Summary - Maastricht University

Summary
Summary
Cancer is one of the major causes of death in the world. The treatment of the majority of the
cancer patients consists of a combination of surgery, chemo- or radiotherapy. Not all cancers
can be cured with these conventional methods, therefore, other therapies like immunotherapy
became of great interest. The major aims of immunotherapy are to trigger the patient’s immune
system to enhance the response against cancer cells or to supply immune cells or components
to the patient that provide a strong immune reaction after administration.
We performed a fundamental study of the thymus, as described in chapter 2, to obtain
further understanding of thymus development, which could be helpful in the development
of therapeutic strategies aiming at thymus rejuvenation, potentially resulting in increased
thymopoiesis. In this chapter we show that during normal thymus development, fibroblast
– that are of mesenchymal origin – ingrowth occurs towards areas where crosstalk between
thymic epithelial cells and thymocytes is abrogated. Additionally, we provide candidate factors
that are potential important in thymus mesenchymal network formation.
For adoptive cellular immunotherapy, the generation of high cell numbers of interest is often
a requirement as well as a limitation of current protocols. In order to provide sufficient cell
numbers, attempts to expand haematopoietic stem cells are of great value and of great interest.
By first expanding haematopoietic stem cells and subsequent differentiation towards specific
cell types, higher total cell numbers of interest can be generated. In chapter 3, we provide
a method for haematopoietic progenitor expansion. A simple blockage of differentiation
by overexpression of the ID3 transcriptional inhibitor in haematopoeitic stem cells in
combination with B cell inducing culture conditions, results in a cell population with arrested
differentiation and great self-renewal capacity. Since these cells are capable to differentiate into
various cell types in an in vivo mouse model, these cells could be used as potential starting
population for different kinds of cell therapies.
T cell progenitor therapy aims at a more rapid recovery of a patient’s T cell pool after
receiving haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) as cancer treatment. Although,
the combination of chemotherapy and HSCT is successful to eliminate cancer in certain
cases, opportunistic infections cause high morbidity and mortality among these patients.
This high infection incidence is caused by the patient’s low T cell counts due to slow recovery
of the T cells from the stem cell graft. A process that can take up from several months to
years. Adoptive T cell precursor therapy could provide faster recovery of patient’s T cell
pool and thereby provide protection for infections. In chapter 4 we reply on a skin-explant
method for the generation of T cells as described by Clark and colleagues 1. We show that
keratinocytes express minimal Delta Like Ligand (DLL), while this signalling is essential
for T cell differentiation and commitment. We concluded that the method by Clark et al. is
unfortunately not suitable for the production of T cells. Meanwhile, it was shown by us and
others that haematopoietic stem cells derived from healthy volunteers have the capacity to
204
Summary
differentiate to T cell progenitors in the presence of certain growth factors in co-culture with
DLL+ murine stromal cell 2-5. It was also shown that these T cell progenitors are capable to
migrate to the thymus of immune deficient mice faster than unmanipulated stem cells.
Murine stromal-cell based systems for cell therapy production are less suitable for clinical
application. Therefore, we aimed to generate a culture method without the use of retrovirally
transduced murine stromal cells overexpressing Delta ligands in chapter 5. Here, we generated
a system consisting of plate bound DLL4:Fc, fibronectin and a cytokine cocktail resulting in
the differentiation of haematopoietic stem cells to T cell progenitors. Nonetheless, these T cell
progenitors did not reach the same maturation stage as in the stromal cell culture validated
previously 2. Consequently, we searched for factors that could make up for this difference.
We found that ascorbic acid, also known as vitamin C, improves not only maturation of T
cell progenitors but also improves the proliferation of these cells. Additionally, we show that
different haematopoietic stem cell sources, cord blood and G-CSF mobilized stem cells, have
the capacity to differentiate into T cell progenitors in the developed system. The differentiation
and expansion of both cell sources are improved by ascorbic acid, proposing a clinical grade
culture system for the generation of T cell progenitors that could improve the patient’s
immunity after stem cell transplantation. Moreover, we show a role for ascorbic acid in the
transition from double negative to double positive T cells. We show that the discrepancy in
the extent of supporting T cell development between TSt-4/DLL4 (ProT2/PreT) and OP-9/
DL1 (DP/SP) is because of the presence of ascorbic acid in the later co-culture. Furthermore,
we concluded that Delta ligand expressing feeder cells nor conditioned media are required for
DP T cell development when culturing stem cells with plate bound DLL4, a defined cytokine
cocktail and ascorbic acid.
T and natural killer (NK) cells share a common progenitor. NK cell therapy is another cellular
immunotherapy for cancer that is currently under investigation. NK cells have an important
role in cancer immunosurveillance and can eliminate tumour cells. However, cell numbers
required for adoptive therapy are enormous. In chapter 6, we show that ascorbic acid has a
positive influence on the expansion of peripheral NK cells, a finding that can be of great value
for the improvement of the production of adoptive NK cell therapy. Moreover, we provide a
culture methods were NK cell progenitors can be generated from haematopoietic stem cells or
T(/NK) cell progenitors, processes that are improved by ascorbic acid. Since ascorbic acid is
an inexpensive and clinical grade available compound, it can easily be implemented in clinical
protocols and clinical trials.
Because of the positive effect of ascorbic acid on both T and NK cell development and
expansion, we determined ascorbic acid serum concentrations in patients with haematological
malignancies. We show in chapter 7 that patients treated with autologous/allogeneic stem cell
transplantation and/or chemotherapy have significantly reduced serum ascorbic acid levels
205
Summary
compared to healthy controls. This interesting observation makes further research to the
possible correlation of ascorbic acid serum levels and the function and recovery of immune
cells plausible. Moreover, the effect of ascorbic acid supplementation on these parameters
would be interesting to investigate.
The findings described in this thesis contribute to the current promising progression in the
field of cellular immunotherapy. Therapies that could improve the life expectancy of patients
with cancer in the near future and should therefore be of main interest for current research
and clinical translation.
206
Summary
References
1.
Clark RA, Yamanaka K, Bai M, Dowgiert R, Kupper TS. Human skin cells support thymus-
independent T cell development. J Clin Invest. 2005 Nov;115(11):3239-49.
2.
Meek B, Cloosen S, Borsotti C, Van Elssen CH, Vanderlocht J, Schnijderberg MC, et al. In
vitro-differentiated T/natural killer-cell progenitors derived from human CD34+ cells
mature in the thymus. Blood. 2010 Jan 14;115(2):261-4.
3.
Awong G, Herer E, Surh CD, Dick JE, La Motte-Mohs RN, Zuniga-Pflucker JC.
Characterization in vitro and engraftment potential in vivo of human progenitor T cells
generated from hematopoietic stem cells. Blood. 2009 Jul 30;114(5):972-82.
4.
De Smedt M, Hoebeke I, Plum J. Human bone marrow CD34+ progenitor cells mature to T
cells on OP9-DL1 stromal cell line without thymus microenvironment. Blood Cells Mol
Dis. 2004 Nov-Dec;33(3):227-32.
5.
Eyrich M, Schreiber SC, Wollny G, Ziegler H, Schlenker R, Koch-Buttner K, et al. Pre-
differentiated human committed T-lymphoid progenitors promote peripheral T-cell re-
constitution after stem cell transplantation in immunodeficient mice. Eur J Immunol. 2011
Dec;41(12):3596-603.
207
208
Samenvatting
Samenvatting
Kanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken. De meerderheid van
behandelingen voor kankerpatiënten bestaat uit een combinatie van chirurgie, chemo- of
radiotherapie. Helaas kunnen niet alle vormen van kanker met de conventionele methodes
adequaat worden behandeld en genezen. Derhalve is de ontwikkeling van nieuwe vormen van
therapie, zoals immuuntherapie, noodzakelijk. Immuuntherapie activeert het immuunsysteem
van de patiënt, zodat de afweerreactie tegen de kankercellen toeneemt. Tevens kan extra
toediening van immuuncellen of componenten de afweerreactie versterken.
Hoofdstuk 2 behandelt een fundamentele studie over de zwezerik, oftewel de thymus, om
meer inzicht te verkrijgen in de ontwikkeling van dit orgaan. Informatie welke uiteindelijk
zal kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van therapeutische strategieën die zich richten op
thymus verjonging, gekenmerkt door een verhoogde T cel productie. T cellen zijn essentieel
voor de specifieke afweer tegen pathogenen. In het hoofdstuk laten we zien dat tijdens normale
thymus ontwikkeling, fibroblasten (embryonale bindweefselcellen) ingroeien naar gebieden
waar communicatie, ook wel crosstalk genoemd, tussen thymus epitheelcellen en thymocyten
afwezig is. We beschrijven kandidaat factoren welke mogelijk essentieel zijn voor het vormen
van het mesenchymale netwerk in de thymus.
Voor adoptieve cellulaire immuuntherapie zijn een hoog aantal cellen vereist. Het vergroten
van de productie van immuuncellen kent momenteel een grote belangstelling, echter zijn
er nog steeds beperkingen aan de huidige protocollen. Er zijn vele pogingen gedaan om
hematopoëtische stamcellen eerst te laten vermeerderen om ze vervolgens te differentiëren
naar specifieke, gewenste cel typen, resulterend in een groter aantal cellen van interesse. In
hoofdstuk 3 dragen we een methode voor om hematopoëtische voorloper cellen te laten
vermeerderen. Een eenvoudige blokkering van differentiatie in stamcellen, bereikt door de
overexpressie van de transcriptie remmer ID3 in combinatie met B lymfocyt inducerende
condities, resulteert in een celpopulatie met geremde differentiatie en een grote capaciteit tot
zelfvernieuwing, beide kenmerken van een stamcel. Deze cellen zijn in staat te differentiëren
tot diverse celtypes in een muismodel, waardoor ze potentieel bruikbaar zijn als startpopulatie
voor verschillende therapieën, waaronder adoptieve voorloper T cel therapie. Voorloper
T cel therapie heeft als doel de populatie T cellen van de patiënt na een hematopoëtische
stamcel transplantatie (HSCT) sneller te herstellen. Hoewel de combinatie van chemotherapie
en HSCT in bepaalde gevallen afdoende is om kanker te elimineren, sterven veel van de
patiënten aan (opportunistische) infecties. Deze hoge infectie-incidentie is te wijten aan de
lage T cel waarden van de patiënt door trage ontwikkeling van T cellen vanuit het stamcel
transplantaat, een herstel dat maanden tot jaren kan duren. Wij hanteerden de hypothese
dat adoptieve voorloper T cel therapie sneller herstel van de T cel populatie van de patiënt
bewerkstelligt en op deze wijze bescherming biedt tegen infecties. Hoofdstuk 4 reageert op
een in de literatuur beschreven kweek methode waar huidcellen op een driedimensionale
matrix gekweekt worden, waarin een goede productie van geschikte T cellen mogelijk zou
210
Samenvatting
zijn 1. Onze studie wijst op een groot aantal problemen en geeft als belangrijkste verklaring voor
het falen van de productie van T cellen dat keratinocyten het eiwit Delta Like Ligand (DLL)
minimaal tot expressie brengen, terwijl deze signalering essentieel is voor T cel differentiatie
en toewijding. Derhalve concludeerden we dat de door Clark et al. beschreven methode niet
geschikt is voor de productie van T cellen voor therapeutische doeleinden. Bovendien hebben
wij en anderen aangetoond dat hematopoëtische stamcellen van gezonde vrijwilligers kunnen
differentiëren naar voorloper T cellen in de aanwezigheid van geselecteerde groeifactoren
in co-cultuur met DLL+ stromale cel lijnen uit muizen 2-5. Deze voorloper T cellen kunnen
na injectie naar de thymus van immuundeficiënte muizen migreren en doen dit bovendien
sneller dan niet-gekweekte stamcellen.
Kweekmethodes welke gebaseerd zijn op retroviraal getransduceerde stromale cellen uit
muizen voor de productie van celtherapie producten zijn minder geschikt als therapeutische/
klinische toepassing. Hoofdstuk 5 introduceert een kweekmethode welke geen gebruik
maakt van stromale cellen uit muizen. Dit systeem, bestaande uit plaat-gebonden DLL4:Fc,
fibronectine en een medium met geselecteerde groeifactoren, resulteerde in de differentiatie
van stamcellen naar voorloper T cellen. Deze T cel voorlopers verkregen een minder
gevorderd rijpingspatroon vergeleken met de cellen geproduceerd in de stromale cel
gebaseerde methode. De zoektocht naar factoren die dit rijpingsverschil kunnen overbruggen,
leverde het nieuwe inzicht dat ascorbinezuur (vitamine C) zowel de rijping als de proliferatie
van de voorloper T cellen verbetert. Differentiatie van verschillende stamcel bronnen,
zowel G-CSF gemobiliseerde als navelstrengbloed stamcellen, bezitten de capaciteit om tot
voorloper T cellen te ontwikkelen in het opgezette systeem. De differentiatie en expansie van
beide celbronnen wordt tevens verbeterd door ascorbinezuur. Hierbij introduceren we een
klinisch toepasbaar kweeksysteem, bruikbaar voor de productie van voorloper T cellen die
het afweersystem van de patiënt na HSCT kunnen versterken. Bovendien tonen we een rol
voor ascorbinezuur aan in de overgang van CD4+CD8+ dubbel negatieve (DN) naar de verder
gerijpte CD4+CD8+ dubbel positieve (DP) T cellen. Het verschil in het kunnen ondersteunen
van T cel ontwikkeling tussen het TSt-4/DLL4 (ProT2/PreT cellen) en het OP-9/DL1 (DP/
CD4 of CD8 enkel positief (SP) cellen) kweeksysteem, komt door de aanwezigheid van
ascorbinezuur in het medium van deze laatste co-cultuur. We concluderen daarom dat
Delta ligand tot expressie brengende stromale cellen niet nodig zijn voor vroege DP T cel
ontwikkeling. Een gedefinieerd systeem waarin stamcellen gekweekt worden met DLL4:Fc,
vier bekende groeifactoren en ascorbinezuur volstaat voor T cel differentiatie.
T cellen en natural killer (NK) cellen delen een gemeenschappelijke voorloper. NK cel
therapie is een cellulaire immuuntherapie tegen kanker welke momenteel onderzocht
wordt. NK cellen hebben onder andere een belangrijke rol in immuun controle en kunnen
bovendien kankercellen elimineren. Het aantal cellen nodig voor therapie is enorm.
Hoofdstuk 6 beschrijft dat ascorbinezuur een versterkende rol heeft op de expansie van
211
Samenvatting
perifere NK cellen, een ontdekking van grote waarde voor het verbeteren/versnellen van
de productie van NK cellen voor therapie. Ook laten we zien dat voorloper NK cellen
gedifferentieerd uit hematopoëtische stamcellen of voorloper T cellen ook positief worden
beïnvloed door ascorbinezuur. Omdat ascorbinezuur goedkoop en klinisch beschikbaar is,
kan het gemakkelijk worden geïmplementeerd in huidige klinische protocollen en klinische
trials.
Door het positieve effect van ascorbinezuur op zowel T als NK cel ontwikkeling en expansie
hebben we de ascorbinezuurwaarden uit serum bepaald van patiënten met hematologische
maligniteiten, vanwege de mogelijke invloed hiervan op het herstel van het immuunsysteem.
Hoofdstuk 7 beschrijft dat patiënten behandeld met chemotherapie of autologe/allogene
stamcel transplantatie inderdaad significant verlaagde ascorbinezuur serumwaardes hebben.
Deze interessante bevinding maakt verder onderzoek naar de mogelijke correlatie tussen
ascorbinezuur serumwaardes en de functie en herstel van immuuncellen plausibel. Ook het
effect van ascorbinezuur op deze parameters is interessant om te onderzoeken.
De bevindingen beschreven in deze thesis dragen bij aan de veelbelovende vooruitgang
in het veld van immuuntherapie. Deze therapieën kunnen bijdragen aan een verbeterde
levensverwachting van patiënten met kanker in de nabije toekomst en zijn daarom van
essentieel belang voor huidig onderzoek en klinische vertaling.
212
Samenvatting
Referenties
1.
Clark RA, Yamanaka K, Bai M, Dowgiert R, Kupper TS. Human skin cells support thymus-
independent T cell development. J Clin Invest. 2005 Nov;115(11):3239-49.
2.
Meek B, Cloosen S, Borsotti C, Van Elssen CH, Vanderlocht J, Schnijderberg MC, et al. In
vitro-differentiated T/natural killer-cell progenitors derived from human CD34+ cells
mature in the thymus. Blood. 2010 Jan 14;115(2):261-4.
3.
Awong G, Herer E, Surh CD, Dick JE, La Motte-Mohs RN, Zuniga-Pflucker JC.
Characterization in vitro and engraftment potential in vivo of human progenitor T cells
generated from hematopoietic stem cells. Blood. 2009 Jul 30;114(5):972-82.
4.
De Smedt M, Hoebeke I, Plum J. Human bone marrow CD34+ progenitor cells mature to T
cells on OP9-DL1 stromal cell line without thymus microenvironment. Blood Cells Mol
Dis. 2004 Nov-Dec;33(3):227-32.
5.
Eyrich M, Schreiber SC, Wollny G, Ziegler H, Schlenker R, Koch-Buttner K, et al. Pre-
differentiated human committed T-lymphoid progenitors promote peripheral T-cell re-
constitution after stem cell transplantation in immunodeficient mice. Eur J Immunol. 2011
Dec;41(12):3596-603.
213
214