SUMMARY Ourrng myofihrillogenesns !n vivo as well as r`n vitro

SUMMARY
Ourrng myofihrillogenesns !n vivo as well as r'n vitro drfferent muscle-specific proteins
are; expressed at different stages cpf development. In the flrst part of this thesis
and d~Sf.erentia"tonare studled
(chapters 1 - 4) in viva and su7 wtfro myof~br~llogenes~s
using rmmunofluorescence and lmrnunoblotrlng assays For fn wvo developmental
stud~es early post~rnplantat~oul
mouse embryos are used. Th~e expiressfon partern of
desmrn and t ~ t i n us studled in these mouse embryos during different stages of
development E8 0 - 9.5 days of development) in the heart-anlage and the myomoms.
Surprrs~ngly,t11t1nIS found rn the lheart rudiment at 8.25 days (Thleller stage 121 in a
punctate pattenn even before desmin IS expressed In the card~omyoblasts. During
further dlerirelopment of the heart a t 8.5 days (The~lerstage 13) t ~ t i nfilaments are
formed and at 9.0 days (Th~eilerstage 14) titlln cross-striation rs detected before d e s m ~ n
cross-strlatlon can be observed. A t 9 5 days [The~lerstage 141 also d e s m ~ ncrossstriatlm was seen In the heart muscle cells. One conclus~onfrom th11s mouse embryo
study is that tuttn is an earher marker for cross-str~ated muscle d ~ f f e r e n t ~ a t ~than
on
desrnln
To further examine the expressllon patterns of muscle-spec~f~~c
proteins, [n vitro hamster
muscle cells (&HK21/C13; chaIp%er2 ) and human skelletal muscle cells (chapter 33 are
studied at several stages of differentlation. In und~fferent~ated
BHK-21lCI 3 cells and
human skeletal myoblasts d~esmln1s detected in a filamentous pattern. None of the
spectf~c sarcomerlc proteuns such as t~ltin, nebulln, sarcomeric myosin, or the
trapomyoslns can be detected 1111 these lundifferentlated cells. Both cell types are
~ndwcedt o drfferentlste by changing the culture rneduum from a high nutrition medium
t o a low nutrition medium. The BHK-21/C13 cells than d~fferentiatefrom a polygonai
p~henotypet o a more ellongated form. The human skeletal muscle cellls form myotubes
dlwrlng this in vEtm d~fferent~~atlon
process Early rn the d~fferentiationprocess of both
cell tylpes, first the typical punctated tltrn exp~ressl~onpattern 1s seen before other
sarcomerlc proteins can be detected. Later, In elon~gatedBHK-21/613 cells and in
matured skeletal muscle myotubes, tltln rs observed rn a cross-str~atedpattern, agaun
before other proteins assernbilled Into a strrated pattern. Ca~nfrrm~atoryresults are
olbtained from ~mmunoblotting assays and by two-dimensuonal gel electrophoresis
studies. The expression of titlln during in vitro rnyof~brillogenes~s
conflrms the results
found 117 the iv;? vsvo model: titln 1s one of the flrst rnyofibrlllar proteins expressed In
d~fferentiaringmuscle cells. Furthermore, the seqwent~al stages of assembly of th~us
protein show that titin IS of great ~lmportancefor arranging other sarcomeric proteins.
in chapter 4 the Flrst charecterization of casdl~otlnrs deiscr~bed.The dlstrrbutnon pa~ttern
of cardlotin, s srructlural component of the myocard, 1s compared t o that of other
sarcomorlc constttuents and the sarcoplasm~creticulum ~n several specres and tlssw~es.
Cardlotln 11slcrlcal~zedbetween the m y o f ~ b r ~ of
l s the card~~ornyocytes,
perperud~cularlyt o
the typical crass-striations, for example observed with ant~bodiest o t r t ~ r iand desmln.
Phis local~zacronaf c a r d ~ o t ~suggests
n
a pass~blalunk w i t h the sarcoplasm~lcretlculurn. In
rinm~unroblottungassays cardiot~nis detocted at a molecular vwe~ght of approximately
3 0 0 kD8 and is cla~ssif~od
as a guant muscle protein lllke t~tnnand nebwlun. Cardlatln
seems to be expressed late In the progress of muscle cell d ~ f f e r e n t ~ a t ~ oInn ,fact onAy
Iseveral months) after birth.
In the seconld part of this khes~sEchapters 5 - 7) the expression patterns of truncatedl
hamster desmin and vllnentln In transgenic muce are described. The flunctronal role of
desrnln and vlmentun ~nterrnedrate filaments In the context of (muscle) tusswe
dlflerentllation 1s exarn~ned by expresslo111 of various ~nterrneduate fllament gene
consrrLlcrs and the d~sruptran of endogenous desmln and vlrnent~n networks ~n
transgenic mlce. The vlmentin-desrntn hybrid gene constructs pWVrm2 (chapter 5) and
pVDes lclra~pler 6) are expressed in all v~menhn-containing cells of transgen~cmlce.
This results 11n hybrld rntermednate fulament Formation, but has no effect on normal
dtlfereint~ationor development of the mice. The gene constructs encoding s carboxyterminally deleted mlutant d e s m ~ n subunit driven by the d e s l n ~ n ar rlra wrrnenti~n~
promoter, pDDV and pVDV respectively [chapter 71, slso cause n a detectable
dewelopme~ntal, morphological, and fwnctsonal abnormalities, although d~srupt-ionof
desmln and vi~mentinfilamsnts 1s seen in pirrt ad tlhe cells In the tlssues. In contrast t o
the expression levels af constructs pVVim2 and ;pVDes, the pVDV construct is
expressed in a small percentage a%w i m e n t ~ n - c o n t a i n ~cells,
n
and slurl~~risingly
elsa in e
small! percentage of cross-striated muscle cells. The pDDV construct 1s only detected En
a small percentag,e of striated muscle cells but not i n smooth rnuscle calls. In
comrzlu~s~on,
several truncated mutant desmin subunats cause dlsruptuon of intermediate
frlament networks In rneservchyrnal tissues, w h ~ l eno fwncruonal. dewelapmsrrtal, and
morphological abnormalities in the an~malsare detected.
Tijdens de spierontwlkkelrng warden, zowel in viva ars in w~tso,verschillende spierspecrfieke eiwitten op verseh~llende momentien van dot ontwikkelingsproces
aangesciiaikeld. I n het eerste gedeelte van drt proefschrift (hoofdstukken 1 - 4) worden
de sphsrontwikkeling en spierdifferentiatie in vivo en in w i d m , beschreven aan de hand
wan de expressie van spierspecifieke komponenten m e t beh,ulp van immunofluorescentte- en ~mmunobiottingexperimenten,
Vaor de ia vivo1 experimenten r i j n rnuize-embryo" van verschillende leeftijden ($,O- 91.5
dagen) bestudeerd. Hierbij is gekeken naar hetexpressiepatroon van m e t name desmine
en titine r0 her zuch ientwikkeiende embryonale hart en in de rnyotornen. Het ss
opvallend, dat in hst rudimentaire hart (clalg 8.25) titine in de worm wan kleine
aggregaten voorkomt, nog voordat desmine kan worden gedetekteerd. In een later
stadium van de ontwekkeilingi valn het embryonale hart (dag 8,5)vormt tstine filamenten
in de cai.diom'yocyten en op dag 9,Oi wordt voor Giet eerst titine-dwarsstreping
waargenomen Dwarsstreping van desmine wordt voor h~eteerst op dag 9.5 in het
embryonale muizehart gevonden. In de rnyotornen wordt een identieke volgorde wan
expressiepatrone~nvan deze eiwltten waargenomen. Uit deze studie kan gekon~kludeerd
worden dat i n her rnwize-embryo titine een vroegere marker voor dwarsgestreepte
spierceldufferentiario is daln d1esrnin1e,hetgoen eerde~rbeschueven is.
In aekwoekte hamster spiercellen EBHK2'1$ C l 3; hoofdstuk 2) en gekweekte hulmame
skeÏetspiercell~n((hoofdstuk J3 is gekeken naar het expressielpatroon valn spierspecifieke
eiwitten v6&, tijdens en na het induceren wa~n dsfferentiatie. In ongedifferentieerde
BHK21iC13 cellen en humane skeletspiercellen wordt desmine waargenomen in een
filamentewre worm. Er worden geen andere sarcomeer-specnflske etwitten. zoals titine,
nebul~ne,sarcomeer specifiek rnyosin~eof tropomyosunes gewonden i n deze cellen. Beide
celtypen kunnen in vEtm worden geinduceerd tot differentiatie door het voedingsrijke
kweekmedium waarin dere cellen normaal prolifereren te vervangen door een woedselari-n medium. Na daze 'medium-switc~h', differentreren de polygonale B H K 2 I l C 1 3
cellen tob een geblongeerd fenotylpe. De h~umaneskeletspiercellen fuseren in wftro tot
rnyotubes. Tijdens de eerste fase van differentiatie vertonen beide celtypen een
gepunkteerd titine patroon, dat eerder dan andere sarcomeer-specifieke eiwitten t o t
exlpressie koint. Eadwrende het differentiiatieproces wordt titrne-dwarsstreping
waargenomen nog voordat andere splerspecifieke eiwitten in een dergelijk patroon
voorkomen. Deze volgorde van aanmlaak van warschiilende eiwitkompone~ntentijdens
het differen~tiatiepnoceswordt eveneens gievonden met behulp van immunoblotting- en
tweedimensio~nal~
gelelektroforese technieken. Met expressiepatraen van titinie tijdens
de pieron ontwikkeling in vitfa, is t e vergeii)~kenm e t de resultaten die gevonden worden in
het rnuiro-embryo model Ehoofdstuk 11: tifine is het eerste s i w i t dat zijn plaats vind~tin
de zich vormende s?rcomeren en het lijkt van belang te zijn voor de assemblage en
rangschikking van aridere sarcorneer-specif~eke elansttten~, zoals actine, myosine,
tropamyosi~neen dcsmine.
In I-ioofdstrwk 4 wordt de karakterisatie van cardiot~ne beschreven, een nieuwe
strukaurele etwitkomponent sin het myocard. De cardiotino-distribwtie in het ha~rtwordt
vergeleken m e t die van andere dwarsgestreepte spierspecifrieke eiwitten en m e t de
sl~ruktuwr van het sarcoplasinatisch reti~culum, in zowel verschillende weefsels als in
verschi~llendle species. Cardlottne is goiIokalise~?ndtussen de myofibrillen van de
cerdiermyacyt, loodrecht op de zo karakteristieke dwarsstreping die wordt gesten m e t
antisera garicht tegen bijvclorbeeld titlne 06 desmine. De lokalisatre van carduotine wijst
op een mogelijk verband met het sarcaplasrnatisch reticwlwm. Cardrotlne heeft op een
SDS-polyacrylamials go1 een molekiuulgewiclrlt van ongeveer 300 kDa en wordt, evenals
titine en nebuline, besch~ouwdals &&n wan de zeer grote struktwrele spiereiwitten.
Ceirdiotiile komt laat tot expressie, namelijk pas (enkele maanden) na de geboorte.
111-i
hot tweede gedeelte van di~tproefschrift Ihoofdstukken 5-71, wo~rdthet expresslie-
patroon wan gemuteerd desmine en ~Ementiinein transgerre rr?uuzerii beschreven. Door
werschillenda gemuteerde dlesmi~ne-vimient~ne
hybrrden Trcrl-isgeen ~ i muizen
r
toe expressie
t e laten komen vindt een veistorlng wan endogene desimme @n vinenaine filamenten
pla~ats. Hierdoor kan de funktie wan deze ftlamenten trjdens de antwikkelnng en
differentiatie van Espier-)weefsel worden bestudeerd.
Desmine-vimentine kanstriukteil geplaatst onder kontrole van de vimentune prornoter,
komen t o t expressie In alle vimentune bevattende cellen. Dercjelijke mutant@ trybruden
onder kontrole van de desmine promoter warden uitsluitend waargenomen in @@nkleum
percentage dwarsgestreepte spiercellen en niet in gladde spiereelle~n~.
Deze konotrukten,
zowel onder kontrole van de virnentiine pvamotsr als de desmine pramorer, hadden
ech~ter geen waarneembaar Inegiatief) e f f e k t op het o n t w i k k s l i n ~ s - en
d~fferentiatileproceswan de muizen. Konkluderend kan gezeg~dworden, dat door hst tot
expressie brengen van werscheidene giemuteiei.de desimine-v~mentine I-iybrid~~n,
verstorung van interrned~a~re
filamerrt-netweirken un cel1Een wan m e s e n c h ~ m a i sorigine
veroorzaakt kan wvo~rdenzander dat un deze cellen of weefsels funktioneAe3 of inorfslogische a f w ~ j k i n g e nkunnen worden waa~rgenomen.