Summary - Maastricht University Research Portal

Summary
Glucose and long-chain fatty aclds (LGSAs) are tlhe predominant e~nergysubstrates for
skeletal muscle and heart. Since cardiac and skeletal muscles do not hold an unlimrted
storage capacity, these tnssues rely heavily on the cont~nwoelssupply o f both glucose and
LGFAs derived from the circulation Cellular LCFA uptake 1s facil~tatedby putative LCFA
transport proteins residing ~nthe plasma membrane of the celi. The bulk o f LCFA uptake
rnto (cardiac) rnyocytes 1s mediated by fatty acid translocase (FAT)JCD36. Oiwerwhelm~ng
evidence was obtained from the generation of transgen~cmouse models w ~ t heither
muscle-targeted overexpression of FATSCD36 or com~pleteabsence o f the gene for
FATJCD36 (FAT/CD36 knockout m~ce).These models not only emphasized a physiological
role for FPtTi(CD36 by illustrat~ngthat altered changes Im rnuscle LCFA uptake rates
paralleled the cha~ngesin FAT/CCa36 expression, they also demonstrated the importance
of the LCFA uptake process t o overall LCFA metabolism and glucose utrlization.
Like the glucose transporter CILUT~,FATICD36 localizat~on is not restricted t o the
sarcolelmma and an intracellwlar storage compartment for FAT/GD36 has been found.
When compared t o cellular glucose uptake by CLUT4, the uptake mechanism o f LGFAs
and 1°C regulation a~reonly poorly undlerstood. However, there are some indications t o
suggest t h a t a similar regulatory rnechan~smaccounts For cellular LCFA uptake as well.
The studies described in this thesis investigate the poss~ble role of FATJCD36
translocat~onas underlying m~erhanisrnin the acute and chronic regulation o f LCFA
uptake in heart and skeletal muscle. In additnon, a first attempt has been made t o unravel
the sig~naltransduction cascades involved in ~nslulin-induced FAT/CDSIG translocation.
CHAPTER1 g11ve5a brief descriptnon o f the main signal~ngcascades rnvolved in the
biological effects of insulin on the regulation o f glwcose, protein and lipid metabolism, An
introduction is given in the m~ainprocess of cellular LCFA and glucose uptake and the
glucose translportelrs predorn~inantlyinvolved in glucose uptake in heart and skeletal
models which are used t h r o ~ l g h o ~ u t
muscle are discussed. After presenting t w o spec~~fic
t h ~ sthes~s,that is pant sorcoSemrnal westcles and cardiomyocytes, a thesis outline 15
provided.
Besides FATJCB36, t w o other pr~tatlwetransport proteins are involved in p r o t e ~ n mediated LCPA
' uptake, plasma membrane Fatty acid b ~ n d i n gprote~n(FABPpm) and fatty
acid transport p ~ ~ o t e i(FATP).
n
Although dnrect proof has not been provided, indirect
cvndence s~nggestan ~nteractiono f FAT/CD?IIG with each of these transport proteins. in
chapter 2 background in~forrnat~on
is given a~boutFATSCD36, FABPpm and FATP, and four
hypothetncal ~noclelsof LCFA uptake are described In a d d ~ t ~ oan review o f current
concepts arid ideas on the regulation of LCFA uptake by insulln and electrrlcal
cor~tract~ons
ns provided The potential involvement of candidate proteins (protein kinase
A (PICA), protein kinase B ( A ~ ~ S P Kprote~n
B),
k~naseC (PKC), and mitogen-activated protein
krnase (MAPK)) as part o.f the leidependent signal transduction k~nasesinduced by rnsuiin
and electrical s t ~ r n u l a t ~ oare
n highlighted F~nallythis chapter describes the current
ev~dencet o ~ndicatea tole for a dnsti!rbed FATICD36 translocation in heart- and skeletal
rnusele o f obese and ~nsul~n-resistant
rats.
TQ v e r i b vhether giant sarco!errIlmaI vesicles can be used as ewperin?entdl tool system il7
LCFA uptake studies and t o detect plasma membrane alterations In tranzpor.it proteins,
giant vesicles f r o m hea&, liver, rnuscle and adipose tlssue were characterized. Therefore,
w e examined of which cell types (pare~i?chymalilendothelial),membrane-domains or cell
regions these giant sarcolernrnal vesicles cons~st In addrtion, we determ,ned tile
existence of FATiCD36, FABPpm and CL1UT4, and o f cytoplasn?ic FABP (FbBPc), the
intracellular counterpart o f albumin. As mentioned in CF~~APTER
3 , giant vesicles not only
consist of parenchymal cells but specufic plasnna membrane dorna~nr,like caveolae which
are known t o be involved i n membrane transport processes, are also represented. Since
giant vesicles do not contain subcellular organelles (i.e, m~tochondria),but FA5Pc as well
as the transport proteins, FdTICD36, FABlPpm and CLUT4, these giant sarcolernnlal
vesicles can be very well used t o study the uptake mechanism o f boll? glucose and LCFAs
i n the absence of metaibolism (i.e. oxidation]
Skeletal muscje metabolism is remarkablly capable of adaiptin,g t o changes i n ~nwsc!e
activity pattern. While 11thas been shown that increased nnuscle activity can increase
FATJsCD36and FABPpm, as well as LCFA t~ansport,the effects o f reduc~rlgmuscle activlty
can LCFA transport and transport prote~nsare not known. In previous studies, it was
demonstrated t h a t LCFA uptake is subject t o short-term regulation by a brief per~odo f
muscle contraction, involving the translocation of FATSCD36 from intracellular stores t o
the sar~ol~emma.
In this respect, it is important t o account for changes in LCFA transport
by examining both the total muscle content arid the plasrmalemm~~al
can tent of FATSCD36
a,nd FABRprn. CHAPTER4 therefore describes the effects s f altered muscle activity on LGFA
transport and the mechanisms involved. For this, we either chron~callystirnulatell or
denervated rat hindlimb muscle for a period o f 7 clansecut~vedays and measured the
total muscle colntent o f FATICD36 and FABPpm in these muscles. We used giant
sarcolemrnal vesicles t o measure the rates o f LCFA transport and the plas~malernrna!
content o f FATICD36 and FABPprn. In this chapter evidence is provided t h a t chronic
alterations in muscle a c t l v ~ t ycan alter the wates o f LCFA transport via different
mechanisms, either I)by Increasing the total ~nusclecontent o f FAXSCD36 and FAMPpm
resulting In a concornartant increase at the sarcoiermrna, or r)i by recluc~ngthe plas~ma
mennbran~econtent of the proteins, in the absence of any changes irr tl-neis total muscle
content
n,
is also capablle o f l~ncrezlslrug
Besides a short-term period o f electrical s t ~ m u l a t ~ otlnsul~n
LGFA transport rates rn skeletal muscle by inducing FAT/CD36 tranisloratiolli t o the
sarcolemma Chapter 5 descr~besthe direct o f effect o f rnsuUin en cellular uptake of L C F A ~
by the heart and prov~dest h e novel f i n d ~ n gof insulin t o nrndlsce FbTXCD36 trams!oci;ut~on
i n h e a in
~ addltron t o the well-known effect of insulin t o sl~mulateglucose uptake and
GLUT4 translocation. Moreover, evidence was found For t w o independent pathways
mediat~ngthe insulin-and contlractlon-induced regulation o f LCFb u~ptakeIn ea~rd~ac
myocy-tes, confunung a p h a s p h a t i d y l i n o s i t o Y - ~ - 4 3 1 H H k ~ n a ~rnechanlsm
e-d~
to
insulin-induced LCFA uptake
Although the vegulat~olnof LCFA and glucose uptake appear t o be ~denttcal,we recently
observed evidence ithat zapnnast, a cGMP-speclfic phosp hadiesterase ~ l n h l b l t ~ r ~
selectively modulated the substrate preference o f the heart by stimulating glucose
suggest t h a t different
uptake and not LICSP, uptake. Notably, these ~~bservations
rnechanjsms are ~nvolwedin the regulation o f glucose and LCFA uptake. Since saprinasl
potentially has anti-diabet~cproperties, we determined the wnderlyong mechanism by
which ztrprinast 1s able t o selectively stimulate glucose uptake, as described in CHAPTER 6 .
Moreover, we rule o u t a role for ,p38 MAPK in the stimulation o f insulin-induced LCFA
uptake in cardiac rnyocytes, suggesting that FAT/CD3;6 translocation and not activation is
involved in the effect of ~rrsulinon LCFA uptake.
In t h e final chapter (CHAPTER 7),the main results o f t h e studies presented in thts thesis are
discussed and put into a broader perspective. Suggestions for future research as well as
clinical implications in respect t o FATICD36 as therapeutic potential are given.
Samenvattirug
Naast glucose als substraat zijn het hart- en de skeletspleren voor biuai energiebel~oefie
voos een belangrijk deel afhankelijk van de verbranding vain vetsulren. Een coritinule
aanvoer van deze voedingsstoffen i s gewenst, aangezien er slechts een beperkte
opslagcapaciteit voorhanden. Het grootste deel van de vetzilren wordt dooi- de hart- en
skeletspiercel opgenomen rnet behulp van zogeriaamde transporteiwitten, die zich in de
pllasmamembraan van de cel bevinden. Fatty acid traiaslacase [FAT)JClD36 is
verantwoordelijk voor meer dan de helft wan de cellulaire op~narnevan vetzuren i n harilen skeletspiercellen en neemt daarmee een prominente plaats i n binlnen het eiwitgemedieerde vetzuuropname proces. De fy~li~ologische
betekenis van d i t ti-ai~sporteiwit
werd nadrukkelijk bevestigd door de ontwikkeling wan transgene diermodellen gericlit op
zowel spierspecifieke overexpressie van FATjCD36 of Juist deletie van liet FAIJCD36 gen.
Deze diermodellen lieten niet alleen een palrrallel zien t~issen veranderii.ngen i n
wetzuurtransparX-snelheid en expressue van FATICID36 in de spier, imaar benadrukten ook
het belang van het vetzuuropname proces voor het vetzuur- en glucose u-netaboilisme in
het algemeen.
Net als GLUT4, de voornaamste glucose transporter i n hart-en skeletspiercelleii, bevindt
FAT/CD36 zich niet uitsluitend in de plasmamembraan van de cel, maar karnt d i t eiwit
ook voor in intracellullaire compartimenten. Ten opzichte van liet bekende fei-ionaeen dat
de cellulaire glucose opname gereguleerd wordt door de hoeveelheid CLUT4 op de
celmembraan, zijn er slechts aanwqzin~gendat FAT/CD36 via eenrellfde mechanisme in
staat is o m de vetzuuropname te reguleren. De studies die in dit proefschrift becchreven
worden, onderzoeken de magelijke rok van het translocatiemechanisme van FATICD36 i11
de chronische en acute regulatie wan vetzuuropname in het hart en de skeletspier van de
rat. Daarnaast is het signaaltransductiemechanisme onderzocht waarmee externe acute
stimuli, zoals insuline en kortdurende elektrische contracties de translocatie wan
FATJCD36 i n deze weefsels kunnen induceren.
Ilri iIioorassulK I w o r d ~ teen beknopte beschrijving gegeven van de signaaltransductiecascades die bei~ioklkenziin bij de insuline-gemedieerde regulatie wrln het glucose-, eiwiten ~etzuiurm~etabolis~rne.
Daarnaast wordt de aandaclitggevestigd op vetzuur- en glucose
opname in h e l algemeen en komen behalve d~evets~uwrtraii~sperler
lFATlCC436 ook dc
belangrijkste glucosetransporters voor het hart en de skeletspier, GIUT1 en GLUT4,
specifiek aan bod. Na een kelnnismaking rnet de twee modellen die In hel. proefsch~rrft
gebruikt worden om de opname en de regulatie van vetzuren t e bestuderen naniel~jk
giant rcjircoS~imrnaSvesSsSes en r~rdiomyocy~an,
wordt de opzet van het proefschrifl.
u iteeegezet
Naast FATICD36 zijn nag twee transpo~rteiwittenbetrokken bij de eiwit-gemedieerde
vetzuuropname, te weten plasma membraan fatty acid bilnding p r o b e i [ F A B P ~ ~en
),
fatty acid transport protein (FATR). t-iloeweil concrete aanwijzingen nog niet geleverd zijn,
is er indirect b e w i ~ svoorhanden om t e verolnderstelllen dat FSI'F/CD3& met elk van dete
eiwitten een interactre aangaat. In HOOFDSTUK
Z wordt dieper ingegaan op deze drie
vetzuurbindende eiwitten en worden vier hypothetische modellen wan vetzuuiropname
uitgewerkt. Daarnaast beschrijft dit hoofdstuk de stand van zaken omtrent de acute
regulatie van de vetzisurapname in hart en skeletspieren orider invloed wan insuline en
elektrrsche stimulatie. De onafhankelijke signaaltransductiecascades behorende bij de
alcute stimulatie van FATt'Cl.336 translocatie en potentiele kandidaateiwittccin die b'inneF
deze cascades een belangrrjke rol kunnen spelen zoals proteine kinase A @?KA), proteine
kinase B (AktlPKB), proteune k~nase5 (PKC), en mitagen,-aclivated prateine- kinase (MAPK)
karnen aan de orde. De aanwijzingen voor een verctoorde translocatie van FATiCD36 En
hart- en skeletspier van obese en insuline-resistent~eratten worden eveneens besproken
Om te werifieren o f giant sarcoilammal veslcles als onderzoeksmodel in wetzuuropnlamestudies gebruikt kunnen worden o m veranderingen in transporkeiwitten op de
plasmarnernbraan a~ante tonen, hebben we onderzocht uit welke cellen (parenchyrnaa~l
of endotheel) en celgedeeltes/compartimenten (onder andere caveolae en T-tubuli) de
plasmamembraan wam gianit wesislies opgebouwd is, Ook hebben we de aanwezigheid
bepaald van FAT/CiDi36, FABPprn en GLUT4, en va~nclytoplasrnatEsch FABP (FABPC), de
intracellu~lairetegenha~ngervan albumine. Zoals vermeld in HOOFDSTUK
3 blijkt dat gicsnt
carcwcalemrnal ves,r/es niet alleen opgebouwd zijn uit de plasmamembraan valn
parenchymale cellen, maar ook dat specifieke plasmamernbnaan domeinen betrokken bij
membraan transport processen zoals ca~veolae vertegenwoardigd mijn. Aangezien
subcellulaire organelllen waaronder rnitochondri~nontbreken, malar zowel de substraat
transporters als FABPc aangetoond konden worden in deze giant sarccoSemmaS vesicles,
kunnen deze vesicles blij uitstek toegepast wordeui ter b~estuderingvan het opname
mechanisme van glucose en vetzuren in afwezigheid van metabole processen (bijv. Poxidatile).
Skeletspieren kuninen hun energiebehoefte gemakkelijk aanpassingen aan eventuele
verander~ngenin het spieractiviteitspatroon. Uit eerder onderzoek is gebleken dat een
verhoogde sp~eractiviteit zowel een toenlame teweegb~rengt ini de wetzuurtransportsnelheid als ook in de hoeveelheid beschikbare transporteiwitten van FAT/CD36 en
FABPprn in de spier. Echter, het is niet bekend w a t het effect is wan een afname van
spieractuvitent op diete parameters Bowendie~nblijkt u i t eerder onderzoek dat het
toebrengen van kiortlluireiide elektrisch~estimulaties de vetzuuropname in staat is te
reguleren door iiniddel van het nnduceren van FATICD36 translocatie naar de
placi7iameumbraan Het is daarom belangrijk om verai~deringen in vetzuurtranspart
si~elheidte relateren aan zowel het totale gehalte van FATlGD36 en FABPpm in de spier
als ook aan de Iioeveellieid vaii deze eiwitten op de sarcolemrn~a.In MoaFosruK 4 wordt
IIet effect van veranderiiigeri in spieractivite~it op vetzuurtransport en de hierbij
betrokkeii? mecchaniisrnen behandeld. Hiervoor, was het vali belang om de
dclit~rpootspiierenvan de rat gedurende een aaneengesloten periode var1 S dagen ofwel
chron~ischte stimuleren o f te denerveren. Verwoilgelns werd het totalle gehalte van
FAT/CD36 en FABPpni in deze spieren bepaald. De vetzuuulcranspo~snelheidalsmede de
hoeweell~eidwan deze Ira~nsporteiwitteriop de plasmamembraan werd gemeten met
behulp vari giant sarsoleinrnal vesicles geisoleerd uit deze spiereill. In dit hoofstuk wordt
bewijs geleverd dat chronische veranderingen in spieractiviteit de vetzuurtranspclrtsneleheid via verschillende mechanissaien kunnen beïnvloeden. Jen eerste door iniddel
van het verlaogen van de totale hoeveelheid aan transporteiwitten en ten tweede door
h e t verminderen wan h e t gehalte van FAT/CD36 en FABPprn olp de plasmainernbraan,
zonder dat er een vera~nderingoptreedt in het totale aantal traiisporteiwtitten in de
spier. U i t recent onderzoek is gebleken! d a t n~aastkortdurende elektrische stimulaties ook
insuline In staat is om in de skeletspier de vetzuwropnarne t e stiiïnulurera via het verhagen
van h e t gehalte van FATjCD36 op de plasmanwmbraan. Hcao~os-su~
5 beschrijft de
nieuwe bevinding dat, insuline niet alleen de glucose opname stimuleert via GLWT4
transllocatie, maar ook de vetzi~wropnarne positief beinvloedt: via het i~ndw~ceren
van
FAI/CCP36 translocaltie naar de plasmam~embraan. Daarnaast blijken insulin~e en
contracties niet via hetzelfde signaaltrau7sductiemechanisme de vetzuuropnarme t e
reguleren waarbij activering van phosphatidylinositol-3-OIH-kinase (PI(3)lK) alleen
betrokken is bij het effect van insuli~neo p de vetzuuropname.
Hoewel de regulatie wan glucose als vetzuren identiek lijkt t e zijn, k o m t u i t recent
onderzoek naar varen d a t zaprinast, een cCMP-phosphodieskerase remmer, i n staat is o m
d e substraatwoolrkeur voor het h a r t selectief t e beïnvloeden. Zonder de vetsuuropname t e
veranderen. w o r d t de glucose opname van het hart verhoogd, w a l erop dw~idtdat
verschillende mechanismen betrokken zijn bij de regulatie vara glhcose- en
vetzuuropname. Aangezien zaprinast hypothetisch gezien bij diabetes gebrw~ikt kan
worden om de glulcose opname t e stimul~eren,w o r d t in HOOFDCTUK 6 het mechanisme
i n het hart. Oip
ontrafeld van het specifieke effect van zaprinast o p de gl~coseopna~rne
basis wan de bevindingen kunnen w e eveneens een rol VOOR p38 MAPK i n de insulinege'iduceerde stimulatie van de vetzuuropnamie uitsluiten waardoor vermoedelijk alleen
FATSCD36 translocatie en niet FATSICD36 actiwatie al15onderlliggend rnecha~~isrne
hierbij
betrokken zijn.
IN HOOFDSTUK
7 worden uiteindelijk de belan~grijkste resultaten van d i t proefschrift
bediscussieerd en in een breder perspectief gesplaatst. Tenslotte worden in dit haofdstu~k
suggesties voor velrder onderzoek en potentiële klinische toepassingen van FATiCD36
aan d e orde gebracht.