gebruik van tumor celculturen in de studie naar oncolytische virussen

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2008-2009
Gebruik van tumor celculturen in de studie naar
oncolytische virussen
door
Dirk Pieter Westra
Promotor: Prof. Dr. Hans J. Nauwynck
Studieproject in het kader
van de Masterproef
De auteur geeft de toelating deze studie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens
vermeld in deze studie berust bij de promotor. Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde
studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en
de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie
geciteerd en beschreven zijn.
Voorwoord
Graag wil ik mijn promotor Prof. Dr. Hans J. Nauwynck bedanken als motivator en voor de gesprekken
die tot meerdere inzichten hebben geleid.
Inhoudsopgave
Samenvatting
1. Inleiding
p.2
2. Literatuurstudie
p.3
2.1 Verkrijgen van tumorcellen
p.3
2.1.1 ATCC
p.3
2.1.2 FNA
p.4
2.1.3 Biopsie
p.4
2.1.4 Tumor inductie van cellen in cultuur
p.4
2.2 Media voor tumorcellen en opgroei
p.5
2.2.1 Chemische parameters
p.5
2.2.2 Fysische invloeden
p.6
2.2.3 Biochemische processen
p.6
2.3 Contaminatie van celculturen
p.7
2.4 Cryopreservatie
p.8
2.5 Typeren van neoplastische cellen
p.8
2.6 Tumor celculturen
p.10
2.6.1 Hepatocellulair carcinoma
p.10
2.6.2 Pancreastumoren
p.12
2.6.3 Mammatumoren
p.13
2.6.4 Hersentumoren
p.15
3. Bespreking
p.17
4. Literatuurlijst
p.19
Samenvatting
Kanker is een erge en vaak ongeneeslijke ziekte. De ziekte is gekenmerkt door een ongecontroleerde
vermeerdering van cellen die naargelang het type tumor kunnen uitzaaien in verschillende organen.
Tumoren komen zowel bij de mens voor als in het dierenrijk, ook bij onze gedomesticeerde dieren.
Om onderzoek te doen naar het tumorgedrag, de ontwikkeling van therapieën en nieuwe
beeldvormingtechnieken worden naast diermodellen vaak celculturen gebruikt. Veelal spitst het
onderzoek zich op het vinden van gestoorde signaal-transductiewegen of op genetische afwijkingen in
de oncogenen en de tumor suppressor genen. Indien deze afwijkende paden gekend zijn wordt er
vervolgens gekeken naar mogelijke strategieën om deze tumorcellen te kunnen diagnosticeren en te
behandelen.
Hierbij
zijn
chemotherapie
en
radiatie
van
tumorcellen
bekende
behandelingsmodaliteiten. Een andere therapie in opkomst is de gentherapie. Hierbij wordt getracht
het genoom zo te modificeren dat de tumorcel te gronde gaat. Het inbrengen van vreemde transgenen
kan onder andere via vectoren, hiertoe kunnen virussen met succes worden aangewend. Het virus
kan de kankercel infecteren en vervolgens een cytotoxisch gen tot expressie brengen waardoor de
tumorcel wordt afgedood. Omdat virussen afhankelijk zijn van levende cellen voor hun vermeerdering
zouden tumor celculturen geschikte studiemodellen kunnen zijn voor kankeronderzoek. In dit
studieproject zal daarom nader worden in gegaan op deze tumor celculturen. Hierbij worden het
vergaren van tumorcellen, de opgroei in verschillende media, eventuele contaminatie, de
cryopreservatie en het typeren van tumorcellen beschreven. Als laatste komen verschillende typen
van tumorcellen van de hond en de mens aan bod.
1. Inleiding
Kanker is een erge ziekte waaraan jaarlijks vele mensen en dieren sterven. De ziekte is gekenmerkt
door een progressieve woekering van lichaamseigen cellen. Door celatypie en verlies van
celdifferentiatie raakt de cel haar biologische functie kwijt. Vele tumoren groeien invasief en kunnen
metastaseren naar andere organen waardoor het weefsel wordt verwoest. De behandeling van kanker
wordt vaak bemoeilijkt doordat vele tumoren niet reageren op radiotherapie en chemotherapie of
doordat micrometastasen nieuwe gezwellen vormen na tumorresectie.
Door het ontrafelen van de genetische code en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de regulatie
van de transcriptie is de wetenschap naarstig op zoek naar verschillende methoden om op het
genomische vlak tumoren te bestrijden. Daarnaast kwamen er doorbraken op het vlak van de
dynamiek van de celcyclus. Zo raakt er steeds meer bekend over de celcyclus controle punten, de
DNA-reparatiemechanismen en de celsenescentie, welke vaak ontregeld zijn in neoplasiën (43). Door
de verworven kennis is het mogelijk om gericht te zoeken naar nieuwe tumortherapieën.
Tumoren kunnen congenitaal zijn of verworven. Voorbeelden van congenitale tumoren zijn oa.
embryonale rhabdomyosarcoma’s (ERMS) (35) en maligne melanoma. Deze laatste wordt in verband
gebracht met zeer grote congenitale melanocyt nevi (CMN) die de kans op melanoma verhogen (17).
Belangrijk in hun cancerogenese zijn genetische abnormaliteiten veroorzaakt door hyperdiploidie,
translocaties van genen (ERMS) en toevallige mutaties in het genoom (maligne CMN). Tumoren
opwekken kan op verschillende manieren. Sommige toxische stoffen kunnen carcinogeen werken.
Een voorbeeld hiervan is het voedselgeassocieerde mycotoxine deoxynivalenol (DON). DON is
volgens Khairul et al. (2009) verantwoordelijk voor de deregulatie van stress-respons genen die onder
andere coderen voor histon-methylerende enzymen. Deze enzymen zijn in staat Hox genen
(homeobox genen), een groep van belangrijke geconserveerde genen, op te reguleren zodat de
celcyclus en celdifferentiatie verstoord raakt.
Een andere manier van tumoren induceren is via infectieuze agentia. Zo wordt het EBV (EbsteinBarr-virus) of humane herpesvirus-4 geassocieerd met overexpressie van het DNA methyltransferase
1 (DNMT 1). Verhoogde expressie van DNMT 1 is verantwoordelijk voor aberrante DNA methylatie
patronen in maagcarcinomen (22). Een gestoorde methylatie kan volgens Tsuyoshi et al. (2004) tot
een verhoogd verlies van allelen leiden, tot verhoogde mutageniciteit en tot onderdrukking van
transcriptie door methylatie van
CpG-eilanden. Gemethyleerde CpG-eilanden kunnen uiteindelijk
verantwoordelijk zijn voor neerwaartse regulatie van tumorsuppressor gentranscripten. Het ENTV of
enzootische nasale tumor virus van schapen is een ander voorbeeld van een infectieus gemedieerde
tumor. Dit virus behoort tot de retrovirussen, net zoals de Jaagsiekte is het in staat via de envelop
proteine (Env) de nasale epitheliale cel via de Hyal 2 receptor te infecteren en
vervolgens te
transformeren tot een nasale adenocarcinoma. Volgens Dirks et al. (2001) zijn er drie manieren hoe
het retrovirus de cel transformeert. Namelijk door virale expressie van cellulair afgeleide oncogenen,
of door middel van insertiemutagenese van een retroviraal provirus in of vlakbij belangrijke protooncogenen en als laatste door expressie van oncogene virale proteïnen (Env). Deze oncogenen
kunnen de cel immortaliseren zodat het virus kan blijven repliceren.
2
Virussen kunnen echter ook gebruikt worden om neoplasiën te bestrijden. Zo kan een virus een
tumorcel infecteren en na replicatie de cel lyseren of een genproduct tot expressie brengen met
antitumorale eigenschappen. Volgens Huch et al. (2009) bestaan er nauwelijks goede therapiën tegen
bepaalde hoogmaligne tumoren, zoals pancreascarcinomen. Dit komt omdat deze tumoren weinig
reageren op cytostatica omdat deze stoffen weinig pancreasspecifiek werken en doordat deze cellen
relatief inactief zijn. Daarom wordt er gezocht naar andere strategiën. Een daarvan is de virale
tumortherapie. Daartoe hebben Huch et al. (2009) een conditioneel replicerend adenovirus
geconstrueerd. Het urokinase-type plasminogeen activator receptor (uPAR) van pancreastumorcellen
is zeer dens op de celmembraan, in tegenstelling tot andere normale cellen. De synthese van uPAR in
deze cellen is dan ook zeer hoog. Deze uPAR is zeer belangrijk in de tumorgenese. Het fasciliteert
ondermeer celmigratie en tumorgroei. Door middel van insertie van een uPAR promotor in het genoom
van een adenovirusvector zou dit virus selectief kunnen repliceren in uPAR dense pancreas
tumorcellen. Er werd met een replicatief-defectief-adenovirus-luciferase-uPAR-promotor (Ad-uPARLuc) hogere luminiscenties vastgesteld dan in normale pancreascellen. Dit gaf het bewijs dat het
luciferase gen inderdaad onder verhoogde promotoractiviteit stond door de uPAR promotor in de
tumorcel. De 2 adenovirus genen E1A en E1B
coderen voor 2 anti-apoptose moleculen. Deze
remmen de p53 en/of pRb apoptose pathways. Omdat in tumoren deze apoptosewegen frequent
defect zijn, zijn deze 2 genen overbodig. Aldus kunnen deze genen uitgewisseld worden met andere
interessante genen, zoals de uPAR promotor (49). Om het cytopathogeen effect na te gaan werd een
replicatief-oncolytisch-adenovirus-uPARpromotor (Ad-uPAR-E1A) getest op verschillende pancreas
tumorcellen. Deze cellen vertoonden verhoogde CPE, gelijkaardig aan het veel gevaarlijkere en
aselectieve wildtype adenovirus. Dit betekent dat Ad-uPAR-E1A een gelijkaardig cytopathogeen effect
vertoont als het wilde type adenovirus echter meer specifiek in pancreastumorcellen dan in gezonde
cellen. In muis xenograft studies werd verhoogde overleving vastgesteld evenals verminderde
tumorgroei en metastatische capaciteit van tumorale pancreascellen na inoculatie van replicatief
oncolytisch Ad-uPAR-E1A.
Om het onderzoek naar de ontstaanswijzen en de bestrijding van tumoren te vereenvoudigen en te
standaardiseren worden celculturen gebruikt. In dit studieproject zal nader ingegaan worden op de
celculturen die veel gebruikt worden naar het onderzoek in de virale tumortherapie. Eveneens zullen
er technieken aan bod komen die gebruikt kunnen worden om veranderingen in de DNA integriteit op
te sporen en voor het meten van tumormarkers.
2. Literatuurstudie
2.1 Verkrijgen van tumorcellen
2.1.1 ATCC
De afkorting ATCC staat voor de American Type Culture Collection, dit is een nonprofit organisatie die
meer dan 5000 celcultuur typen bewaart van verschillende weefsels en species. Wetenschappers
3
kunnen via hun internetsite, www.lgcstandards-atcc.org, deze celculturen aankopen en eventueel
technische ondersteuning verkrijgen.
2.1.2 FNA
Met FNA wordt “fijne naald aspiraat” bedoeld, bij deze techniek wordt een gewone spuit met naald
gebruikt om tumorale cellen op te zuigen. Deze techniek wordt niet alleen gebruikt in de orthopedie
om intra-articulaire lesies (50) te diagnosticeren maar ook in de oncologie om celaspiraten van
neoplasien te bekomen. De techniek kan bij transcutane FNA naast palpatie eventueel begeleid
worden met medische beeldvormingtechnieken (47). Indien asepsie nagestreefd wordt is het een
makkelijke en relatief atraumatische manier van staalname, die tevens zonder lokale anesthesie
uitgevoerd kan worden. Eveneens kan het geschikt zijn indien eigenaars van de patiënt in kwestie
geen postmortale autopsie wensen. Een groot voordeel is dat indien het letsel niet tumoraal is het
betreffende weefsel gespaard wordt van resectie, dit kan in geval van ovariële letsels beteken dat de
vruchtbaarheid bewaard blijft (52). Nadelen komen naar voor met deze techniek indien de naald
verkeerd geplaatst wordt, bijvoorbeeld naast de tumorale massa of zelfs in een ander naastgelegen
pathologisch proces. Een ander nadeel is de kleinere hoeveelheid aan celmateriaal die bekomen
wordt vergeleken met chirurgische biopsie (62). Tevens bevat het aspiraat ook andere cellen,
bijvoorbeeld stromale cellen die een primaire tumorcultuur kunnen overgroeien. Opvallend is dat
invasief groeiende tumoren meer verlies aan celcontact hebben en daardoor beter geaspireerd
worden (66). Nadelig kunnen de daaruit voortvloeiende implantatiemetastasen vermeld worden ter
hoogte van het naaldtraject (26,52).
2.1.3 Biopsie
Verschillende chirurgische technieken worden beschreven, zoals excisie biopt, wigvormige incisie en
de tru-cut naald methode. Nadeel van deze methoden is dat ze invasief zijn en onder aseptische
omstandigheden dienen uitgevoerd te worden met lokale of algemene anesthesie. Andere nadelen
zijn bloedingen, abcedatie, fistulatie en traumatische ontstekingen (26,62). Voordeel is dat er veel
weefsel gewonnen kan worden voor primaire celculturen en dat er histopathologische preparaten van
kunnen worden gemaakt (61).
2.1.4 Tumor inductie van cellen in cultuur
Verschillende fysische en chemische invloeden kunnen een carcinogene, mutagene of mitogene
werking hebben. Volgens Bignold et al. (2004) moet een carcinogeen celschade aanrichten zonder
dat de DNA synthese wordt getermineerd. Er bestaan verschillende mechanismen daarvoor, een
daarvan is de aantasting van enzymatische reactieve plaatsen in het DNA-polymerase. Hierdoor
worden verschillende functies van het DNA-polymerase aangetast. Bijvoorbeeld de base selectie, de
mismatch repair en de proofreading van het DNA-polymerase. Hierdoor kunnen mutaties ontstaan in
tumor suppressor genen. Zeer potente carcinogenen voor de lever zijn de carbazolen, namelijk 7Hdibenzocarbazole (DBC) en de methyl derivaat 5,9-dimethyldibenzocarbazole (DiMeDBC). DiMeDBC
is volgens Valovicova et al. (2009) selectiever hepatocarcinogeen dan DBC, daar de laatste ook
4
toxisch is voor de huid. In dierexperimenten, ondermeer bij honden, ontstaan er na subcutane
administratie van DBC en DiMeDBC meerdere maligne levertumoren en longmetastasen in honderd
procent van de gevallen.
Met behulp van transgenen kunnen tumorale cellen verkregen worden door welbepaalde oncogenen
tot expressie te brengen, een voorbeeld van een transgen met tumorale eigenschappen is het c-myc
(17). Virale vectoren kunnen gebruikt worden om oncogenen te transfecteren naar cellen.
2.2 Media voor tumorcellen en opgroei
Vele tumoren zijn wat betreft hun aberrante fenotype heterogeen. Dit komt doordat er verschillende
defecten kunnen optreden ter hoogte van het genoom. Volgens Bruserud et al. (2005) is het nodig om
in de toekomst gestandaardiseerde media te gebruiken opdat meerdere defecte signaal-transductie
wegen vergeleken kunnen worden binnen verschillende cellijnen. Hierdoor kunnen er comparatieve
therapeuthische in vitro modellen ontstaan. Bekend is dat chemische, fysische, biochemische
processen in het medium waarin de cellijnen vertoeven een grote invloed kunnen hebben op het
fenotype van cellijnen en dus ook op de expressie van het genoom (51).
2.2.1 Chemische parameters
Zuurstof is een vereiste opdat cellen hun cellulaire respiratie kunnen uitoefenen. Normoxische
condities zijn 21 % zuurstof; 1% en 0 % zuurstof zijn respectievelijk hypoxisch en anoxisch. De
cellulaire respons is zeer divers na zuurstof deprivatie, in een studie ernaar uitgevoerd door Sorensen
et al. (2009) werden meerdere proteinen op gereguleerd na hypoxische stress. Hypoxie reguleert
meerdere genen waaronder deze van de HIF-pathway (hypoxia-inducible-factor), mTOR (mammalian
target of rapamycin) en de UPR pathway (unfolded protein response) (29). Zo werd een verhoogde
expressie vastgesteld van stress respons moleculen (heat shock proteins) en metabole enzymen,
zoals deze die tussenkomen in de anaerobe glycolyse. Ook werden cytoskeletale proteinen,
antioxidanten, cAMP hydrolasen, proteine disulfide isomerasen en dyneine opgereguleerd. Uiteindelijk
contribueerde dit in een metabole adaptatie aan hypoxie, stabilisatie van eiwitten, verhoogde
celoverleving en tumorinvasie (43). Eveneens reageert de cel op hypoxie door verhoogde secretie van
vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), zodat de tumormassa in vivo hypervasculariseert (31).
Volgens Koumenis et al. (2006) leiden hypoxische regio’s in tumormassa’s tot verhoogde
radioresistentie en chemoresistentie. Dit komt doordat hypoxische tumor cellen hun metabolisme en
celcyclus neerwaarts reguleren en zo minder permissief worden aan chemotherapeutica. Verhoogde
radioresistentie wordt op zijn beurt weer veroorzaakt door een tekort aan zuurstof, waardoor de
straling geen toxische zuurstof radicalen kan aanmaken om het DNA te beschadigen. Deze maligne
eigenschappen worden ook vermeld voor viraal geïnduceerde cervixcarcinomen. In een in vitro studie
uitgevoerd door
dezelfde onderzoeksgroep van Koumenis
werden verschillende pogingen
ondernomen om de regulatie door hypoxie te ontrafelen. Twee verschillende mechanismen zouden
verantwoordelijk zijn namelijk door fosforylatie en inhibitie van het eukaryote initiatie factor 2 alfa (eIF2alfa) en van het eukaryote initiatie factor 4F (eIF-4F). Deze inhibitie zorgt uiteindelijk voor een
algemeen verminderde proteïne synthese daar het preinitiatiecomplex niet gevormd kan worden.
5
Opvallend is dat welbepaalde genen wel tot expressie worden gebracht namelijk degene die
verantwoordelijk zijn voor verandering in het celmetabolisme en deze die angiogenetische factoren
coderen.
2.2.2 Fysische invloeden
Hittestress kan cellulaire eiwitten ontrafelen en tot aggregaten aaneen klitten met verlies aan
functionaliteit. De cel zal hier op antwoorden door middel van verhoogde expressie van heat shock
proteins (HSPs). Dit zijn moleculen met cytoprotectieve eigenschappen, volgens Calderwood et al.
(2006) hebben de HSPs twee grote taken namelijk; proteine vasthouden (chaperonen) tijdens mRNA
synthese, constitutief en gedurende hittestress of eiwitten vouwen (chaperonine) in hun finale tertiaire
structuur. Echter verlies aan p53 (tumor suppressor gen) en verhoogde expressie van protooncogenen zoals c-MYC kan resulteren in verhoogde expressie van HSPs. Op deze manier vergaart
de tumor meer cytoprotectie en kan ondermeer ontsnappen aan apoptose en celsenescentie.
2.2.3 Biochemische processen
Cellijnen worden in laboratorium omstandigheden opgekweekt in verschillende media. Deze bevatten
water, zuurstof, elektrolyten, groeifactoren en nutriënten voor het basale metabolisme van de cel.
Meestal wordt er ook bovine serum of foetale kalf serum (FCS) aan het medium toegevoegd. FCS
heeft volgens Clavreul et al. (2009) een antioxidante werking. Naast proteïnen bevat FCS ook
carbohydraten, vrije vetzuren en aminozuren. Het is dus een heterogene en moeilijk te
standaardiseren oplossing. In een studie uitgevoerd door Tabakov et al. (2009) werden lymfocyten in
cultuur gebracht met en zonder serum (serum vrij medium), vervolgens werd aan beide IL-2 en de
mitogeen phytohemagglutinine toegevoegd. Optimale proliferatie werd voor serum vrije media bij een
zes maal lagere concentratie bekomen dan voor serum bevattende media. Dit zou te wijten zijn aan
neutraliserende of bindende eigenschappen van globulinen in het serum, waardoor de ongebonden
biologische fractie daalt in serum bevattende media. Verschillende bestanddelen in de media kunnen
een invloed hebben op de mitogene activiteit van de cellen, belangrijk is dan ook om dit te
standaardiseren om tot comparatieve studies te kunnen komen tussen heterogene cellen van
eenzelfde of verschillende type tumor (8). Daarom wordt er steeds meer onderzoek gedaan naar het
gebruik van serum vrije media. Een ander gevaar van het gebruik van FCS situeert zich op het
klinische niveau, namelijk bij het maken van tumorvaccins gebaseerd op tumorcel lysaten is het
mogelijk dat bacteriën, virussen of prionen de patiënt infecteren na inoculatie van het vaccin (15).
Glucose is een belangrijk bestanddeel voor het basale metabolisme van de tumorcel. Hypoxie en
glucose tekort komen veelvuldig voor in in vivo condities van tumoren. Zoals hoger vermeld voor
hypoxie is het ook mogelijk om het fenotype van tumorcellen te veranderen door glucose deprivatie.
Zo werd door Natsuizaka et al. (2007) aangetoond dat er vijf van de vijfenveertig HIF geassocieerde
genen verhoogd tot expressie werden gebracht. Deze coderen ondermeer voor GLUT-1, GLUT-3,
hexokinase-2 en adrenomodullin. GLUT-1 en GLUT-3 zijn glucose transport moleculen die door
insuline geactiveerd worden en de glucose-concentraties in de cel moeten waarborgen. Volgens
Kuhajda et al. (2008) kent de tumorcel twee strategieën om het celmetabolisme aan te passen
6
naargelang het energie aanbod. Verschillende kankers kennen twee gecombineerde metabole wegen
namelijk; de aerobe glycolyse en de lipogenese. Deze zijn in normale cellen meestal niet frequent
tegelijk aanwezig. Het LKB1 is een AMPK kinase. LKB 1 fungeert als cel energie controle punt en als
tumor suppressor gen. Indien de AMP/ATP ratio stijgt door energiedepletie, door een verhoogd
verbruik van het ATP, wordt LKB 1 geactiveerd. Het actieve LKB1 fosforyleert en activeert het
activated protein kinase (AMPK) tot pAMPK (fosforylated AMPK). pAMPK activeert op zijn beurt het
anti-oncogen p53 en remt eveneens het oncogen pAKT wat resulteert in celcyclus stilstand.
Gefosforyleerd AMPK activeert ook het hamartine-tuberine (tuberous sclerosis complex 1 en 2) wat
resulteert in inhibitie van mTOR via Rheb (ras homolog enriched in brain). Hierdoor daalt de energie
verslindende proteïne synthese en de aanmaak van glycolytische enzymen. Op deze manier kan de
tumorcel energie besparen en wachten tot de neovascularisatie nieuwe nutriënten aanvoert zodat de
AMP/ATP ratio’s weer dalen en het pAMPK deactiveert om zo weer de celcyclus stilstand op te heffen
en anabole processen te hernemen. In toestanden van ‘normale’ energie aanvoer is het LKB1 en dus
het AMPK in inactieve toestand. Het oncogen pAKT is daardoor in verhoogde actieve toestand
aanwezig. pAKT verzorgt de metabole transformatie naar het hoger vermelde fenotype van lipogenese
en aerobe glycolyse. Hamartine-tuberine (tuberous sclerosis complex 1 en 2) wordt door pAKT
geïnhibeerd waardoor Rheb niet wordt geremd en mTOR HIF, SK6 en 4EBP1 kan fosforyleren en
daardoor de eiwitsynthese en de glycolyse promoot. Het hexokinase wordt eveneens geactiveerd door
pAKT, dit enzym staat in voor verhoogde glycolyse. De verhoogde glycolyse zorgt voor verhoging van
de activiteit van de pentose-fosfaat-shunt die de productie van ribose en NADPH verzorgt. Dit
resulteert in verhoogde nucleïnezuur synthese en reductie tijdens de productie van macromoleculen.
Een ander enzym dat door pAKT in actieve toestand wordt gebracht is het ATP-citraat-lyase, dit
enzym verzorgt de synthese van acetyl-CoA die de koolstofbron is voor de vetzuursynthese. De
vetzuren in tumorcellen worden dan weer meer gebruikt als structurele bouwstenen dan als
energiebron. Al deze processen gemedieërd door pAKT kunnen dus aanzien worden als een
transformatie naar een maligne metabool fenotype.
2.3 Contaminatie van celculturen
De verontreiniging van celculturen kan grote problemen geven gedurende de opkweek en bij de
interpretatie van data verkregen tijdens de studie. Volgens Drexler et al. (2001) zijn er twee grote
boosdoeners namelijk contaminatie met microorganismen en dan vooral de Mycoplasma’s en
kruiscontaminatie met ongerelateerde cellen die de celcultuur van interesse overwoekeren en
eventueel tot vals positieve uitslagen kan leiden. De laatste kan voorkomen worden door ‘good culture
practice’ en door identificatie van de cellijn van interesse met behulp van DNA fingerprinting en
cytogenetisch onderzoek (karyotypering).
Eliminatie van pathogene kiemen door toevoegen van chemotherapeutica aan het medium is
volgens Uphoff et al. (2002) de meest effectieve en praktische methode. In een studie uitgevoerd naar
een honderdtal geïnfecteerde lymfoma celculturen door het DSMZ (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen) onder leiding van Uphoff werden zesennegentig procent van de
celculturen Mycocoplasma vrij verkregen na antibioticum behandeling. De gekozen methode tot
7
eliminatie dient makkelijk, effectief en niet cytotoxisch te zijn. Andere methoden tot eliminatie van
kiemen zijn fysische, chemische en immunologische methoden. Deze methoden zijn echter inferieur
aan chemotherapeutica vanwege hun lage efficaciteit. Omdat Mycoplasma’s geen peptidoglycaan
celwand bevatten zijn ze van nature resistent aan Beta-lactam antibiotica. Aanbevelenswaardig is het
bewaren van een reserve celcultuur mocht er resistentie of celcultuur dood optreden. Na toevoegen
van een quinolone (Enrofloxacine) of BM-cycline (Tiamuline, Minocycline) werd de celcultuur getest op
aanwezigheid van Mycoplasma’s door middel van een PCR-test. De negatieve celculturen waren klaar
voor experimenteel onderzoek maar de positieve werden opnieuw behandeld. Indien deze tweede
behandelingsmethode faalde werd geopteerd voor een andere BM-cycline of quinolone behandeling
of zelfs voor een andere behandelingsmethode.
2.4 Cryopreservatie
Het invriezen van tumorweefsel is een goede manier van bewaring. Preservatie van cellen is
belangrijk voor bewaring van de celcultuur van interesse, indien deze verloren gaat is er altijd een
reserve voorhanden. Andere toepassingen zijn de mogelijkheid tot transport wereldwijd en het
uitvoeren van mogelijke retrospectieve studies (21). Drie grote obstakels worden beschreven door
Meryman et al. (2007) die zich kunnen voordoen bij het invriezen van weefsel of celculturen. De eerste
is osmotische stress van de celmembraan waardoor cellen kunnen barsten of krimpen in
respectievelijk hypotone of hypertone omgeving. Koude denaturatie van proteïnen is een ander
probleem die toeneemt met dalende temperatuur. De laatste is de vorming van ijskristallen rond een
nucleus.
IJskristallen vormen zich rond hydrofobe moleculen die de structuur van H2O nabootsen. Deze
nuclei komen normaal gezien niet voor in levende cellen, zodat het extracellulaire compartiment als
eerste zal bevriezen bij dalende temperatuur. Extracellulaire ijskristallen kunnen dan de celmembraan
ruptureren waardoor ijsvorming in de cel mogelijk wordt. Deze intracellulaire ijskristallen kunnen dan
op hun beurt de integriteit van de verschillende celcompartimenten aantasten. Een manier om
intracellulaire ijsformatie tegen te gaan is “vitrificatie” van het cytoplasma door toevoegen van
cryoprotectantia in hoge concentraties of door ultra snelle koeling. Vitrificatie is het glasachtig solide
worden van oplossingen door toename van de viscositeit gedurende invriezen zonder formatie van
ijskristallen. Veel gebruikte cryoprotectantia zijn glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide), propyleen glycol,
Me2SO4,
trehalose
en
gemodificeerd
zetmeel
(21,36).
Belangrijke
eigenschappen
van
cryoprotectantia zijn dat ze snel de cel moeten penetreren en non-toxisch moeten zijn. De eerste kan
nogal eens moeilijkheden geven bij grote klompen van cellen (sferoïden). Andere nadelen die de
levensvatbaarheid van ingevroren weefsel kunnen ondermijnen zijn ijsexpansie in bloedvaten en
extracellulaire matrix van weefselbiopten en eerdere chemo- of radiatietherapie (21).
2.5 Typeren van neoplastische cellen
Grote moeite wordt er hedendaags gedaan om het in vitro fenotype van neoplastische cellen te
relateren aan de tumorbiologie in vivo. Dit is belangrijk om de prognose van de patiënt te bepalen
maar nog meer om multimodale behandelingsstrategieën te testen en eventueel toe te passen.
8
Doordat vele tumoren heterogeen zijn bij verschillende patiënten en zelfs binnen een patiënt, wordt
door het ontcijferen van de verschillende aberrante tumor paden het mogelijk om individuele
strategieën op te stellen. Opgelet moet worden dat het fenotype sterk kan verschillen naargelang de
cultuurcondities die gebruikt worden (37).
Naast de gebruikelijke cytologische aspecten als anisocytose, anisokaryose en verlies van
contactinhibitie zijn er nog andere manieren om tumorcellen in vitro te typeren. Zo zijn er
cytogenetische studies die kwantitatieve en/ of kwalitatieve chromosoomabnormaliteiten kunnen
detecteren. Deze omvatten karyotypering met conventionele Giemsa-bandering, SKY (spectrale
karyotypering), FISH (fluorescentie in situ hybridisatie), DNA microarray, Southern blotting en RT-PCR
(reverse transcriptase- polymerase chain reaction). Chromosoomabnormaliteiten komen zeer veel
voor in ALL (acute lymfoblastische leukemie) bij kinderen en kunnen zeer subtiel zijn. Volgens
Nordgren et al. (2003) kunnen deze subtiele abnormaliteiten over het hoofd worden gezien door
gebruik te maken van conventionele karyotyperingen. Dit komt door a) analyse van normale cellen in
plaats van leukemie cellen b) slechte chromosoom morfologie c) ondetecteerbare abnormaliteiten
doordat de chromosoom niet in lengte verschilt d) te weinig maligne metafase cellen. Om dit te
voorkomen zijn er gevoeligere technieken nodig, SKY en FISH zijn betere technieken maar mogen
niet het karyotyperen vervangen. FISH is gebaseerd op baseparing van welbepaalde ‘probes’ met de
complementaire aberrante sequenties. Deze probes zijn gekoppeld aan een fluorescerende molecule
of met biotine die bindt met een fluorochroom gemerkte antistof. Visualisatie gebeurt dan met een
fluorescentiemicroscoop. Spectrale karyotypering of SKY is een variant van de FISH methode, waarbij
probes met één tot vier verschillende fluorochromen worden gekoppeld voor elke chromosoom.
Hierdoor is detectie mogelijk van subtiele translocaties en inserties.
DNA microarray is een vrij recente techniek waarbij in een ronde meerdere tot duizenden genen
onderzocht kunnen worden. Deze techniek wordt in meerdere disciplines gebruikt, ondermeer in de
immunologie. In kankeronderzoek wordt het vooral toegepast om verschillende expressie patronen te
onderkennen, de zogenaamde “genetische handtekening”. Zoals hoger vermeld is het de uitdaging
om deze genetische tumor handtekening te relateren aan het in vitro fenotype en de in vivo
tumorbiologie (1). Volgens Abdullah-Sayani et al. (2006) werkt de applicatie als volgt, een glazen
drager bevat duizenden vaststaande plekken waarop met behulp van een ‘inktjet’ nucleotiden wordt
vastgeplakt. De inktjet bevat 4 printers elk geladen met een van de vier nucleotiden waaruit DNA is
gemaakt. Op deze manier kan elke sequentie van een gen geprint worden op het glas. Vervolgens
wordt het mRNA geisoleerd uit de tumorcel van interesse en met behulp van RT-PCR omgezet tot
complementair DNA (cDNA) uit gemerkte nucleotiden. Deze gelabelde cDNA wordt dan
gehybridiseerd met de micro array. Een fluorescentiescanner digitaliseert dan de glazen chips en
meet eveneens de mate van expressie door de data te vergelijken met een vastgelegde
referentiewaarde. Voorzichtigheid is wel geboden met de interpretatie van de data daar alleen de
mRNA wordt gemeten en niet de stroomafwaarts gelegen proteïnen die ook DNA regulatorische
invloeden kunnen hebben. Regulatorische RNA sequenties zoals siRNA’s moeten ook niet vergeten
worden in dit proces. Door middel van eiwitanalysen kan het eerste probleem worden verholpen.
9
Immunohistochemie van tumormarkers zoals cytokeratinen en andere proteïnen worden verderop
besproken bij de specifieke tumor celculturen.
2.6 Tumor celculturen
Tumor celculturen zijn ideaal voor het gestandaardiseerde onderzoek naar kanker. Zo kunnen
bijvoorbeeld met behulp van deleties tumor suppressor genen worden uitgeschakeld of oncogenen
worden geactiveerd. Op deze manier is de onderzoeker in staat om op het DNA niveau en
stroomafwaarts het complexe netwerk van transcriptie en translatie te volgen. Zo worden er nieuwe
inzichten verkregen in wat er gebeurd als bepaalde genen defect raken en welke tumormarkers
verhoogd tot expressie worden gebracht. Zulke tumormarkers kunnen ondermeer GTPasen van
signaal-transductie wegen zijn, groeireceptoren voor autocriene activatie van de celdeling of
cytoskelet onderdelen geassocieerd met metastaserend vermogen zijn. Wanneer deze aberrante
paden gekend zijn kunnen er nieuwe behandelingsstrategieën en diagnostische technieken worden
getest op deze celculturen.
Volgens Paoloni et al. (2007) is het zinvol om data bekend van de humane geneeskunde te
vergelijken met informatie opgedaan in de veterinaire geneeskunde oftewel de comparatieve
oncologie. Dit om tot nieuwe inzichten te komen over de tumorgenese en om nieuwe therapieën te
toetsen. Zo zijn er vele overeenkomsten tussen de omgevingsfactoren van de mens en de hond, ook
de leeftijdsgerelateerde ziekten door de verbeterde algemene gezondheid kunnen de verhoogde
prevalentie van bepaalde tumoren in huisdieren verklaren. Eveneens blijken lymfoma’s bij honden
resistent te zijn voor dezelfde chemotherapeutica als bij de mens. In 2005 is de Caniene Genoom
Project van start gegaan waarbij negentienduizend genen reeds zijn geïdentificeerd, vele van deze
genen komen overeen met humane genen. Daarom kan het interessant zijn om de “genetische
handtekeningen” van tumoren te vergelijken tussen deze twee species. In het volgende zal dan vooral
ingegaan worden op tumoren die bij zowel mens als hond voorkomen en deze die vooral een
fulminante uitkomst hebben vanwege hun maligniteit (pancreastumoren, hepatocellulair carcinoma) of
locatie van voorkomen (hersentumoren). Vanuit veterinair oogpunt zal de literatuur vooral over de
caniene neoplasiën handelen.
2.6.1 Hepatocellulair carcinoma
Caniene hepatocellulair carcinoma (HCC) is de meest voorkomende maligne tumor bij honden ouder
dan tien jaar. Er bestaat ook een geslachtsdimorfisme, zo komt HCC meer voor bij reuen dan bij teven
(56). Volgens Tian et al. (1999) is HCC een van de meest voorkomende tumor bij de mens, waarbij de
prevalentie erg hoog is in Afrika en Azië. HCC in mensen wordt vooral in verband gebracht met virale
infecties zoals hepatitis B en C virussen, dit in tegenstelling tot de hond waar het ethiologisch agens
niet geheel gekend is. Bij de mens zijn er tussen de twee virussen ook belangrijke verschillen qua
moleculaire mechanismen daar het hepatitis B virus een DNA virus is en het hepatitis C virus een
RNA virus is (45). Factoren die HCC waarschijnlijk bij honden veroorzaakt zijn vooral van toxische
aard zoals mycotoxinen, carcinogenen en pesticiden (6,56). Levercirrhose wordt vooral aanzien als
een precancereus stadium.
10
De meest gebruikte behandelingsmethode is tumorresectie, maar de meeste patiënten sterven door
recurrente ziekte en metastasen volgens Zhao-You et al. (2001). Chemotherapie is moeilijk omdat de
lever als detoxificerend orgaan door tumoraal weefsel is aangetast of de leverfunctie wordt door de
chemotherapeutica ondermijnd (32).
Veel onderzoek wordt verricht naar de onderliggende moleculaire mechanismen van het agressieve
metastaserende karakter van HCC en recurrentie. Hiertoe worden meerdere cellijnen gebruikt. Het
verkrijgen van celculturen uit patiënten met HCC is volgens Tian et al. (1999) moeilijk omdat de te
cultiveren cellen vroeg in celsenescentie gaan, cellen weinig levensvatbaar zijn of de celcultuur wordt
overgroeid door fibroblasten of andere cellen. HCC moet gedifferentieerd worden van gecombineerde
hepatocellulair en cholangiocellulair carcinoma (CC). Gecombineerde HCCC is een zeldzame
combinatie van primaire HCC en CC binnen hetzelfde neoplastische weefsel bij honden (49). Met
behulp van immunohistochemie is HCC te onderscheiden van CC, doordat HCC een negatieve
immunoperoxidase-test voor galweg type-cytokeratine heeft in tegenstelling tot CC.
Tumormarkers of tumormerkstoffen zijn antigenen die door neoplasiën aangemaakt worden en
kunnen worden aangetoond door gemerkte monoklonale antistoffen. In een experiment uitgevoerd
door Tashbaeva et al. (2007) op honden HCC werden meerdere tumor geassocieerde antigenen
aangetroffen. Deze waren P-glycoproteine (P-gp), Alfa fetoproteine (AFP) en CD31 of platelet
endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1). Opvallend is dat deze markers ook voorkomen bij
humane HCC. P-gp zorgt als “multidrug resistance receptor” (MDR-1) voor verhoogde excretie van
chemotherapeutica wat de chemoresistentie van deze tumoren verklaart. CD31 is een marker voor
endotheliale cellen. Deze is eveneens verhoogd in HCC, dit geeft nieuwe inzichten in de
mechanismen van de neovascularisatie in HCC. Het oncofetale proteine AFP is een marker die
normaal geproduceerd wordt in de embryonale vitellus en niet in normaal volwassen weefsel. AFP
verhoogt gedurende tumorgenese of tijdens levercelregeneratie (levercirrhose). Expressie van AFP is
echter hoger in tumoraal weefsel dan in cirrhotisch leverweefsel. ALP of alkalische fosfatase is een
enzym die vele isovormen kent afkomstig van verschillende weefseltypen ondermeer uit de lever.
Deze isoenzymen zijn membraangebonden glycoproteinen die verschillen in hun suikerfractie. Bij de
mens is bekend dat deze meetbare weefselspecifieke isoenzymen kunnen stijgen in het bloed
naargelang het type tumor. Deze vaststelling was nog niet eerder gedaan voor caniene tumoren.
Echter in een studie ernaar uitgevoerd door Fukui et al. (2006) werd toch een thermostabiele ALP
isoenzym gevonden met behulp van polyacrylamide gel elektroforese bij een hond met HCC. Deze
dient gedifferentieerd te worden van lever-, been- en corticosteroïd geïnduceerde ALP.
HCC is gekenmerkt door een hoog metastatisch potentieel. De onderliggende mechanismen zijn
zeer complex en de verschillende inter-agerende moleculen zijn eveneens betrokken in de proliferatie,
de celadhesie en de motiliteit van cellen. EMT of epitheliale-naar-mesenchymale transitie is volgens
Fuchs et al. (2006) de formatie van mesenchymale cellen uit epitheliale cellen. Dit is in de embryonale
fase een normaal fenomeen maar kan ook gebeuren in tumoraal ontaard weefsel. Karakteristiek in
EMT is het verlies van celadhesie moleculen zoals E-cadherine en het verkrijgen van mesenchymale
cytokeratinen als vimentine. Overexpressie van het integrine-gebonden kinase (ILK) zou EMT
induceren door E-cadherine expressie neerwaarts te reguleren en het Beta-catenine te activeren in de
11
nucleus waardoor celtransformatie optreedt. Volgens Hirohashi et al. (1998) verzorgen de cateninen
de sterke calcium-afhankelijke bindingen tussen cadherinen en de intracellulaire actinefilamenten.
Indien deze functie verloren gaat in de cadherine gemedieërde celadhesie systeem dan verliest de cel
haar polariteit met verlies van de histologische structuur en kan de cel zich distantiëren van de
tumormassa. Verschillende mechanismen kunnen de cadherine gemedieërde celadhesie systeem
inactiveren, zoals verlaagde promotoractiviteit van het E-cadherine gen, sterke tyrosine fosforylatie
van cateninen na binding van epidermale groei factor receptoren met EGF en zwakke E-cadherine
tyrosine fosforylatie. EMT veruiterlijkt zich in celculturen door verlies aan contactinhibitie met
desorganisatie van de monolaag.
In een histomorfologische studie van een caniene HCC primaire celcultuur uitgevoerd door
Boomkens et al. (2004) werden veel overeenkomsten gevonden met betrekking tot de humane HCC
celculturen. De caniene celcultuur kende eveneens dezelfde immunohistochemische markers als de
humane HCC
celcultuur. Namelijk
positieve kleuring van markers
HepPar1, CK7, ALT,
ceruloplasmine, albumine en AFP. Deze bevindingen kunnen suggereren dat caniene HCC
celculturen geschikt zijn als studiemodel in de comparatieve oncologie.
Veel onderzoek wordt er gedaan naar de bruikbaarheid van oncolytische virussen voor de
bestrijding van tumoren. Frequent gebruikte virussen zijn de adenovirussen. Meestal zijn dit
recombinante virussen die een tumorspecifieke promotor in hun genoom herbergen, waardoor
tumorselectiviteit wordt gewaarborgd. De bedoeling is dat deze promotor een welbepaald gen tot
activatie brengt dat eveneens vervat zit in het adenovirale DNA, een mogelijk gen zou een tumor
suppressor gen kunnen zijn (17). Xue et al. (2008) voerde een experiment uit met een recombinante
replicatie-defectieve adenovirus waarin het melanoma differentiatie geassocieerde gen-7 (MDA-7)
gecodeerd was. Deze MDA-7 is een tumor suppressor gen dat via neerwaartse regulatie van het antiapoptose molecule bcl-2 apoptose en groei inhibitie induceerde in HCC cellen maar niet in normale
hepatocyten.
2.6.2 Pancreastumoren
Tumoren van de pancreas zijn zeldzaam bij honden. Indien ze voorkomen zijn deze zeer agressief,
metastasen doen zich reeds voor vooraleer klinische symptomen op de voorgrond treden (16). Zoals
voor de normale pancreas zijn de neoplasiën onder te verdelen in exocriene pancreas carcinomen en
in hormoonproducerende tumoren (insulinoma, glucagonoma) (12,13).
Pancreastumoren zijn veelal zeer resistent aan chemo- en radiotherapie wat hun hoge maligniteit en
slechte prognose verklaart. Kanker stamcellen (CSC) zijn een nieuw fenomeen in de wetenschap.
CSC zijn cellen die zoals normale stamcellen multipele differentiatie wegen kennen, zelfvernieuwing
kunnen ondergaan en een verhoogde DNA reparatie kennen na DNA schade. Neoplastisch weefsel
van de pancreas is erg heterogeen en bestaat uit subpopulaties van ongedifferentieerde CSC
verantwoordelijk voor tumorinitiatie en propagatie en uit goed gedifferentieerde kankercellen met
weinig prolifererende eigenschappen. Deze CSC zijn immunohistochemisch positief voor de
celadhesie moleculen CD24 en CD44. Vermoed wordt dat deze CSC verantwoordelijk zijn voor de
12
resistentie tegen de verschillende therapeutische ingrepen, daarom gaat er steeds meer interesse uit
naar deze kleine subpopulatie om nieuwe behandelingsstrategieën te onderzoeken (14).
Metastasen zijn de grootste oorzaak van sterfte bij patiënten met pancreastumoren. Pancreas
neoplasiën metastaseren vooral naar de lever, de longen en het peritoneum. Volgens Zhou et al.
(2008) zijn er nu nog te weinig diermodellen om de biologie van pancreastumoren volledig te
begrijpen. Wegens het grote belang om metastasen vroeg te onderkennen alvorens symptomen
optreden, hebben zij een lentivirus (retrovirus) ontwikkeld dat stabiel rode fluorescentie proteïnen
(RFP) kan overbrengen in micrometastasen van de pancreasneoplasie. Het grote voordeel van een
lentivirus is dat deze ook cellen infecteert die weinig actieve celdelingen kennen en stabiel hun virale
transgene genoom kunnen incorporeren voor langere tijd. Met behulp van noninvasieve
beeldvormingtechnieken kunnen dan de fluorescerende tumorcellen opgespoord en gevisualiseerd
worden zonder het gebruik van toxische fluorescerende substraten.
2.6.3 Mammatumoren
Bij de vrouw is borstkanker de meest voorkomende vorm van neoplasie en na longkanker de meest
dodelijke type van tumor (39). Zoals bij de vrouw zijn mammatumoren eveneens de meest frequente
type tumor bij teven. Dit zijn spontane en hormoonafhankelijke tumoren. Preventieve ovariëctomie zou
protectief
werken.
Immunohistochemische
markers
zijn
receptoren
voor
oestrogenen
en
progestagenen. Cyclo-oxygenasen of COX zijn enzymen die prostaglandinen synthetiseren uit
arachidonzuur.
Prostaglandinen
komen
tussen
in
fysiologische
processen
maar
ook
in
ontstekingsprocessen. Het COX-2 isoenzym is verhoogd in sommige primaire mamma carcinomen
van de hond en de mens. COX-2 produceert prostaglandine-E2 en deze zou proliferatie inducerend
werken in het bijzijn van EGF en door verhoogde productie van oestrogenen. Deze laatste actie wordt
bewerkstelligd door prostaglandine-E2 inductie van het aromatase CYP19 gen, deze aromatasen zijn
verantwoordelijk voor de oestrogeen productie (7). Verschillende predisposities worden vermeld
ondermeer raspredisposities (voor de Chihuahua, poedels en Ierse Setters) en leeftijdspredisposities
(tussen zes en zeven jaar ouderdom). Dit type tumor kan zowel benigne als maligne zijn,
kwaadaardige veruiterlijking doet zich voor in de helft van de gevallen. Maligne mamma carcinomen
metastaseren naar de longen, de lymfeklieren en de lever. Recurrentie wordt eveneens veel
vastgesteld na tumorresectie van mammacarcinomen (7).
Volgens Pinho et al. (2007) is metastaseren een meertraps mechanisme met loskomen van de
tumorcellen aan de periferie van de tumormassa, invasie van de lymfebanen of bloedvaten,
extravasatie na endothelium interactie en de formatie van nieuwe tumorhaarden. Dit alles is een
complex fenomeen met interacties tussen cellen en de intercellulaire matrix. De moleculen hiervoor
verantwoordelijk zijn integrinen, cadherinen, leden van de immunoglobuline superfamilie en de
selectinen met hun koolhydraat liganden. Selectinen binden met de tetrasachariden Sialyl Lewis x en
a. Zoals in mens worden Sialyl Lewis koolhydraten verhoogd tot expressie gebracht in teven met
mammacarcinomen maar niet in normaal klierweefsel. Abnormale en verhoogde glycosylatie wordt in
verband gebracht met maligniteit en kunnen immunohistochemisch aangetoond worden, aldus kunnen
deze koolhydraat fracties als tumormarkers gebruikt worden.
13
Intraepitheliale mammaire lesies (IEL) zijn proliferatieve letsels die als risicofactor geldt voor
infiltratieve borstkanker in de mens. Deze kunnen gepalpeerd worden en gevisualiseerd worden met
behulp van een mammogram. IEL worden verder ingedeeld naargelang celatypie, zonder celatypie
wordt verbonden met benigne tumor eigenschappen en met celatypie wordt gerelateerd aan maligne
uitkomst met lage of afwezige expressie van oestrogeenreceptor-alpha. In een studie naar IEL in
tweehonderd teven uitgevoerd door Antuofermo et al. (2007) werden grote overeenkomsten gevonden
met de bevindingen opgedaan bij vrouwen. Histologisch en immunohistochemisch kwamen IEL bij
honden zeer veel overeen met IEL van vrouwen.
Uit het voorgaande blijkt dat er veel overeenkomsten zijn tussen humane en caniene
mammacarcinomen. Om dit nog verder te toetsen werden micro array testen uitgevoerd op zowel
mensen en honden mammacarcinomen. Zo werden tienduizend orthologe genen van honden met
menselijke genen vergeleken uit tumoraal weefsel en normaal weefsel. Hieruit bleek er zeer grote
overlap te bestaan tussen verschillende kanker gerelateerde paden. Deze zijn ondermeer de MAPK
cascade, de WNT- receptor signaal-transductie, AKT inductie van HIF en Kras 2 signaal-transductie
GTPase.
Opregulering
of
neerwaartse
regulering
resulteert
in
verhoogde
celproliferatie,
tumorceloverleving, EMT en inactivatie van apoptose (59). Het tumor suppressie gen p53 codeert voor
eiwitten die tussen komen in de apoptose of geprogrammeerde celdood, de proliferatie en de stabiliteit
van het genoom. Van p53 is bekent dat als er mutaties in optreden weefsels tumoraal kunnen
ontaarden. Dit is het geval voor vele tumoren in de mens ondermeer in borstkanker. P53 mutaties
kunnen voorkomen in preneoplastisch borstweefsel, in benigne en maligne typen van borsttumoren.
Mutaties in de p53 gen komen voor in de zogenaamde “hot spots” van het menselijke gen. De hot
spots situeren zich in de exons vijf tot acht. In een studie naar p53 mutaties bij de hond kwam naar
voren dat in tachtig procent van de gevallen zich eveneens deze mutaties in de hot spots voor deden
(38). Gpx2 is een glutathione peroxidase 2 welke vaak opgereguleerd is in humane kankers.
Glutathione peroxidase 2 is een selenium afhankelijk peroxidase die waterstofperoxiden en
hydroperoxide verbindingen neutraliseert. Overexpressie van Gpx2 wordt in meerdere tumoren
beschreven van de mens, deze zou de oxidatieve stressgeïnduceerde apoptose in kankercellen
onderdrukken. Naiki-Ito et al. (2007) remde met behulp van Gpx2 specifieke siRNA sequenties de
Gpx2 transcripten, dit resulteerde in inhibitie van de celproliferatie van p53 gemuteerde borst
carcinoma celculturen. Dit zou een relatie tussen Gpx2 en het p53 kunnen aantonen.
P53 wordt ook geassocieerd met verhoogde telomerase activiteit. Telomeren zijn de uiteinden van
het lineaire DNA fragment, deze bestaan uit “tandem hexomere herhalingen”, TTAGGG, deze zijn op
hun beurt gestabiliseerd door telomeer-bindende proteïnen en in stamcellen of kankercellen door het
enzym telomerase. Telomerase is een ribonucleoproteine. Het bestaat uit een telomerase RNA
fragment gekoppeld aan een reverse transcriptase enzym. Telomerase RNA is de matrijs voor het
telomere DNA en het reverse telomerase synthetiseert het telomere DNA. Normaal verkort het
telomere DNA met elke delingscyclus. Gedifferentieerde cellen kennen geen telomerase activiteit. Op
een bepaald ogenblik is het DNA uiteinde dusdanig ingekort dat de cel stopt met delen of overgaat tot
geprogrammeerde celdood. Dit is een natuurlijk beschermingsmechanisme tegen kanker. In
14
tumorcellen kunnen echter deze mechanismen van celsenescentie onderdrukt zijn met verhoogde
telomerase activiteit, zodat de cel ontsnapt aan celdood en continu kan prolifereren (65).
FAS of vetzuur synthase wordt in borstkanker verhoogd tot expressie gebracht, dit resulteert in een
verhoogde synthese van vetzuren die op hun beurt kunnen dienen als bouwsteen of brandstof voor de
tumorcel. In normale cellen zoals fibroblasten wordt FAS niet tot overexpressie gebracht. Een van de
grootste doelstellingen in de kankertherapie is het selectief afdoden van neoplastisch weefsel waar
normaal weefsel ongemoeid gelaten moet worden. Hiertoe gebruikte Yan et al. (2006) een op
adenoviruss gebaseerde gen bezorgingsysteem namelijk het Ad-FAS-TK. Ad-FAS-TK gebruikt een
tumorspecifieke FAS promotor aangedreven thymidine kinase in combinatie met gancyclovir (GCV)
toediening. Gancyclovir is een inactief cytostaticum dat door het thymidine kinase intracellulair wordt
geactiveerd, waardoor het actieve GCV de DNA synthese van de borstkankercel kan inhiberen. In
deze studie waren verschillende cellijnen afkomstig van borstkanker gevoelig aan deze combinatie
wat resulteerde in celdood van de getroffen neoplastische cellen.
2.6.4 Hersentumoren
De meest voorkomende tumor in volwassen mensen is glioblastoma multiforme of GBM en is
gekenmerkt door een agressieve en infiltrerend karakter, de prognose is dan ook zeer slecht mede
door recurrentie (10). GBM kunnen ontstaan zonder voorafgaande letsels oftewel de novo, of ontstaan
uit laaggradige anaplastische astrocytoma (LGA) (53). In honden is GBM niet frequent voorkomend en
maakt vijf procent uit van alle astrocytoma’s gezien in honden (34). Brachycephale honden zouden
een predispositie voor GBM kennen (10). De tumorbiologie van GBM is gekenmerkt door
intratumorale hemorragiën en necrose. Het massa-effect wordt bewerkstelligd door de tumorgroei, de
microvasculaire proliferatie en de peritumorale oedeemvorming (18,33). Al deze effecten samen
zorgen voor uitval van vitale functies en het verhogen van de intracraniale druk.
Met behulp van immunohistochemische kleuringen kunnen onder andere verschillende celtypen in
het zenuwstelsel gedifferentieerd worden. Zo kleuren cellen van neuronale afkomst positief voor het
gliacel fibrillaire zurige proteïne (GFAP). In een studie naar de verschillende expressies van
cytokeratinen kwam naar voren dat ependymoma cellen altijd positief kleuren voor GFAP maar niet
altijd cytokeratine positief in tegenstelling tot choroid plexus tumoren. Volgens de auteur kon de coexpressie van GFAP en cytokeratinen in ependymoma cellen een soort overgangsceltype voorstellen
met eigenschappen van zowel ependymocyten en choroid plexus epitheel (34). Onlangs zijn er glioma
stamcellen of GSC ontdekt die waarschijnlijk verantwoordelijk zijn voor het recurrente karakter en de
formatie van heterogene tumorcellen. GSC kleuren positief voor verschillende differentiatie markers
zoals nestin, CD133, GFAP, en Beta-tubuline-3. Kenmerkend voor deze cellen is dat ze agressief
kunnen vermeerden, aan zelfvernieuwing doen en kunnen differentiëren in een heterogene
celpopulatie zonder terminatie van de differentiatie welke normaal gezien wordt in normale neuronale
cellen (27). Cytogenetische hybridisatie met behulp van DNA array techniek toonde meerdere
defecten aan in het genoom van deze cellen. Zo was de tumor suppressor PTEN gedeleteerd, het
oncogen EGFR opgereguleerd samen met het MTA 1 of metastase geassocieerde gen 1 (27).
15
Eveneens konden deze GSC voor zeer lange tijd in cultuur gebracht worden dat in tegenstelling tot
niet GSC glioblastoma cellen.
In glioblastoma’s van de mens is bekend dat de vasculaire endotheliale groeifactor of VEGF vaak
een gestoorde opregulatie kent (33). VEGF is een factor die tussenkomt in de mitose van endotheel
en in de overleving van endotheel. Peri-tumoraal oedeem wordt eveneens in verband gebracht met
VEGF, daar VEGF een permiabiliteits verhogende werking kent die duizend maal sterker is dan
histamine (18). Om te onderzoeken of deze VEGF eigenschappen ook bij honden glioblastoma’s
voorkomen werden twee studies uitgevoerd ernaar door Dickinson et al. (2008) en Lipsitz et al. (2003).
Lipsitz toonde met behulp van immunohistochemie aan dat zowel EGFR en VEGF verhoogd tot
expressie wordt gebracht in honden GBM ter hoogte van het proteasome niveau. Terwijl Dickinson
een verhoogde mRNA concentratie van VEGF vaststelde. Eveneens werden in beide studies grote
overeenkomsten gevonden met de histologische eigenschappen, zoals endotheelproliferatie, van
zowel de hond als de mens in GBM.
MMP’s zijn matrixmetalloproteinasen, deze moleculen worden als inactieve proenzymen in het
extracellulaire milieu gesecreteerd. Extracellulaire activatie gebeurt door afsplitsen van het pro-domein
onder invloed van andere proteasen. Matrixmetalloproteasen verzorgen de afbraak van proteïne
fracties in de basaalmembraan en het extracellulaire milieu. In glioblastoma tumoren zijn deze MMP’s
verhoogd tot expressie gebracht en reeds in haar actieve vorm, dit in tegenstelling tot het normale
zenuwweefsel en de laaggradige astrocytoma. Door deze verhoogde MMP activiteit wordt het
peritumorale weefsel geremodeleerd en wordt de weg vrijgemaakt voor migratie en invasie in gezond
hersenweefsel (53). Zo reflecteert een verhoogde MMP activiteit een meer agressief type tumor.
Er is voor GBM geen remedie daarom wordt er druk gezocht naar meer innovatieve therapieën. Eén
daarvan is het gebruik van adenovirussen die de tumorcel moet opsporen, infecteren en vervolgens
moet afdoden. Belangrijk is het verlagen van de hoeveelheid gebruikte virus, zodat nevenwerkingen
en inflammatie (immuunreactie) opgewekt door het geïnoculeerde virus geminimaliseerd worden. Een
strategie daartoe bestaat erin een transgen door een promotor te laten opdrijven of de virale genen
verantwoordelijk voor de populatie immuniteit in honden te deleteren (10). Een andere manier van
virale tumorlyse zou kunnen zijn door immunostimulatie. In een in vitro en in vivo studie naar honden
GBM werden tumorcellen geïnfecteerd met een adenovirus type 5. Deze vector herbergt een
immunostimulatorische molecule, Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), die onder de promotor
activiteit staat van een “intermediate early promotor” afkomstig van een cytomegalovirus in de E1
regio van het adenovirus genoom. Tegelijkertijd werd een cytotoxische vector met thymidine-kinase
(TK) activiteit toegediend. Na administratie van gancyclovir werden de met TK positieve cellen
gelyseerd door activatie van het cytotoxische gancyclovir. Daar de immunostimulatorische vector ook
aanwezig is in de gelyseerde cellen komt het immunostimulatorische Flt3L ook vrij. Flt3L induceerde
een infiltratie van T-cellen en microgliacellen met fagocytotische activiteit. Dit alles gebeurde zonder
erge nevenwerkingen (11).
16
3.Bespreking
Uit de literatuur blijkt dat er vele manieren zijn om tumorcellen te verkrijgen. De veiligste methoden
zijn; inductie van tumorcellen in vitro, het gebruik van bestaande celculturen en volledige excissie
biopten (mits er geen postoperatieve complicaties voordoen, zoals recurrentie door micrometastasen).
Echter de fijne naald aspiraat methode is minder invasief dan het nemen van excissie biopten maar
toch bestaat er het gevaar van implantatiemetastasen ter hoogte van het naaldtraject. Excissie
biopten zijn voor histopathologisch onderzoek en het in vitro opkweken beter dan FNA omdat er meer
tumorweefsel voor handen is.
Vermijden van contaminatie en celschade gedurende de opkweek en cryopreservatie zijn kritisch
voor het slagen van eventuele experimenten. ‘Good culture practice’ en het gebruik van antibiotica of
chemotherapeutica tegen infectieuze agentia zijn dan ook onontbeerlijk.
Om tot vergelijkende studies te kunnen komen in het onderzoek naar kanker is het belangrijk dat alle
stappen gestandaardiseerd worden. Uit de literatuur is gebleken dat de samenstelling en fysische
eigenschappen van het medium waarin celculturen zich bevinden een grote invloed hebben op de
expressie van verschillende genen. Veranderlijke omstandigheden kunnen dus een groot effect
hebben op de uitkomsten van het experiment met incongruentie van andere te vergelijken
experimenten tot gevolg. Eveneens moeten bij comparatieve studies op het genomisch vlak niet
alleen de genen in het oog worden gehouden maar ook de kwalitatieve en kwantitatieve kenmerken
ter hoogte van het transcriptosome en proteasome niveau. Dit omdat RNA sequenties en bepaalde
eiwitten ook een effect kunnen hebben op het genoom en dus ook op de fenotypische kenmerken van
tumorcellen.
Vergelijkende studies van tumoraal weefsel tussen hond en mens stellen grote overeenkomsten wat
betreft tumorbiologie aan het licht. Ook de behandelingsmethoden en de prognose van tumoren bij
honden en mensen vertonen veel gelijkenissen. De mens en hond bevinden zich over het algemeen in
hetzelfde levensmilieu waardoor beide genomen aan dezelfde omgevingsomstandigheden onderhevig
kunnen zijn. Van zowel de hond als de mens is er veel gekend over de bouw en functie van het
genoom, in beide komen veel dezelfde genetische aberraties voor in tumoren van hetzelfde celtype.
Uit de literatuur kan geconcludeerd worden dat de hond een geschikt studiemodel kan vormen voor de
studie naar kanker bij de mens.
Interessant kan het zijn om met adenovirussen tumorcellen te infecteren. Adenovirussen zijn
uitermate geschikt voor gentherapie omdat zij transgenen stabiel tot expressie brengen en tevens zijn
deze virussen makkelijk te manipuleren. Met behulp van genetische modificaties van het virale
genoom kunnen welbepaalde transgenen onder de controle van een tumorspecifieke promotor
worden gesteld. Een dergelijk transgen kan dan tumorspecifiek en verhoogd tot expressie worden
gebracht in de tumorcel, indien de specifieke tumorale transcriptiefactor de promotor verhoogd
activeert. Zo kan een transgen voor een immunostimulatorische molecule coderen (tumor
immunotherapie) of voor een cytotoxisch product coderen met oncolyse tot gevolg (oncolytisch virus).
Indien de vector een replicatief virus is kunnen na virusvermeerdering en tumorcellyse nieuwe
tumorcellen geïnfecteerd worden net zolang tot alle tumorcellen gedood zijn. Voor de toekomst zou
17
het interessant kunnen zijn om experimenten uit te voeren op tumorcellijnen van honden geïnoculeerd
met tumorspecifieke adenovirussen en deze uitkomsten te vergelijken met humane tumorcellijnen. Dit
is mogelijk omdat gebleken is dat zowel honden als mensen tumorcellijnen geïnfecteerd kunnen
worden met adenovirussen. Nadeel van het gebruik van adenovirussen in vivo bij honden is de
bestaande populatie-immuniteit waardoor de beoogde werking teniet kan worden gedaan. Het
omzeilen van deze populatie-immuniteit vormt waarschijnlijk een groot obstakel.
18
4. Literatuurlijst
1) Abdullah-Sayani A., Bueno-de-Mesquita J.M., van de Vijver M.J. (2006). Technology insight: tuning into the genetic orchestra
using microarrays-limitations of DNA microarrays in clinical practice. Nature/ clinical practice oncology 3, 501-516.
2) Ansari K.I., Hussain I., Das H.K., Mandal S.S. (2009). Overexpression of human histone methylase MLL1 upon exposure to a
food contaminant mycotoxin, deoxynilvalenol. FEBS Journal 276, 3299-3307.
3) Antuofermo E., Miller M.A., Pirino S., Xie J., Badve S, Mohammed S.I. (2007). Spontaneous Mammary Intraepithelial Lesions
in Dogs-A Model of Breast Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16, 2247-2256.
4) Arbuthnot P.B., Bralet M-P, Le Josic C., Dedieu J-F, Perricaudet M., Brechot C., Ferry N. (1996). In vitro and In vivo
Hepatoma Cell-specific Expression of a Gene Transferred with an Adenoviral Vector. Human Gene Therapy 7, 1503-1514.
5) Bignold L.P. (2004). Carcinogen-induced impairment of enzymes for replicative fidelity of DNA and the initiation of tumors.
Carcinogenesis 25, 299-307.
6) Boomkens S.Y., Spee B., Ijzer J., Kisjes R., Egberink H.F., van den Ingh T.S., Rothuizen J., Penning L.C. (2004). The
establishment and characterization of the first canine hepatocellular carcinoma cell line, which resembles human oncogenic
expression patterns. Comparative Hepatology 3, 1-10.
7) Brunelle M., Sartin E.A., Wolfe L.G., Sirois J., Doré M. (2006). Cyclooxygenase-2 Expression in Normal and Neoplastic
Canine Mammary Cell Lines. Vet Pathol 43, 656-666.
8) Bruserud Ø., Tronstad K.J., Berge R. (2005). In vitro culture of human osteosarcoma cell lines: a comparison of functional
characteristics for cell lines cultured in medium without and with fetal calf serum. J Cancer Res Clin Oncol 131, 377-384.
9) Calderwood S.K., Khaleque M.A., Sawyer D.B., Ciocca D.R. (2006). Heat shock proteins in cancer: chaperones of
tumorigenesis. TRENDS in Biochemical Sciences 3, 164-172.
10) Candolfi M., Pluhar G.E., Kroeger K., Puntel M., Curtin J., Barcia C., Ghulam Mohammed A.K.M., Xiong W., Liu C., Mondkar
S., Kuoy W., Kang T., McNeil E.A., Freese A.B., Ohlfest J.R., Moore P., Palmer D., Ng P., Young J.D., Lowenstein P.R., Castro
M.G. (2006). Optimization of adenoviral vector-mediated transgene expression in the canine brain in vivo, and in canine glioma
cells in vitro. Neuro-Oncology 9, 245-258.
11) Candolfi M., Kroeger K.M., Pluhar G.E., Bergeron J., Puntel M., Curtin J.F., McNeil E.A., Freese A.B., Ohlfest J.R., Moore
P., Lowenstein P.R. Castro M.G. (2007). Adenoviral-mediated Gene Transfer into the Canine Brain In Vivo. Neurosurgery 60,
167-178.
12) Cave T.A., Evans H., Hargraeves J., Blunden A.S. (2007). Metabolic epidermal necrosis in a dog with pancreatic
adenocarcinoma, hyperglucagonaemia, hyperinsulinaemia and hypoaminoacidaemia. Journal of Small Animal Practice 48, 522526.
13) Chang S-C, Liao J-W, Lin Y-C, Liu C-I, Wong M-L (2007). Pancreatic Acinar Cell Carcinoma with Intracranial Metastasis in a
Dog. J. Vet. Med. Sci. 69, 91-93.
14) Cheong J.L., Li C., Simeone D.M. (2008). Human Pancreatic Cancer Stem Cells: Implications for How We Treat Pancreatic
Cancer. Translational Oncology 1, 14-18.
15) Clavreul A., Jean I., Preisser L., Chassevent A., Sapin A., Michalak S., Menei P. (2009). Human Glioma cell culture: two
FCS-free media could be recommended for clinical use in immunotherapy. The Society for In Vitro Biology.
16) Dennis M.M., O’Brian T.D., Wayne T., Kiupel M., Williams M., Powers B.E. (2008). Hyalinizing Pancreatic Adenocarcinoma
in Six Dogs. Vet Pathol 45, 475-483.
17) Dessars B., De Raeve L.E., Morandini R., Lefort A., Housni H.E., Ghanem G.E., Van den Eynde B.J., Ma W., Roseeuw D.,
Vassart G., Libert F., Heimann P. (2009). Genotypic and Gene Expression Studies in Congenital Melanocytic Nevi: Insight into
Initial Steps of Melanotumorigenesis.Journal of Investigative Dermatology 129, 139-147.
18) Dickinson P.J., Sturges B.K., Higgens R.J., Roberts B.N., Leutenegger C.M., Bollen A.W., LeCouteur R.A. (2008). Vascular
Endothelial Growth Factor mRNA Expression and Peritumoral Edema in Canine Primary Central Nervous System Tumors. Vet
Pathol 45, 131-139.
19) Dirks C., Duh F-M, Rai S.K., Lerman M.I., Miller A.D. (2002). Mechanism of Cell Entry and Transformation by Enzootic
Nasal Tumor Virus. Journal of Virology, 2141-2149.
20) Drexler H.G., Uphoff C.C., Dirks W.G., Macleod R.A.F. (2002). Mix-ups and mycoplasma: the enemies within. Leukemia
Research 26, 329-333.
19
21) Ehrhart F., Schulz J.C., Katsen-Globa A., Shirley S.G., Reuter D., Bach F., Zimmermann U., Zimmermann H. (2009). A
comparative study of freezing single cells and spheroids: Towards a new model system for optimizing freezing protocols for
cryobanking of human tumours. Cryobiology 58, 119-127.
22) Etoh T., Kanai Y., Ushijima S., Nakagawa T., Nakanishi Y., Sasako M., Kitano S., Hirohashi S. (2004). Increased DNA
Methyltransferase 1 (DNMT1) Protein Expression Correlates Significantly with Poorer Tumor Differentiation and Frequent DNA
Hypermethylation of Multiple CpG Islands in Gastric Cancers. American Journal of Pathology 164, 689-695.
23) Fuchs B.C., Fujii T., Dorfman J.D., Goodwin J.M., Zhu A.X., Lanuti M., Tanabe K.K. (2008). Epithelial-to-Mesenchymal
Transition and Integrin-Linked Kinase Mediate Sensitivity to Epidermal Growth Factor Receptor Inhibition in Human Hepatoma
Cells. Cancer Res 68, 2391-2399.
24) Fukui Y-I, Sato J., Sato R., Yasuda J., Naito Y. (2006). Canine serum Thermostable Alkaline Phosphatase Isoenzyme From
a Dog With Hepatocellular Carcinoma. J. Vet. Med. Sci. 68, 1129-1132.
25) Hirohashi S. (1998). Inactivation of the E-Cadherin-Mediated Cell Adhesion System in Human Cancers. American Journal of
Pathology 153, 333-338.
26) Ho J.M., Darcy S.J., Eysselein V.E., Venegas R., French S.W., Stabile B.E. (2007). Evolution of Fine Needle Aspiration
Cytology in the Accurate Diagnosis of Pancreatic Neoplasms. The American Surgeon 73, 941-944.
27) Huang Q., Zhang Q-B, Dong J., Wu Y-Y, Shen Y-T, Zhao Y-D, Zhu Y-D, Diao Y., Wang A-D, Lan Q. (2008). Glioma stem
cells are more agressive in recurrent tumors with malignant progression than in the primary tumor, and both can be maintained
long-term in vitro. BMC Cancer 8, 1-11.
28) Huch M., Gros A., José A., Gonzalez J.R. Alemany R., Fillat C. (2009). Urokinase-Type Plasminogen Activator Receptor
Transcriptionally Controlled Adenoviruses Eradicate Pancreatic Tumors and Liver Metastasis in Mouse Models. Neoplasia 11,
518-528.
29) Koumenis C., Wouters B.G. (2006). “Translating” Tumor Hypoxia: Unfolded Protein Response (UPR)-Dependent and UPRIndipendent Pathways. Mol Cancer Res 4, 423-436.
30) Kuhajda F.P. (2008). AMP-activated protein kinase and human cancer: cancer metabolism revisited. International Journal of
Obesity 32, 36-41.
31) Land S.C., Tee A.R. (2007). Hypoxia-inducible Factor 1α Is Regulated by the Mammalian Target of Rapamycin (mTOR)
Signaling Motif. The Journal of Biological Chemistry 282, 20534-20543.
32) Lee J.O., Lee K.W., Oh D.Y., Kim J.H., Im S.A., Kim T.Y., Bang Y.J. (2009). Combination chemotherapy with capecitabine
and cisplatin for patients with metastatic hepatocellular carcinoma. Annals of Oncology ,june 5, 1-6.
33) Lipsitz D., Higgins R.J., Kortz G.D., Dickinson P.J., Bollen A.W., Naydan D.K., LeCouteur R.A. (2003). Glioblastoma
Multiforme: Clinical Findings, Magnetic Resonance Imaging, and Pathology in Five Dogs. Vet Pathol 40, 659-669.
34) Mannoji H., Becker L.E. (1988). Ependymal and Choroid Plexus Tumors Cytokeratin and GFAP Expression. Cancer 61,
1377-1385.
35) Meloni-Ehrig A., Smith B., Zgoda J., Greenberg J., Perdahl-Wallace E., Zaman S., Mowrey P. (2009). Translocation
(2;8)(q35;q13): a recurrent abnormality in congenital embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Genetics and Cytogenetics 191,
43-45.
36) Meryman H.T. (2007). Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion 47, 935-945.
37) Mori S., Chang J.T., Andrechek E.R., Matsumura N., Baba T., Yao G., Kim J.W., Gatza M., Murphy S., Nevins J.R. (2009).
Anchorage-independent cell growth signature identifies tumors with metastatic potential. Oncogene, 1-10.
38) Muto T., Wakui S., Takahashi H., Maekawa S., Masaoka T., Ushigome S., Furusato M. (2000). p53 Gene Mutations
Occuring in Spontaneous Benign and Malignant Mammary Tumors of the Dog. Vet Pathol 37, 248-253.
39) Naiki-Ito A., Asamoto M., Hokaiwada N., Takahashi S., Yamashita H., Tsuda H., Ogawa K., Shirai T. (2007). Gpx2 Is An
Overexpressed Gene in Rat Breast Cancers Induced by Three Different Chemical Carcinogens. Cancer Res 67, 11353-11358.
40) Natsuizaka M., Ozasa M., Darmanin S., Miyamoto M., Kondo S., Kamada S., Shindoh M., Higashino F., Suhara W., Koide
H., Aita K., Nakagawa K., Kondo T., Asaka M., Okada F., Kobayashi M. (2007). Synergistic up-regulation of Hexokinase-2,
glucose transporters and angiogenic factors in pancreatic cancer cells by glucose deprivation and hypoxia. Experimental Cell
Research 313, 3337-3348.
41) Nordgren A. (2003). Hidden Aberrations Diagnosed by Interphase Fluorescence In Situ Hybridisation and Spectral
Karyotyping in Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia. Leukemia & Lymphoma 44, 2039-2053.
42) Ohtani N., Mann D.J., Hara E. (2009). Cellular senescence: Its role in tumor suppression and aging. Cancer Sci 100, 792797.
20
43) Osinsky S., Zavelevich M., Vaupel P. (2009). Tumor Hypoxia And Malignant Progression. Exp Oncol 31, 80-86.
44) Pang R.W.C, Joh J.W.J., Johnson P.J., Monden M., Pawlik T.M., Poon R.T.P. Biology of Hepatocellular Carcinoma. Annals
of Surgical Oncology 15, 962-971.
45) Paoloni M.C., Khanna C. Comparative Oncology Today. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 37, 1023-1033.
46) Pinho S.S., Matos A.J.F., Lopes C., Marcos N.T., Carvalheira J., Reis C.A., Gärtner F. (2007). Sialyl Lewis x expression in
canine malignant mammary tumours: correlation with clinicopathological features and E-cadherin expression. BMC Cancer 7,
124-134.
47) Platt S.R., Alleman A.R., Lanz O.I., Chrisman C.L. (2002). Comparison of Fine-Needle and Surgical-Tissue Biopsy in the
Diagnosis of Canine Brain Tumors. Veterinary Surgery 31, 65-69.
48) Rein D.T., Breidenbach M., Curiel D.T. (2006). Current developments in adenovirus-based cancer gene therapy. Future
Oncol. 2, 137-143.
49) Shiga A., Shirota K., Enomoto M. (2001). Combined Hepatocellular and Cholangiocellular Carcinoma in a Dog. J. Vet. Med.
Sci. 63, 483-486.
50) Siegfried R., Busato A., Schawalder P., Rytz U. (2005). Evaluation of different techniques for percutaneous needle biopsy of
synovial membrane in the dog. Vet Comp Orthop Traumatol 3, 127-134.
51) Sørensen B.S., Horsman M.R., Vorum H., Honoré B., Overgaard J.,Alsner J. (2009). Proteins upregulated by mild and
severe hypoxia in squamous cell carcinomas in vitro identified by proteomics. Radiother Oncol (2009).
52) Sood T., Handa U., Mohan H., Goel P. (2009). Evaluation of aspiration cytology of ovarian masses with histopathological
correlation. Cytopathology (2009).
53) Stojic J., Hagemann C., Haas S., Herbold C., Kühnel S., Gerngras S., Roggendorf W., Roosen K., Vince G.H. (2008).
Expression of matrix metalloproteinases MMP-1, MMP-11 and MMP-19 is correlated with the WHO-grading of human malignant
gliomas. Neuroscience Research 60, 40-49.
54) Tabakov V.U., Litvina M.M., Schepkina J.V., Jarilin A.A., Chestkov V.V. (2009). Studying the Proliferation of Human
Peripheral Blood T Lymphocytes in Serum-Free Medium. Cell Technologies in Biology and Medicine 1, 120-124.
55) Tang Z-Y, Sun F-X, Tian J.,Ye S-L, Liu Y-K, Liu K-D, Xue Q., Chen J., Xia J-L, Qin L-X, Sun H-C, Wang L., Zhou J., Li Y.,
Ma Z-C, Zhou X-D, Wu Z-Q, Lini Z-Y, Yang B-H (2001). Metastatic human hepatocellular carcinoma models in nude mice and
cell line with metastatic potential. World J Gastroenterol 7, 597-601.
56) Tashbaeva R.E., Hwang D.-N., Song G.-S., Choi N.-H., Lee J.-h., Lyoo Y.-S., Lee S.-J., Jung D.-I., Kim H.-Y., Sur J.-H.
(2007). Cellular Characterization of Multidrug Resistance P-glycoprotein, Alpha Fetoprotein, and Neovascular-Associated
Antigens in Canine Hepatocellular Carcinoma and Cirrhotic Liver. Vet Pathol 44, 600-606.
57) Tian J., Tang Z.Y., Ye S.L., Liu Y.K., Lin Z.Y., Chen J., Xue Q. (1999). New human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line
with high metastatic potential (MHCC97) and its expressions of the factors associated with metastasis. British Journal of Cancer
81, 814-821.
58) Uphoff C.C., Meyer C., Drexler H.G. (2002). Elimination of mycoplasma from leukemia-lymphoma cell lines using antibiotics.
Leukemia 16, 284-288.
59) Uva P., Aurisicchio L., Watters J., Loboda A., Kulkarni A., Castle J., Palombo F., Viti V., Mesiti G., Zappulli V., Marconato L.,
Abramo F., Ciliberto G., Lahm A., La Monica N., de Rinaldis E. (2009). Comparative expression pathway analysis of human and
canine mammary tumors. BMC Genomics 10, 135-155.
60) Valivicova Z., Marvanova S., Meszarosova M., Srancikova A., Trilecova L., Milcova A., Libalova H., Vondracek J., Machala
M., Topinka J., Gabelova A. (2009). Differences in DNA damage and repair produced by systemic, hepatocarcinogenic and
sarcomagenic dibenzocarbazole derivatives in a model of rat liver progenitor cells. Mutation Research 665, 51-60.
61) Verhijen P., Witjes H., van Gorp J., Hennipman A., van Dalen T. (2009). Current pathology work-up of extremity soft tissue
sarcomas, evaluation of the validity of different techniques. Eur J Surg Oncol 20, 1-5.
62) Wakely P.E., Kneisl J.S. (2000). Soft Tissue Aspiration Cytopathology. American Cancer Society (2000).
63) Xue X-B, Chen K., Wang C-J, Zheng J-W, Yu Y., Peng Z-H, Wu Z-D (2008). Adenovirus vector expressing mda-7
selectively kills hepatocellular carcinoma cell line Hep3B. Hepatobilliary Pancreat Dis Int 7, 509-514.
64) Yan C., Wen-Chao L., Hong-Yan Q., Rui Z., Wei-Lin J., Hua H. (2007). A new approach for breast cancer gene therapy
using the human fatty acid synthase promotor. Acta Oncologica 46, 773-781.
65) Zhang X., Chen Z., Chen Y., Tong T. (2003). Delivering antisense telomerase RNA by a hybrid adenovirus/adenoassociated virus significantly suppresses the malignant phenotype and enhances cell apoptosis of human breast cancer cells.
Oncogene 22, 2405-2416.
21
66) Zheng L., Bustos V., Miner J., Paulo E., Meng Z.H., Zlotnikov G., Ljung B-M, Dairkee S.H. (1998). Propagation of
Genetically Altered Tumor Cells Derived from Fine-Needle Aspirates of Primary Breast Carcinoma. Cancer Research 58, 52715274.
67) Zhou J., Yu Z., Zhao S., Hu L., Zheng J., Yang D., Bouvet M., Hoffman R.M. (2009). Lentivirus-based DsRed-2-Transfected
Pancreatic Cancer Cells for Deep In Vivo Imaging of Metastatic Disease. Journal of Surgical Research, 1-8.
22