No Slide Title

DNA micro arrays
• Heel recente techniek
• Gene array, GeneChip (Affymetrix), genome chip
• Huidig probleem: grote hoeveelheden RNA-nodig 2-5
µg mRNA; 107-108 cellen; 1 tot 10 mg weefsel
• Gebaseerd op reverse hybridizatie
• Niet gelabelde probes op glas of membranen (nylon of
nitrocellulose) in spots kleiner dan 200 µm
• 2 grote varianten (zie artikelen)
• Niet geschikt voor de novo gen ontdekking
DNA micro arrays
• cDNA-probes
– Probes 500 tot 5000 basen, aanmaken van cDNA
libraries met PCR, OPZUIVERING
– Met spotting robot immobiliseren op drager
– Nadelen: lange probes kunnen aanleiding geven tot
mismatch hybridisatie, arbeidsintensief
– Voordeel: kan zelf aangemaakt worden
– Zie artikel vb van gen expressie studie
DNA micro arrays GENEXPRESSIE studies
• Verschillen in gen expressie tussen cellen bestuderen
(ziekte-gezond, met-zonder stimulus,...)
• RNA extractie, met oligo-dT primer cDNA synthese met
fluorescente labels Cye3-dUTP of Cye5-dUTP
• Transcription bias oplossen door vergelijkende studie
• Na hybridizatie scannen met laser an CCD camera
DNA micro array met cDNA probe
DNA micro array met cDNA probe
DNA micro arrays
• Oligonucleotide arrays
– Probes 20-25 basen, kunnen rechtstreeks op chip
(glas slide) gesynthetiseerd worden
– Fotolithografie en oligonucleotide synthese
Oligonucleotide arrays
Oligonucleotide arrays
• Oligonucleotide arrays
– Probes 20-25 basen, kunnen rechtstreeks op chip
(glas slide) gesynthetiseerd worden
– Fotolithografie en oligonucleotide synthese
– Nadeel: moet door firma aangemaakt worden (custom
synthese) Affymetrix
– Voordeel: polyvalenter, specifieker door meerdere
kortere probes per gen, mismatch controles
– Zie artikel
Oligonucleotide arrays
• Toepassingen:
– Gen-expressie vergelijkbaar met cDNA-probe micro
arrays
• Meerdere probes per te bestuderen gen
• Perfect match – mismatch probes
• Kunnen voor een aantal toepassingen aangekocht worden
(zie atikel)
• GEBRUIK:
– Gen-expressie voor klassificatie van kankers, ziekte progressie
voorspellen, gevoeligheid voor bepaalde therapeutica voorspellen
Oligonucleotide array GENEXPRESSIE
studies
Oligonucleotide array GENEXPRESSIE
studies
Typisch resultaat na
verwerking door computer
Geclusterde gen expressie
Groen betekent minder dan
referentie cellen
Rood meer dan referentie
cellen
Zwart gelijke expressie
Oligonucleotide arrays
• Toepassingen:
– Gen-expressie
– DNA-sekwentie informatie
•
•
•
•
Testen voor gekende mutaties in ziekte genen
Single nucleotide polymorfimsen
DNA sequentie bepalen van een bepaald gen
KAN ENKEL MET OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS
Oligonucleotide arrays
Bepalen van de DNA sekwentie van een bepaald gen,
of sommige genen
Detectie van mutaties, substituties
Oligonucleotide arrays
Detectie van verschillende allelen van een bepaalde DNAsequentie
Polymorfismen van genen
SNP analyse en mapping
Allel specifieke oligonucleotide
hybridizatie ASO
• Dot-blotting, target DNA op membraan (nylon,
nitrocellulose) aanbrengen en binden
• Denatureren en gelabelde probe hybridiseren, wassen en
detectie (radio-actief of niet radioactieve technieken (zie
vroeger))
• Kan gebruikt worden voor detectie van puntmutaties
• ASO-probe 15-20 nucleotiden, verschil centraal in probe
• Ook reverse dot-blot met ASO, ongelabelde probe
gebonden op membraan, hybridiseren met gelabeld
target (analoog aan LiPA en AMPLICOR)
ASO
ASO
Oligonucleotide ligation assay OLA
• Test voor gekende punt mutaties of
polymorfismen
• Gebaseerd op ligeren van twee probes indien
complete complementariteit
• Gebruik DNA-ligasen: rTth, T4 DNA ligase
• Testen voor 31 gekende mutaties in één enkele
analyse
• Flourescent gelabelde probes met laser
fluorescentie detectie
Oligonucleotide ligation assay OLA
Pentaethylene oxide eenheden
Fluorescente labels
FAM
HEX
TET
Voor elke label (aantal common
probes) moet IEDERE
selectieve probe een
verschillende lengte hebben
Oligonucleotide ligation assay OLA
In situ amplificatie (In situ PCR)
• PCR in gefixeerde weefsels of cellen, correleren
van PCR reultaat naar morfolgie
• Gevoeliger dan in situ hybridizatie ISH
• Cel voldoende permeabiliseren voor PCR
reagentia, doch voldoende intact om PCR
producten te behouden
• Studie van gen expressie en mutaties in
abnormale cellen of weefsels
In situ amplificatie (In situ PCR)
Proteinase K
Formalin
paraformaldehyde
Denhardt’s
solution
Southern blotting
Ook ASO probe
mogelijk
Ook niet radioActieve labeling
mogelijk
RFLP
• = Restriction Fragment Length Polymorphism
• Gebruikt southern blotting
• Typeren van mutaties die een restrictie-site
veranderen en grote inserties of deleties tussen
restrictie-sites
• Ook voor genotypische klassificatie van virussen
RFLP
Detectie met DNAprobe specifiek
voor b-globine gen
GEEN ASO-probe
Restriction mapping
• Gebruikt ook Southern blotting
• Detecteerd gen-deleties, met intragene DNAprobe (probe tegen sekwentie in het gen)
• Kleine deleties (100 tal basen) korter fragment
• Grote deleties geen fragment indien homozygoot,
heterozygoot minder intens ten opzichte van
andere fragmenten
• Vb 21-hydroxylase deficiency (deficientie in
cortisol en aldosteron productie)
Restriction mapping
Pseudogenen
Functionele genen
2
1
1
1
Northern blotting
• Variant van Southern waarbij het target RNA is
ipv DNA
• Studie van expressie patroon van een gekloond
gen in verschillende weefsels
• Geen restrictie enzymen nodig
Northern blotting