maakte
deel uit van een proef aan het proefcentrum in Beitem (Inagro). Er werden op deze gronden
verschillende bodemontsmettingsmiddelen (Herbie en Monam) getest. Daarnaast bevatte de proef
ook een onbehandelde plot die dienst deed als controle. Doordat de gronden uit dezelfde serre
afkomstig waren, was de variabiliteit omwille van andere factoren, zoals bodemtype en geschiedenis,
minimaal. De verschillende behandeling van de bodem zou aanleiding moeten geven tot
verschillende weerbaarheid en inoculumdensiteit. Deze zouden te detecteren moeten zijn met de
biotest.
Herbie is een in Nederland ontwikkeld product gebaseerd op organisch materiaal waarvan de juiste
samenstelling een geheim is voor het publiek. Eiwitrijk, makkelijk afbreekbaar materiaal wordt aan
de bodem toegevoegd. Vervolgens wordt de bodem afgedekt met plastiek. Een korte tijd later
verkeert de bodem in anaerobe toestand en worden anaerobe bacteriën gestimuleerd. Deze zouden,
onder meer door de productie van vetzuren, methaan en H2S, de schadelijke schimmels en aaltjes
vernietigen. De ontsmettingsmethode met Herbie zou de bodemweerbaarheid niet schaden
aangezien zij een rijke bodempopulatie stimuleert. Daarenboven zou men met Herbie een
volledigere en duurzamere ontsmetting bekomen dan met chemische middelen (SOSEF, 2009;
Thatchtec BV, 2009).
Monam is een frequent gebruikte bodemontsmetter met metamnatrium als actieve stof.
Metamnatrium is de generator van methylisothiocyanaat (MITC), een enzym dat interfereert met
respiratie enzymen. Het is een effectief nematicide en fungicide. Ook onkruiden, bodeminsecten en
bacteriën worden aangetast. Het effect van Monam lijkt in tegenstelling tot Herbie veel meer op het
klassieke, maar verboden methylbromide. Door het afdoden van een groot deel van het microbieel
bodemleven is de bodembiologie ernstig verstoord. Rekolonisatie-effecten, zoals de plotse stijging
van bacteriën of gewijzigde enzymatische activiteiten verstoren het natuurlijk evenwicht van de
bodem en schaden mogelijks op deze manier zijn weerbaarheid (Van Beneden et al., 2011).
28
Er werden volgende veronderstellingen opgesteld over de bodems: de natuurlijke densiteit van
R. solani in de bodems behandeld met Monam en Herbie zou verwaarloosbaar klein moeten zijn. De
onbehandelde bodem (controle) kan daarentegen weldegelijk reeds een natuurlijk startinoculum
bevatten. Aangezien de chemische behandeling, die het geheel microbieel bodemleven ernstig
vermindert, werd de bodemweerbaarheid van de met Monam behandelde bodem lager
verondersteld dan deze van de controle of met Herbie behandelde bodem.
4.A.2. Voorafgaande testen: analyse van de slatypes en het inoculumtype
Symptoomscore
4.A.2.1. Slatype
De vatbaarheid van botersla voor R. solani AG1-1B werd vergeleken met deze van eikenbladsla
omdat in de biotesten van beide types gebruik werd gemaakt. Uit de biotest bleek dat bij botersla
sneller symptomen verschenen dan bij eikenbladsla. De boterslabladschijfjes bereikten reeds na drie
dagen een symptoomscore 3, terwijl hetzelfde niveau van aantasting bij eikenbladsla pas optrad na
vijf dagen. Op dag 3 en 4 was de aantasting van botersla significant verder gevorderd dan deze van
de eikenbladsla (Eenzijdige Wilcoxon rank sum test, p= 0.05). Eenmaal de eikenbladsla aangetast
was, waren slechts twee dagen nodig tot volledige verrotting (Figuur 8).
6
5
4
3
2
1
0
Eikenbladsla
Botersla
0
2
4
6
Dagen
Figuur 8: DPC van R. solani AG1-1B op de slatypes botersla en eikenbladsla. De foutbalken geven de standaardfout weer
(n=3).
4.A.2.2. Type inoculum
Om na te gaan welke bron van inoculum best aangewend zou worden, werden scleroten vergeleken
met graankorrels besmet met R. solani AG1-1B. Na drie dagen waren de slabladschijfjes boven de
korrels al volledig aangetast, terwijl deze boven de scleroten niet (Figuur 9). De symptoomscore op
dag 3 was significant verschillend (Wilcoxon rank sum test, n=9, p=0.05). De aantasting was
onafhankelijk van de concentratie bijgemengd zand. Uit deze test werd besloten verder te werken
met de korrels aangezien scleroten een te lange en onvoorspelbare tijd doormaken vooraleer ze
kiemen.
Figuur 9: Vergelijking van inoculum van R. solani AG1-1B scleroten vs. tarwekorrels. Bakje onbehandelde bodem (controle)
met 50% zand. Drie dagen na het opzetten van de proef. Onder: de rij licht aangetaste boterslaschijfjes boven de scleroten.
Boven: de zwaar aangetaste bladschijfjes boven de korrels.
29
4.A.3. Detectie van het natuurlijk inoculum van R. solani
Het eerste luik van de biotest had als doel het natuurlijk aanwezig inoculum van R. solani op te
sporen via een eenvoudige biotest. Er werd verondersteld dat enkel de onbehandelde controle
bodem een meetbare natuurlijke populatie van R. solani bezat. Deze veronderstelling werd door de
uitgevoerde biotest bevestigd (Figuur 10). Bij de gronden behandeld met Monam en Herbie werden
geen symptomen die te wijten waren aan R. solani waargenomen op de slabladjes, bij de
onbehandelde bodem wel. De slabladjes op de Herbie bodem, werden consistent aan de rand
aangetast, maar niet volledig gedood. Deze aantasting bleek na isolatie te wijten aan een Mucorales.
Bodems die een grote zandfractie hebben, hebben vaak een hoge ziekte-incidentie en uit vorige
experimenten was reeds gebleken dat vermenging van de bodem met zand de inoculumpotentie van
R. solani kan verhogen (França, 2011; Raaijmakers et al., 2009). Zand verhoogt de porositeit
waardoor de pathogeen minder weerstand van de matrix ondervindt. Daarom werden er
verschillende concentraties zand vermengd onder de bodems. Zowel in de onbehandelde bodem
zonder zand als met 50% zand werden symptomen van R. solani vastgesteld. De AUDPC van 50%
zand was significant groter dan bij 0% (Bonferroni, p=0.05). Bij 70% zand werden er niet langer
symptomen waargenomen. Bij een dermate hoog zandpercentage zou de propagule densiteit
dermate verdund zijn, dat zij niet langer in staat was om symptomen te veroorzaken. Via isolatie uit
bladschijfjes met symptomen werd bevestigd dat het inderdaad om R. solani ging. De isolaten
werden geïdentificeerd als AG4 HGI (JN545836; q.c. 100%; max identity 100%) en AG4 HGII
(HQ629876; q.c. 100%; max identity 99%).
Symptoomscore
6
55,5 a
39,6 b
5
4
Con 50
Con 0
3
Mon 50
2
Mon 0
1
0
0
0
2
4
6
8
10
12
c
14
Herb 50
Herb 0
Dagen
Figuur 10: DPC van de detectie van het natuurlijk inoculum van R.solani. Con, mon, herb wijzen respectievelijk op de
onbehandelde bodem, de bodem behandeld met Monam en de bodem behandeld met Herbie. De getallen 0 en 50 in de
legende wijzen op het percentage bijgemengd zand. De proef werd uitgevoerd met botersla. Op de x-as staat het aantal
dagen na het opzetten van de proef. De verschillende letters tonen statistisch significant verschillende AUDPC (Bonferroni,
p=0.05). De bijhorende relatieve AUDPC staat tevens genoteerd. De foutbalken geven de standaardfout weer (n=12).
Een test met slabladschijfes kan dus inderdaad dienst doen ter detectie van de natuurlijke densiteit
van R. solani. Aangezien de inoculumdensiteit sterk gecorreleerd is met de ziektedruk, kan deze
informatie voor een teler van groot belang zijn (Raaijmakers et al., 2009). De isolatie van de
pathogeen blijft echter nodig ter bevestiging dat de symptomen weldegelijk te wijten zijn aan
R. solani.
30
De grens tussen een betere detectie door verbeterde omstandigheden voor R. solani door
zandtoevoeging en geen detectie door een te hoge verdunning bevond zich tussen 50% en 70% zand.
In bodems met een lagere natuurlijke densiteit zou bij 50% zand al te veel verdunning kunnen
optreden. Omdat het ook mogelijk is om zonder bijgemengd zand de pathogeen vast te stellen, is het
misschien beter om het zand achterwege te laten of om minder toe te voegen. Zand kan immers voor
extra afwijkingen zorgen en zorgde slechts voor een minimale versnelling in detectie.
4.A.4. Detectie van de bodemweerbaarheid
4.A.4.1. Detectie van de verschillen in bodemweerbaarheid door verschillen in
voorbehandeling van gronden, autoclavering en inoculumconcentratie
De literatuur vermeldt autoclaveren als methode om de biologische component van de
bodemweerbaarheid te vernietigen (Termorshuizen en Jeger, 2008; Bonanomi et al., 2010; Van der
Wurff, 2010; Sneh et al., 1996). Een biotest die als doel heeft om weerbaarheidsverschillen tussen
bodems vast te stellen, zou dus ook het verschil tussen al dan niet geautoclaveerde bodems moeten
kunnen vaststellen.
Figuur 11 toont de DPC van de verschillende bodems die al dan niet geautoclaveerd waren en met
verschillende concentraties geïnoculeerd waren (bijhorende AUDPC in Tabel 2). Het natuurlijk
inoculum uit de onbehandelde bodem werd weerom vastgesteld met de biotest en werd
geïdentificeerd als AG4 HGI (JN545836; q.c. 100%; max identity 99%). De test was ook in staat om op
statistisch significante wijze de hoge inoculatieconcentraties te onderscheiden van de lage via een
sneller verloop van de DPC (Wilcoxon rank sum test, p=0.05).
Na het autoclaveren van de bodem werd een consistent sneller verloop van de DPC vastgesteld bij de
bodems behandeld met Monam en Herbie. Bij de hoge inoculatieconcentratie was dit verschil niet
erg duidelijk. De hoge pathogeendruk liet niet langer toe aan de bodem om variatie te tonen. Enkel
bij de bodems behandeld met Monam was het verschil tussen de geautoclaveerde en niet
geautoclaveerde DPC statistisch significant bij zowel de hoge als lage inoculumconcentratie (AUDPC,
Wilcoxon rank sum test, p=0.05). De niet geautoclaveerde controle bodem had bij een inoculum van
0.25 korrel 100ml-1 bodem een sneller ziekteverloop dan bij de geautoclaveerde bodem. Dit zou te
wijten kunnen zijn aan het natuurlijk inoculum van R. solani in de onbehandelde bodem, dat
bovenop het toegevoegd inoculum aanwezig was. De grotere pathogeendruk zou het effect van het
weerbaarheidsverlies door autoclavering kunnen overstijgen.
31
Controle
Symptoomscore
6
5
con NA 0
4
con NA 0.25
3
con NA 2.5
2
con A 0
1
con A 0.25
0
0
2
4
6
8
10
con A 2.5
Dagen
Monam
Symptoomscore
6
5
mon NA 0
4
mon NA 0.25
3
mon NA 2.5
2
mon A 0
1
mon A 0.25
0
0
2
4
6
8
10
mon A 2.5
Dagen
Symptoomscore
Herbie
6
5
4
3
2
1
0
herb NA 0
herb NA 0.25
Herb NA 2.5
Herb A 0
herb A 0.25
0
2
4
6
8
10
herb A 2.5
Dagen
Figuur 11: DPC van R. solani AG1-1B op slabladschijfjes (eikenbladsla) bij geautoclaveerde en niet geautoclaveerde gronden.
Boven: Onbehandelde bodem (controle), Midden: bodem behandeld met Monam, Onder: bodem behandeld met Herbie.
NA: Niet geautoclaveerd, A: geautoclaveerd. 0: geen inoculatie, 0.25: inoculatie met 1 fijngekapte korrel per bakje (0.25
-1
-1
korrel 100ml bodem), 2.5: inoculatie met 10 fijngekapte korrels per bakje (2.5 korrels 100ml bodem). Op de x-as staat
het aantal dagen na het opzetten van de proef. De foutbalken tonen de standaardfout (n=12).
32
Tabel 2: Relatieve AUDPC van R. solani AG 1-1B op slabladschijfjes (eikenbladsla) in niet geautoclaveerde en
geautoclaveerde bodems. Eikenbladsla. NA: niet geautoclaveerd, A: geautoclaveerd. Verschillende letters tonen statistisch
significante verschillen binnen eenzelfde inoculuatieniveau (Wilcoxon rank sum test, p=0.05, n=12)
Concentratie
(korrel 100ml-1)
Controle NA
A
Monam
NA
A
Herbie
NA
A
0
0.25
7.40 a
0b
0b
0b
0b
0b
28.54 b’
24.06 b’
21.88 b’
59.17 a’
49.06 a’
57.81 a’
2.5
65.00 b”
63.75 b”
53.44 c”
70.63 ab”
74.90 a”
74.17 a”
De onbehandelde bodem leek de grootste weerbaarheid te bezitten, maar had daarentegen een
hoger en meetbaar natuurlijk inoculum aan R. solani. Op plaatsen met hoge pathogeendruk kan de
bodem een efficiënte antagonistische microbiële populatie ontwikkelen en zo meer weerbaar
worden (Anees et al., 2010; Weller et al., 2002). Vooral na autoclaveren was de controle bodem
meer weerbaar dan bodems behandeld met Monam en Herbie (Tabel 2).
De bodems behandeld met Monam namen tegen de verwachting in een intermediaire plaats in qua
weerbaarheid (Tabel 2). Het is verrassend dat enkel bij bodems behandeld met Monam een
significant verschil optrad tussen de AUDPC van geautoclaveerde en niet geautoclaveerde bodems.
Er werd immers verondersteld dat de biologische populatie in de controle en Herbie bodems groter
was dan in bodem behandeld met Monam. Van Beneden (persoonlijke communicatie) nam echter
waar dat Trichoderma spp. niet afgedood worden door fumigatie met Monam en dat de bodem zijn
weerbaarheid deels kan behouden door o.a. het behoud van deze antagonist.
De behandeling met Monam was, net als die met Herbie, effectief voor het afdoden van het
natuurlijk inoculum. Herbie bleek uit de biotest de weerbaarheid van de bodem het meest te
verlagen (Tabel 2). Het werkingsmechanisme van Herbie kan hier aan de basis van liggen. De
anaerobe omstandigheden die optreden bij de behandeling met Herbie, zorgen voor een grote
verandering in de bodempopulatie. De specifieke organismen die R. solani onderdrukken kunnen
tijdens het ontsmettingsproces weggeselecteerd zijn uit de bodem. Er wordt aangenomen dat de
weerbaarheid van de bodem tegenover R. solani voornamelijk net berust op specifieke
onderdrukking (Bonanomi et al., 2010). Wanneer de bodem die behandeld was met Herbie een
langere tijd terug aan aerobe omstandigheden was blootgesteld, was deze niet langer minder
weerbaar (resultaten niet weergegeven). De ontsmetting met Monam plaatste in tegenstelling tot
deze met Herbie, geen andere microbiële populatie in de plaats, waardoor de gewenste specifieke
antagonistische organismen gemakkelijker in de bodem bleven of weer konden bezetten.
4.A.4.2. Bepaling van de ideale inoculumconcentratie
Vorige proef toonde aan dat een inoculatieconcentratie van 2.5 korrel 100ml-1 te hoog was om een
handelbare pathogeendruk te creëren. Om de meest toepasselijke inoculatieconcentratie te
achterhalen, werd een experiment met een exponentiële reeks van inoculatieconcentraties opgezet.
De verspreiding van de pathogeen doorheen een zand/potgrondmengsel werd opgemeten a.d.h.v.
het verschijnen van symptomen op drie rijtjes van cirkelvormige slabladschijfjes.
33
Vanaf een inoculum concentratie groter of gelijk aan 1 korrel 100 ml-1 bodem was de groeisnelheid
van het mycelium uniform doorheen het zand/potgrond mengsel (Figuur 12). Deze bedroeg 3.6 cm
dag-1 uitgemiddeld over de intervallen tussen dag 1 en 2 en 2 en 3, en kan als maat beschouwd
worden voor de snelheid van een onbelemmerde groei in een bevorderlijk medium. De snelheid bij
concentratie 0.5 korrel 100ml-1 was niet significant verschillend van deze bij 0.25 korrel 100ml-1, maar
wel van 1 korrel 100ml-1 en hogere concentraties (AUDPC, Wilcoxon rank sum test, p=0.05).
afgelegde afstand R. solani
(cm)
De geïnfecteerde korrels hadden een 1000 korrelgewicht van 55.8g in gehydrateerde vorm en 28.6g
wanneer ze gedroogd waren gedurende 2 dagen aan open lucht. Budge et al. (2009) vermeldt dat de
gemiddelde natuurlijke concentratie van Rhizoctonia propagule in bodems rond 0.73*10-7g g-1 bodem
ligt. Deze kan echter niet op voldoende nauwkeurige wijze vergeleken worden met het toegediend
inoculum aangezien er geen correcte schatting voor het aandeel R. solani op de geïnfecteerde korrels
kan gegeven worden.
12
10
8
0.25
6
0.5
4
1
2
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
4
Dagen
Figuur 12: Groeisnelheid van R. solani AG1-1B doorheen zand/potgrondmengsel bij verschillende inoculatieconcentraties.
Het inoculum bestond uit 100ml grond, behandeld met monam en vermengd met verschillende inoculumconcentraties
-1
(0.25; 0.5; 1; 2; 4 fijngekapte korrel 100ml bodem). De afstand werd bepaald vanuit de start van de inoculatieplaats door
symptomen op drie rijen cirkelvormige slabladschijfjes (botersla). Op de x-as staat het aantal dagen na het opzetten van de
proef. De foutbalken tonen de standaardfout (n=3).
In de literatuur wordt vermeld dat bioassays optimale resultaten geven wanneer er gewerkt wordt
met een inoculatieniveau dat ongeveer 70% van de planten ziek maakt. Bij hogere concentraties
wordt de ziektedruk te hoog en onrealistisch (Termorshuizen en Jeger, 2008). Bij de onderzochte
biotests kunnen we geen inoculatieconcentratie bepalen op basis van deze 70% grenswaarde,
aangezien er met afzonderlijke slabladschijfjes gewerkt werd en niet met levende slaplantjes. Met
slabladschijfjes is het niet mogelijk om op voldoende wijze de plant met rhizosfeer, ISR, etc na te
bootsen en kan dus geen echte ziekte worden vastgesteld. De gewenste inoculatieconcentratie is in
dit geval niet deze die een ziekte-incidentie van 70% geeft, maar deze die voldoende pathogeendruk
geeft en terwijl ook kansen biedt aan de bodem om de kracht van zijn weerbaarheid te laten zien. Op
empirische wijze werd waargenomen dat dit mogelijk is tot een inoculatieconcentratie van 0.5 korrel
100ml-1 bodem. Bij het gebruik van 0.25 korrel 100ml-1 heeft men nog een veiligheidsmarge
vooraleer de pathogeendruk te hoog zou worden. Ook lagere inoculatieconcentraties zouden
voldoende ziektedruk kunnen geven. Postma et al. (2010) inoculeerden gronden met 1 haverkorrel
kg-1 bodem, wat overeenkomt met de helft van 0.25 korrel 100ml-1.
34
4.A.4.3. Verhoging van het vermogen van het inoculum door toevoeging van boekweitmeel.
Naar het voorbeeld van Anees et al. (2010) werd boekweit toegevoegd aan de bodem. Boekweit zou
de potentie van het inoculum van R. solani bevorderen. In tegenstelling tot het geciteerde artikel
konden de proeven dit stimulerend effect niet bevestigen. Boekweit gaf niet het gewenste effect
omdat het voornamelijk andere schimmels stimuleerde. Bij de onbehandelde (controle) en Monam
bodem werd een zeer snelle en verhoogde opkomst van symptomen die niet te wijten waren aan R.
solani waargenomen. In de bodem behandeld met Herbie stimuleerde boekweit echter een
schimmel die onschadelijk was voor slabladschijfjes en die de aantasting door R. solani opmerkelijk
vertraagde.
Boekweittoevoeging verhoogt de beschikbare nutriënten in de bodem (Anees et al., 2010). R. solani
is sterk competitief en zou door de verhoogde nutriëntenstatus positief gestimuleerd moeten
worden (Sneh et al., 1996). In tegenstelling tot bijv. Pythium wordt R. solani niet direct door een
verhoogde nutriëntenstatus gestimuleerd, maar kan pas later door competitie de overhand halen
(Bonanomi et al., 2010). Ondanks het uitblijven van de gewenste stimulatie van R. solani kan
toevoeging van boekweit interessante informatie verschaffen over de aard van de andere aanwezige
schimmels.
4.A.5. Bevindingen en voorstellen voor de verdere ontwikkeling van de biotest
De voorgestelde biotest leek in staat verschillen te detecteren in de weerbaarheid van de gronden
tegenover R. solani en was geschikt om het natuurlijk inoculum waar te nemen. Voor het
pathosysteem R. solani op sla bestaat geen andere methode om de weerbaarheid te evalueren (Sneh
et al., 1996). De bestaande methoden om de inoculumdensiteit van R. solani te bepalen, zoals met
moleculaire technieken, met isolaties of met antilichamen zijn vaak ontoereikend (Sneh et al., 1996;
Budge et al., 2009; Grosch et al., 2007). De voorgestelde biotest laat toe om op eenvoudige wijze een
idee te scheppen over het natuurlijk inoculum in de bodem, zonder nood aan veel laboinfrastructuur. De informatie over de inoculumdensiteit is slechts van waarde wanneer deze
gerelateerd kan worden aan de bodemweerbaarheid (Raaijmakers et al., 2009). Telers die hun bedrijf
willen runnen gebaseerd op basis van het versterken van de bodemweerbaarheid, willen graag de
goede werking onderbouwd zien met biotesten (Boonekamp, 2011). De resultaten van deze biotest
dienen bij verder onderzoek nog gevalideerd te worden door ze te relateren met de ziekte-incidentie
op de velden van de geteste gronden.
Een voornaam probleem van de biotest is de specificiteit van de symptomen. Aangezien er in plaats
van met plantjes met slabladschijfjes gewerkt wordt, kunnen saprofyten evengoed symptomen
veroorzaken en blijft isolatie ter bevestiging nodig (Sneh et al., 1996). Er wordt in de gesloten bakjes
een zeer vochtig microklimaat gecreëerd dat andere saprofyten sterk kan bevorderen. Het openlaten
van de bakjes biedt geen oplossing aangezien de grond snel uitdroogt en de slabladjes een voldoende
vochtige omgeving nodig hebben om niet te verschrompelen.
35
Bij de test van de weerbaarheid zou specificiteit bereikt kunnen worden door te werken met een
inoculum dat geconcentreerd is aan één zijde. De symptomen die optreden vanuit de
inoculatieplaats kunnen met voldoende betrouwbaarheid toegeschreven worden aan R. solani. De
spatiaal geconcentreerde inoculatie kan zowel met de vierkante als rijtjes cirkelvormige
slabladschijfjes toegepast worden.
De evaluatie is aanzienlijk arbeidsintensief aangezien dagelijks moet gescoord worden om de DPC te
bekomen en daaruit de AUDPC te berekenen. Er werd vastgesteld dat door de band genomen bij een
inoculatie concentratie van 0.25 korrel 100ml-1 bodem de duidelijkste verschillen in symptoomscores
optreden na 5 dagen. Dit is geldig voor temperaturen rond 25°C. Bij lagere temperaturen kan het
optimale interval groter zijn. Wanneer men de natuurlijke densiteit wil detecteren, is een groter
interval (7 tot 10 dagen) nodig vooraleer duidelijk symptomen waar te nemen zijn.
Boekweit kan niet gebruikt worden ter stimulatie van R. solani in de bodem. Het is echter wel
interessant om waar te nemen welke andere schimmels gestimuleerd worden en of deze de
slabladschijfjes aantasten. Er zou eventueel gezocht kunnen worden naar een organische stof die
meer specifiek R. solani stimuleert. Met de biotest kan men een onderschatting van de densiteit
bekomen omdat rustend propagule niet zal waargenomen worden met de bladschijfjes (Sneh et al.,
1996). Een stof die R. solani stimuleert kan helpen deze tekortkoming te overbruggen. Het aantal
slabladschijfjes dat nodig is voor een accurate schatting varieert bovendien met de inoculumdensiteit
(Sneh et al., 1996).
Voor de ontwikkeling van deze biotest werd uitgegaan van het idee dat de dieperliggende
mechanismen van de bodemweerbaarheid op R. solani niet gekend zijn. In deel B werd echter
getracht de black box van de weerbaarheid open te breken en de elementen die de natuurlijke en de
(door lignine) geïnduceerde weerbaarheid bepalen te ontrafelen.
36
Deel B: Effectiviteit van verschillende ligninerijke bodemsupplementen
4.B.1. Inleiding
Het toepassen van lignine op de bodem bleek uit vorige testen een goede methode om R. solani te
beheersen (Van Beneden et al., 2010). Om de gevonden successen van ligninetoepassing te
verzilveren, werd gezocht naar bronnen van lignine die gebruiksvriendelijk en economisch
verantwoord zijn. De producten moeten een voldoende hoge lignine concentratie bezitten en geen
negatieve bijwerkingen vertonen. Drie producten leken aan deze criteria te voldoen: Lignosol,
Sappi-Out en Miscanthus.
4.B.1.1. Lignosol
Lignosol is een poeder uit gemalen druivenpitten dat door De Ceuster Meststoffen NV aangewend
wordt in substraten en in biologische meststoffen. Druivenpitten bestaan uit 44% lignine, 7%
cellulose en 31% hemicellulose (Moldes et al., 2003). Aangezien een substraat uit druivenpitten
gebruikt wordt om laccases aan te maken, zou het toevoegen van dit product aan de bodem ook de
productie van dit enzym en bijhorende melanineafbraak kunnen stimuleren.
4.B.1.2. Sappi-Out
Al sinds 25 jaar wordt er onderzoek gedaan naar het toepassen van papierafval op landbouwbodems,
vooral met het doel om het organisch stofgehalte op te krikken (Bellamy et al., 1995). Het effluent
gebruikt in deze thesis is een van de laatste afvalstromen uit het productieproces van papier en is
een effluent met als voornaamste component lignine (200 mg l-1). Dit product werd aangeleverd
door Sappi Netherlands Services, Lanaken. Vorig onderzoek toonde betere resultaten van het
effluent na de aerobische zuiveringsreactor, dan van het effluent voor de reactor (França, 2011). Met
het eerstgenoemde, nl. Sappi-Out, werd verder gewerkt in deze thesis.
4.B.1.3. Miscanthus
Miscanthus sinensis L. var. gigantheus (olifantengras) is een meerjarig gras met potentieel hoge
opbrengsten en een hoog lignine gehalte (10 à 12%). Het kan op eenvoudige wijze geteeld worden en
doordat het vochtpercentage bij de oogst om en bij 15% ligt, zijn latere droogbewerkingen niet meer
nodig (França, 2011; Muylle, z.d.). Het gehalte aan cellulose bedraagt 48% en van hemicellulose 28%.
Hoewel hier het onbewerkte gras onderzocht werd, werd het effect van toepassing van Steam
exploded Miscanthus supplementatie reeds onderzocht. De studie toonde succesvolle resultaten
m.b.t. de beheersing van R. solani (De Corato et al., 2011).
4.B.2. Directe effecten van Lignosol op R. solani
Hoewel het voornaamste onderdrukkende effect van lignine te wijten zou zijn aan de ligninemelanine hypothese, kunnen de onderzochte producten ook via andere mechanismen de pathogeen
onderdrukken. De stimulatie van de kieming en de directe vermindering van groei door bijv. toxische
stoffen kunnen alternatieve werkingsmechanismen zijn.
4.B.2.1. Direct effect van Lignosol op de hyfale groei van R. solani
De directe impact van Lignosol op de groei van R. solani werd nagegaan door de groei van de
schimmel op te meten op PDA vermengd met verschillende concentraties aan Lignosol. Er werd
medium gebruikt waarbij Lignosol meegeautoclaveerd was en ook een medium waarbij na het
autoclaveren een extract van Lignosol was toegevoegd.
37
Wanneer Lignosol tesamen met het PDA medium geautoclaveerd werd, werd de groei vanaf
concentraties van 1% significant onderdrukt. Dit was waar te nemen bij AG1-1B en AG4 HGI, maar bij
de laatstgenoemde met een minder duidelijk verschil (Figuur 13). De groei werd niet beïnvloed door
de spatiale verdeling van de brokjes Lignosol in het medium. Dit wijst erop dat het effect toe te
schrijven is aan een stof die opgelost is in het PDA medium. Wanneer het niet geautoclaveerd extract
van Lignosol toegevoegd werd aan het medium waren er niet langer significante verschillen
waarneembaar bij AG4 HGI, behalve bij 0.1%. Ook bij AG1-1B was het groei-afremmend effect
minder duidelijk. Alle concentraties aan Lignosol vertraagden significant de groei. Het effect op
R. solani leek afhankelijk te zijn van AG (hoofdeffect groep AG met en zonder autoclavering
significant p<0.001; significante interactie: p<0.001 met autoclavering, p<0.01 zonder autoclavering).
De groei van R. solani AG1-1B bleek uit beide proeven meer onderdrukt te worden door Lignosol dan
AG4 HGI.
60
50
a
a
B
b
a' a'
40
30
c
b'
c'
0%
0.10%
1%
20
5%
10
80
Diameter kolonie (mm)
Diameter kolonie (mm)
A
70
a
bb
b
60
a'
b'
a' ab'
0%
50
40
0.10%
30
1%
20
5%
10
0
0
AG 1-1B
AG 1-1B
AG 4 HGI
AG 4 HGI
Figuur 13: Kolonie diameters van R. solani op PDA met verschillende concentraties (0,0.1,1,5%) van Lignosol. A: Lignosol
samen met PDA geautoclaveerd. Opgemeten na 36 uur. B: PDA vermengd met een niet geautoclaveerd extract op basis van
0; 0.1; 1 en 5% Lignosol. Gemeten na twee dagen. De letters wijzen op significante verschillen op basis van een t-test
(Bonferroni, p=0.05). De foutbalken tonen de standaardfout (A: n=5, B: n=6).
Bij de bewaring van de platen werd vastgesteld dat het patroon van sclerotenvorming verschilde bij
verschillende concentraties aan Lignosol. Bij hogere concentraties van Lignosol trad de vorming van
scleroten dichter bij de inoculatieplaats op. Het effect was het duidelijkst bij het experiment waarbij
Lignosol mee geautoclaveerd was (Figuur 14), maar ook bij niet geautoclaveerde Lignosol werd bij
het 1% extract een vernauwde cirkel van scleroten vastgesteld.
Figuur 14: Sclerotenvormingspatroon van R. solani AG1-1B op PDA met (van links naar rechts) 0; 0.1; 1 en 5% Lignosol meegeautoclaveerd in het medium. Vijf dagen na uitplating.
38
4.B.2.2. Direct effect van Lignosol op de kieming van scleroten in labo condities
Het gedrag van scleroten in een oplossing met verschillende concentraties aan Lignosol in
gedestilleerd water werd nagegaan om een idee te krijgen over de stimulatie van de kieming.
Figuur 15 illustreert de visueel waarneembare myceliumgroei na twee dagen lichtjes schudden op
kamertemperatuur. Er is duidelijk te zien dat water zonder Lignosol (bovenste rij) geen stimulus gaf
om te kiemen en dat de hoeveelheid myceliumgroei gradueel toenam naarmate hogere percentages
Lignosol waren toegevoegd. Er waren geen visueel waar te nemen verschillen tussen de oplossingen
die geautoclaveerd waren en zij die geen autoclavering ondergingen.
De scleroten werden ook uitgeplaat om de verschillen in groei op te meten. Door een te agressieve
was-behandeling in H2O2 werden de verschillen in opgebouwde myceliumgroei teniet gedaan en
konden geen verschillen op de uitplating waargenomen worden. Omwille van deze reden zijn geen
kwantitatieve gegevens beschikbaar.
Figuur 15: Het kiemgedrag van scleroten van R. solani AG1-1B in oplossing van gedestilleerd water met Lignosol. Van boven
naar onder werden respectievelijk de concentraties 0; 0.1; 1; 5% aangewend. In de drie linkse kolommen werd de waterLignosoloplossing niet geautoclaveerd, in de drie rechter kolommen wel. Twee dagen na het opzetten van de proef. Drie
herhalingen per behandeling.
4.B.2.3. Direct effect van Lignosol op de kieming van scleroten in bodem
De biotest met slabladschijfjes die in deel A besproken werd, werd tevens gebruikt om het effect van
Lignosol in de bodem op de kieming van scleroten te testen. Plastieken bakjes werden gevuld met
bodem afkomstig uit het PCG die vermengd werd met 0%; 0.1%; 1% en 4% Lignosol. Aan de kop
werden vier scleroten van R. solani AG1-1B begraven.
In de bodem zonder Lignosol supplementatie werden noch van R. solani, noch van andere schimmels
rotsymptomen waargenomen. Bij hoge concentraties (1 en 4%) werd een weelderige groei aan
schimmels waargenomen die niet afkomstig was van R. solani. Ondanks de stimulatie van andere
schimmels, kon waargenomen worden dat R. solani tevens gestimuleerd werd omdat er een
duidelijke gradiënt optrad vanuit de inoculatieplaats (Figuur 16). Zelfs in zeer beperkte concentraties
(0.1%) was Lignosol in staat om scleroten te doen kiemen.
39
Figuur 16: Stimulatie van kieming van scleroten van R. solani AG1-1B door Lignosol vermengd in de bodem. De percentages
tonen de bijgemengde fractie Lignosol (w/v). De oranje stipjes wijzen op de inoculatieplaats van de scleroten. Er is een
duidelijke gradiënt van symptomen waarneembaar vanuit de inoculatieplaats. Verschillende letters tonen statistisch
significante verschillen (Wilcoxon rank sum test, n=4, analyses op basis gemiddelden van de symptoomscores per rij
slabladschijfes).
4.B.2.4. Discussie
De lignine-melanine hypothese baseert zijn werking op een samenspel van de totale microbiële
populatie van de bodem. Lignosol kan echter ook directe effecten hebben op R. solani. De groei van
het mycelium kan door toxische stoffen in Lignosol worden verminderd. Ook het patroon van
sclerotenvorming toonde aan dat de pathogeen onder stress stond wanneer Lignosol toegevoegd
was aan het medium. Het is bekend dat R. solani overgaat tot vorming van scleroten wanneer de
schimmel onder stress staat. Deze stress kan optreden door gewijzigde abiotische factoren zoals
droogte, koude of door mechanische stress door het raken van een rand (Sneh et al., 1996). De
aanwezigheid van chemische stoffen, zoals deze komend uit het Lignosol extract, zou tevens een
bron van stress kunnen vormen. De effecten waren het duidelijkst wanneer Lignosol mee
geautoclaveerd was. Druk en warmte kunnen meer componenten vrijmaken uit Lignosol dan deze
die zouden vrijkomen bij gewoon gebruik van Lignosol.
Zowel bij toediening van Lignosol in de bodem als in een waterig extract werd een gestimuleerde
kieming waargenomen. In tegenstelling tot het effect op de myceliumgroei uit vorig experiment, zou
het effect op de kieming niet te wijten zijn aan de aanwezigheid van specifieke moleculen, maar
eerder aan de aanwezigheid van organisch materiaal dat de energie voor kieming kan leveren. De
aanwezigheid van organisch materiaal wordt minder beïnvloed door autoclavering en dit verklaart de
gelijke reactie van R. solani in een geautoclaveerde tegenover niet geautoclaveerde oplossing.
De gestimuleerde kieming zou positief kunnen zijn voor de beheersing van de pathogeen. Scleroten
die gekiemd zijn, vertonen niet langer dezelfde rigiditeit en kunnen gemakkelijker door antagonisten
aangevallen worden. Het aanwezige propagule van R. solani kan uitgeput worden. De verhoogde
kieming stimuleert de actieve aanwezigheid van R. solani. Meer actief mycelium stimuleert de
aanwezige antagonisten (Weller et al., 2002; Postma et al., 2010). De opbouw van een specifieke
antagonistische populatie vormt ook de voornaamste verklaring van het fenomeen Rhizoctonia
disease decline (RDD) (Hyakumachi, 1996). Als de werking van Lignosol op dit mechanisme steunt,
zou een wachtperiode na aanwenden aangewezen zijn, want de verhoogde aanwezigheid van de
pathogeen is op korte termijn nefast voor telers. Er is een overgangsperiode nodig waarin R. solani
eerst moet toenemen, waarna de weerbaarheid zou kunnen toenemen. Meestal treedt na 1
40
teeltcyclus reeds de afname van R. solani aantasting in (Hyakumachi, 1996). De toepassing van dood
mycelium van R. solani of van niet pathogene soorten (Rhizoctonia oryzae) bleek uit vorig onderzoek
niet dezelfde rol te kunnen spelen in de weerbaarheidsopbouw als levend mycelium (Sayama et al.,
2001; Lucas et al., 1993).
Uit deze proeven kan besloten worden dat Lignosol ook andere werkingsmechanismen kan hebben
buiten de lignine-melanine hypothese. Lignosol kan in beperkte mate de groei vertragen en kan de
kieming van scleroten bevorderen.
4.B.3. Evaluatie van Lignosol en Sappi-Out onder veldomstandigheden
4.B.3.1. Resultaten
In een serre te Sint-Katelijne-Waver werd de bodem behandeld met Sappi-Out en Lignosol. Na het
planten van de sla werden nylon zakjes met scleroten en korrels R. solani AG1-1B begraven.
Tijdens de oogst werden per plot 30 kroppen gescoord op aantasting. Er konden geen significante
verschillen tussen de controle en de behandelingen worden waargenomen, noch in de totale smetscores, noch in het optreden van de verschillende pathogenen. B. cinerea was de meest
voorkomende pathogeen, gevolgd door Sclerotinia spp.. De symptomen te wijten aan R. solani waren
moeilijk te onderscheiden van deze veroorzaakt door B. cinerea. Bij de isolatie uit de symptomen kon
geen R. solani gevonden worden, maar werd bijna uitsluitend B. cinerea vastgesteld. Het gemiddeld
kropgewicht was ook niet significant verschillend.
Uit de uitplating van de begraven scleroten op de selectieve media werd een significant effect van de
behandeling op het parasitisme van de scleroten waargenomen (Tabel 3). Zowel de behandeling met
Lignosol als die met Sappi-Out zorgde voor een significante toename van het totale percentage
geparasiteerde scleroten. De behandeling met Sappi-Out zorgde ook voor een significante toename
in het parasitisme door Trichoderma. Ondanks het toegenomen parasitisme werd er geen afname in
levensvatbaarheid van de scleroten waargenomen. Uit interactie-plots bleek dat er geen invloed was
van de blokkingfactor op de resultaten van het parasitisme.
Na de incorporatie van de ligninerijke stoffen in de bodem werden ook bodemstalen genomen om
scleroten te begraven onder labo condities. De resultaten van de labo-proef bevestigden de
bevindingen uit de serreproef. Trichoderma was significant meer aanwezig in scleroten uit de
gronden behandeld met Sappi-Out. Ook het totaal parasitisme was het grootst na behandeling met
Sappi-Out (Tabel 3). De proportie van parasitisme lag hoger in het potexperiment dan in de serre.
Ondanks het hoger percentage parasitisme waren alle scleroten nog levensvatbaar.
De parasieten teruggevonden in de uit de serre opgegraven korrels toonden niet volledig dezelfde
trend. Trichoderma was ditmaal significant meer aanwezig in de plots behandeld met Lignosol
(40.62%, σ=3.61, Wald test, p=0.05) dan met Sappi-Out (15.6%, σ=2.99) en de controle (12.5%,
σ=2.99). Behalve bij Trichoderma kan bij korrelinoculum moeilijk gesproken worden van parasitisme
aangezien deze organismen ook aanwezig kunnen zijn dankzij de koolstofbron van de tarwekorrel
zelf. Deze resultaten worden bijgevolg niet verder getoond.
41
Tabel 3: Levensvatbaarheid (%) en parasitisme (%) van scleroten van R. solani AG1-1B begraven in grond behandeld met
Sappi-Out en Lignosol. Enerzijds in de serre zelf, anderzijds in bodem in glazen potten in het labo. Het parasitisme werd
nagegaan op een selectief medium bestaande uit PDA en streptomycine. Verschillende letters tonen statistisch significante
verschillen aan binnen dezelfde parameter en proef (Wald test, p=0.05, n=4). Tussen haakjes staat de standaardafwijking.
Serre
Glazen potten
Controle
SappiOut
Levensvatbare
scleroten
Totaal
parasitisme
Trichoderma
100
(0)
1.6
(0.58)
0.0 (0)
a
Fusarium
0.0 (0)
a
Mucorales
0.0 (0)
a
Bacteriën
1.6
(0.58)
b
b
b
Lignosol
96.9
(2.00)
14.8
(3.77)
5.5
(2.87)
0.8
(0.50)
0.0 (0)
a
8.6
(2.99)
a
a
a
a
a
Controle
100
(0)
4.7
(1.29)
1.6
(1.0)
0.0 (0)
a
0.8
(0.50)
2.3
(0.50)
a
a
ab
a
b
SappiOut
100
(0)
26.3
(3.69)
1.3
(0.50)
6.3
(1.50)
0.0 (0)
a
20.0
(3.37)
a
ab
b
a
a
100
(0)
31.3
(3.30)
10.0
(3.37)
5.0
(1.4)
1.3
(0.50)
17.5
(1.73)
Lignosol
a 97.5
(0.58)
a 17.5
(2.38)
a 5.0
(2.00)
a 6.3
(1.26)
a 0 (0)
a
a 8.8
b (0.50)
b
b
ab
a
a
4.B.3.2. Discussie
In deze proef werd een kleine verhoging van het parasitisme van de scleroten waargenomen na de
behandeling met Sappi-Out of Lignosol. Deze was echter niet voldoende om de levensvatbaarheid
van de scleroten en de ziekte-incidentie te beïnvloeden. De beperkte impact van de behandelingen
op deze factoren zou te wijten kunnen zijn aan de lage concentratie toegediend product en de korte
tijd tussen incorporatie en het planten van de slaplantjes. Van Beneden (2009) zag voor de
toepassing van vlasvezels en houtsnippers pas effect op de levensvatbaarheid van scleroten na
toepassing van 5%, terwijl in deze proef slechts 0.5% werd toegepast. Lignine is een complexe
molecule die niet onmiddellijk na toediening snel gemetaboliseerd kan worden (Thevenot et al.,
2010). De geteste producten bestaan overigens niet uitsluitend uit lignine, maar bevatten ook
fracties van ander organisch materiaal, zoals cellulose en hemicellulose. Dat organisch materiaal kan
in een eerste periode na toediening ten goede komen aan organismen die leven volgens een rselectie strategie en bijgevolg eerst onderdrukkend werken voor parasieten en witrotters. Een
wachtperiode (om en bij 4 weken) tussen de incorporatie en het planten kan aangewezen zijn om de
eerst gestimuleerde organismen te verdringen. Het effect van de toegepaste ligninerijke bronnen zou
kunnen verbeteren na herhaalde behandeling. Het startinoculum kan zo jaar na jaar worden
teruggedrongen. Van Beneden (2009) vond na drie opeenvolgende teeltjaren waarin behandeld werd
met pure lignine (kraft Pine Lignin) een significante afname van de ziekte-incidentie.
Van Beneden (2009) toonde tevens de bodemafhankelijkheid van het succes van lignine-toediening
aan. Hoewel de grond uit deze proef niet dezelfde is als de grond van PSKW van de hierna
beschreven proef, zou het kunnen dat deze grond ook minder capaciteit heeft om positief te
reageren op ligninetoediening.
42
De alomtegenwoordigheid van B. cinerea maakte het moeilijk om het effect van de behandeling op
R. solani efficiënt te beoordelen. Gezien het tijdstip van de proef was de aantasting van B. cinerea
niet verbazingwekkend. B. cinerea staat immers bekend als een pathogeen die goed gedijt in de
koude en vochtige omstandigheden van de herfst en winter (Höfte, 2010-2011). Deze proef zal in
dezelfde serre herhaald worden waarbij behandeld zal worden met fungiciden die B. cinerea en
Sclerotinia spp. moeten onderdrukken om afwijking door gemengde aantasting van deze schimmels
te vermijden.
In het experiment onder labo condities werden hogere percentages aan parasitisme waargenomen.
Dit zou verklaard kunnen worden door de hogere constante incubatietemperatuur (22°C) terwijl de
bodemtemperaturen in de serre varieerden tussen 24 en 9.8°C. Behandeling tijdens een warmer
seizoen zou eventueel de effectiviteit van de ligninetoediening kunnen bevorderen.
De beste resultaten werden geobserveerd voor de behandeling met Sappi-Out. Dit was
verbazingwekkend omdat het toegediende gehalte aan lignine veel lager lag bij Sappi-Out dan bij
Lignosol. De lignine werd voor wat Sappi-out betreft toegediend onder vloeibare vorm. Deze is
mogelijk sneller beschikbaar en kon, gezien de korte duur van de proef, de beste resultaten
voorleggen. Het is tevens mogelijk dat andere mechanismen de werking van Sappi-Out verklaren. Dit
effluent is economisch interessant aangezien het gratis beschikbaar is. Wanneer de effectiviteit van
dit product bewezen zou zijn, zal dit niet langer gratis blijven omdat het nog verder verwerkt moet
worden om het grote watervolume te verminderen om het product gebruiksvriendelijk te maken. De
kosten zouden echter beperkt blijven (persoonlijke communicatie, França).
Tussen verschillende parasitaire organismen is er een groot verschil in hun effectiviteit in het
afdoden van scleroten. Trichoderma kan met veel betere efficiëntie dan andere schimmels de
scleroten afdoden (Schuster en Schmoll, 2010). Parasieten kunnen tevens de levensvatbaarheid
verminderen zonder de scleroot volledig af te doden. Scleroten bestaan uit een verzameling van
individueel verstevigde cellen, waarbij de levensvatbaarheid behouden blijft wanneer enkele van
cellen van de scleroot onaangetast blijven (Coley-Smith en Cooke, 1971; Liu et al., 2011).
Er werd geen significante reductie in de groei van de sla waargenomen. Dit zou kunnen aantonen dat
de toevoeging van Sappi-Out en Lignosol geen negatieve effecten heeft op de groei van de plant. Na
toediening van Lignosol was er een kleine toename van de nitraat- en ammoniumgehaltes in de
bodem (resultaten niet weergegeven). Sappi-Out en Lignosol leiden waarschijnlijk niet tot
immobilisatie van de bodemstikstof, zoals eerder wel opgemerkt was bij toevoeging van een
afvalstroom uit de papierindustrie of vlaslemen en houtsnippers (Croteau en Zibilske, 1998; De
Langhe, 2011). De pH toonde geen significante veranderingen na de behandelingen (resultaten niet
weergegeven).
Uit deze proef kan een aanzet tot gestimuleerd parasitisme vastgesteld worden. Het effect was
beperkt omwille van een te korte wachtperiode tussen het toedienen en het planten van de sla, de
bodemafhankelijkheid van de werking, de lage toegepaste dosis en interferentie met andere
organismen die smetsymptomen veroorzaken.
43
4.B.4. Potexperiment: Bodemafhankelijke effectiviteit van Miscanthus en Lignosol
incorporatie op de overleving en parasitisme van scleroten van R. solani
Van Beneden (2009) stelde vast dat de effectiviteit van incorporatie van pure lignine op het
overleven van de scleroten bodemafhankelijk is. In voorgaande proeven werd een dergelijk verschil
in effectiviteit vastgesteld in de gronden afkomstig uit de serres van PCG en PSKW. In de grond van
PCG lijkt lignine een groter effect op de overleving van R. solani te hebben, dan in PSKW (França,
2011). In beide serres werden ernstige problemen met deze ziekte vastgesteld. In onderstaande
proef werd de effectiviteit van Miscanthus en Lignosol op het afdoden van de scleroten nagegaan in
beide bodems. De verschillen in verschuivingen binnen de microbiële bodempopulatie werden
geanalyseerd a.d.h.v. metabolische profilering (Biolog) en PLFA extractie. Volgens Croteau en Zibilske
(1998) is de werkzaamheid van organische bodemsupplementen afhankelijk van de
decompositieperiode voor het planten. Daarom werd er geanalyseerd na een incubatieperiode van
twee en een van vier weken.
4.B.4.1. Parasitisme en levensvatbaarheid van scleroten bij Miscanthus- en
Lignosolbehandeling
Om het effect van Miscanthus en Lignosol op de levensvatbaarheid en parasitisme van scleroten te
analyseren werden nylon zakjes met scleroten begraven in glazen potten gevuld met bodem uit het
PCG of PSKW. Er werd behandeld met 1% Miscanthus of 1% Lignosol. Als controle bleef de bodem
onbehandeld. De potten werden gedurende twee en vier weken geïncubeerd. De scleroten werden
terug opgegraven en uitgeplaat op selectieve media.
Na twee weken incubatie was in de PCG bodem behandeld met Lignosol of Miscanthus reeds een
significante toename van het aantal scleroten geparasiteerd met Trichoderma waar te nemen. In
PSKW behandeld met Lignosol was er een kleine, niet significante toename van Trichoderma.
Fusarium werd in geen van beide bodems significant beïnvloed. Lignosolbehandeling stimuleerde in
PCG een sterke toename van Mucorales. Hoewel de Mucorales teruggevonden werden vanuit
gewassen scleroten, zijn deze schimmels geen efficiënte parasieten van R. solani. Na vier weken was
de sterke abundante aanwezigheid van Mucorales in PCG bodem met Lignosol verminderd. Na vier
weken incubatie vond er een verdere stijging van het aantal scleroten geparasiteerd door
Trichoderma in PCG bodems behandeld met Miscanthus en Lignosol plaats (Figuur 17). Het
parasitisme met Trichoderma correleerde goed met de levensvatbaarheid van de scleroten. Bij de
behandeling met Miscanthus in PCG bodem was 92% van de scleroten geparasiteerd met
Trichoderma, tegenover 74% met Lignosol. Dit kwam overeen met respectievelijk 10% en 58.3%
levenvatbare scleroten (Tabel 4). In de bodem van PSKW werd na vier weken geen significante
stijging van het aantal scleroten geparasiteerd met Trichoderma waargenomen bij behandeling met
Lignosol of Miscanthus. Er werd wel een significante toename van andere schimmels in de scleroten
waargenomen. De andere parasieten bezaten niet dezelfde capaciteit om de scleroten af te doden
want er trad geen significante vermindering op in de levensvatbaarheid van de scleroten.
44
Parasitisme (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2 weken
A
Bac
B
C
D
b'
b
Controle
D
b'
b
Miscanthus
Parasitisme (%)
Muc
a'
Fus + Muc
b'
b'
Fus + andere
D
b
Lignosol
Fus
b'
a
a
b
Controle
Miscanthus
Lignosol
PSKW
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Andere
Trich + Fus
Trich
PCG
A
A
b'
4 weken
b'
*
B
Andere
Bac
B
Muc +
a'
a
C
Muc
b
a'
Fus
D
a'
c
Controle
cd
Miscanthus
Trich +
d b'
d
Lignosol
Controle
Miscanthus
PSKW
Lignosol
Trich
PCG
Figuur 17: Parasitisme van scleroten van R. solani AG1-1B in bodems van het PCG en PSKW behandeld met Miscanthus en
Lignosol. Uitplating na twee en vier weken incubatie. Trich: Trichoderma, Fus: Fusarium, Muc: Mucorales, Bac: Bacterieën,
Andere: andere schimmel, Trich +: Trichoderma en een andere schimmel, Muc +: Mucorales en een andere schimmel.
Verschillende letters tonen statistisch significante verschillen aan (Wald test, p=0.05). De fracties zonder letter zijn niet
significant verschillend. De hoofdletters tonen significante verschillen van het totale parasitisme.
Tabel 4: Levensvatbaarheid van de scleroten van R. solani (%) na twee en vier weken incubatie in gronden van PCG en PSKW
behandeld met Miscanthus, Lignosol of onbehandeld als controle. Tussen haakjes staat de standaardafwijking (n=3).
Verschillende letters duiden op statistisch significante verschillen (Wald test, p=0.05).
2 weken
4 weken
Controle
100 (0) a
100 (0) a’
PSKW
Miscanthus
100 (0) a
100 (0) a’
Lignosol
98.3 (2.9) a
95 (5) a’
Contole
100 (0) a
98.3 (0) a’
PCG
Miscanthus
95 (5) ab
10 (5) c’
Lignosol
88.3 (12.6) b
58.3 (30.6) b’
4.B.4.2. Functionele profilering van de microbiële populatie (Biolog)
Algemene activiteit van bacteriële bodempopulatie
De functionaliteit van de bacteriële gemeenschap na behandeling met ligninerijke bronnen werd
nagegaan aan de hand van metabolische profilering van de gemeenschap met Biolog. Een van de
redenen waarom een bodem minder weerbaar zou kunnen zijn dan een andere, is de algemeen
45
lagere graad van activiteit van micro-organismen. Deze kan aan de hand van de Biolog test geschat
worden met de AWCD (Average Well Colour Development) (Preston-Mafham et al., 2002; Harch et
al., 1997).
Er werd dagelijks gedurende één week gemeten. Het verloop van de AWCD (Figuur 18) toonde
gedurende heel de meetperiode gelijke relatieve verhoudingen tussen de behandelingen, zowel bij
de stalen met incubatieperiode twee en vier weken. Daarom werd er gekozen om alle verdere
analyses uit te voeren op de gegevens bekomen op dag zes van de metingen. Een incubatieperiode
van zes dagen volstond om stoffen die trager gemetaboliseerd werden, te laten reageren, zonder een
te grote afwijking door te hoge ouderdom van de Eco MicroPlates™. Wegens de analogie met vier
weken worden enkel de curves voor twee weken incubatie weergegeven.
Absorbantie (590nm)
2
2
PSKW
PCG
1.8
1.8
1.6
1.6
1.4
1.4
1.2
1.2
1
1
con
0.8
0.8
Mis
0.6
0.6
Lig
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
0
24
48
72
96
120 144 168 192
0
Tijd (uur)
24
48
72
96
120 144 168 192
Tijd (uur)
Figuur 18: Average Well Colour Development (AWCD) gedurende een meetperiode van acht dagen (PCG en
PSKW) behandeld met Miscanthus (Mis), Lignosol (Lig) en onbehandeld als controle (con) op Eco MicroPlates™
(Biolog). De bodemstalen waren gedurende twee weken in de glazen potten geïncubeerd. De foutbalken geven
de standaardfout (n=3).
Factoriale analyse van de AWCD op dag zes toonde aan dat het effect van de bodem en dat van de
behandeling statistisch significant verschillen (p<0.001). De interactie was niet significant verschillend
na twee weken incubatie (p=0.22) en wel na vier weken (p<0.01).
De onbehandelde bodems van PSKW en PCG hadden geen significant verschillende AWCD zowel na
twee als na vier weken incubatie (Tabel 5). Na twee weken incubatie had de populatie uit de bodems
behandeld met Lignosol een significant hogere AWCD dan de controle, zowel in PCG als PSKW
bodem. In PCG bodem leek de populatie van de met Miscanthus behandelde bodem reeds een
verhoogde AWCD te bezitten, terwijl dit in bodem van PSKW niet het geval was. Na vier weken
incubatie was het verschil tussen de bodems van PSKW en PCG meer uitgesproken. In PSKW was
geen van de behandelingen significant verschillend van de controle, terwijl in PCG zowel de
behandeling met Miscanthus als met Lignosol resulteerde in een hogere AWCD. De absolute waarden
tussen twee en vier weken zijn niet op betrouwbare wijze met elkaar te vergelijken wegens licht
verschillende omstandigheden tijdens de incubatie van de Eco MicroPlates™.
46
Tabel 5: AWCD na 144h incubatie van bacteriële gemeenschap van de bodems van PSKW en PCG behandeld met
Miscanthus en Lignosol en onbehandeld (controle). De bodems werden zowel voor twee als vier weken geïncubeerd.
Tussen haakjes staat de standaardafwijking. Verschillende letters wijzen op significante verschillen binnen dezelfde
incubatieperiode (Bonferroni, p=0.05, n=3).
2 weken
4 weken
Controle
PCG
Miscanthus
Lignosol
Controle
PSKW
Miscanthus
Lignosol
1.21 (0.09) bc
0.98 (0.10) c’
1.34 (0.07) ab
1.27 (0.04) ab’
1.46 (0.06) a
1.46 (0.04) a’
1.09 (0.02) bc
1.01 (0.02) c’
1.05 (0.04) c
1.00 (0.03) c’
1.31 (0.10) ab
1.15 (0.16) bc’
Diversiteit van het metabolisme van de bacteriële bodempopulatie
De AWCD geeft enkel weer hoeveel van de koolstof in totaal verbruikt werd, echter niet hoe het
verbruik verdeeld was over de verschillende koolstofbronnen. Een hoge AWCD kan samengaan met
enkele veel verbruikte bronnen of vele bronnen die half aangewend zijn. De diversiteit valt bijgevolg
uiteen in de rijkheid aan aangewende bronnen (richness) en hun gelijkmatig gebruik (evenness) en
kan samengevat worden in de Lorenz-curve met bijhorende Gini-coëfficiënt. Harch et al. (1997)
beschreef hoe de Gini-coëfficiënt goed correleert met de shannon-index en hoe deze door haar
grafische weergave in de Lorenz-curve, de voorkeur kan genieten.
1
1
A
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.8
0.7
0.6
PCG
0.5
PCG mis
0.4
PCG lig
PSKW mis
0.2
0.1
0
0
0.5
Cumulatief aandeel welletjes
PSKW
0.3
0.1
0
B
0.9
Cumulatief aandeel absorbantie
Cumulatief aandeel absorbantie
0.9
1
PSKW lig
perfect gelijke
verdeling
0
0.5
Cumulatief aandeel welletjes
1
Figuur 19: Lorenz-curves van de verdeling van aangewende koolstofbronnen in Biolog Eco Microplates™. Analyse na 144h
uitgevoerd in twee gronden (PCG-PSKW) met verschillende lignine bronnen toegevoegd (mis: Miscanthus, lig: Lignosol). Er
was telkens ook een onbehandelde controle. A: na twee weken incubatie B: na vier weken incubatie. Hoe groter de
afwijking van de perfect gelijke verdeling, hoe minder diversiteit in gebruikte koolstofbronnen.
Uit de Lorenz-curves blijkt hoe Lignosol en -in mindere mate- Miscanthus, kunnen zorgen voor een
hogere diversiteit van de gebruikte koolstofbronnen (Figuur 19). Dit wijst erop dat deze
ligninebronnen niet een bepaalde groep van bacteriën met een nauw spectrum aan metabolisch
vermogen stimuleerden, maar een populatie met een breed scala aan mogelijkheden om
verschillende bronnen aan te wenden. Omdat de Gini-coëfficiënt en bijhorende Lorenz-curve
bekomen werden met absorbanties die gewogen waren aan de AWCD, tonen zij niet de toename in
totaal metabolisme, maar uitsluitend in diversiteit (Tabel 6). Factoriale analyse van de Ginicoëfficiënten toont dat zowel de bodems (p<0.01) als de behandelingen (p<0.05) significant
47
verschilden zowel na twee als na vier weken. De interactie was enkel bij vier weken incubatie
significant verschillend (p<0.01). In PCG bodem nam de diversiteit bij beide behandelingen toe,
terwijl in PSKW de diversiteit tussen de controle en behandeling met Miscanthus niet significant
verschillend was.
Tabel 6: Gini-coëfficiënten van de metabolische profielen van de bacteriële populatie in de bodems van PSKW en PCG
behandeld met Miscanthus, Lignosol en onbehandeld als controle. Analyse na 144h. De bodems werden zowel twee als vier
weken geïncubeerd. Tussen haakjes staat de standaardafwijking. Verschillende letters wijzen op significante verschillen
(Bonferroni, p = 0.05, n = 3). De Gini-coëfficiënt heeft waarden tussen 0 en 1, met 0 als absoluut gelijke verdeling en 1 als
absoluut ongelijke verdeling.
2 weken
4 weken
Controle
0.27 (0.03) ab
0.41 (0.04) a’
PCG
Miscanthus
0.21 (0.04) b
0.23 (0.03) c’
Lignosol
0.21 (0.01) b
0.21 (0.04) c’
Controle
0.29 (0.03) ab
0.34 (0.02) ab’
PSKW
Miscanthus
0.30 (0.03) a
0.34 (0.02) ab’
Lignosol
0.23 (0.01) ab
0.27 (0.04) bc’
Bacterieel metabolisch profiel van de onbehandelde bodems
Uit vorige paragrafen bleek reeds dat de onbehandelde bodems geen significante verschillen
vertoonden in AWCD en diversiteit. De analyse van de metabolische profielen zou echter de
verschillen in gronden verder duidelijk kunnen maken. Met behulp van principal component analyse
(PCA) werd getracht de koolstofbronnen die zorgden voor de meeste differentiatie in de
metabolische profielen te detecteren. De eerste principale component (PC) verklaarde 42.1% van de
variantie en de tweede PC 27.8% bij twee weken incubatie (Figuur 20). Bij de bodems na twee weken
incubatie werd na MANOVA analyse van de scores van de weerhouden PC (3 stuks, 98,3% van de
variantie) de variantie niet significant verschillend verklaard tussen de bodem van PSKW en PCG
(F=4.64, Df=3, p=0.18). De differentiatie tussen beide bodems was niet significant omdat in beide
bodems telkens een van de drie herhalingen een extra hoge concentratie had aan Itaconic acid (V22)
en β-methyl-D-glucoside (V9). Het verbruik van de andere koolstofbronnen was in deze stalen erg
gelijkend aan de andere stalen. De overige twee herhalingen werden voornamelijk uitgesplitst via de
positieve kant van de eerste principale component (PC) voor PSKW en de negatieve zijde van de
tweede PC voor PCG. De stoffen die de voornaamste bron van variatie uitmaakten in deze delen van
de PC’s worden afgebeeld in Figuur 21 (A en B).
Na vier weken incubatie verklaarden de scores van de eerste drie PC (88.4%) weldegelijk op
significante wijze de variantie tussen de bodems van PCG en PSKW (F=26.16, Df=3, p=0.037). De
eerste PC verklaarde 45% van de variantie en de tweede 26.3%. Het metabolisme van beide bodems
werd voornamelijk uitgesplitst volgens de tweede PC. Van deze PC zijn de koolstofbronnen die de
grootste bron van variantie bepaalden afgebeeld in Figuur 21 (C en D).
48
B
A
Figuur 20: Biplot van de PC- analyse gebaseerd op genormaliseerde absorbanties van de onbehandelde bodems PCG en
PSKW na 144h incubatie in Eco MicroPlates™. Rode bolletjes: PCG, groene bolletjes: PSKW. A: twee weken geïncubeerde
bodem, PC1 geeft 42.1% en PC2 27.8% van de totale variantie weer, B: vier weken geïncubeerde bodem, PC1 geeft 45.0%
en PC2 geeft 26.3% van de totale variantie weer. De vectoren tonen de verschillende koolstofbronnen (lijst in bijlage).
V31*
V24
B
V26
Absorbantie (590nm)
2.5
V12
2
1.5
1
0.5
0
3
2.5
V22
2
V19*
V27
C
Absorbantie (590nm)
Absorbantie (590nm)
Absorbantie (590nm)
A
3
1.5
1
0.5
0
Itaconic Acid
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
V27
V7
V6
V5
PCG
PSKW
V24
V7
V13*
V10
V9
D
V29*
2-Hydroxy L-Phenylalanine
Bennzoic Acid
Figuur 21: Absorbanties van het metabolisme van de koolstofbronnen door de bacteriële populatie van de bodems PSKW
en PCG. De voornaamste koolstofbronnen van: A: de positieve zijde van de eerste PC die zorgen voor de uitsplitsing van
PSKW na twee weken incubatie. B: de negatieve zijde van de tweede PC die zorgen voor de uitsplitsing van PCG na twee
weken. C: de negatieve zijde van de tweede PC na vier weken incubatie. D: de positieve zijde van de tweede PC na vier
weken incubatie. De asterix wijst op significante verschillen (Bonferroni, p=0.05, n=3). De foutbalken tonen de
standaardfout.
49
Na twee weken incubatie zorgde het hoger metabolisme van cellobiose (V7), α-cyclodextrine (V5) en
glycogeen (V6) in PCG voor het onderscheid met de grond van PSKW. Na een incubatieperiode van
vier weken waren het niet langer dezelfde stoffen die het onderscheid tussen beide bodems
uitmaakte. Op een periode van twee weken vond reeds een heuse verschuiving plaats in de
metabolische capaciteit van de populatie.
Bacterieel metabolisch profiel na behandeling met Miscanthus en Lignosol
De PC-analyse van de metabolische profielen van de bacteriële populaties bij de verschillende
gronden toonde duidelijke differentiatie tussen de behandelingen (Figuur 22). De eerste principale
component bij de analyse na twee weken verklaarde 43.4% van de variantie en de tweede 15.1%. Na
vier weken verklaarden deze respectievelijk 37.7% en 19.4%. Zowel na twee als na vier weken
incubatie werden de verschillen door de behandeling ondersteund door significante variantie van de
scores van de weerhouden PC (MANOVA, 2 weken: F=2.7, Df=8, p=0.031; 4 weken: F=3.4, Df=4,
p=0.024). De variantie in het metabolisch profiel te wijten aan de grondsoort, onafhankelijk van de
behandeling, was via analoge analyse significant verschillend (2 weken: F= 27.31, Df=4, p<0.001; 4
weken: F=23.2, Df=2, p<0.001). De interactie was enkel significant verschillend na twee weken
incubatie (2 weken: F=2.57, Df=8, p=0.04; 4 weken: F=2.4, Df=4, p=0.08).
In de bodem van PCG die behandeld was met Lignosol en Miscanthus vond er een verschuiving plaats
tegenover de controle naar de negatieve zijde van de eerste principale component. Deze richting
werd gedomineerd door het metabolisme van de stoffen α-cyclodextrine (V5), glycogeen (V6),
D-cellobiose (V7) en β-methyl-D-glucoside (V9)(Figuur 23). Uit de absorbanties van deze stoffen bleek
dat het metabolisme, hoewel niet significant, hoogst was bij behandeling met Lignosol. Enkel het
verbruik van β-methyl-D-glucoside was in de met Miscanthus behandelde bodempopulatie even
hoog als na behandeling met Lignosol.
In de bodem van PSKW werd een analoge verschuiving van het metabolisch vermogen van de
populatie waargenomen wanneer deze behandeld was met Lignosol. Het metabolisch profiel van de
bacteriële populatie differentiëerde zich niet van de onbehandelde bodem na behandeling met
Miscanthus. De absolute waarde van de absorbanties van deze stoffen was lager in PSKW dan in PCG.
Dit kan verklaard worden door de algemeen lagere AWCD in PSKW bodem. Omwille van deze reden
werd geopteerd om de absolute waarden niet tussen de verschillende bodems te vergelijken met
ANOVA, maar enkel tussen de verandering binnen dezelfde bodem (Figuur 23).
Na vier weken incubatie was de verschuiving in het bacterieel metabolisch profiel van PCG bodem na
behandeling met Lignosol en Miscanthus van dezelfde grootteorde. De behandeling met Miscanthus
resulteerde in een metabolisch profiel met meer variatie dan deze na Lignosolbehandeling. In de
bodem van PSKW leek het metabolisch profiel na de behandeling met Lignosol nog lichtjes te
verschuiven in dezelfde richting van de Lignosolbehandeling in PCG bodem. Na twee weken was de
verschuiving van Lignosolbehandeling in PSKW groter dan na vier weken. De behandeling met
Miscanthus zorgde ook na vier weken incubatie voor geen significante verandering in het
metabolisme.
50
De onbehandelde stalen van de bodems leken zich ook reeds te differentiëren. De bacteriële
populatie van PCG had een metabolisme dat reeds sterker aanleunde bij deze die behandeld zijn met
de ligninerijke bronnen.
De stoffen die met een hoger gehalte gemetaboliseerd werden na de behandelingen, werden
voornamelijk verklaard door de negatieve zijde van de eerste PC. De positieve zijde van de eerste
principale component werd voornamelijk bepaald door stoffen die onafhankelijk van de behandeling
hoge absorbanties hadden, zowel in PCG als in PSKW bodem. Na twee weken incubatie waren deze
stoffen L-asparagine (V26) en fenylethylamine (V31), na vier weken D-mannitol (V12) en L-arginine
(V25).
Wanneer men per soort koolstofbron vergelijkt, was de voornaamste toename bij Lignosol- en
Miscanthusbehandeling in PCG grond te vinden bij de polymeren (o.a. α-cyclodextrine, glycogeen) en
bij de carboxyhydraten (D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside). Deze toename was in PSKW enkel
waarneembaar bij Lignosol toediening.
A
B
Figuur 22: Biplot van de PC- analyse gebaseerd op genormaliseerde absorbanties uit Biolog Ecoplates™ geïncubeerd met
bodemstalen (PCG en PSKW) behandeld met Miscanthus, Lignosol en onbehandeld als controle. Rood: PCG-bodem, Groen:
PSKW-bodem. Cirkels: Controle, Vierkantjes: Miscanthus, Driehoekjes: Lignosol. A: na twee weken incubatie. De eerste
twee PC’s omvatten respectievelijk 43.4% en 15.1% van de variatie. B: na vier weken incubatie. De eerste twee PC’s
omvatten respectievelijk 37.7% en 19.4% van de variatie.
51
PCG, 2 weken
V5
PSKW, 2 weken
V7
V6
V9
2.5
Absorbantie (590nm)
Absorbantie (590nm)
3
2
1.5
Con
1
Mis
0.5
Lig
0
3
V5*
V6*
V7
V9*
2.5
2
1.5
a
b
1
0.5
abb
a
ab
a
b
con
b
Mis
0
Lig
3
V5*
V6*
a
2.5
2
b
1
0.5
0
b
3
V9
a a
aa
1.5
a
V7*
b
Con
Mis
Absorbantie (590nm)
Absorbantie (590nm)
PCG, 4 weken
2.5
V5
V6*
V7
V9
2
1.5
1
0.5
0
Lig
PSKW, 4 weken
a
ab
Con
b
Mis
Lig
Figuur 23: Absorbanties van de koolstofbronnen die de voornaamste component vormen van de negatieve zijde van de
eerste PC. De resultaten worden weergegeven voor de bodems PCG en PSKW met de behandelingen Miscanthus (mis) en
Lignosol (lig) en onbehandeld als controle (con). Bij het optreden van significante verschillen wordt een asterix
weergegeven en tonen de verschillende letters waar de significante verschillen zich bevinden (Bonferroni, p=0.05, n=3). De
foutbalken tonen de standaardfout.
Algemene activiteit van schimmels
De metabolische activiteit kan ook voor de schimmelpopulatie nagegaan worden met Biolog
(FF MicroPlates™). Net zoals bij de bacteriën kan aan de hand van de gemiddelde verkleuring van de
wells de graad van metabolische activiteit van de schimmels geschat worden. Hoewel de AWCD
(Figuur 24) zich in het verloop van de tijd leek te differentiëren tussen de behandelingen, was dit
verschil niet statistisch significant, behalve voor PSKW na twee weken (Tabel 8). De behandeling met
Lignosol veroorzaakte in PSKW na twee weken een significante verhoging van de AWCD. De
metabolische activiteit van de schimmels in PCG bodem was significant hoger dan deze in PSKW
bodem (ANOVA, p=0.039). Het uitblijven van statistische significantie van de behandelingen zou te
wijten kunnen zijn aan de grote standaardafwijking van de Miscanthusbehandeling in PCG grond na
twee weken. Na vier weken werd slechts gedurende zes dagen gemeten. Op dit tijdstip was de
differentiatie tussen verschillende koolstofbronnen minimaal. Omwille van deze reden werd de
analyse voor twee weken uitgevoerd na 192h en deze na vier weken na 144h. Het vroege meetpunt
(na 144h) na vier weken kan verklaren waarom de behandelingen niet significant verschilden.
52
0.25
PSKW
0.2
0.2
AWCD (490nm)
AWCD (490nm)
PCG
0.25
0.15
0.1
0.05
0.15
Con
Mis
0.1
Lig
0.05
0
0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
0
24 48 72 96 120 144 168 192 216
Tijd (uur)
Tijd (uur)
Figuur 24: Average Well Coulour Development (AWCD) gedurende de incubatieperiode van bodemstalen van PSKW en PCG
op FF MicroPlates™. De bodemstalen waren gedurende twee weken in glazen potten met Lignosol (Lig) en Miscanthus (Mis)
en onbehandeld als controle (Con) geïncubeerd. De foutbalken geven de standaardfout (n=3).
Tabel 7: AWCD van de schimmelpopulatie van de bodems van PSKW en PCG behandeld met Miscanthus en Lignosol en
onbehandeld als controle. De bodems werden zowel voor twee (meting na 192h) als vier weken (meting na 144h)
geïncubeerd. Tussen haakjes staat de standaardafwijking. Verschillende letters wijzen op significante verschillen. De letters
tussen haakjes tonen de statistisch significante verschillen binnen PSKW (Bonferroni, p=0.05, n=3).
Controle
PCG
Miscanthus
Lignosol
Controle
PSKW
Miscanthus
Lignosol
2 weken
0.17 (0.019) a
0.12 (0.113) a
0.14 (0.053) a
4 weken
0.07 (0.019) a’
0.07 (0.005) a’
0.07 (0.013) a’
0.04 (0.006) a
(b)
0.01 (0.004) a’
0.04 (0.003) a
(b)
0.01 (0.010) a’
0.10 (0.032) a
(a)
0.03 (0.012) a’
Metabolische diversiteit van schimmels
De Lorenz-curves uit Figuur 25 tonen hoe de diversiteit van het metabolisme van de
schimmelpopulatie verschilde tussen bodems en behandelingen met Miscanthus en Lignosol. De
diversiteit van het metabolisme van de schimmels in de bodems van PCG en PSKW verschilde
significant zowel na twee (p<0.01) als na vier weken incubatie (p<0.001). De toediening van
Miscanthus en Lignosol veroorzaakte in PCG bodem geen significante toename of afname van de
diversiteit van de gemetaboliseerde stoffen na twee weken incubatie. De behandeling met
Miscanthus leek de diversiteit te verminderen in PCG bodem, maar slechts 1 van de 3 stalen met
Miscanthus had een opmerkelijk lagere diversiteit. In PSKW kon de schimmelpopulatie na
behandeling met Lignosol zich significant onderscheiden van de controle en behandeling met
Miscanthus; Lignosol zorgde hier voor een toename van de diversiteit.
Na vier weken incubatie was zowel het verschil tussen de gronden (p< 0.001) als het verschil van de
behandeling significant (p=0.026). De Lorenz-curves van de PCG bodem lagen dichter bij de perfect
gelijke verdeling en hadden bijgevolg een hogere diversiteit aan gemetaboliseerde stoffen. Lignosol
stimuleerde weerom de diversiteit in PSKW bodem. In PCG bodem had Lignosol niet dit
diversiteitsverhogend effect. In beide bodems werd een terugval in diversiteit teruggevonden na
behandeling met Miscanthus.
53
1
A
0.9
Cumulatief aandeel absorbanties
Cumulatief aandeel absorbanties
1
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
B
0.9
PCG
0.8
PCG Mis
0.7
0.6
PCG Lig
0.5
PSKW
0.4
0.3
0.2
PSKW
Mis
0.1
PSKW Lig
0
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Cumulatief aandeel welletjes
Cumulatief aandeel welletjes
Perfect
gelijke
verdeling
Figuur 25: Lorenz-curves van de verdeling van het gebruik van verschillende koolstofbronnen op FF Microplates™
geïncubeerd met bodemstalen van PCG en PSKW behandeld met Miscanthus (Mis), Lignosol (Lig) en onbehandeld als
controle. A: bodemstalen gedurende twee weken geïncubeerd, gemeten na 192h. B: bodemstalen gedurende vier weken
geïncubeerd, gemeten na 144h. Hoe groter de afwijking van de perfect gelijke verdeling, hoe minder de diversiteit in
gebruikte koolstofbronnen.
Tabel 8: Gini-coëfficiënten van de metabolische profielen van de schimmel populatie in de bodems van PSKW en PCG
behandeld met Miscanthus, Lignosol en onbehandeld als controle. Analyse na 192h voor twee weken, 144h bij vier weken
incubatie. Tussen haakjes staat de standaardafwijking. Verschillende letters wijzen op significante verschillen. De letters
tussen haakjes tonen de statistisch significante verschillen binnen PSKW (Bonferroni, p=0.05, n=3). De Gini-coëfficiënt heeft
waarden tussen 0 en 1, met 0 als absoluut gelijke verdeling en 1 als absoluut ongelijke verdeling.
Controle
PCG
Miscanthus
Lignosol
Controle
PSKW
Miscanthus
Lignosol
2 weken
0.73 (0.048) a
0.82 (0.142) a
0.73 (0.095) a
4 weken
0.84 (0.039) c’
0.88 (0.016) bc’
0.83 (0.035) c’
0.90 (0.012) a
(a”)
0.94 (0.020) ab’
0.90 (0.017) a
(a”)
0.96 (0.003) a’
0.81 (0.046) a
(b”)
0.93 (0.010) ab’
Metabolisch profiel van de schimmelpopulatie in de onbehandelde bodems
De verschillen in metabolische profielen van de onbehandelde bodems PCG en PSKW werden
geanalyseerd met PCA. Bij twee weken incubatie verklaarde de eerste PC 42.1% van de variantie en
de tweede 27.1%. Na vier weken was dit respectievelijk 40,0% en 28.7% (Figuur 26). De scores van de
weerhouden PC toonden dat de variantie significante verschillen weergeeft tussen de bodems, zowel
bij twee weken (MANOVA: F=43.87, Df=3, p=0.022) als bij vier weken (F=1299.6, Df=3, p=0.001).
De opsplitsing tussen verschillende metabolische profielen werd overheerst door de trend waarbij de
populatie uit PCG bodem telkens meer van de koolstofbronnen verbruikte dan deze van PSKW.
Omwille van die reden werden de kleine verschillen in PSKW metabolisme uitvergroot en leek er een
grotere variatie tussen de stalen van PSKW te bestaan. Na twee weken waren de voornaamste
gemetaboliseerde stoffen: D-fructose (V16), dextrine (V14), D-xylose (V59), D-mannose (V37),
gentiobiose (V20), sucrose (V54) en α-D-glucose (V23). Enkel voor dextrine, α-cyclodextrine (V12) en
putrescine (V92) was het verbruik hoger in PSKW bodem dan in PCG bodem. Na vier weken werd in
PCG bodem ook veel Tween 80 en glycogeen verbruikt. De absorbanties van dextrine en Tween 80
waren het tweevoud van deze van andere stoffen. Ook na twee extra weken incubatie verbruikte de
populatie uit PCG bodem bijna alle stoffen meer dan in PSKW bodem.
54
A
B
Figuur 26: Biplot van de PC analyse gebaseerd op genormaliseerde absorbanties van de onbehandelde bodems PCG en
PSKW in FF MicroPlates™. Rode bolletjes: PCG, groene bolletjes: PSKW. A: twee weken geïncubeerde bodem, analyse na
192h, PC1 geeft 42.1% en PC2 27.1% van de totale variantie weer, B: vier weken geïncubeerde bodem, analyse na 144h,
PC1 geeft 40.0% en PC2 geeft 28.7% van de totale variantie weer. De vectoren tonen de verschillende koolstofbronnen (lijst
in bijlage).
Metabolisch profiel van de schimmelpopulatie na behandeling met Miscanthus en Lignosol in de
bodems PCG en PSKW.
Voor de analyse van de impact van de behandelingen werden enkel de resultaten na twee weken
incubatie weerhouden omdat het meetpunt bij vier weken incubatie (na 144h) te vroeg lag om
voldoende differentiatie in de metabolische profielen te bekomen. De PC-analyse werd uitgevoerd
op de bodemstalen na twee weken. De eerste PC verklaarde 30.2% van de variantie en de tweede
17.3% (Figuur 27). De factoriale analyse van de scores van de principale componenten toonde enkel
voor de bodemsoort een significante uitsplitsing van de variantie (MANOVA: F=5.0419, Df=4,
p=0.0207). De behandeling (F=1.92, Df=8, p=0.11) en de interactie (F=0.88, Df=8, p=0.54) waren niet
significant verschillend.
De metabolische profielen in PCG bodem behandeld met Lignosol en Miscanthus differentieerden
zich niet significant van de onbehandelde bodem. Een van de stalen behandeld met Miscanthus werd
via de eerste PC aan de positieve zijde verdeeld, in tegenstelling tot alle andere profielen uit PCG
bodems. In dit afwijkend staal werd bij de uitplating van de scleroten significant minder parasitisme
door Trichoderma waargenomen. Er werd slechts 5% parasitisme door Trichoderma waargenomen,
tegenover 30% en 40% in de andere stalen van PCG met Miscanthus.
In de bodem van PSKW trad er wel een splitsing op tussen de controle en Miscanthusbehandeling
langs de positieve zijde van de eerste PC en de Lignosolbehandeling aan de negatieve zijde. De
behandeling met Lignosol situeerde zich eerder ter hoogte van de metabolische profielen afkomstig
uit PCG bodems. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het toegenomen aantal verschillende gebruikte
stoffen. Dit werd tevens aangetoond in de analyse van de diversiteit.
55
Na de analyse van de koolstofbronnen die de grootste bron van variantie verklaarden, werd
opgemerkt dat het verbruik van sommige eenvoudige suikermoleculen (D-fructose, gentiobiose,
D-mannose en D-xylose) afnam bij behandeling met Lignosol en Miscanthus. Het metabolisme van
α-D-glucose nam in PSKW toe en af in PCG bodem. Er kan geconcludeerd worden dat de populatie
met het hoogste en meest divers metabolisme afkomstig was van PCG bodem, die tevens de hoogste
lignine-effectiviteit bezit. Lignosol heeft voornamelijk het vermogen om in gronden waar het
metabolisme van de schimmelpopulatie niet erg uitgebreid is deze te verbreden.
Figuur 27: Biplot van de PC-analyse gebaseerd op genormaliseerde absorbanties uit Biolog FF Microplates™ geïncubeerd
met bodemstalen (PCG en PSKW) behandeld met Miscanthus, Lignosol en onbehandeld als controle. Rood: PCG-bodem,
Groen: PSKW-bodem. Cirkels: Controle, Vierkantjes: Miscanthus, Driehoekjes: Lignosol. De bodemstalen waren geïncubeerd
gedurende twee weken. De eerste twee principale componenten omvatten respectievelijk 30.2% en 17.3% van de variantie.
4.B.4.3. Veranderingen in de micobiële gemeenschap van de bodem bij toevoeging van
Lignosol en Miscanthus
De verschuiving in de microbiële bodempopulatie na toediening van Miscanthus en Lignosol werd
ook geanalyseerd met PLFA. De samenstelling van de fosfolipidenfractie uit de bodem geeft een idee
over de proportie van de groepen Gram +, Gram -, schimmels en Actinomyceten in de bodem (Zelles,
1999). Voor de analyse werden 7 biomerkers weerhouden die voor de stalen van twee en vier weken
incubatie respectievelijk 70.1% en 71.1% van de totale geëxtraheerde PLFA uitmaakten. De PLFA’s
C16:1’9c en C18:1’11c werden toegekend als biomerker van Gram negatieve bacteriën. De groep van
de schimmels werd verklaard met de biomerkers C18:2(n-6) en C18:1’9c. C16:0 was de enige merker
die bekend staat als universele merker die weerhouden werd. Voor de Gram positieve bacteriën
werden de PLFA’s i-C15:0, a-C15:0 (enkel bij twee weken) en i-C16:0 (enkel bij vier weken) ingesloten
(Zelles, 1997; Stahl en Klug, 1996).
De totale biomassa
De totale geëxtraheerde concentratie PLFA-C kan dienst doen als maat voor de omvang van
microbieel bodemleven (Zelles, 1999). In de bodems behandeld met Lignosol werd een significant
hoger gehalte aan PLFA-C teruggevonden, zowel na twee weken als na vier weken (Figuur 28). Na
vier weken was ook in beide gronden een kleine, niet significante toename bij de bodems behandeld
met Miscanthus waar te nemen. Er werd tevens een hoger gehalte aan PLFA’s geëxtraheerd uit de
bodem van PSKW. De waarden van twee weken en vier weken incubatie kunnen verschillen
aangezien de extracties uitgevoerd werden op een ander moment.
56
a
0.8
µmol PLFA-C g-1 bodem
0.7
b
a'
0.6
0.5
0.4
b'
c
c
b'
c
c
bc'
bc'
PSKW
c'
0.3
PCG
0.2
0.1
0
Controle
Miscanthus
Lignosol
Controle
2 weken
Miscanthus
Lignosol
4 weken
-1
Figuur 28: Totale PLFA-C (µmol PLFA-C g bodem) in bodems PSKW en PCG behandeld met Miscanthus en Lignosol. De
foutbalken tonen de standaardfout (n=3). Balken met dezelfde letter zijn statistisch niet significant verschillend (Bonferroni,
p=0.05).
De microbiële populaties van de onbehandelde gronden
De samenstelling van de microbiële populatie is erg afhankelijk van de bodem. Om een beeld te
vormen van de populatie in PCG en PSKW bodem werden de onbehandelde stalen geanalyseerd met
PC-ordinatie (Figuur 29). De eerste PC verklaarde 86.0% (2 weken), 92.7% (4 weken) van de variantie
en de tweede 12.8% (2 weken), 4.05% (4 weken). De variantie van de structuur van de microbiële
bodempopulatie bleek significant verschillend tussen beide bodems na MANOVA analyse van de
weerhouden PC-scores (2 weken: F=150.5, Df=2, p<0.01 & 4 weken: F=279.37, Df=1, p<0.001). De
gronden uit PSKW hadden een hoger aandeel van biomerkers die toebehoren aan de schimmels
(C18:1’9c) en Gram negatieve bacteriën (C16:1’9c en C18:1’11c). Uit de bodem van PCG werd een
significant groter gehalte van de universele biomerker C16:0 geëxtraheerd. De verdeling was
gelijkend voor de incubatieperioden van twee en vier weken, daarom worden enkel de proporties
van de biomerkers van vier weken incubatie weergegeven (Figuur 30).
A
B
Figuur 29: Biplot van de PC-analyce gebaseerd op de PLFA-C mol percentages van de onbehandelde bodems van PCG (rode
bolletjes) en PSKW (groen). A: bodemstalen gedurende twee weken geïncubeerd. PC1 verklaart 86,0% en PC2 12.8% van de
variantie. B: bodemstalen met incubatieperiode van vier weken. PC1 verklaart 92.7% PC2 verklaart 4.05% van de variantie.
57
Proportie biomerkers
PLFA-C mol %
50
*
PSKW
40
PCG
30
*
20
*
*
*
10
0
i-C15:0
i-C16:0
C16:0
C16:1'9c
C18:1'9c
C18:1'11c
C18:2(n-6)
Figuur 30: De relatieve verdeling van de weerhouden biomerkers in de controlegronden van PSKW en PCG na vier weken
incubatieperiode. De foutbalken tonen de standaardfout (n=3). De asterix boven de balken wijst op significante verschillen
tussen beide bodems (Bonferroni, p=0.05).
De verschuiving van de microbiële populatie na incorporatie van Miscanthus en Lignosol
De verschuivingen in biomerkerconcentraties na incorporatie van de Miscanthus en Lignosol werden
geanalyseerd met PC-ordinatie (Figuur 31). Bij de analyse na twee weken verklaarde de eerste PC
76,9% en tweede 15.4% van de variantie; na vier weken was dit respectievelijk 69.2% en 26.3%. De
varianties van de biomerker verdelingen in eenzelfde bodem waren significant verschillend
(MANOVA analyse van de PCA scores van de weerhouden eerst en tweede PC, 2 weken: F=44.98,
Df=4, p<0.001, 4 weken: F=31.0, Df=4, p<0.001). De afkomst van de gronden gaf tevens een
significante verklaring voor de varianties (2 weken: F= 411.8, Df=3, p<0.001 en 4 weken: F= 221.18,
Df=3, p<0.001). De significante interactie van bodem en behandeling wijst op de
bodemafhankelijkheid van het effect van incorporatie van Miscanthus en Lignosol op de
veranderingen in microbiële populatie (2 weken: F=3.24, Df=4, p<0.05 en 4 weken: F=5.70, Df=4,
p<0.01).
Ondanks de aangetoonde bodemafhankelijkheid van de behandelingen, was duidelijk te zien in de
PCA biplot dat de verschuiving in de microbiële populatie bij incorporatie van Lignosol en Miscanthus
tegenover de controle bij zowel PCG als PSKW bodem in dezelfde richting ging. Bij de analyse van de
proporties van de biomerkers bleek dat slechts bij de biomerkers C16:1’9c en C18:1’9c (2 weken) en
C16:0 en C18:2(n-6) (4 weken) statistisch significante interactie van bodem met behandeling werd
waargenomen (ANOVA, p<0.05). Behalve voor C18:2(n-6) betreft het slechts een minimale
verschuiving van een enkel percent dat hoewel statistisch significant, geen enorme impact op de
populatiesamenstelling heeft. Uit de procentuele verdeling van de biomerkers bleek dat de
incorporatie van Lignosol en Miscanthus zorgde voor een gelijkaardige shift in microbiële groepen in
beide bodems. De verschillende initiële startsamenstelling van de populatie (een hoger gehalte aan
universele merker in PCG en een hoger gehalte aan Gram - en schimmelmerkers in PSKW) leek de
voornaamste bron van differentiatie na behandeling met Lignosol en Miscanthus. De analyses
werden uitgevoerd met de procentuele verdeling van de merkers aangezien de behandeling met
Lignosol zorgde voor een absolute toename in alle weerhouden biomerkers.
58
Na twee weken was de populatie van de bodems behandeld met Lignosol verschoven naar een met
een groter aandeel van biomerker C18:2(n-6) (schimmels) en C18:1’11c (Gram -). Deze toename ging
voornamelijk ten koste van het aandeel van de universele merker C16:0 en in mindere mate van de
Gram positieve merker iC15:0 (niet significant, p=0.05). Er vond na behandeling met Miscanthus
tevens een shift plaats richting meer C18:2(n-6) (schimmels) en minder universele merker C16:0,
maar deze was niet zo uitgesproken als bij de Lignosolbehandeling (Figuur 32).
Na vier weken incubatie was de verschuiving naar een groter aandeel van biomerker C18:2(n-6) van
gelijke grootteorde na behandeling met Miscanthus als met Lignosol. In de PCG bodem was het
aandeel van C18:2(n-6) zelfs hoger in de bodems behandeld met Miscanthus dan met Lignosol. In de
grond behandeld met Miscanthus was biomerker C16:1’9c (Gram -) proportioneel minder aanwezig
dan in de controle en behandeling met Lignosol.
Samenvattend kan gesteld worden dat de proporties aan merkers van Gram positieve bacteriën en
de universele af nam, deze van schimmels (C18:2(n-6)) en Gram negatieve bacteriën (C16:1’9c)
namen toe na behandeling met Lignosol en Miscanthus.
A
B
Figuur 31: Biplot van de PC-analyse gebaseerd op de molpercentages van individuele PLFA biomerkers bij de analyse van
bodemstalen (PCG: rood en PSKW: groen) met verschillende behandelingen. Cirkels: controle, vierkant: Miscanthus incorporatie
(1%), driehoek: Lignosol (1%). A: incubatieperiode van 2 weken, PC1 verklaart 76,9% en PC2 15.4% van de variantie. B:
incubatieperiode van 4 weken, PC1 verklaart 69.2% en PC2 26.3% van de variantie.
59
40
aa
30
20
b
aaa
aaa
a
ab b
aaa
10
50
PSKW, 2 weken
Proportie (%)
Proportie (%)
50
aaa
c
b
a
30
20
40
Con
b
Mis
Lig
bca
aaa
ab
30
a
50
PSKW, 4 weken
aaa
30
ab
ab
aa
ab
ab
a
40
c
Proportie (%)
Proportie (%)
PCG, 2 weken
bba
c
ba
0
50
10
aaa
10
0
20
aa
40
aaa
20
aaa
aa
b
10
a bab
PCG, 4 weken
bb
ab
ab
acb
bba
a
ab
b
a
b
c
0
0
Figuur 32: Procentuele verdeling van de weerhouden PLFA-C biomerkers bij de bodems PSKW en PCG behandeld met
Miscanthus (Mis), Lignosol (Lig) en onbehandeld als controle (Con). A: incubatieperiode van 2 weken. B: incubatieperiode
van 4 weken. De foutbalken tonen de standaardfout. Verschillende letters wijzen op significante verschillen tussen de
behandelingen binnen dezelfde biomerker (Bonferroni, p=0.05, n=3)
4.B.4.4. Discussie
In deze proef werd aangetoond dat Miscanthus en Lignosol de levensvatbaarheid van scleroten van
R. solani kunnen terugdringen en het parasitisme verhogen. Het effect blijkt echter afhankelijk van
de bodem en de tijd na toediening. In de bodem van PCG waren deze stoffen effectiever in het
afdoden van scleroten dan in de bodem van PSKW. Vier weken na toepassing was het afdoden
significant hoger dan na twee weken. De afname van levensvatbare scleroten ging samen met een
verhoogd parasitisme met Trichoderma spp.. Deze resultaten bevestigden de eerder gevonden
verschillen in het vermogen van de bodems PCG en PSKW om positief te reageren op lignine
incorporatie (França, 2011). De analyses en interpretatie van het metabolisch profiel van de
microbiële gemeenschap en de PLFA extractie zijn gebaseerd op de veronderstelling dat de bodem
van PCG een hoge lignine-effectiviteit heeft en deze van PSKW een lage.
Het onderscheid van de onbehandelde bodems: PCG en PSKW
Het verschil in werkzaamheid van ligninerijke bronnen in de bodems van PCG en PSKW is hoogst
waarschijnlijk te wijten aan verschillen in de aanwezige microbiële bodempopulatie. Deze wordt
echter beïnvloed door de abiotische eigenschappen van de bodem en het beheer (Raaijmakers et al.,
2009). De AWCD is een parameter die de graad van totaal metabolisme binnen de populatie schat
(Preston-Mafham et al., 2002). Deze parameter maakt echter geen onderscheid tussen hogere
activiteit omwille van een populatie met breder werkingspotentieel of hogere inoculumconcentratie
(Garland, 1997). In onze resultaten werd vastgesteld dat een verhoogde AWCD samen ging met een
hogere diversiteit in verbruikte bronnen.
60
De AWCD en diversiteit van de bacteriële populatie verschilden niet significant tussen de
onbehandelde bodems van PSKW en PCG. Het metabolisch profiel differentieerde zich wel. Echter,
de koolstofbronnen waar het onderscheid op gebaseerd was verschilden volkomen na twee of vier
weken incubatie. De metabolische capaciteit van de bacteriële bodempopulatie kan snel wijzigen.
Microbiologische eigenschappen van de bodem kunnen immers sneller wijzigen dan chemisch of
fysische eigenschappen van de bodem (Gomez et al., 2006). Tijdens de incubatie in de glazen potten
kunnen de eigenschappen van de bodem veranderen (bijv. afname van organisch materiaal) en
bijgevolg een verschuiving in de populatie veroorzaken. Een andere reden voor het verschil zou de
eventueel lichtjes uiteenlopende omstandigheden tijdens de incubatie van de MicroPlates™ kunnen
zijn. Na vier weken was de temperatuur wat lager gedurende de incubatie van de MicroPlates™ en
omdat Biolog een cultuur gebaseerde techniek is, kan de temperatuur een invloed uitoefenen op de
groeiende populatie (Preston-Mafham et al., 2002). Het loont de moeite om het metabolisch profiel
van de bacteriële populaties na te gaan op niet geïncubeerde bodems.
De gronden waren ook te onderscheiden op basis van het metabolisch profiel van de
schimmelpopulatie. De schimmelpopulatie van PSKW had een significant lagere AWCD en diversiteit
in gebruikte koolstofbronnen dan deze van PCG bodem. Dit staat echter lijnrecht tegenover de
hogere totale gehaltes van geëxtraheerde PLFA’s en biomerkers voor schimmels (C18:2(n-6) en
C18:1’9c) in PSKW bodem. De gehaltes van PLFA waren in PSKW, ook na behandeling met Lignosol,
opmerkelijk hoger dan in PCG bodem met Lignosol. Dit zou kunnen aantonen dat er in PSKW een
grotere populatie van schimmels aanwezig was, maar dat de variatie in soorten en functioneel
vermogen van de organismen kleiner was. De populatie in PCG bodem kan kleiner in omvang zijn,
maar bestaan uit een grotere diversiteit aan individuen die een breder metaboliseringsprofiel
hebben.
Verschuivingen in de microbiële populatie na toediening van Lignosol en Miscanthus
De AWCD van de bacteriële populatie bleek meer verhoogd te worden bij behandeling met Lignosol
en Miscanthus in de grond met grootste potentieel (PCG) dan in PSKW. De behandeling met Lignosol
zorgde in PCG bodem voor de grootste verhoging van de AWCD en Miscanthus zorgde voor een
intermediaire stijging. In PSKW zorgde enkel Lignosol voor een verhoging van de AWCD na twee
weken incubatie. Na vier weken waren er geen significante verschillen meer in AWCD van de
verschillende behandelingen in PSKW bodem. De AWCD bleek overeen te komen met een
succesvolle bestrijding. Na twee weken werd bij de behandeling met Lignosol in PSKW bodem een
significante toename aan Trichoderma spp. waargenomen, meer afgedode scleroten en tevens een
hogere AWCD. Na vier weken werd geen significante Trichoderma spp. toename geobserveerd en
tevens geen verschillen in AWCD. Ook in PCG bodem werd deze correlatie teruggevonden. De
toename aan Trichoderma lijkt samen te gaan met een metabolisch actievere bacteriële populatie.
Nauwe interacties tussen Trichoderma en bacteriën zijn reeds beschreven (Hoppener-Ogawa et al.,
2009; Kwok et al., 1987). In het algemeen bestaat er een nauwe samenwerking tussen schimmels en
bacteriën voor nutriënten, waarbij schimmels de complexe moleculen afbreken en de intermediairen
voor bacteriën nalaten (de Boer et al., 2005).
61
De AWCD van de bacteriële populatie is echter geen sluitende indicator voor een hogere afdoding
van de scleroten en het parasitisme met Trichoderma. In PCG was het parasitisme met Trichoderma
hoger bij Miscanthusbehandeling, hoewel de AWCD enkel bij Lignosolbehandeling significant hoger
was. De AWCD kan zijn kracht als indicator missen omdat een gelijke AWCD helemaal geen gelijk
metabolisch profiel betekent. Binnen een even hoge AWCD kunnen immers verschuivingen optreden
in het gebruik van verschillende bronnen (Preston-Mafham et al., 2002).
De bacteriële populatie na behandeling met Lignosol onderscheidde zich ook door een toename in de
diversiteit van gebruikte bronnen. Na behandeling met Lignosol en Miscanthus in PCG bodem werd
een hoger verbruik van de bronnen α-cyclodextrine, glycogeen, D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside
waargenomen. In PSKW werd dezelfde verschuiving gezien bij Lignosolbehandeling. De populatie van
de onbehandelde PCG bodem had na twee weken ook een hoger verbruik van deze bronnen.
Glycogeen en α-cyclodextrine zijn beide verbonden aan het metabolisme van zetmeel. Glycogeen is
de niet-plantaardige variant van zetmeel en tevens een α-(1-4) verbonden glucose polymeer (Wang
en Wise, 2011). α-Cyclodextrine is een cyclisch oligosacharide dat aangemaakt wordt tijdens de
afbraak van zetmeel (glycogeen) door het enzym cyclodextrine glycosyltransferase (Del Valle, 2004).
D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside zijn daarentegen verbonden aan het metabolisme van
cellulose. D-cellobiose is een β-gebonden dissacharide dat overblijft na de eerste afbraak van
cellulose en kan enkel bacterieel worden gesplitst (Lynd et al., 2002). Voor de afbraak van cellobiose
tot glucose zijn β-glucosidases als katalysator vereist. Die enzymen zijn ook in staat andere
glucosides, zoals β-methyl-D-glucoside te splitsen (Woodward, 1982). De afbraak van cellulose is
vaak een zaak van gespecialiseerde organismen (Lynd et al., 2002). De toevoeging van organisch
materiaal zorgt voor een verhoogde beschikbaarheid van cellulose en stimuleert dus specifiek die
organismen die cellulose kunnen afbreken. Door het specifiek metabolisme van cellulose-afbrekers,
kan een toename van die organismen gezien worden in een shift in de populatie. Dit kan tevens de
toename in diversiteit van aangewende bronnen verklaren.
De PLFA analyse wees op een toename van schimmels in de bodems behandeld met Lignosol en
Miscanthus. Schimmels kunnen meer cellulose vrijstellen uit het lignocellulosecomplex en
beschikbaar maken voor bacteriën (Lynd et al., 2002). Debode et al. (2005) namen waar dat de
werking van ingewerkte gewassen met hoog lignine gehalte niet uitsluitend aan de lignine te danken
was, maar versterkt werd door de aanwezigheid van cellulose en andere koolwaterstoffen. Er wordt
aangenomen dat die koolwaterstoffen de motor vormen van de afbraak van lignine aangezien zij de
activiteit, de overleving en de groei van witrotters bevorderen (Butler et al., 2005). Daarenboven
stimuleert de niet-ligninefractie ook het algemeen bodemleven. De stijging in het verbruik van
andere suikers, zoals xylose, zou kunnen verklaard worden aan de hand van de verhoogde
hemicellulosefractie. Deze is echter minder consistent in samenstelling en kan dus minder de bron
van een goede indicator voor de lignine-effectiviteit vormen.
Het belang van individuele bronnen als eigenschap van de bodempopulatie dient echter gematigd te
worden aangezien de bronnen in Biolog MicroPlates™ niet helemaal accuraat de substraten uit
ecosystemen weerspiegelen (Gomez et al., 2006). De analysemethode laat wel toe de relatieve
metabolische veranderlijkheid van de microbiële populatie weer te geven. Metabolische profilering is
geen methode om de karakteristieken van een populatie te bepalen, maar kan wel dienen voor het
vergelijken met andere populaties (Preston-Mafham et al., 2002).
62
Het metabolisch profiel van de schimmelpopulaties na behandeling met Lignosol of Miscanthus in
PCG bodem was niet te onderscheiden aan de hand van de FF MicroPlates™. Enkel de behandeling
met Lignosol in PSKW zorgde voor een verhoogde AWCD, diversiteit en een verschuiving in het
metabolisch profiel. Die verschuiving is grotendeels te wijten aan de gestegen diversiteit en
verbruiksniveau van de koolstofbronnen. Dat dit enkel in PSKW waar te nemen is, kan te wijten zijn
aan de zeer nauwe populatie van schimmels die in deze bodem aanwezig is. Door het eng
metabolisch spectrum van de schimmelpopulatie heeft deze net nog ruimte om te reageren op de
behandeling.
De PLFA extractie lijkt de veronderstelling dat er in PCG geen shift in de gemeenschap van schimmels
plaatsvond echter niet te ondersteunen omdat ook in PCG bodem bij Lignosol- en
Miscanthusbehandeling een verschuiving in gehaltes aan biomerkers voor schimmels voorviel. Het
gehalte aan biomerker C18:2(n-6) nam toe zowel in PSKW als in PCG bodem en na Lignosol- of
Miscanthustoediening. In PCG bodem zou het gehalte aan schimmels kunnen toegenomen zijn
zonder dat hierbij nog een uitbreiding van het metabolisch spectrum plaatsvond. Hieruit kan
besloten worden dat de FF MicroPlates™ niet toelaten op voldoende significante wijze veranderingen
in de schimmelpopulatie aan te geven.
Hoewel er geen specifieke profilering optrad in de FF MicroPlates™, werd aangetoond dat een
schimmelpopulatie met breed metabolisch profiel beter toelaat om R. solani te bestrijden. In het
afwijkend staal van PCG bodem met Miscanthus, waar een opmerkelijk lager aantal koolstofbronnen
gemetaboliseerd werden, werd minder parasitisme vastgesteld. De diversiteit en AWCD van de
schimmelpopulatie kunnen zodoende wel optreden als een mogelijk kenmerk van bodems met
hogere potentiële weerbaarheid. Er wordt echter aangenomen dat bij het verhogen van het
organisch materiaal in de bodem de enzymatische activiteit toeneemt in elke bodem (Hu et al.,
2010). Dit ontkracht de geschiktheid van de AWCD om een indicator te zijn voor de
lignine-effectiviteit van de bodem. Een voldoende hoge AWCD –zowel voor bacteriën als schimmelskan daarentegen wel een voorwaarde vormen opdat ligninebronnen zouden werken.
De incorporatie met Lignosol verhoogde de totale hoeveelheid PLFA’s. Dit is, naast de verhoogde
AWCD, een extra aanwijzing van het pathogeen-onderdrukkend effect via een stimulus van het totale
microbiële bodemleven. In de literatuur wordt echter de effectiviteit van een niet-specifieke
populatie ter onderdrukking van R. solani in twijfel getrokken (Bonanomi et al., 2010). De intensiteit
van de algemene weerbaarheid is sterk gelinkt aan het fenomeen fungistasis (Termorshuizen en
Jeger, 2008). Fungistasis is ongustig voor de meeste plantpathogenen aangezien zij meestal zwakke
saprofyten zijn (Garbeva et al., 2011). R. solani is echter een pathogeen met een sterk saprofytisch
vermogen en is daarom minder onderhevig aan fungistasis (Sneh et al., 1996). Er werd echter wel
reeds een onderdrukking van R. solani gerapporteerd die veroorzaakt leek door fungistasis (Garbeva
et al., 2011). In de bacteriële populatie werd een verhoogde diversiteit van het metabolisme
vastgesteld. Dit stelt de bacteriën beter in staat om de omgeving te ledigen van nutriënten en bij te
dragen aan fungistasis (Garbeva et al., 2011). De specifieke weerbaarheid wordt tevens versterkt
door een sterk aanwezige totale microbiële populatie.
63
Het is echter opvallend dat in beide bodems dezelfde verhoging aan PLFA’s en verschuiving in
samenstelling plaatsvonden, maar dat dit samenging met uiteenlopende resultaten in de
levensvatbaarheid en parasitisme van de scleroten. Het totale bodemleven is niet de enige
bepalende factor voor fungistasis. In een aantal recente artikels werd aangetoond dat er verschillen
zijn tussen de bijdrage van de leden van de bodemgemeenschap aan fungistasis (Garbeva et al.,
2011). De microbiële populatie die voor de incorporatie van ligninebronnen aanwezig is, kan dus van
belang zijn.
De analyse van de geëxtraheerde PLFA’s toonde aan dat de behandeling met Lignosol voornamelijk
een toename in biomerker C18:2(n-6) betekende die ten koste ging van het aandeel aan de
universele biomerker C16:0. De biomerker C18:2(n-6) is dominant bij de meeste schimmels, maar het
aandeel van deze PLFA in het membraan van basidiomyceten (gemiddeld 62%) is doorgaans hoger
dan bij andere schimmels (bijv. ascomyceten: 47%) (Stahl en Klug, 1998; Larsen et al., 1998). De
verhoging van het aandeel C18:2(n-6), die niet volledig samen ging met de verhoging in de andere
biomerker voor schimmels (C18:1’9c), wijst in de richting van een verhoogde aanwezigheid van
basidiomyceten en ondersteunt de lignine-melanine hypothese. In voorgaand onderzoek werd bij de
toevoeging van puur lignine een analoge verhoging van deze biomerker waargenomen die bovendien
samen ging met verhoogde productie van het enzym Mn-peroxidase (Van Beneden, 2009). De
verhoging van biomerker C18:2(n-6) ondersteunt de lignine-melanine hypothese, maar is niet
voldoende als bewijs voor de hypothese. Via uitplating op selectieve media zou kunnen bevestigd
worden dat witrotters effectief gestimuleerd werden (Thorn et al., 1996). De capaciteit van
witrotters om fungaal melanine af te breken verschilt van soort tot soort (White en Traquair, 2006).
Lignine kan in beide gronden verschillende soorten basidiomyceten stimuleren met verschillende
capaciteit in afbraak van melanine. De karakteristatie van de witrotters kan mogelijks de
verschillende werkzaamheid in de bodems PCG en PSKW verklaren. Sommige lignocellulolytische
basidiomyceten staan ook bekend als mycoparasieten (White en Traquair, 2006).
Het verhoogd aandeel van biomerker C18:2(n-6) zou ook kunnen verklaard worden door aan een
direct stimulerend effect van Lignosol en Miscanthus op de schimmelpopulatie in het algemeen. Per
individu kunnen schimmels een aanzienlijk grote bijdrage leveren in het totaal gehalte aan PLFA’s.
Schimmels kunnen gestimuleerd worden door de verhoogde fractie aan complexe moleculen die
door bacteriën niet af te breken zijn (de Boer et al., 2005). De toename van schimmels kan
bijvoorbeeld deze van de ascomyceet Trichoderma inhouden. De incorporatie van producten met
hoge C/N ratio, zoals ook verondersteld wordt van Lignosol en Miscanthus, toonde reeds een
stimulatie van de kieming van Trichoderma sporen (Gao et al., 2007). Nelson et al. (1993) nam ook
reeds de stimulatie van T. hamatum waar in een ligninerijke omgeving. De verhoogde aanwezigheid
van biomerker C18:2(n-6) in PCG bodem met Miscanthusbehandeling na vier weken incubatie
correleerde dan ook met het lage percentage levensvatbare scleroten en hoog gehalte aan
Trichoderma.
De verschuivingen binnenin groepen die toegekend zijn aan een bepaalde biomerker kunnen ook aan
de basis liggen van de verschillen in parasitisme. De Gram negatieve bacteriën lijken na incorporatie
van de ligninebronnen lichtjes toe te nemen en de Gram positieve lichtjes af. De beperkte
verschuiving van de groepen bacteriën betekent echter niet dat binnenin deze grote groepen geen
verschuivingen kunnen hebben plaatsgehad (Zelles, 1999).
64
Voor de analyse van de data van de PLFA’s werden slechts 7 biomerkers weerhouden die in beide
bodems ongeveer 70% van de totale geëxtraheerde PLFA’s uitmaakten. Zelles (1999) geeft aan dat
hoe groter het aantal ingesloten PLFA’s, hoe beter de identificatie van organismen is in de hele
gemeenschap. Voor de analyse van twee weken gaven extra ingesloten biomerkers geen
verschillende uitsplitsing en bij vier weken zorgden enkele biomerkers voor variatie die niet te wijten
was aan de behandeling. Deze werden uit de analyse geweerd. Het was overigens niet het doel om te
differentiëren tot op soortsniveau, maar om de verschuivingen in samenstelling van de populatie na
te gaan. In voorgaande PLFA analyses van het effect van lignine-incorporatie werden 17 merkers
weerhouden (Van Beneden, 2009). In die studie werd echter gewerkt met vollevelds gronden, terwijl
de gronden uit voorliggend werk kwamen uit serres. In serres wordt regelmatig ontsmet en samen
met de intensieve productieomstandigheden zorgt dit voor een verminderde diversiteit aan
microbieel bodemleven (Paulitz en Belanger, 2001; Roobroek, persoonlijke communicatie). Fumigatie
met chloroform kan de totale fractie aan PLFA’s halveren (Zelles, 1999). De lagere biodiversiteit die
terug te vinden is in serrebodems is misschien een verklaring waarom in deze proef geen biomerkers
voor Actinomyceten teruggevonden werden, terwijl in de vorige studie Actinomyceten net
gestimuleerd werden door de incorporatie van lignine (Van Beneden, 2009). Actinomyceten lijken
niet aanwezig te zijn in de serregronden en kunnen bijgevolg ook niet gestimuleerd worden door
ligninebronnen.
Een analyse van de abiotische parameters van de bodems van PSKW en PCG zou tevens nuttig zijn.
De zuurtegraad beïnvloedt bijvoorbeeld in sterke mate de samenstelling en werkzaamheid van de
populatie. Bij lage pH worden schimmels tegenover bacteriën bevoordeeld en bij hoge pH hebben
witrotters een hoger vermogen om complexe moleculen af te breken (Rousk et al., 2009; Okeke et
al., 1996). Thevenot et al. (2010) vermeldt een optimale lignineafbraak door witrotters bij pH 5. Het
zou interessant zijn om te kijken wat de pH van deze grond is voor behandeling en hoe deze
evolueert na toediening. In een bodem met hoger kleigehalte is de afbraak van lignine trager dan bij
grove textuur. De bodem van PCG heeft een grovere textuur (zand) dan PSKW (zandleem), en kan
zodoende een snellere lignine afbraak toelaten (Thevenot et al., 2010). Daarnaast zou een
karakterisatie van de Trichoderma spp. die optreden in beide bodems ook waardevolle informatie
verstrekken over de verschillen in de bodems. Niet alle Trichoderma spp. bezitten immers dezelfde
parasitaire capaciteiten (Schuster en Schmoll, 2010).
Invloed van de tijd na incorporatie
In deze studie werd voor het eerst het effect van incorporatie van ligninerijke bronnen na een
periode van 2 weken nagegaan. Na twee weken incubatie werd in PCG bodem reeds de start van een
verhoogd parasitisme door Trichoderma na behandeling met Miscanthus of Lignosol waargenomen,
maar dit resulteerde in een zeer beperkte afname in de levensvatbaarheid van de scleroten. Na vier
weken waren de percentages parasitisme veel hoger en de overleving van de scleroten veel lager. Liu
et al. (2009) noteerden na 20 dagen incubatie van R. solani scleroten met Trichoderma virens 97.5%
levensvatbare scleroten en na 40 dagen nog 76%. Deze resultaten tonen aan dat Trichoderma
voldoende tijd moet krijgen om een effect te kunnen vertonen op de scleroten. Organische
bodemsupplementen worden in optimale omstandigheden in 1 tot 3 weken afgebroken en in 3 tot 7
weken minder gunstige omstandigheden. Deze afbraakperiode is nodig alvorens ze een bijdrage
kunnen leveren aan de bodemweerbaarheid (Croteau en Zibilske, 1998).
65
Na twee weken werd in PCG bodem behandeld met Lignosol ook een hoog percentage parasitisme
door Mucorales vastgesteld. De toename aan Mucorales draagt niet veel bij in het afdoden van
scleroten van R. solani. Trichoderma spp. zijn daarentegen veel efficiëntere parasieten en worden als
zodanig veel vaker gerapporteerd (Schuster en Schmoll, 2010; Hoffmann en Voigt, 2009). Mucorales
staan bekend als r-organismen die profiteren van een snelle vermenigvuldiging bij optimale
omstandigheden, zoals vlak na de toevoeging van organisch materiaal (de Boer et al., 2005). Na enige
tijd kunnen meer competitieve schimmels, zoals Trichoderma spp. overnemen (de Boer et al., 2005).
Hieruit zou besloten kunnen worden dat het voordelig kan zijn een wachtperiode tussen het
toedienen van een ligninebron en het planten van de sla in te lassen. Na twee weken is er nog veel
interferentie met de Mucorales. Sommige Mucorales bezitten mycoparasitaire eigenschappen, maar
er zijn naar onze kennis geen gegevens beschikbaar over parasitisme op R. solani (Hoffmann en
Voigt, 2009).
Verschillen tussen behandeling met Lignosol en Miscanthus.
Lignosol bleek het duidelijkste effect op de bodempopulatie te hebben. In beide bodems nam bij
Lignosolbehandeling de AWCD en diversiteit van de gebruikte stoffen voor het bacterieel
metabolisme toe. Lignosol veroorzaakte dezelfde verhoging van AWCD en diversiteit in de
schimmelpopulatie van PSKW bodem. De variatie tussen de stalen behandeld met Lignosol was
daarenboven altijd klein, wat wijst op een consistent effect.
De behandeling met Miscanthus resulteerde vaak in een verschuiving die dezelfde richting uit ging als
bij Lignosol, maar niet zo ver gevorderd was. Miscanthus zorgde bijv. in beide bodems voor een veel
kleinere toename in de totale hoeveelheid geëxtraheerde PLFA’s dan bij Lignosol. De bodems
behandeld met Miscanthus na twee weken incubatie hadden een intermediaire positie tussen de
controle en Lignosol qua gehalte biomerker C18:2(n-6). Na vier weken was het gehalte bij
behandeling met Lignosol en Miscanthus gelijk. De behandeling met Miscanthus kan dus meer tijd
nodig kan hebben vooraleer effecten kunnen optreden. Dit zou verklaard kunnen worden door de
vorm van het toegediend product. Lignosol is een poederachtig product dat gemakkelijk uniform te
verdelen is in de bodem en heeft een hoge actieve oppervlakte. Miscanthus daarentegen werd
toegediend als gedroogde vezels die veel minder toegankelijk zijn en een kleinere actieve
oppervlakte hebben. Organismen hebben meer tijd nodig om toegang te krijgen tot het organisch
materiaal aangebracht via Miscanthus. De effecten van beide producten kunnen ook differentiëren
omwille van de verschillende vorm van lignine. Debode et al. (2005) namen een verschillende
werking van lignine op Verticilium longisporum waar naar gelang het type gewas en het type
gebruikte lignine. Miscanthus is een gras en de lignine geproduceerd door grassen zijn verschillend
van deze uit dicotyle gewassen (Thevenot et al., 2010). Ook de verschillende gehaltes aan
(hemi)cellulose kunnen verschillende reacties uitlokken.
66
De variabiliteit in de resultaten na Miscanthus incorporatie was groot. Een vezelige stof is moeilijker
uniform in de bodem te verdelen. Er kan een grote variabiliteit ontstaan tussen bodemdelen die
dicht tegen de Miscanthusdeeltjes liggen en zij die verder verwijderd zijn. De afbraak van cellulose is
immers vaak een oppervlakteverbonden proces en de microbiële populatie die niet verbonden is met
dat oppervlak kan volledig verschillen van deze aan het oppervlak (Lynd et al., 2002). Miscanthus lijkt
de diversiteit in gebruikte koolstofbronnen door bacteriën -maar vooral door schimmels- te
onderdrukken. De reden hiervoor werd niet nader onderzocht.
Welke bron van lignine gebruikt werd, bleek reeds uit ander onderzoek de effectiviteit als
beheersingsmiddel tegen R. solani niet veel te beïnvloeden. Tenminste wanneer deze in een bodem
die reactie toelaat toegevoegd werd. Onderzoek aan het lab van fytopathologie toonde reeds de
effectiviteit van kokosnootresten, vlasvezels en houtsnippers aan (Van Beneden, 2009; Hua,
persoonlijke communicatie). De initiële reactie van de bodempopulatie, vooraleer de lignine
afbrekers gestimuleerd worden, leek wel te verschillen naargelang van de gebruikte bron. Hout- en
vlasvezels bleken bij een dosis van 5% de levensvatbaarheid van de scleroten significant terug te
dringen en ook een verhoging in de biomerker C18:2(n-6) te induceren. Bij het incorporeren van 1%
werden geen significante resultaten waargenomen (Van Beneden, 2009). Het behandelen met 1%
Lignosol of Miscanthus gaf echter wel al significante resultaten in PCG bodem. Van Beneden voerde
bovenstaand beschreven experiment uit in de bodem waar voorheen ook slechtere resultaten
bekomen werden na lignine incorporatie. Een hogere dosis zou dus ook een goede werking in
bodems met minder potentieel kunnen betekenen. De producten Lignosol en Miscanthus lijken
alvast veelbelovend en zijn economisch ook interessant. De prijs van Lignosol bedraagt ongeveer
1 EUR kg-1. Wanneer men 1% lignosol zou inbrengen in de bovenste 10 cm van de bodem, zou men
1.4 kg m-2 nodig hebben, met een kost van 1.4 EUR m-2. De kost van bodemontsmetting met bijv.
Monam ligt rond 0.9 EUR m-2 (França, persoonlijke communicatie). Miscanthus is te verkrijgen voor
een kost van 100 EUR ton-1. Dit zou neerkomen op een prijs van 0.14 EUR m-2 bij aanwending van 1%
in de bovenste 10 cm van de bodem en dus zou dit slechts een beperkte investering vragen van de
landbouwer.
Besluit
De bevindingen uit deze analyses kunnen gebruikt worden in de zoektocht naar een indicator voor de
bodemweerbaarheid en de lignine-effectiviteit van de bodem. Via modelleringstechnieken kan men
aan de hand van de meest voorname parameters een bodemweerbaarheidsindex ontwikkelen. Het
verhoogd bacterieel metabolisme van de stoffen α-cyclodextrine, glycogeen, D-cellobiose en
β-methyl-D-glucoside zou een dergelijke indicator kunnen zijn voor bodems met verhoogde
weerbaarheid na ligninetoediening. De AWCD en diversiteit van de schimmelgemeenschap kunnen
een andere aanwijzing vormen voor bodems met verhoogde lignine-effectiviteit en weerbaarheid. De
initiële samenstelling van de bodempopulatie a.d.h.v. PLFA biomerkers kan tevens interessante
informatie verstrekken over het potentieeel van de bodems. De karakterisatie en concentratie van
witrotters en Trichoderma spp. zouden een aanvullende piste kunnen zijn voor het vinden van een
goede indicator. De uitgevoerde proef keek enkel naar de interacties tussen de pathogeen en de
microbiële bodempopulatie, terwijl de plant ook een fel aanwezige actor is. De rol van de plant in de
werking van ligninebronnen en weerbaarheid dient ook nog verder onderzocht te worden.
67
5. Algemene conclusies
Het natuurlijk inoculum van R. solani kon geëvalueerd worden aan de hand van de in deze thesis
voorgestelde biotest. De eenvoudige constructie maakt de test gemakkelijk toegankelijk voor telers
en geeft hen de mogelijkheid hun beheersingsmethoden aan te passen aan informatie uit de biotest.
De test is echter onvoldoende om specifiek R. solani te capteren, maar telers zijn vaak meer
geïnteresseerd in een overzicht van alle bodempathogenen. Voor een goede afstelling en
interpretatie van de test, dienen meer gronden getest te worden en dienen de resultaten
gekwantificeerd te worden via metingen van de R. solani densiteit met andere methodes.
De test leek ook in staat verschillen in bodemweerbaarheid te kunnen detecteren. Bodems met
verschillende voorbehandeling (Monam, Herbie, Onbehandeld) en sterilisatie hadden een
verschillende snelheid van het ziekteverloop. Er dient nog verder nagegaan te worden in welke mate
deze snelheid overeenkomt met de bodemweerbaarheid en met de ziekte op levende planten. De
inoculatie met 0.25 korrel 100ml-1 bodem lijkt een geschikte pathogeendruk te geven om verschillen
tussen bodems op te meten.
Bij het testen van de ligninerijke producten werd gezien dat Lignosol werkingsmechanismen zou
kunnen hebben die niet vallen binnen de lignine-melanine hypothese. Lignosol vertraagde in
beperkte mate de groei van R. solani en zou dus kunnen bijdragen aan fungistasis (Garbeva et al.,
2011). De kieming van scleroten leek ook gestimuleerd te worden door Lignosol waardoor scleroten
afgezwakt worden en antagonisten gestimuleerd kunnen worden. Er dient nog gekeken te worden of
Miscanthus en Sappi-Out ook dergelijke mechanismen ondersteunen.
De toediening van Lignosol en Sappi-Out in een serrebodem resulteerde niet in verschillen in
ziektebeheersing en levensvatbaarheid van de scleroten. Er werden echter wel significante
verschillen waargenomen in de gehaltes parasitisme van de scleroten. De beperkte effectiviteit kan
verklaard worden door de lage dosis (0.5%), de korte tijd tussen het toepassen en het planten van de
sla en de intrinsieke capaciteit van de bodem om te reageren op ligninebronnen.
In het potexperiment met Lignosol en Miscanthus (1%) werd in de grond met hoge lignineeffectiviteit (PCG) een significante verhoging van het parasitisme door Trichoderma spp. en een
afname van de levensvatbaarheid van de scleroten waargenomen. Dit was niet het geval in de
andere grond (PSKW). De onbehandelde bodem van PCG onderscheidde zich van PSKW door een
schimmelpopulatie met een diverser en hoger metabolisme. Het bacterieel metabolisme verschilde
niet in niveau en diversiteit maar wel in samenstelling tussen beide bodems. De gebruikte
koolstofbronnen varieerden echter snel gedurende de incubatieperiode. De bacteriële populatie van
PCG bodem leek reeds een hoger verbruik te hebben van de bronnen α-cyclodextrine, glycogeen,
D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside. Het totaal van geëxtraheerde PLFA’s verschilde eveneens niet
tussen de onbehandelde bodems, maar de bodem van PSKW had een hogere proportie van merkers
voor Gram negatieve bacteriën en schimmels, tegenover een hogere proportie van de universele
biomerker in de PCG bodem.
68
De behandeling met Lignosol en Miscanthus resulteerde in PCG bodem in duidelijke verschuivingen
in de microbiële populatie. In PSKW bodem veroorzaakte enkel Lignosol dergelijke verschuivingen.
Het metabolisch profiel van de bacteriële populatie toonde een hoger verbruik van de bronnen
α-cyclodextrine, glycogeen, D-cellobiose en β-methyl-D-glucoside. De verschuiving in PLFA proporties
was niet bodemafhankelijk en toonde een verhoogd gehalte van biomerkers voor schimmels na
aanwending van Miscanthus en Lignosol. De toename van het aandeel schimmels is een bevestiging
van de eerder gevonden verschuiving in de populatie na het toevoegen van ligninerijke bronnen en
zou kunnen verklaard worden door de toename van lignine afbrekende basidiomyceten (Van
Beneden, 2009).
Van Beneden toonde de werkzaamheid van ligninebronnen aan in volleveldsgronden. Voorliggende
studie toonde dat ligninebronnen eveneens effectief kunnen zijn in serregronden. De meting na twee
weken onthulde dat Lignosol sneller en consistenter verschuivingen veroorzaakte in de samenstelling
van de microbiële bodempopulatie en in het parasitisme van de scleroten dan Miscanthus. Na twee
weken was er echter interferentie met organismen die niet langer waarneembaar waren na vier
weken. Dit wijst op een afwijkend starteffect. Pas na vier weken incubatie was het terugdringen van
de levensvatbaarheid van de scleroten van een grootteorde waar telers tevreden mee zouden zijn.
Vooraleer echte conclusies kunnen getrokken worden, dienen de resultaten gevalideerd te worden
aan een grotere set van bodems met verschillende lignine-effectiviteit. Pas dan zal blijken of het
verhoogd bacterieel metabolisme van de bronnen α-cyclodextrine, glycogeen, D-cellobiose en
β-methyl-D-glucoside en het diverser metabolisme van de schimmelpopulatie effectief als indicator
voor bodems met goede lignine-effectiviteit kunnen gezien worden. De analyse van meer bodems
zou ook toelaten om kenmerken te bepalen waarmee de lignine-effectiviteit van bodems geschat kan
worden vóór de behandeling. Het bepalen van de abiotische kenmerken, zoals pH en textuur, en de
soorten Trichoderma en witrotters in de bodem zou tevens waardevolle informatie kunnen
opleveren.
69
6. Referenties

























Agrios, G.N. (2005) Plant Pathology. Fifth edition. Burlington, Elsevier Academic Press, 922p.
Aliferis, K.A.; Jabaji, S. (2010) Metabolite Composition and Bioactivity of Rhizoctonia solani Sclerotial Exudates. Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 58: 7604 - 7615.
Anees, M.; Tronsmo, A.; Edel-Hermann, V.; Gautheron, N.; Faloya, V.; Steinberg, C. (2010) Biotic changes in relation to
local decrease in soil conductiveness to disease caused by Rhizctonia solani. European Journal of Phytopathogy, 126:
29 - 41.
Baker K.F.; Cook R.J. (1974) Biological Control of Plant Pathogens. San Francisco: Freeman, 433 pp.
Baldrian, P.; Snajdr, J. (2006) Production of ligninolytic enzymes by litter-decomposing fungi and their ability to
decolorize synthetic dyes. Enzyme and Microbial Technology, 39: 1023 - 1029.
Bellamy, K.L.; Chong, C.; Cline, R.A. (1995) Paper sludge utilization in agriculture and container nursery culture. Journal
of Environmental Quality, 24: 1074 - 1082.
Bonanomi, G.; Antignani, V.; Capodilupo, M.; Scala, F. (2010) Identifying the characteristics of organic soil amendments
that suppress soilborne plant diseases. Soil Biology and Biochemistry, 42: 136 - 144.
Boonekamp, G. (2011) Weerbaarheid plant begint bij de wortels. Groenten en Fruit. 5 mei, p32 - 33.
Brohon, B.; Delolme, C.; Gourdon, R. (1999) Qualification of soils through microbial activities measurements: Influence
of the storage period on INT-reductase, phosphatase and respiration. Chemosphere, 38: 1973 - 1984.
Budge, G.E.; Shaw, M.W.; Colyer, A.; Pietravalle, S.; Boonham, N. (2009) Molecular tools to investigate Rhizoctonia
solani distribution in soil. Plant Pathology, 58: 1071 - 1080.
Bugg, T.D.H.; Ahmad, M.; Hardiman, E.M.; Singh, R. (2011) The emerging role for bacteria in lignin degradation and bioproduct formation. Current Opinion in Biotechnology, 22: 394 - 400.
Butler, M.J.; Gardiner, R.B.; Day, A.W. (2005) Degradation of melanin or inhibition of its synthesis: are these a
significant approach as a biological control of phytopathogenic fungi? Biological Control, 32: 326 – 336.
Coley-Smith J.R. en Cooke R.C. (1971) Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology,
9: 65 - 92.
Croteau, G.A.; Zibilske, L.M. (1998) Influence of papermill processing residuals on saprophytic growth and disease
caused by Rhizoctonia solani. Applied Soil Ecology, 10: 103 - 115.
D'aes, J.; Gia, K.H.H.; De Maeyer, K.; Pannecoucque, J.; Forrez, I.; Ongena, M.; Dietrich, L.E.P.; Thomashow, L.S.;
Mavrodi, D.V.; Hofte, M. (2011) Biological Control of Rhizoctonia Root Rot on Bean by Phenazine- and Cyclic
Lipopeptide-Producing Pseudomonas CMR12a. Phytopathology, 101: 996 - 1004.
DeAngelis, K.M.; Allgaier, M.; Chavarria, Y.; Fortney, J.L.; Hugenholtz, P.; Simmons, B.; Sublette, K.; Silver, W.L.; Hazen,
T.C. (2011) Characterization of trapped lignin-degrading microbes in tropical forest soil. PlosONE, 6: 1 - 9.
de Boer, W.; Folman, L.B.; Summerbell, R.C.; Boddy, L. (2005) Living in a fungal world: impact of fungi on soil bacterial
niche development. Fems Microbiology Reviews, 29: 795 - 811.
De Corato, U.; Sharma, N.; Maccioni, O.; Zimbardi, F. (2011) Suppressiveness of steam-exploded biomass of Miscanthus
sinensis var. giganteus against soil-borne plant pathogens. Crop Protection, 30: 246 - 252.
Debode, J.; Clewes, E.; De Backer, G.; Hofte, M. (2005) Lignin is involved in the reduction of Verticillium dahliae var.
longisporum inoculum in soil by crop residue incorporation. Soil Biology and Biochemistry, 37: 301 - 309.
De Langhe, T. (2011) Biologische bestrijding van Rhizoctonia solani in de slateeld met behulp van vlaslemen en
Pseudomonas CMR12a. Masterthesis voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bioingenieurswetenschappen: Landbouwkunde. Universiteit Gent, p69.
Del Valle, E.M.M. (2004) Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochemistry, 39: 1033 - 1046.
Druzhinina, I.S.; Kopchinskiy, A.G.; Kubicek, C.P. (2006) The first 1000 Trichoderma species characterized by molecular
data. Mycoscience, 47: 55 - 64.
Falcon, M.A.; Rodriquez, A.; Carnicero, A; Regalado, V.; Perestelo, F.; Milstein, O.; Delefuente, G. (1995) Isolation of
microorganisms with lignin transformation potential from soil of Tenerife Island. Soil Biology and Biochemistry, 27: 121
- 126.
Faltin, F.; Lottmann, J.; Grosch, R.; Berg, G. (2004) Strategy to select and assess antagonistic bacteria for biological
control of Rhizoctonia solani Kuhn. Canadian Journal of Microbiology, 50: 811 - 820.
Fiddaman, P.J.; Rossall, S. (1995) Selection of bacterial antagonists for the biological control of Rhizoctonia solani
in oilseed rape (Brassica napus ). Plant Pathology, 44: 695 - 703.
70


























Fiddaman, P.J. ; O'Neill, T.M.; Rossall, S. (2000) Screening of bacteria for the suppression of Botrytis cinerea and
Rhizoctonia solani on lettuce (Lactuca sativa) using leaf disc bioassays. Annuals of Applied Biology, 137: 223 - 235.
França, S.C. (2011) Beheersing van Rhizoctonia solani bij bladgewassen door het bevorderen van de
bodemweerbaarheid, Voorgangsverslag IWT november 2011. Ugent, p13.
Fravel, D.R. (2005) Commercialization and implementation of biocontrol. Annual Review of Phytopahtology, 43: 337 359.
Fytoweb, Lijst geregistreerde producten, http://www.fytoweb.fgov.be/Xls/StofNl.txt, geraadpleegd op 24/12/2011.
Garbeva, P.; Hol, W.H.G.; Termorshuizen, A.J.; Kowalchuk, G.A.; de Boer, W. (2011) Fungistasis and general soil
biostasis - A new synthesis. Soil Biology and Biochemistry, 43: 469 - 477.
Garland, J.; Mills, A.L. (1991) Classification and Characterization of Heterotrophic Microbial Communities on the Basis
of Patterns of Community-Level Sole-Carbon-Source Utilization. Applied and Environmental Biology, 57: 2351 - 2359.
Gomez, E.; Ferreras, L.; Toresani S. (2006) Soil bacterial functional diversity as influenced by organic amendment
application. Bioresource Technology, 97: 1484 – 1489.
Grosch, R.; Scherwinski, K.; Lottmann, J.; Berg, G.(2006) Fungal antagonists of the plant pathogen Rhizoctonia solani:
selection, control efficacy and influence on the indigenous microbial community. Mycological research, 110: 1464 1474.
Grosch, R.; Schneider, J.H.M.; Peth, A.; Waschke, A.; Franken, P.; Kofoet, A.; Jabaji-Hare, S.H. (2007) Development of a
specific PCR assay for the detection of Rhizoctonia solani AG 1-IB using SCAR primers. Journal of Applied Microbiology,
102: 806 - 819.
Grosch, R.; Schneider, J.H.M.; Kofoet, A.; Feller, C. (2011) Impact of Continuous Cropping of Lettuce on the Disease
Dynamics of Bottom Rot and Genotypic Diversity of Rhizoctonia solani AG 1-IB. Journal of Phytopathology, 159: 35 - 44.
Harch, B.D.; Correll, R.L.; Meech, W.; Kirkby, C.A.; Pankhurst, C.E. (1997) Using the Gini coefficient with BIOLOG
substrate utilisation data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities.
Journal of Microbial Methods, 30: 91 - 101.
Harman, G.E.; Howell, C.R.; Viterbo, A.; Chet, I.; Lorito, M. (2004) Trichoderma species - Opportunistic, avirulent plant
symbionts. Nature reviews Microbiology, 2: 43 - 56.
Henis, Y.; Ghaffar, A.; Baker, R.; Gillespie, S.L. (1978) New peller soil-sampler and its use for study of populationdynamics of Rhizoctonia solani in soil. Phytopathology, 68: 371 - 376.
Hodge, A. (2004) The plastic plant: root responses to heterogeneous supplies of nutrients. New Phytologist, 162: 9 - 24.
Hoffmann, K.; Voigt, K. (2009) Absidia parricida plays a dominant role in biotrophic fusion parasitism among
mucoralean fungi (Zygomycetes): Lentamyces, a new genus for A. parricida and A. zychae. Plant Biology, 11: 537-554.
Höfte, M. (2010-2011) Gewasbeschadigers. Cursus master Bio-ingenieurswetenschappen. Universiteit Gent.
Hoitink, H.A.J.; Boehm, M.J. (1999) Biocontrol within the context of soil microbial communities: A substrate-dependent
phenomenon. Annual Review of Phytopathology, 97: 427 - 446.
Hoppener-Ogawa, S.; Leveau, J.H.J.; van Veen, J.A.; De Boer, W. (2009) Mycophagous growth of Collimonas bacteria in
natural soils, impact on fungal biomass turnover and interactions with mycophagous Trichoderma fungi. ISME Journal,
3: 190-189.
Hornby, D. (1983) Suppressive soils. Annual Review of Phytopathology, 21: 65 – 85.
Hu, J.; Lin, X.; Wang, J.; Dai,J.; Chen, R.; Zhang, J.; Wong, M.H. (2010) Microbial functional diversity, metabolic quotient,
and invertase activity of a sandy loam soil as affected by long-term application of organic amendment and mineral
fertilizer. Journal of Soils and Sediments, 11: 271 - 280.
Hyakumachi, M. (1996) Mechanisms involved in disease decline. In: Rhizoctonia species: Taxonomy, Molecular Biology,
Ecology, Pathology and Disease Control. Sneh, B.; Jaboji-Hare, S.; Neate, S.; Dijst, G., 1996, Kluwer academic Publishers,
Dordrecht, 578p.
Kirby, R. (2006) Actinomycetes and lignin degradation. Advances in Applied Microbiology, 58: 125 - 168.
Kwok, O.C.H.; Fahy, P.C.; Hoitink, H.A.J.; Kuter, G.A. (1987) Interactions between bacteria and Trichoderma hamatum
in suppression of Rhizoctonia damping-off in bark compost media. Phytopathology, 77: 1206 – 1212.
Larsen, J.; Olsson, P.A.; Jakobsen, I. (1998) The use of fatty acid signatures to study mycelial interactions between the
arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices and the saprotrophic fungus Fusarium culmorum in root-free soil.
Mycological Research, 102: 1491 - 1492.
Leach, L.D.; Garben, R.H. (1970) Control of Rhizoctonia solani. In: Rhizoctonia Solani: Biology and Pathology. Parmeter,
J.R. University of California Press, Berkerley, Los Angelos and London, p189-198.
Liu, T.H.; Lin, M.J.; Ko, W.H. (2011) Development of artificial conidia for ecological studies of Rhizoctonia solani in soil.
New Biotechnology, 28: 86 - 91.
71


























Lucas, P.; Smiley, R.W.; Collins, H.P. (1993) Decline of Rhizoctonia root rot on wheat in soils infested with Rhizoctonia
solari AG-8. Phytopathology, 83: 260 - 265.
Lynd, L.R.; Weimer, P.J.; van Zyl, W.H.; Pretorius, I.S. (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and
biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66: 506 - 577.
MacArthur, R.H.; Wilson, E.O. (1963) Equilibrium theory of insular zoogeography. Evolution, 17: 373 - 387.
Manning, W.J.; Crossan, D.F.; Adams, A.L. (1970) Method for production of sclerotia of Rhizoctonia solani.
Phytopathology, 60: 179 - 180.
Mazzola, M.; Granatstein, D.M.; Elfving, D.C.; Mullinix, K. (2001) Suppression of specific apple root pathogens by
Brassica napus seed meal amendment regardless of glucosinolate content. Phytopathology, 91: 673 - 679.
Mazzola, M. (2004) Assessment and management of soil microbial community structure for disease suppression.
Annual Review of Phytopathology, 42: 35 - 59.
Mendes, R.; Kruijt, M.; de Bruijn, I.; Dekkers, E.; van der Voort, M.; Schneider, J. H. M.; Piceno, Y. M.; DeSantis, T. Z.;
Andersen, G. L.; Bakker, P. A. H. M.; Raaijmakers, J. M. (2011) Deciphering the Rhizosphere Microbiome for DiseaseSuppressive Bacteria. Science, 332: 1097 - 1100.
Moldes, D.; Gallego, P.P.; Couto, S.R.; Sanroman, A. (2003) Grape seeds: the best lignocellulosic waste to produce
laccase by solid state cultures of Trametes hirsute. Biotechnology letters, 25: 491 - 495.
Muylle, H; (z.d.) Miscanthus: Teelt en Opbrengst.
http://www.agripress.be/_STUDIOEMMA_UPLOADS/downloads/3_0_1.pdf, geraadpleegd op 11/5/2012.
Nelson, E.B.; Kuter, G.A.; Hoitink, H.A. (1983) Effects of fungal antagonists and compost age on suppression of
Rhizoctonia damping-off in container media amended with composted hardwood bark. Phytopathology, 73:
1457-1462.
Nerey, Y.; Van Beneden, S.; Franca, S.C.; Jimenez, A.; Cupull, R.; Herrera, L.; Hofte, M. (2010) Influence of soil type and
indigenous pathogenic fungi on bean hypocotyl rot caused by Rhizoctonia solani AG4 HGI in Cuba. Soil Biology and
Biochemistry, 42: 797 - 803.
NIS. (2008) Landbouwstatistieken:
http://statbel.fgov.be/nl/modules/publications/statistiques/economie/Kerncijfers_landbouw_2008.jsp, geraadpleegd
op 19/12/2011.
Okeke, B. C.; Paterson,A.; Smith, J. E.; Watson-Craik, I. A.(1996) Comparative biotransformation of pentachlorophenol
in soils by solid substrate cultures of Lentinula edodes. Applied Microbiology and Biotechnology, 48: 563 - 569.
Pannecoucque, J.; Van Beneden, S.; Hofte, M. (2008) Characterization and pathogenicity of Rhizoctonia isolates
associated with cauliflower in Belgium. Plant Pathology, 57: 737 - 746.
Papavizas, G.C.; Davey, C.B., 1960. The Rhizoctonia disease of bean as affected by decomposing green plant materials
and associated microfloras. Phytopathology, 50: 516 - 522.
Paulitz, T.C.; Belanger, R.R. (2001) Biological control in greenhouse systems. Annual Review of Phytopathology, 39: 103
- 133.
Perez-Piqueres, A.; Edel-Hermann, W.; Alabouvette, C.; Steinberg, C. (2006) Response of soil microbial communities to
compost amendments. Soil Biology and Biochemistry, 38: 460 - 470.
Postma, J.; Scheper, R.W.A.; Schilder, M.T. (2010) Effect of successive cauliflower plantings and Rhizoctonia solani AG
2-1 inoculations on disease suppressiveness of a suppressive and a conducive soil. Soil Biology and Biochemistry, 42:
804 - 812.
Preston-Mafham, J.; Boddy, L.; Randerson, P.F. (2002) Analysis of microbial community functional diversity using solecarbon-source utilization profiles- a critique. Microbiological Ecology, 42: 1 - 14.
Raaijmakers, J.M.; de Bruijn, I.; de Kock, M.J.D. (2006) Cyclic lipopeptide production by plant-associated Pseudomonas
spp.: Diversity, activity, biosynthesis, and regulation. Molecular Plant-Microbe Interactions, 19: 699 - 710.
Raaijmakers, J. M.; Paulitz, T. C.; Steinberg, C.; Alabouvette, C.; Moënne-Loccoz, Y. (2009) The rhizosphere: a
playground and battlefield for soilborne pathogens and beneficial microorganisms. Plant Soil, 321: 341 - 361.
Rothrock, C.S.; Kirkpatrick, T.L.; Frans, R.E.; Scott, H.D. (1995) The influence of winter legume cover crops on soilborne
plant-pathogens and cotton seedling diseases. Plant Disease, 79: 167 - 171.
Rousk, J.; Brookes, P.C.; Baath, E. (2009) Contrasting Soil pH Effects on Fungal and Bacterial Growth Suggest Functional
Redundancy in Carbon Mineralization. Applied and Environmental Microbiology, 75: 1589 - 1596.
RSF (Roots, shoot and fruits) (2011) http://www.rd2.co.nz/index.php?page=biologicals, geraadpleegd op 23/12/2011.
Sayama, M.; Homma, Y.; Furuya, H.; Takenaka, S. (2001) Some microbial properties of suppressive soil induced by
successive inoculations of Rhizoctonia solani anastomosis group 2-2. Soil Microorganisms, 55: 37 - 44.
Scherwinski, K.; Grosch, R.; Berg, G (2008) Effect of bacterial antagonists on lettuce: active biocontrol of Rhizoctonia
solani and negligible, short-term effects on nontarget microorganisms. Fems microbiology Ecology, 64: 106 - 116.
72
























Scheuerell, S.J.; Mahaffee, W.F. (2005) Microbial recolonization of compost after peak heating needed for the rapid
development of damping-off suppression. Compost Science and Utilization, 13: 65 - 71.
Scheuerell, S.J.; Sullivan, D.M.; Mahaffee, W.F. (2005) Suppression of seedling damping-off caused by Pythium
ultimum, P. irregulare, and Rhizoctonia solani in container media amended with a diverse range of Pacific northwest
compost sources. Phytopathology, 95: 306 - 315.
Schuster, A.; Schmoll, M. (2010) Biology and biotechnology of Trichoderma. Applied Microbiology and Biotechnology,
87: 787 - 799.
Sneh, B.; Jaboji-Hare, S.; Neate, S.; Dijst, G. (1996) Rhizoctonia species: Taxonomy, Molecular Biology, Ecology,
Pathology and Disease Control. Kluwer academic Publishers, Dordrecht, 578p.
SOSEF (2009) Bodem resetten, http://www.sosef.nl/documents/Bodem%20resetten-E.pdf , geraadpleegd op
20/11/2011.
Stahl, P.D.; Klug, M.J. (1998) Characterization and differentiation of filamentous fungi based on fatty acid composition.
Applied and Environmental Microbiology, 62: 4136 - 4146.
Subbarao, K.V.; Hubbard, J.C.; Koike, S.T. (1999) Evaluation of broccoli residue incorporation into field soil for
Verticillium wilt control in cauliflower. Phytopathology, 86: 1303 - 1310.
Taheri, P.; Gnanamanickam, S; Höfte, M. (2007) Characterization, genetic structure, and pathogenicity of Rhizoctonia
spp. associated with rice sheath diseases in India. Phytopathology, 97: 373 - 383.
Tenuta, M.; Lazarovits, G. (2004) Soil properties associated with the variable effectiveness of meat and bone meal to
kill microsclerotia of Verticillium dahlia. Applied Soil Ecology, 25: 219 - 236.
Termorshuizen, A.J.; van Rijn, E.; van der Gaag, D.J.; Alabouvette, C.; Chen, Y.; Lagerlof, J.; Malandrakis, A.A.;
Paplomatas, E.J.; Ramert, B.; Ryckeboer, J.; Steinberg, C.; Zmora-Nahum, S. (2006) Suppressiveness of 18 composts
against 7 pathosystems: Variability in pathogen response. Soil Biology and Biochemistry, 38: 2461 - 2477.
Termorshuizen, A.J.; Jeger, M.J. (2008) Strategies of soilborne plant pathogenic fungi in relation to disease
suppression. Fungal ecology, 1: 108 - 114.
Thatchtec BV (2009) “Bodem Resetten” De nieuwe methode voor biologisch verwijderen van grondgebonden ziekten,
http://www.thatchtec.com/?Biologische_grondontsmetting_%28%22Bodem_Resetten%22%29, geraadpleegd op
20/11/2011.
Thevenot, M.; Dignac, M.F.; Rumpel, C. (2010) Fate of lignins in soils: A review. Soil Biology and Biochemistry, 42: 1200
- 1211.
Thorn, R.G.; Reddy, C.A.; Harris, D.; Paul, E.A. (1996) Isolation of saprophytic basidiomycetes from soil. Applied and
Environmental Microbiology, 62: 4288 - 4292.
Thuerig, B.; Fliessbach, A.; Berger, N.; Fuchs, J.G.; Kraus, N.; Mahlberg, N.; Nietlispach, B.; Tamm, L. (2009) Reestablishment of suppressiveness to soil- and air-borne diseases by re-inoculation of soil microbial communities. Soil
Biology and Biochemistry, 41: 2153 - 2161.
Toda, T., Mghalu, J.M., Priyatomojo, A. and Hyakumachi, M. (2004) Comparison of sequences for the internal
transcribed spacer region in Rhizoctonia solani AG 1-ID and other subgroups of AG 1. J Genetic Plant Pathology, 70: 270
– 272.
Tsuneda, A. en Thorn, R.G. (1994) Interactions of wood decay fungi with other microorganisms, with emphasis on the
degradation of cell-walls. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique, 73: 1325 - 1333.
Tuitert, G.; Szczech, M.; Bollen, G.J. (1998) Suppression of Rhizoctonia solani in potting mixtures amended with
compost made from organic household waste. Phytopathology, 88: 764 - 773.
Van Beneden, S. (2009) Basal rot in Belgian lettuce greenhouses: causal agents and development of sustainable control
measures. Thesis submitted in fulfillment of the requirements for the degree of Doctor (PhD) in Bioscience
engineering: Agriculture. Ghent University. Belgium.
Van Beneden, S.; Pannecoucque, J.; Debode, J.; De Backer, G.; Hofte, M. (2009) Characterisation of fungal pathogens
causing basal rot of lettuce in Belgian greenhouses. European Journal of Plant Pathology, 124: 9 - 19.
Van Beneden, S.; Leenknegt, I.; Franca, S.C.; Hofte, M. (2010a) Improved control of lettuce drop caused by Sclerotinia
sclerotiorum using Contans combined with lignin or a reduced fungicide application. Crop protection, 29: 168 - 174.
Van Beneden, S.; Roobroeck, D.; Franca, S.C.; De Neve, S.; Boeckx, P.; Hofte, M. (2010b) Microbial populations involved
in the suppression of Rhizoctonia solani AG1-1B by lignin incorporation in soil. Soil Biology and Biochemistry, 42: 1268 1274.
Van Beneden, S.; Ceustermans, A.; Höfte, M.; Coosemans, J.; Legrève, A. (2011) Alternatieven voor het gebruik van
methylbromide bij de teelt van serresla. FOD Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu, Brussel.
Van der Wurff, A. (2010) Goede bodemweerbaarheid vormt de sleutel tot duurzaam telen. Onder Glas, 12:19 - 21.
73













Van Labeke, M.C. (2011-2012) Fytotechnie:partim groententeelt. Cursus Master Bio-ingenieurswetenschappen.
Universiteit Gent.
Van Toor, R.F.; Jaspers, M.V.; Stewart, A. (2005) Wood rotting fungi and pine mulches enhance parasitism of Ciborinia
camelliae sclerotia in vitro. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 33: 389 -397.
VBT (2010) Verbond van Belgische tuinbouwveilingen: jaarverslag 2010. Leuven, VBT.
http://www.vbt.eu/documents/pdfs-jaarverslagen/vbt-jv-2010.pdf, geraadpleegd op 19/12/2011.
Verstegen, S. (2010) Organische stof is cruciaal voor bodemweerbaarheid. Groeten en Fruit, p20.
Vicuña, R.; González, B.; Seelenfreund, D.; Rüttimann, C.; Salas, L. (1993) Ability of natural bacterial isolates to
metabolize high and low molecular weight lignin-derived molecules. Journal of Biotechnology, 30: 9 - 13.
Vidhyasekaran, P. (2004) Concise encyclopedia of plant pathology. The Haworth Reference Press, Binghamton, New
York.
Vinale, F.; Ghisalberti, E.L.; Sivasithamparam, K.; Marra, R.; Ritieni, A.; Ferracane, R.; Woo, S.1; Lorito, M. (2009)
Factors affecting the production of Trichoderma harzianum secondary metabolites during the interaction with
different plant pathogens. Letters in Applied Microbiology, 48: 705 - 711.
Wang L.; Wise M. J. (2011) Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.
Naturwissenschaften, 98: 719 - 729.
Weller, D.M.; Raaijmakers, J.M.; Gardener, B.B.M.; Thomashow, L.S. (2002) Microbial populations responsible for
specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annual Review of Phytopathology, 40: 309 - 348.
White, G.J.; Traquair, J.A. (2006) Necrotrophic mycoparasitism of Botrytis cinerea by cellulolytic and ligninocellulolytic
Basidiomycetes. Canadian Journal of Microbiology, 52: 508 - 518.
Woodward, J. (1982) Fungal and other β-d-glucosidases — Their properties and applications. Enzyme and Microbial
Techology, 4: 73 - 79.
Zelles, L. (1997) Phospholipid fatty acid profiles in selected members of soil microbial communities. Chemosphere, 35:
275 - 294.
Zelles, L (1999) Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial
communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils, 29: 111 - 129.
74
7. Bijlages
Bijlage 1: Koolstofbronnen van de Eco MicroPlates™
Tabel: De koolstofbronnen van de gebruikte Eco Microplate. De eerste letter-getalcombinatie wijst op de plaats
op de 96 well-plate. De daaropvolgende letter-getalcombinatie komt overeen met de naamgeving gebruikt in
de PCA en verdere analyses.
A1
Water
A2-V9
β-Methyl-DGlucoside
B1-V2
Pyruvic Acid
Methyl Ester
C1-V3
Tween 40
B2-V10
D-Xylose
D1-V4
Tween 80
D2-V12
D-Mannitol
E1-V5
α-Cyclodextrin
E2-V13
N-Acetyl-D-Glucosamine
F1-V6
Glycogen
F2-V14
D-Glucosaminic
Acid
G2-V15
Glucose-1Phosphate
H2-V16
D,L-α-Glycerol
Phosphate
G1-V7
D-Cellobiose
H1-V8
α-D-Lactose
C2-V11
i-Erythritol
A3-V17
D-Galactonic Acid
γ-Lactone
B3-V18
D-Galacturonic
A4-V25
L-Arginine
C3-V19
2-Hydroxy
Benzoic Acid
D3-V20
4-Hydroxy
Benzoic Acid
E3-V21
γ-Hydroxybutyric
Acid
F3-V22
Itaconic Acid
C4-V27
L-Phenylalanine
G3-V23
α-Ketobutyric
Acid
H3-V24
D-Malic Acid
G4-V31
Phenylethylamine
75
B4-V26
L-Asparagine
D4-V28
L-Serine
E4-V29
L-Threonine
F4-V30
Glycyl-L-Glutamic Acid
H4-V32
Putrescine
Tabel: De koolstofbronnen van de FF-Microplate. De eerste letter-getalcombinatie wijst op de plaatsing op de
96wellplate. De daaropvolgende letter-getalcombinatie (beginnend met V) komt overeen met de benummering
gebruikt voor de vectoren in de PCA en verdere analyses
Bijlage 2: koolstofbronnen van de FF MicroPlates™
.
76