University of Groningen Structure of photosystem II van Bezouwen

University of Groningen
Structure of photosystem II
van Bezouwen, Laura
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2016
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
van Bezouwen, L. (2016). Structure of photosystem II [Groningen]: Rijksuniversiteit Groningen
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Samenvatting Samenvatting Introductie In groene organismen wordt licht energie omgezet naar chemische energie met behulp van fotosynthese. Dit proces bevat vier belangrijke eiwitten: fotosysteem I, fotosysteem II, het cytochroom b6f en de ATP synthese. Fotosysteem I en fotosysteem II worden door licht aangestuurd en hier vinden de eerste fotosynthetisch reacties plaats. Gedurende deze reactie wordt water omgezet naar zuurstof en kleine enzymen zetten NADP+ om naar NADPH. In de donker reactie wordt koolstofdioxide omgezet tot suikers met behulp van de energie die is opgeslagen in de ATP en NADPH. In fotosysteem II wordt met behulp van zonlicht water gesplitst in zuurstof, protonen en elektronen. Deze vier eiwitten bevinden zich in de membranen van de thylakoïden, en deze bevinden zich in planten in een speciaal organel, de chloroplast, of bladgroenkorrel. Zowel fotosysteem I als fotosysteem II zijn grote multi-­‐subeenheid bevattende eiwit-­‐
pigment complexen. Afhankelijk van het organisme hebben fotosysteem I en fotosysteem II een in een membraan ingebed, perifere antenne complex, de licht-­‐
oogstende eiwit-­‐pigment complexen, of een membraan gebonden complex, de phycobilisomen. Terwijl de structuur van fotosysteem I is blootgelegd met X-­‐ray kristallografie voor verschillende organismen, zijn er voor fotosysteem II enkel structuren bekend van cyanobacteriën en zeer recent ook van rode algen, maar niet van planten. Het begrijpen van de structuur om zodoende de exacte functie te achterhalen, is zeer belangrijk voor het optimale gebruik van de eigenschappen. Fotosysteem I heeft een kerngedeelte welke bestaat uit 12-­‐16 sub eenheden en dit hangt af van het organisme. Cyanobacteriën hebben de phycobilisomen als een antenne complex, waar planten 4 extra licht-­‐oogstende eiwit-­‐pigment complexen hebben in een 1:1 ratio met het kerngedeelte. Rode algen zijn waarschijnlijk de link tussen de cyanobacteriën en planten in evolutie. Al is het niet bekend hoeveel licht-­‐
oogstende eiwit aan het kerngedeelte binden. Fotosysteem II heeft een dimeer als kerngedeelte, en een monomeer bevat 20-­‐23 sub eenheden, afhankelijk van het organismen. Waar cyanobacteriën en rode algen phycobilisomen hebben als antenne complex, hebben planten de licht-­‐oogstende complexen. Deze complexen bevatten zes verschillende eiwitten, waarvan drie in heterotrimeren voorkomen. De andere drie zijn de kleine antenne eiwitten en komen voor als enkelvoudige eiwitten. Een plant kan tot zes van de licht-­‐oogstende heterotrimeren binden, hiervan zijn er twee sterk gebonden, twee middel sterk gebonden en twee losjes gebonden. De laatste twee zijn alleen gevonden bij fotosysteem II in spinazie. De focus van deze thesis is de structuur bepaling van fotosysteem II van rode algen en planten, met behulp van verschillende elektronenmicroscopische technieken. 138 Samenvatting Ernst Ruska heeft de elektronenmicroscoop uitgevonden in 1931, waarvoor hij een Nobel prijs voor de natuurkunde heeft gekregen in 1986. Het voordeel van elektronenmicroscopie ten opzichte van lichtmicroscopie is gebaseerd op de golflengte. Elektronen hebben namelijk een kleinere golflengte dan fotonen, en daarom kan een resolutie behaald worden in het gebied sub-­‐Ångström. In het veld van de biomoleculen kan momenteel een bijna-­‐atomische resolutie worden behaald, vanwege de recente nieuwe instrumentele ontwikkelingen. Een plaatje wordt gecreëerd in een elektronenmicroscoop doordat er versnelde elektronen van een elektronen bron afkomen. Dit kan zowel een simpele thermische bron zijn of een zeer geavanceerde veld-­‐emissie bron. Een coherente bundel van versnelde elektronen wordt verstrooid door een object terwijl deze door een kolom gaan, waar een complex lenzen system in zit waarmee een vergroot plaatje wordt gecreëerd. De kolom staat onder hoog vacuüm, zodat ongewenste verstrooiing van de elektronen zo veel mogelijk wordt vermeden. Om het specimen te vergroten zijn er verschillende soorten lenzen nodig. De eerste is de condensor lens en deze bevindt zich voor het specimen. Deze lens is noodzakelijk voor de intensiteit en de grootte van de elektronen bundel. De objectief lens produceert het eerste beeld, de projector lenzen vergroten dit beeld verder. Voor hoge resolutie beelden moet ook met enkele andere aspecten rekening worden gehouden. De eerste betreft de imperfecties van de lenzen. Hierdoor zijn er verschillende afwijkingen: sferisch en chromatische aberraties en het astigmatisme. Het tweede aspect is beeldvorming en hoe de twee, elastisch en inelastisch, verstrooiingen bijdragen aan het contrast van het eind plaatje. De contrast overdracht functie (CTF) is het derde aspect. De CTF beschrijft de overdracht van de ruimtelijke informatie van het object naar het beeld. Dit is namelijk een functie van de defocus instelling van de objectieflens, de hoeveelheid astigmatisme en de golflengte van de elektronen. Het laatste onderdeel is de camera. De eind resolutie, die bereikt kan worden gedurende data verwerking, hangt zeer sterk af van de kwaliteit van de camera. In het verleden zijn zowel film als CCD camera’s gebruikt, maar beide hebben nadelen. Langzaam aan wordt bij hoge resolutie werk de CCD camera’s en de film vervangen door directe elektronen detectoren, vanwege hun superieure kwaliteit tijdens het opnemen van data. Een extra voordeel van dit type camera is dat de beelden kunnen worden opgenomen als dosis-­‐gefractioneerde filmpjes en daardoor kan er voor de door de elektronen bundel veroorzaakte bewegingen gecorrigeerd worden. Zelfs wanneer alle deze aspecten in acht worden genomen moet het specimen nog steeds voorbereid worden voor het vacuüm. Twee relevante technieken worden 139 Samenvatting besproken, negatief kleuren en in ijs ingebedde samples. Negatief kleuren gebeurt bij kamer temperatuur en de eiwitten worden ingebed in een laagje zout van een zwaar metaal. Hiermee wordt voorkomen dat het eiwit ineenstort en dit zorgt voor een beter contrast. Bij het inbedden in ijs, ook wel cryo-­‐EM genoemd, blijven de eiwitten volledig gehydrateerd terwijl ze ingevroren zijn in een dun laagje ijs. Dit gebeurt zonder toevoeging van een zwaar metaal zout. Omdat dit alles wordt gedaan bij temperaturen onder het sublimatiepunt, kan er ondanks het vacuüm een beeld worden gevormd in de microscoop. Er zijn verschillende manieren om een structuur met behulp van een elektronen microscoop te bepalen. Twee daarvan worden besproken en dat zijn de losse deeltjes analyse en de elektronen tomografie. Met losse deeltjes analyse wordt een 2D of 3D reconstructie gemaakt van projecties van individuele eiwitten of geïsoleerde complexen. Met elektronen tomografie wordt een hele cel gebruikt of unieke sub-­‐cellulaire structuren en een 3D reconstructie van deze specimenen wordt geproduceerd. Om een vraag te beantwoorden over een structuur of complex in situ bij een hogere resolutie kan sub-­‐tomogram averaging worden gebruikt. Alleen niet elke vraag over een structuur kan beantwoord worden met deze technieken, zonder dat een extra stap voor het klaar maken van het specimen aan toe wordt gevoegd. Een mogelijkheid is cryo-­‐focused-­‐ion-­‐beam milling. Met deze techniek worden er laagjes van 200 tot 500 nm dik gecreëerd welke gebruikt kunnen worden met elektronen tomografie. Een andere optie is cryo-­‐scanning transmissie elektronen tomografie. Hiermee kan het contrast van dikkere samples worden verbeterd en zo kan een betere signaal-­‐ruis verhouding worden gecreëerd. Hetzelfde geldt voor het toevoegen van een fase plaat bij elektronen tomografie. Dit proefschrift In hoofdstuk 2 beschrijven we het biochemische en biofysische karakter van de rode alg, Cyandioschyzon merolae. Leden van de Rhodophyta order Cyanidiales zijn uniek tussen de fototropen, vanwege hun mogelijkheid om te leven bij extreem lage pH niveaus en gemiddeld hoge temperaturen. Het fotosynthese onderdeel van de rode alg C. merolae representeert een tussentype tussen cyanobacteriën en planten. Dit suggereert dat deze alg de evolutionaire link is tussen de prokaryoten en eukaryotische fototropen. Hoewel er vandaag de dag een gedetailleerd model op atomisch niveau is van fotosysteem II van cyanobacteriën, is er geen vergelijkebare structuur bekend van fotosysteem II van eukaryoten tot op heden. In deze studie beschrijven we de isolatie en karakterisering van een zeer actieve en robuuste fotosysteem II dimeer van C. merolae. We laten zien dat dit complex zeer stabiel is in een heel scala van extreem licht, temperatuur en pH condities. Tijdens het meten 140 Samenvatting van de fluorescentie uitdoving eigenschappen van de geïsoleerde C. merolae fotosysteem II complexen konden we voor de eerste keer aantonen dat de non-­‐
photochemical quenching in het reactie centrum pH afhankelijk is. Dit type quenching, samen met de hoge hoeveelheid zeaxanthin is blijkbaar het onderliggende zeer efficiënte fotoprotectie mechanisme, welke in dienst is van dit zeer robuust natuurlijk water-­‐splittende complex onder zeer veel straling. Om de structurele details van deze eukaryotische vorm van fotosysteem II te bepalen, hebben we met behulp van een elektronen microscoop en losse deeltjes analyse een structurele map van C. merolae opgelost met een resolutie van 17 Å. Hierin konden we de dichtheid die correspondeert met het extrinsieke eiwit PsbQ’ lokaliseren. Dit eiwit is betrokken in de stabilisatie van het zuurstof-­‐ontwikkelende complex. We hebben geconcludeerd dat het eiwit, gelokaliseerd aan de lumen kant, aanwezig is in de nabijheid van CP43, dicht bij het membraan vlak. In hoofdstuk 3 is er geprobeerd om een hoge resolutie structuur van planten fotosysteem II op te lossen in het membraan vlak. Hiervoor is de gerst (Hordeum vulgare) mutant viridis zb63 gebruikt. Deze mutant heeft geen fotosysteem I expressie, en hierdoor maakt de plant natuurlijke tweedimensionale kristallijne gebieden van fotosysteem II, met enkel het C2S2 deeltje. Deze kristallijne stukken zijn zeer geschikt voor structurele analyse. We zijn begonnen met een 2D kristallografische methode om de structuur van fotosysteem II te bepalen. Maar vanwege de dubbele lagen in de kristallijne stukken, die niet gescheiden konden worden, is er gewisseld naar een andere techniek om de data te analyseren, namelijk losse deeltjes analyse. Gebaseerd op beide technieken is er een 2D structuur bepaald met een resolutie van 13 Å. In deze projectie map kon de locatie en de oriëntatie van de kleine antenne eiwitten bepaald worden. Dit resultaat is vergeleken met eerder gepubliceerde resultaten en dit is uitgebreid besproken. Ook is er besproken waarom er is gewisseld tussen de twee technieken. Hoewel het resultaat van hoofdstuk 3 al een verbetering was ten opzichte van eerder gepubliceerde fotosysteem II resultaten, was het resultaat niet goed genoeg om ook daadwerkelijk de locatie van alle sub eenheden te bepalen. Daarom hebben we besloten gebruik te maken van het geïsoleerd grootste algemene fotosysteem II supercomplex, namelijk het C2S2M2 deeltje. In hoofdstuk 4 wordt voor de allereerste keer een hoge resolutie structuur van planten fotosysteem II gepresenteerd. De algemene resolutie van het deeltje is 5.4 Å maar op plekken in het kerngedeelte ligt de lokale resolutie tegen de 4 Å aan. Gebaseerd om deze resolutie was het mogelijk om alle sub eenheden van het kerngedeelte te lokaliseren, inclusief de onbekende locatie van sub eenheid PsbW. In het kerngedeelte missen twee kleine intrinsieke sub eenheden, PsbJ en PsbY, en ook de extrinsieke sub eenheden PsbP, PsbQ en 141 Samenvatting PsbR missen. De locatie en oriëntatie van de antenne eiwitten kon ook bepaald worden, al was de resolutie van de M-­‐trimer en CP24 limiterend. Voor alle regio’s konden de locaties van de chlorofyllen bepaald worden. De gevonden chlorofyllen van het kerngedeelte zijn geconserveerd gebaseerd op de cyanobacteriën. De chlorofyllen van CP26 en CP24 konden ook worden geïndiceerd, dit is gedaan gebaseerd op de bekende kristalstructuren van de LHCII trimeer en CP29. Mogelijke andere pigmenten en lipiden zijn ook aangeduid, maar het mangaan cluster mist in deze structuur. Dit wordt in een uitgebreide discussie uitgelegd. Hierin worden ook andere mogelijkheden om de structuur te verbeteren besproken. In het laatste hoofdstuk, hoofdstuk 5, was de bedoeling om in situ de structuur van de phycobilisomen te bepalen en hun connectie met fotosysteem II en/of fotosysteem I. Cyanobacteriën hebben namelijk geen ruimtelijke scheiding van de twee fotosystemen in de thylakoïde membranen. De phycobilisomen zijn gebonden aan de membranen. Verschillende soorten cyanobacteriën, die geschikt zouden moeten zijn voor elektronen tomografie, zijn bekeken. Met behulp van deze techniek is het mogelijk geweest om de interne membranen aan de punt van de bacterie zichtbaar te maken. De membranen komen per paar voor en hebben ongeveer een afstand van 50 nm. Tussen deze membranen konden we voor de eerste keer in intacte cyanobacteriën de phycobilisomen lokaliseren. In een kritische discussie wordt besproken hoe voor zulke grote bacteriën de visualisatie van de interne structuren verbeterd kan worden. Nieuwe instrumentele ontwikkelingen en sub-­‐tomogram averaging kan helpen om uiteindelijk de interactie van de phycobilisomen met fotosysteem II en/of fotosysteem I zichtbaar te maken. 142