Biomoleculen
advertisement
BIOCHEMIE A - BIOMOLECULEN MOLECULARIE BASIS VAN HET LEVEN Basiseenheid van alle levende wezens = cel Alles in het leven is gericht op overleving en voortplanting prokaryote cel eukaryote cel cytoplasma cytoplasma celmembraan met pompen en kanalen subcellulaire organellen celwand kern met chromosomen cirkelvormig chromosoom ribosomen ribosomen endoplasmatisch reticulum cytosol met moleculen voor stofwisseling Golgi-apparaat lysosomen secretiegranulae mitochondriën Cellen zijn microscopisch klein, maar 1 middelgrote dierlijke cel bevat 1,3 x 1013 watermoleculen die door hun polariteit en vermogen tot vorming van waterstofbruggen bijdragen tot 3D structuur van vrijwel alle biomoleculen 1 Å = 10-10 m = 0,1 nm Afmetingen van biomoleculen - 7 µm: kleinste menselijke cellen zoals erytrocyten - 65 Å: eiwit zoals hemoglobine - 6 Å: glucose - 1,5 Å: lengte van een covalente C-C binding Resoluties: - lichtmicroscoop: 2000 Å - elektronenmicroscoop: 10 Å - röntgendiffractie: 1 Å Snelheid van biochemische reacties - 10-12 s: verplaatsing van een elektronenpaar binnen een molecuul als rhodopsine (pigment netvlies, fotoreceptor) - 10-9 s: vorming of verbreking van een covalente verbinding en de conformatieverandering van een proteïne - 10-6 s: katalytische reacties van snelle enzymen en conformatieveranderingen van grote macromoleculen zoals DNA - 10-3 s: trage enzymen - 1014 s geleden: gemeenschappelijke voorouder mens en chimpansee - 1017 s geleden: eerste biomoleculen 1kcal = 4,2 kJ Energetische aspecten van biochemische reacties - <4 kJ/mol: trillingsenergie van moleculen bij lichaamstemperatuur - 4-40 kJ/mol: zwakke niet-covalente bindingen - 400 kJ/mol: bindingsenergieën van de meeste covalente bindingen verbroken met behulp van enzymen en inbreng van chemische energie - 30 kJ/mol: energie die vrijkomt bij hydrolyse van de terminale fosfaatgroep van ATP (intermediair tussen verbreken van een covalente C-C binding en een niet-covalente interactie - 9000 kJ energie per dag: onderhoud van basale en specifieke levensfuncties bij gemiddelde actieve volwassen mens 3600 kJ: 40% van de energie die wordt omgezet tot ATP (120 mol) 3-10 kJ/mol: energie betrokken bij een dipool-dipool interactie 12-25 kJ/mol: bindingsenergie van een H-brug Wet van Coulomb: F q1q2 afstotend wanneer beide ladingen hetzelfde teken dragen en r ² aantrekkend bij ladingen van tegengesteld teken vb: negatieve lading van fosfaatgroepen op DNA-molecuul met positeive lysine- en arginineresidu’s van DNA-bindende eiwitten (vb histonen) Permanente dipolen kunnen elektrostatische reacties aangaan met ionen en andere permanente dipolen zwakker dan ion-ion interacties London-dispersiekracht: de ene geïnduceerde dipool van molecuul 1 gaat een dipool van omgekeerde fase induceren in molecuul 2 (= Van der Waalskrachten) zwakste van alle niet covalente krachten, maar ook talrijkste interacties tussen biomoleculen Van der Waals-contactafstand: bij een zekere dichte toenadering bestaat er een maximale aantrekking tussen de atomen (= som van van der Waals-contactradii) Waterstofbruggen: gemeenschappelijk delen van een waterstofatoom door 2 naburige atomen stabilisatie van secundaire eiwitstructuur (- helix en -vouwblad) en vorming van basenparen in de dubbelstrengige DNA-keten hoek van de H-brug belangrijk voor zijn sterkte: co-lineariteit Water maakt steeds 70% of meer uit van de massa van organismen en 95% van alle lichaamsmoleculen Water heeft een abnormaal hoog smelt- en kookpunt zeer sterke intermoleculaire interacties (Hbruggen en dipool-dipool interacties) De valentie-elektronen van het zuurstofatoom in ater zijn via sp3-hybridisatie verdeeld over 4 orbitalen met bij benadering een tetraëdrische configuratie De beide vrije elektronenparen van O zijn uitstekende acceptors voor het aangaan van waterstofbruggen; de beide H-atomen zijn uitstekende donors elk watermolecuul kan 4 H-bruggen aangaan met 4 andere watermoleculen ijs Wanneer ijs smelt, verbreken er ongeveer 15% van de H-bruggen open structuur van water iets gecondenseerd dichtheid van water groter dan van ijs ijs drijft op water Solvatie = oplossend vermogen van water Water gaat zeer goed interacties aan met polaire moleculen en groepen polaire moleculen goed wateroplosbaar (hydrofiel): dipolen van water schermen de ladingen van de ionen als het ware af en beletten dat deze ionen elektrostatische interacties aangaan hoge diëlektrische constante van water als medium Apolaire structuren kunnen geen H-bruggen of dipool-dipool interacties met water aangaan, alleen in staat tot zwakke induced-dipool interacties onder elkaar (hydrofoob) watermoleculen zullen dergelijke apolaire stoffen proberen te omgeven met een kooi (clathraat) waarin een maximum aantal H-bruggen tussen de watermoleculen onderling aanwezig zijn thermodynamisch onwaarschijnlijk apolaire stoffen worden bijeengedreven weg van de waterfase Een molecuul die zowel apolaire als polaire groepen bevat, noemt men amfifatisch Water is tegelijkertijd een zwak zuur en een zwakke geconjugeerde base Een buffer bestaat uit een waterige oplossing van een zwak zuur met zijn geconjugeerde base vermogen om de pH van een oplossing relatief constant te houden ondanks toevoeging van een (beperkte) hoeveelheid zuur of base (principe van Le Châtelier-van’t Hof) Normale pH-waarde van bloed: 7,35-7,45 - te lage bloed pH: acidose - te hoge bloed pH: alkalose De bufferende werking is het grootst in de nabijheid van de pKz-waarde van de buffer HendersonHasselbalch: pH pK z log geconjugeerde base pK -waarde = de pH-waarde waarbij er evenveel z zwak zuur moleculen geconjugeerde base zijn als moleculen zwak zuur (indien 50% van de zuurmoleculen zijn gedissocieerd in geconjugeerde base en protonen) Wanneer we de pH 1 eenheid laten stijgen boven de pKz-waarde, dan is de verhouding geconjugeerde base 10 ongeveer 91% van het zuur is gedissocieerd zwak zuur Wanneer we de pH 1 eenheid laten dalen onder de pKz-waarde, dan is de verhouding geconjugeerde base 0,1 ongeveer 9% van het zuur is gedissocieerd zwak zuur Buffers in het menselijk bloed - HCO3-/H2CO3 chemische vorm waarin het meeste koolzuurgas van de weefsels naar de longen wordt vervoerd - HPO42-/H2PO4- bestanddeel van botmineraal en bestanddeel van vele biomoleculen - albumine transporteiwit, osmotische zuigkracht waardoor water in de bloedbaan blijft - hemoglobine in de rode bloedcellen RBC noodzakelijk om CO2 om te zetten in HCO3Niet-covalente wisselwerkingen in water zijn belangrijk voor het totstandkomen van moleculaire structuur en voor het aangaan van intermoleculaire interacties (juise complementaire vorm tussen 2 groepen) denaturatie: hoge concentraties NaCl of ureum aan water toevoegen renaturatie: wanneer de denaturerende agentia worde nweggenomen, nemen de moleculen vaak weer spontaan hun natuurlijke vorm aan 4 grote families macromoleculen vertegenwoordigt in alle cellen: - proteïnen - nucleïnezuren - lipiden - koolhydraten bouw: polymerisatie van een beperkt aantal bouwstenen Proteïnen - opgebouwd uit onvertakte aminozuurketens van uiteenlopende lengte - bouwstenen: 20 verschillende aminozuren Nucleïnezuren - informatiedragende moleculen (RNA, DNA) - lange onvertakte ketens van nucleotiden - bouwstenen: 4 verschillende nucleotiden Koolhydraten (sachariden of suikers) - monomeren metabolisme - oligomeren vaak covalent gebonden aan eiwitten en lipiden rol in herkenning en binding van macromoleculen onderling - polymeren brandstofreserve (glycogeen, zetmeel), vormen van structuur (cellulose, chitine) Lipiden - kleinere afmetingen - vertakte moleculen - bestaan meestal uit vetzuren en een alcohol waarop 1 of meerdere kleine (polaire) moleculen gehecht kunnen zitten - belangrijke structurele rol en als cellulaire brandstoffen Er bestaan covalente bindingen tussen suikters en eiwitten of lipiden hybride moleculen (glycoproteïnen, glycolipiden) Primaire structuur = volgorde waarin schakels aan elkaar vast zitten Secundaire structuur = ruimtelijke vorm van het polymeer over korte afstand Tertiaire structuur = ruimtelijke vorm voor het gehele polymeer in-vivo-experimenten: proefopstelling waar men gebruik maakt van intacta organismen eerste: op Escherichia coli (darmbacterie) of Saccharomyces cerevisiae (gist) daarna op primitieve dieren vb: drosophila melanogaster (vlieg) en caenorhabditis elegans (worm) nu: op kleine zoogdieren (muis, rat) in-vitro-experimenten: isoleren van een bepaald bestanddeel uit het organisme (geïsoleerde cellen uit een orgaan, gezuiverde celorganellen, celvrij extract …) Ultracentrifugatie: cellen op een weinig beschadigdende wijze openbreken en diverse celbestanddelen te fractioneren Biomoleculen scheiden: - naar grootte: gelchromatografie of polyacrylamide gelelektroforese - naar lading: ion-uitwisselingschromatografie en iso-elektrische focussing - naar specifieke groepen: affiniteitschromatografie Radioisotopen: ontrafelen van een aantal biochemische processen: natuurlijk voorkomende elementen (14C, 3H, 32P, 35S) als precursor ingebouwd of gezuiverde eiwitten in vitro merken met 125I (radio-immunoassay) Structuuranalyse van eiwitten en nucleïnezuren: - ontcijferen van de sequentie of volgorde van hun bouwstenen - analyse van hogere graden van moleculaire structuur (3D conformatie röntgendiffractie of NMRspectroscopie) Antilichamen (immunoglobulines): - zeer hoog discriminatief vermogen - diverse biomoleculen opsporen, zuiveren of doseren (vb: RIA, Western Blot en affiniteitschromatografie) Met specifieke enzymen kan men heel gericht bepaalde reacties in vitro uitvoeren: vb reproduceerbaar knippen va een lang DNA-molecuul in fragmenten met behulp van restrictieenzymen vb Taq-DNA polymerase kan in vitro vele kopieën maken van een stukje DNA dat de onderzoeker interesseert Ultracentrifuge - doorbraak: biochemische processen lokaliseren in subcellulaire compartimenten van eukaryote weefsels of cellen - kleinere subcellulaire deeltjes of zelfs grote geïsoleerde moleculen scheiden ten zuiveren - preparatieve scheidingstechniek - principe berust op een beweging van een deeltje of molecuul in een snel ronddraaiende buis, zodat op dit deeltje een netto fysische kracht werkt = resultante van de centrifugale kracht die op elk deeltje met een massa groter dan nu werkt en de tegenwerkende wrijvingskracht die ontstaat van zodra het deeltje begint te bewegen - de centrifugale kracht hangt af van o kwadraat van de hoeksnelheid o de straal van het zwaartepunt van het deeltje tot de as van de centrifuge o de massa van het deeltje o dimensieloze coëfficiënt gebaseerd op het verschil in dichtheid tussen het deeltje en de vloeistof waarin het deeltje zich beweegt Fc= m (1 - ) ² r - de centrifugebuis bevindt zich in een rotor met vaste hoek of beweeglijke hoek ten opzichte van de rotatieas Isopycnische centrifugatie: - dichtheid van de vloeistof in de centrifugebuis overal gelijk - wrijvingskracht zal evenredig met de snelheid van het partikel en de wrijvingscoëfficiënt van de vloeistof toenemen, er komt een moment dat de snelheid zo groot is dat Fw=Fc: Steady state het deeltje beweegt zich met constante snelheid voort: sedimentatiecoëfficiënt die de steady state snelheid per centrifugatieversnelling: S = v / ² r = m (1 - ) / f met v: sedimentatiesnelheid en ² r = hoekversnelling eenheid: Svedberg (S) = 10-3 s afhankelijk van massa en densiteit van het deeltje en van dichtheid en viscositeit van de centrifugatievloeistof grote biomoleculen: S = 2-20 S Dichtheidsgradiëntcentrifugatie - dichtheid van de vloeistof is variabel afhankelijk van de plaats in de centrifugebuis (1 - ) zal naar nul naderen naargelang het deeltje meer naar beneden de centrifugebuis beweegt - deeltje komt tot stilstand wanneer de dichtheden van het deeltje en omgeving even groot zijn - veel gebruikte vloeistoffen: waterige sucrosegradiënten en waterige gradiënt van het zout cesiumchloride (CsCl) ( RNA en DNA uit cellen isoleren) Isotopen van een bepaald element bezitten hetzelfde aantal protonen in de kern en hetzelfde aantal elektronen in de orbitalen; zij verschillen echter in het aantal neutronen in de kern quasi-identieke scheikundige eigenschappen Stabiele (niet-radioactieve) isotopen - inbouwen daarvan in biomoleculen kunnen verschillen in de dichtheid van de stof teweeg brengen: (Meselson en Stahl) 14N-DNA en 15N-DNA via ultracentrifugatie scheiden bewijs voor wijze waarop DNA zich repliceert - verschil in nucleaire magnetische resonantie (NMR) NMR-spectroscopie om glucosemetabolisme bij de mens in vivo te bestuderen na injectie van 13C-gemerkt glucose in de bloedbaan Radio-actieve (niet stabiele) isotopen: atoomkernen vervallen in de tijd naar nieuwe structuren met grotere bindingskrachten tussen de protonen en neutronen in de kern ontvangst of uitzending van energierijke elementaire deeltje Elk type radio-isotoop bezit zijn eigen karakteristiek patroon van verval dat gekenmerkt wordt door een karakteristieke emissie en een karakteristieke tijdsconstante waarin een fractie van de kern vervallen is De snelheid van verval is de daling door desintegratie van het aantal radio-actieve kernen per tijdseenheid evenredig met het aantal kernen op dat moment aanwezig: dN N aantal overgebleven dt radioactieve kernen als functie van de tijd: N N 0 e t Met de desintegratieconstante, nauw verwant aan de halveringstijd t1/2: t1/2 = 0,693/ Zelfs als de fractie klein is, kunnen er door het doorgaans grote aantal atomen in een biosysteem, toch veel desintegraties per seconde optreden heel kleine hoeveelheden radioactief gemerkte stof gemeten (= tracer) Vb: tritium 3H: - desintegreert tot helium waarbij een neutron uiteenvalt in een proton en een energierijk elektron - -straler - energie per elektron: 2 x 104 eV = 0,02 MeV - halveringstijd: 12,1 jaar - Specifieke activiteit = verhouding van het aantal 3H-atomen op het aantal glucosemoleculen (Curie/mol) met 1 Ci = 3,7 x 1010 dps (Bq) 14 C isotoop: - -straler - energie van het gemiddelde elektron per desintegratie 0,16 MeV - halveringstijd 5 x 103 jaar max. speciefieke activiteit ongeveer 3 groottes lager dan van 3H-gemerkte biomoleculen 32 P-isotoop - radioactieve labeling van nucleïnezuren en andere fosfaatbevattende biomoleculen - hoge energie van -stralen (1,4 MeV) - kortere halveringstijd: 14 dagen - specifieke activiteit tot 104 Ci/mmol - toep: DNA of RNA blot die het mogelijk maakt een bepaalde nucleotidensequentie uit een verzamelingvan duizenden verschillende sequenties te detecteren met een gemerkte radiactieve proob 35 S-isotoop - radioactieve labeling van eiwitten, middels het inbouwen van een radioactieve methionine tracer - -straler - energie van emissie-elektronen vergelijkbaar met 14C (0,16 MeV) - halfwaardetijd 87 dagen - specifieke activiteit tot 103 Ci/mmol Radio-isotopen van jood (125I en 131I) - -stralers uitzenden van hoogenergetisch foton - 125I: o eiwitten labelen door jodinatie vantyrosine zijketens o zeer hoge specifieke activiteit detectie van zeer kleine hoeveelheden molec Geiger-Muller-teller: klassieke detector voor radioactiviteit Nauwkeurige meting van radioactieve monsters via vloeibare scintillatietelling, gamma-foton-telling en autoradiografie Vloeibare scintillatietelling: - energierijke emissi-elektronen van de radioactieve desintegraties exciteren een soort ‘remspoor’ in de -elektronen van het organische oplosmiddel (aromatische ringen) waarmee het radioactieve monster is verdund - elke excitatie geeft een lichtfoton door het terugkeren van het geëxciteerde -elektron naar zijn oorspronkelijke orbitaal - lichtflits wordt opgevangen en elektronisch versterkt door een fotomultiplier - energie van het emissie-elektron bepaalt de intensiteit van het gemeten lichtflitsje - telling van 2 soorten emissie-elektronen mogelijk (dubbellabeling) - aantal lichtflitsen per seconde is evenredig met de hoeveelheid radioactieve desintegraties per seconde - de hoeveelheid getelde desintegraties = de werkelijke hoeveelheid desintegraties vermenigvuldigd met de counting efficiency (meestal ongeveer 0,5): cpm = dpm x CE Autoradiografie: detectie van desintegraties gebaseerd op de excitatie van elektronen in een fotogevoelige laag (emulsie) - in combinatie met LM of EM waarbij men in weefsel- of celsneden onderzoekt waar een bepaalde radioactieve tracer gelokaliseerd is (vb lokalisatie van een bepaalde mRNA in een bepaald celtype) eerder kwalitatieve techniek - in combinatie met gelelektroforese waarbij radioactieve biomoleculen eerst op grootte of lading van elkaar worden gescheiden en vervolgens met een radiografische emulsie worden gedetecteerd (plaatsen aar radioactieve biomoleculen geconcentreerd zwarte vlek optische dichtheid meten) semi-kwantitatieve techniek DE PRIMAIRE EIWITSTRUCTUUR De functionele en morfologische eigenschappen van de verscheidenheid aan cellen waaruit het menselijk lichaam is opgebouwd, worden in grote mate bepaald door de aard van de proteïnen die in deze cellen aanwezig zijn eiwitfuncties: - katalyse: bijna alle enzymen zijn proteïnen (uits: sommige RNA-moleculen) - structuur: vorm en stevigheid van weefsels en organen via proteïnen van cytoskelet en via collageen, elastine en andere bindweefselproteïnen tussen de cellen - beweging: intracellulaire contractiele proteïnen (filamenten van actine, myosine en geassocieerde proteïnen - transport en opslag: transporteiwitten o transferrine: vervoert ijzer o albumine: transport van apolaire moleculen zoals bilirubine o celmembraan bevat specifieke transporteiwitten en –kanalen die opname van polaire moleculen zoals ionen, suikers en aminozuren toelaten o in cel bestaan er speciale eiwitten met opslagfunctie (vb: ferritine voor ijzer) o myoglobine draagt zuurstof in cytoplasma van spiercel o hemoglobine transporteert zuurstof in de rode bloedcel - intercellulaire communicatie: hormonen en neurotransmitters binden op zeer specifieke wijze op hun doelwitcellen via receptoren die een signaal van buiten doorgeven naar het binnenste van de cel - intracellulaire communicatie: doorgeven van informatie van receptorbezetting aan structuren die dieper in de cel liggen (signaaltransductie) o transducereiwitten: tijdelijke associatie met nucleotide GTP o transcriptiefactoren: eiwitten die de expressie van het erfelijk materiaal op het niveau van mRNA-aanmaak zeer selectief regelen - Groei en differentiatie: differentiatie als gevolg van weefselspecifieke genexpressie geregeld door extracellulaire signalen, groeifactoren immunologische afweer: immunoglobulines functioneren als moleculaire antistoffen die vreemde moleculen op een specifieke wijze herkennen en binden o complement systeem: eiwit-eiwit interacties dat leidt tot het doorboren van de celmembraan van een lichaamsvreemde cel en het aantrekken van fagocyten o histocompatibiliteits systeem en T-cel-receptoren: in plasmamembranen cellulaire immuniteit Chromatine = associatie van DNA met DNA-bindende eiwitten (vb histonen) Specifieke wijze waarop proteïnen interacties aangaan met hun doelwit 3D complementariteit tussen het specifieke proteïne en het bijbehorende ligand 2 modellen om de specifieke eiwit-ligand interacties te verklaren: - instructieve theorie: 1 zeer veelzijdige flexibele proteïneketen vouwt zich netjes om het ligand heen voor N verschillende liganden bestaan er dus N verschillend specifieke conformaties van hetzelfde proteïne - matrijs theorie: voor elk ligand bestaat er een specifiek afzonderlijk proteïne dat vanaf de eiwitsynthese reeds de complementaire conformatie bezit meestal 2de theorie juist, maar ook in zekere mate sprake van een kleine of grotere aanpassing van de vorm van het eiwit aan die van het ligand, dit nadat de binding tot stand is gekomen = induced fit Alle proteïnen zijn opgebouwd als onvertakte ketens van 20 soorten bouwstenen die onveranderd gebleven zijn gedurende miljarden jaren van evolutie = aminozuren Aminozuur < aminogroep, carboxylgroep, waterstofatoom en variabele zijketen gebonden op een centraal koolstofatoom (chiraal centrum enantiomeren L en D) - carboxylgroep: zwak zuur met pKz = 2 bij fysiologische pH volledig geïoniseerd tot COO- aminogroep: base met pKz = 10 bij pH = 7 bijna volledig geïoniseerd tot NH3+ Aminozuren dragen bij pH 7 minstens 2 geïoniseerde gropen = zwitterionen Hydrofobe aminozuren: geen sterke interacties met water, in diepte van 3D-eiwitstructuur zijketens met weinig of geen elektronegatieve groepen, maar vooral koolstof- en waterstofatomen - glycine o zeer klein wanneer er weinig plaats in een bepaalde positie in het eiwit beschikbaar is o enige symmetrische aminozuur (geen entantiomeren) - proline o bezit een secundaire aminogroep omdat de zijketen ‘teruggevouwen’ is om het constante gedeelte o ringstructuur beperkte rotatievrijheid kan ruimtelijke structuur sterk beïnvloeden - alifatische apolaire aminozuren : o alanine o valine : zeer hydrofoob o isoleucine : zeer hydrofoob o leucine : zeer hydrofoob - zwavelatoom in zijketen beperkte polariteit, maar apolaire karakter CH-groepen overheerst o cysteïne: SH-groep aan uiteinde cysteïne zwavelbrug: stabilisatie ruimtelijke eiwitstructuur o methionine: van alle nieuw aangemaakte eiwitten het eerste aminozuur - aromatische zijketens UV-absorptie max bij golflengtes van 280 nm (Trp en Tyr) en 260 nm (Phe) o fenylalanine o tyrosine: bezit polaire hydroxylgroep zodat het minder hydrofoob is (kan meedoen in Hbruggen) o tryptofaan Hydrofiele aminozuren : wel interacties met water, aan oppervlakte van een eiwit - aminozuren met alifatische alcoholgroep: vrij reactieve hydroxylgroepen soms vervangen door andere groepen (post-translationele modificaties) o serine: serine-O-groep vaak een belangrijk onderdeel van de actieve site van enzymen (vb serine proteasen) o threonine - positieve lading bij pH 7,4: vormen ionbindingen met anionen of gaan elektrostatische interacties aan met water o lysine: hoge pKz (10,8) o arginine : hoge pKz (12,5) o histidine imidazolgroep heeft pKz van 6-7: bij neutrale pH evenwicht waarbij ongeveer de helft van de histidines neutraal en de helft positief geladen zijn verschuivingen evenwicht belangrijk voor veranderingen in eiwitstructuur of eiwitfunctie vaak onderdeel van actieve site van enzymen - netto negatief geladen zijketens bij pH 7 : komen bij neutrale pH voor al anionen intramoleculaire ionbindingen of sterke interacties met waterige omgeving o aspartaat o glutamaat - zeer polair maar niet geladen : directe afgeleiden van aspartaat en glutamaat o asparagine amidogroep wordt in sommige eiwitten geglycosyleer = N-gebonden glycosylering o glutamine Post-translationele modificaties : sommige aminozuurzijketens worden na inbouw van het aminozuur in een eiwit nog chemisch gewijzigd belangrijk voor het bepalen van de uiteindelijke eiwitstructuur of voor de regulatie van de eiwitfunctie - onomkeerbare modificaties herkenning van eiwitten door andere eiwitten (chemische communicatie tussen cellen o hydroxylatie van sommige prolines en lysines in het structuureiwit collageen o sommige asparagine, serine en threoninezijketens in eiwitten worden geglycosylerd (= covalent vasthechten van korte vertakte suikerketens die het eiwit extra polariteit geven) - omkeerbare modificaties: o fosforylatie (proteïne kinasen) /defosforylatie (proteïne fosfatasen) van sommige serine, threonine of tyrosineresidu’s in eiwitten actief of inactie maken meest gebruikte chemische vorm van regulatie van eiwitfunctie Modificaties van vrije aminozuren zijn belangrijk voor de werking van het zenuwstelsel: zenuwcellen communiceren met andere zenuwcellen of met doelwitcellen via chemische boodschapperstoffen (neurotransmitters, vaak directe afgeleiden van aminozuren) en worden door de zenuwcel in de buitenwereld gebracht via een proces van secretie Binding van een neurotransmitter ionenstromen door de plasmamembraan of aanmaak van kleine intracellulaire signalen - neurotransmitters afgeleid van tyrosine: dopamine, adrenaline en noradrenaline - neurotransmitter afgeleid van tryptofaan: serotonine - neurotransmitter afgeleid van glutamaat: GABA - ongewijzigde aminozuren als neurotransmitters: glycine en glutamaat (belangrijkste stimulerende boodschapperstof in de hersenen, onontbeerlijk voor geheugen en redenering) Een peptidebinding ontstaat wanneer de -carboxylgroep van het ene aminozuur condenseert met de aminogroep van het andere aminozuur, waarbij een watermolecuul vrijkomt evenwicht naar links, omdat peptidebinding een hogere energie-inhoud bezit aanzienlijke inbreng van energie (ATP) Vorming van peptidebindingen vindt plaats in een levende cel via ribosomen, afbraak (proteolyse) gebeurt op vele plaatsen en verloopt via een serie specifieke katalysatoren vb: bloedstolling wordt via beperkte proteolyse geregeld - oligopeptiden: minder dan 20 AZ - polypeptiden: 20 tot 100 AZ - proteïnen: grote tot zeer grote polypeptiden die uit 1 of meerdere ketens van honderden aminozuren kunnen bestaan (vb IgG: 2 lichte en 2 zware ketens, gezamenlijk 1500 aminozuurbouwstenen) Aminoterminaal deel is volgens afspraak het begin van de peptideketen, het is ook de zijde die het eerst ontstaat tijdens het proces van proteïnesynthese Primaire structuur: aminozuursequentie en de juiste posities van S-S-bruggen verantwoordelijk voor de eigenschappen van het eiwit en bevat de informatie die bepaalt hoe het eiwitmolecuul zich driedimensionaal gaat oprollen tot een min of meer compacte structuur De sequentiebepaling van de aminozuurvolgorde van insuline uit runderen door Fred Sanger leverde het experimenteel bewijs dat een welbepaald proteïne gekarakteriseerd wordt door een welbepaalde unieke aminozuurvolgorde insuline: - peptidehormoon dat bij hogere diersoorten het bloedsuikergehalte verlaagt - vrij klein eiwit, bestaat uit 2 ketens die onderling covalent verbonden zijn door 2 zwavelbruggen - er bestaat binnen de A-keten ook een interne S-S brug - runderpacreas insuline en menselijk insuline zijn voor meer dan 90% gelijk zeer grote sequentiehomologie en meeste wijzigingen conservatief (gewijzigde aminozuren bezitten vrijwel identieke zijketens) (hetzelfde eiwit in 2 levensvormen = orthologen) - verschillen tussen mens en rund voor insuline op DNA-niveau zijn groter dan de verschillen die werden opgemerkt op eiwitniveau Primaire structuur van zuurstoftransporteiwit myoglobine: 1 enkele polypeptide met 153 residu’s primaire structuur in verschillende diersoorten vrij sterk vergelijkbaar (walvis en mens: 84% identiek) Moleculaire evolutieleer: duidelijke relatie tussen de volutionaire afstand tussen twee levensvormen en de graad van identiteit van 2 primaire sequenties van een bepaald type eiwit dat aanwezig is in deze levenvormen (aantal aminozuursubstituties per miljoen jaren evolutie is echter zeer verschillend van eiwit tot eiwit Cytochroom c - van mens en rhesusaap verschilt slechts 1 van de 104 aminozuurresidu’s - voor mens en hond: 11 residu’s - voor mens en saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) tot 45 residu’s elke mutatie van een dergelijk geconserveerd aminozuur is fataal voor het individu en blijft dus niet behouden voor de volgende generatie Histonen: - histon H4 verschilt slecht 2 op 102 residu’s tussen erwt en rund (evolutionaire afstand: 1 miljard jaar) - aminozuursequentie van histon H4 bevat relatief veel aminozuren met positief geladen zijketens (Lys en Arg) van groot belang voor de binding van deze eiwitten op het negatief geladen DNA Fibrine: - sterke verschillen in primaire structuur in nauw verwante diersoorten - maar weinig of geen functieverlies Sterk geconserveerde residu’s zijn belangrijk voor de functie van het eiwit elke mutatie van een dergelijk geconserveerd aminozuur is nadelig voor het individu en blijft dus niet behouden voor de volgende generatie IGF1 en IGF2 (insulinlike growth factoren) - lijken op insuline sequentiehomologie - groeistimulatoren de meeste eiwitten zijn leden van een of andere eiwitfamilie, 2 eiwitfamilieleden in dezelfde levensvorm zijn paralogen of isovormen van elkaar De biochemische studie van de eiwitfunctie start meestal met de zuivering van het studieobject uit het startmateriaal Elektroforese is een techniek die geladen moleculen van elkaar scheidt door differentiële mobiliteit in een ruimte waarin een elektrisch veld aanwezig is Elektroforese wordt uitgevoerd in een gel - die bestaat uit een macromoleculair netwerk waarin water, zouten en biomoleculen zich kunnen bewegen - voordeel: stabiliseert de waterfase enorm geen turbulenties in het scheidingsveld ten gevolge van warmteontwikkeling - polyacrylamide-gel: eiwitelektroforese, bestaat uit chemisch inert steunmateriaal (polyacrylamide) - agarose: elektroforese van nucleïnezuren - eiwitmengsels volgens 2 principes scheiden (eiwitgrootte en netto eiwitlading) gecombineerd tot 2D eiwitelektroforese Polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-PAGE) - eiwitten in het te scheiden mengsel worden eerst voorbehandels met SDS (sodiumdodecylsulfaat): negatief geladen detergens dat de eiwitten gedeeltelijk denatureerd en dat in grote hoeveelheden gaat binden op het eiwit (natuurlijke nettolading van het eiwit speelt dus geen rol) - door eiwitten vooraf te reduceren met -mercapto-ethanol of dithiotreitol, verbreekt men ook de eventueel aanwezige S-S-bruggen - alle eiwitten bewegen dus naar de positieve elektrode (anode) o kleinste eiwitten, die een kleine wrijving ondergaan in het netwerk zullen het snelst migreren o grootste eiwitten zullen langzamer migreren praktijk: eiwitten in een bepaalde tijdsperiode laten migreren over een afstand die omgekeerd evenredig is met de logaritme van hun moleculair gewicht - door in parallel met het onbekende eiwit(mengsel) een aantal standaardeiwitten met bekende moleculaire gewichten te laten migreren, kan men de molecuulmassa van het onbekende eiwit bepalen - meestal zijn eiwitten kleurloos kleuren of visualiseren: o coomassie blauw of zilverkleuring o autoradiografie (bij radioactief gemerkte eiwitten) o blotting: eiwitten uit de gel kwantitatief overdragen op een membraan (Western blotting) wat toelaat om de eiwitbandjes te onderzoeken met specifieke antisera Iso-elektrische focussing (IEF): eiwitten gescheiden naargelang de natuurlijke nettolading eiwitten bevatten naast de vrije amino- en carboxyterminus ook ioniseerbare aminozuurzijketens (lading hangt af van pH) - elk eiwit kan door het aantal en type ioniseerbare groepen worden gekarakteriseerd door een grootheid: pI of iso-elektrisch punt = pH-waarde waarbij de som van alle ladingen van het eiwitmolecuul 0 is en waarin een eiwit niet meer beweegt in een elektrisch veld omdat de voortstuwende kracht dan gelijk is aan nul - belangrijkste ioniseerbare groepen: o carboxylgroep Asparaginezuur of glutaminezuur - o histidine o lysine aminogroep o arginine aminogroep gel waarin zich een pH-gradiënt bevindt komt tot stand door een gradiënt van zogeheten amfolines (kleine polymeren die ioniseerbare groepen dragen) te gebruiken ieder eiwit zal volgens zijn eigen ‘natuurlijke’ nettolading gaan bewegen totdat het terechtkomt in een gebied dat een pH-waarde bezit die gelijk is aan de pI van het eiwit In de chromatografie wordt een mechainsche kracht uitgeoefend op een zogenoemde mobiele fase die langs een vaste fase stroomt - vaste fase: grote aantallen zeer kleine bolletjes in de kolom met een relatief klein volume mobiele fase kan met een enorme oppervlakte vaste drager bereiken efficiënte scheiding - gebaseerd op molecuul specifieke verschillen in de relatieve interacties (adsorptie, diffusie, binding) tussen moleculen, de vaste fase en de vloeibare fase - moleculen met de zwakste interacties komen het eerst de kolom weer uit, moleculen met sterkere interacties volgen later - verschillende soorten: gelfiltratie, ion-exchange chromatography, affiniteitschromatografie en high performance liquid chromatografie (HPLC) Gelfiltratie: de vaste drager werkt als een moleculaire zeer omdat de kleine bolletjes (sephadex, sepharose …) heel poreus zijn en van binnen bestaan uit een doolhof van mazen en spleten waarin kleine moleculen kunnen doordringen en dus sterk vertraagd worden. De keuze van de poriegrootte van de bolletjes bepaalt het gebied van moleculaire gewichten waar de scheiding het meest efficiënt is. Ionenuitwisselingschromatografie: de vaste drager draagt geladen groepen - drager negatief: carboxymetylcellulose (CM-cellulose) netto positief geladen eiwitten worden door elektrostatische aantrekkingskrachten tegengehouden en dus vertraagt tov loopbuffer - door pH van de loopbuffer geleidelijk te verhogen, zullen alle eiwitten meer en meer netto negatief geladen worden o de volgorde van loslaten van eiwitten van de kolom geeft een beeld van de pI-waarden van deze eiwitten o tijdens elutie worden de oorspronkelijk positief geladen eiwitten dus van de drager losgemaakt door de pH te verhogen - door de concentratie NaCl of een ander zout van de loopbuffer gradueel te verhogen, gaan de positief geladen natriumionen competeren met de positief geladen eiwitgroepen voor binding op de negatief geladen dragergroepen op de kolom Gelfiltratie lijkt op SDS-PAGE terwijl ionenuitwisselingschromatografie wat lijkt op IEF Affiniteitschromatografie: drager met een covalent gebonden groep die een affiniteit bezit voor het eiwit dat men wil zuiveren - grote specificiteit - vb: lectine concanavaline A bindt aan glycoproteïnen die glucoseresidu’s bevatten o weerhoudt op een specifieke wijze de glucose bevattende glycoproteïnen uit een zeer complex eiwitmengsel o na de kolom te hebben gewassen, blijven gezuiverde glucose bevattende glycoproteïnen over o deze worden uit de kolom geëlueerd door een overmaat glucose aan de nieuwe loopbuffer toe te voegen competitie voor binding aan Con A glycoproteïne wordt verdrongen en wordt als zuivere fractie onderaan de kolom opgevangen - krachtiger als scheidingstechniek naarmate men een specifieker en sterker bindende groep als lokaas op de drager hecht High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - scheidingen bij hoge vloeistofdruk vloeistofstroom door de gehele kolom sneller en scheidingsprocedure vlotter - hoge druk laat toe om relatief lange kolommen te gebruiken met een zeer kleine diameter en toch een zeer groot oppervlak voor uitwisseling met de te scheiden moleculen scheiding mogelijk op relatief kleine hoeveelheden monsters en scheidingsvermogen van mengsels beter - volautomatisch en computergestuurd analyses en verwerking van de resultaten kunnen continu doorgaan Reverse-phase HPLC: eiwitten worden vooral op basis van hun hydrofobiciteit gescheiden door gebruik te maken van een apolaire vaste drager en een min of meer polaire vloeibare fase (vb water, trifluorazijnzuur TFA en acetonitril) - polariteit van de vloeibare fase kan in de tijd worden veranderd: gradiënt - mogelijk om in een complex mengsel vele soorten peptiden van elkaar te scheiden - door UV-absorptie metingen wordt de eiwitconcentratie in het eluans gemeten - de volgorde waarmee de peptiden als functie van de tijd uit de kolom elueren en de piekhoogtes worden weergegeven door het chromatogram - door te werken met radioactief gemerkte eiwitten, kan met de fracties ook kwantificeren via scintillatietelling Aminozuursamenstelling van een zuiver eiwit bepalen: analyse van de primaire structuur: - zure hydrolyse van alle peptidebindingen - de 20 verschillende soorten aminozuren in het hydrolysaat worden door een speciale ionenuitwisselingschromatografie van elkaar gescheiden - de hoeveelheden van elk aminozuurfractie worden bepaald door een kwantitatieve kleurreactie met ninhydrine of een andere kleurstof Bepaling van de aminoterminus - Fred Sanger - gebruik van stoffen die een stabiele covalente binding aangaan met de vrije aminoterminus - zure hydrolyse levert een veranderend NH2-terminaal residu op dat door ionenuitwisselingschromatografie kan worden geïdentificeerd - Sangerreagens: fluorodinitrobenzeen Bepaling van de aminozuurvolgorde Edman-degradatie - verbinding gevormd tussen de aminoterminus van het eiwit en de stof fenylisothiocyanaat - in licht zure omstandigheden splitst alleen het NH2-terminale aminozuurderivaat af, waarbij een fenylthiohydantoïne-ring (FTH) ontstaat - nieuwe aminoterminus kan in een volgende ronde met fenylisothiocyanaat reageren - verschil met Sanger: geen agressieve zure hydrolyse, maar lichte hydrolyse waarbij alleen het hydantoïnederivaat ontstaat - de sequentiebepaling vindt plaats op een zuivere eiwitfractie - alle eiwitmoleculen behouden tijdens de sequentiebepaling synchroon dezelfde opeenvolgende aminotermini - met moderne geautomatiseerde apparaten = sequenators: van zeer kleine hoeveelheden zuiver eiwit sequentie van enkele 10tallen opeenvolgende aminozuren te achterhalen Selectieve proteolyse - bij elke volgende ronde van Edman-degradatie neemt de ruis een beetje toe en het signaal een beetje af (synchrone status van de afzonderlijke eiwitmoleculen is niet perfect) - eiwit eerst in kleinere fragmenten splitsen en dan van elk fragment wordt de aminozuursequentie bepaald - cyanogeenbromide (CNBr): verbreekt alleen peptidebindingen aan de carboxyterminale zijde van methionineresidu’s (methionine is vrij zeldzaam in eiwitten) - trypsine: spijsverteringsenzym, knipt peptideketen uitsluitend aan de carboxyterminale zijde van arginine- of lysine-residu’s de verkregen eiwitfragmenten worden via HPLC van elkaar gescheiden en daarna wordt via Edmandegradatie de aminozuursequentie van elk fragment bepaald om volgorde van fragmenten te kennen overlappende eiwitfragmenten die met andere knipmethode werden gemaakt (vb eerst CNBr en dan trypsine) Families van eiwitten: - haem-dragende zuurstoftransporteiwitten: globines - serine proteasen: trypsine, chymotrypsine, thrombine en plasmine - secretie-eiwitten bevatten aan aminoterminale kant een signaalsequentie die bestaat uit een 20-tal hydrofobe residu’s - transmembranaire eiwitten bevatten 1 of meerdere hydrofobe stukken van 20-tal residu’s Bekende aminozuursequenties maken van antilichamen tegen het eiwit, vertalen van aminozuursequentie in waarschijnlijke nucleotidensequentie om een synthetisch oligonucleotide te vervaardigen dat gebruikt kan worden als probe in moleculair biologisch onderzoek Synthetische oligopeptiden - omgekeerde weg van machinale polypeptideafbraak van sequencing = solid phase methode van Merrifield - via organisch-chemische synthese specifieke oligopeptiden met een maximale lengte van ongeveer 40 aminozuren kan synthetiseren - principe: groeiende peptideketen tijdens de synthese geïmmobiliseerd zodat alle reacties zich afspelen in een kleine kamer die tussen de ahtereenvolgende koppelingscycli grondig gewassen wordt - telkens wordt 1 specifieke peptidebinding gevormd doordat de gewenste COO—groep van het aan te koppelen aminozuur is geactiveerd met DCC (dicyclohexylcarbodiimide) terwijl alle overige groepen chemisch zijn afgeschermd met t-Boc (tertbutyloxycarbonyl) - door zachte hydrolyse komt het uiteindelijke polypeptide los van de vaste drager en kan het met HPLC van onzuiverheden worden gescheiden - belang in het medisch-biologisch onderzoek en in de geneeskunde: o met deze peptiden specifieke antilichamen maken (peptide wel gekoppeld aan drager) o als synthetisch hormoon o synthetische peptide-analogen als geneesmiddelen met een betere werking Een verandering in de gezondheidstoestand gaat vaak gepaard met veranderingen in de biochemische samenstelling van het extracellulair vocht bloedafname is daarom een belangrijk middel om biologische en biochemische criteria van gezondheid of ziekte bij de mens vast te stellen Extracellulaire vochten: - bloed(plasma) - lymfe - interstitieel vocht - cerebrospinaal vocht (bijzondere vorm van interstitieel vocht in het centraal zenuwstelsel) Bloed bestaat uit een cellulaire component en een vloeistofcomponent die van elkaar gescheiden worden dankzij sedimentatie en centrifugatie - beiden nemen normaal 50% van het totale bloedvolume in - bepalen van het celvolume-aandeel in het bloed (hematocriet) is een belangrijk routinebloedonderzoek Plasma is de vloeistoffase die overblijft wanneer men de bloedcellen verwijderd via centrifugatie uit onstolbaar gemaakt bloed Als men vers bloed laat stollen: - klonter opgebouwd als een netwerk van onoplosbaar fibrine waarin de bloedcellen gevangen zitten - de lichtgele bovenstaande vloeistof = serum lichtgele kleur is afkomstig aan het opgelost bilirubine (afbraakproduct van haem) Lymfe en interstitieel vocht zijn relatief arm aan grotere eiwitten en bevatten normaal geen rode bloedcellen Bij bloedafname moet men er rekening mee houden dat de cellulaire component een invloed kan hebben op de biochemische eigenschappen van de niet-cellulaire fase, vb: Hemolyse (artefact waarbij rode bloedcellen openbarsten) hemoglobine en kalium in plasmafase kunnen door glucoseopname en – metabolisme de plasmaglucosespiegel doen dalen Plasma-eiwitten zorgen voor een groot aandeel van biomoleculen in het bloed - verschil tussen plasma en serum: in plasma is er nog fibrinogeen aanwezig - plasma- of serumeiwitten worden van elkaar gescheiden mbv elektroforese Serumeiwitten: - albumine (54-58%) - 1-globulinen (6-7%) - 2-globulinen (8-9%) - -globulinen (13-14%) : verzameling van plasmaeiwitten met een elektroforetische mobiliteit van de globulinegroep - -globulinen (11-12%) Albumine - 66kDa - opgebouwd uit 1 enkele polypeptideketen (580 AZ-residu’s) - meest vertegenwoordigde eiwit in serum en een van de kleinste serumeiwitten draagt bij tot de osmotische druk van het plasma - in mindere mate aanwezig in interstitieel vocht oncotische druk (microcirculatie) - afgeronde elliptische vorm geeft relatief kleine viscositeit aan bloed (gunstig omdat dit van het hart een relatief geringe inspanning vraagt - fysiologische rol in het transport van sommige apolaire biomoleculen door de bloedbaan (vb vrije vetzuren en bilirubine, steroidhormonen, tryptofaan) o vrij vetzuurtransport: belangrijk tijdens periode van vasten waarbij vetcellen hun triglyceriden afbreken tot glycerol en vetzuren vetzuuren naar lever waar via endocytose opgenomen in parenchymcellen - analbuminemie: hoeveelheden cholesterol, triglyceriden en fosfolipiden in het bloed zijn gestegen (erfelijke ziekte) - bindt ook geneesmiddelen (penicilline, coumarinederivaten, aspirine …) farmacokinetiek van geneesmiddelen - aangemaakt en gesecreteerd door de parenchymcellen van de lever plasmaconcentratie van dit eiwit daalt bij ernstige leverziekten (levercirrhose) - hypoalbuminemie: verlies van albumine in de urine (albuminurie) met als gevolg oedemen (verlaagde oncotische druk in capillairen leidt tot verhoogde vloeistofstroom vanuit de bloedvaatjes naar de interstitiële ruimte vochtopstapeling) o vb bij ontstekingsreactie van de glomerulus waarbij de membraan gaat lekken (= nefrotisch syndroom) o vb bij chronische eiwitmalnutritie (ontwikkelingslanden) -globulinen: - uiteenlopende functies - retinol binding proteïn (vormt een complex met transthyretine vermijden van verdwijnen in urine), TBG (thyroxine binding globuline) en transcortine: 1-globulines die functioneren als specifieke transporteiwitten (retinol=vitamine A, thyroxine en cortisol) - ceruloplasmine en haptoglobulinen: 2-globulines, specifieke transporteiwitten o ceruloplasmine: glycoproteïne dat koperionen vervoerd, rol in regulatie van ijzertransport o haptoglobulinen: specifiek vrij hemoglobine binden dat ontstaat door intravasculaire hemolyse niet gebonden circulerend hemoglobine wordt door glomeruli in nier doorgelaten wat leidt tot nierschade en verlies van ijzer (heterogeniteit quaternaire structuur van lichte - en zware -ketens) - serine protease inhibitors (antithrombine III en 2-antiplasmine) o 2-macroglobuline dat allerlei ongewenste proteolytische activiteit in het bloed remt o 1-antitrypsine remt elastase dat vrijkomt wanneer fagocyterende witte bloedcellen hun secretiegranulae exocyteren (gaat overdreven werking van elastase tegen) -globulinen: - transferrine: transporteiwit voor Fe3+-ionen in de bloedbaan (2-3 gram/liter), gehalte stijgt bij patiënten met ijzertekort (normaal 30% van bindingsplaatsen bezet, bij ijzertekort neemt dit percentage af) - hemopexine: bindt specifiek vrije haemgroepen , vooral belangrijk bij overdreven intravasculaire hemolyse o complex haem-hemopexine wordt opgenomen in Kupfercellen van de lever waar het ijzer wordt gerecupereerd - 2-microglobuline: in zeer lage gehaltes in serum, vormen invariabele lichte-keten-component van klasse I-HLA (Human Leucocyte Antigen, polymorfe groep membraaneiwitten) - C-reactive proteïn (CRP): normaal in kleine hoeveelheden, gehalte stijgt sterk in acute fase van infectieziekten (acute fase eiwit) Enzymen komen bij veel lagere concentraties in het bloed voor, in sommige pathologische omstandigheden gepaard met weefselschade intracellulaire enzymen in bloed Hormonen zijn ook vaak serumeiwitten, vaak in zeer lage concentraties: vb insuline RUIMTELIJKE EIWITSTRUCTUUR röntgendiffractie en 2D NMR spectroscopie De ruimtelijke eiwitstructuur over korte afstand = secundaire structuur Röngendiffractie-analyse van oligopeptiden door Pauling en Corey info over manieren waarop een lineaire polypeptideketen zich over korte afstand kan oprollen - peptidebinding is vrij stijve 2D-structuur waarbij carbonyl-zuurstof en amino-waterstof in transpositie tegenover elkaar liggen - beide centrale koolstofatomen hebben el een zekere rotatievrijheid -helix - rechtsdraaiende spiraal van de peptideketen - CO-groep van aminozuur 1 vormt een H-brug met de NH-groep van een aminozuur 4 plaatsen meer naar het carboxyterminaal - per winding zijn er gemiddeld 3,6 aminozuurresidu’s overspannen 1 AZ roteert ong 100° tov zijn buren - zijketens van de aminozuurresidu’s liggen loodrecht op lengteas van de helix en wijzen naar buiten toe - in een aantal proteïnen betrokken bij vormgeving of verdeling van trek- en drukkrachtveld in of tussen cellen: -helix gedeelten zeer uitgestrekt en vormen meerdere naast elkaar gelegen moleculen als het ware gevlochten kabels die heel wat kracht kunnen opvangen (vb: myosine, keratine in huid en haar, fibrine in bloedklonters) -vouwblad - vlakke structuur waar de polypeptideketen bijna volledig uitgerekt is - talrijke H-bruggen tussen CO- en NH-groepen van aminozuren die ver van elkaar liggen, vaak zelfs op verschillende polypeptideketens - parallel -vouwblad: verschillende peptideketens lopen in dezelfde richting - anti-parallel -vouwblad: in tegengestelde richting - aminozuurzijketens steken naar boven en onder het vlak van het vouwblad uit - vb: zijde-fibroïne geeft stevigheid en elasticiteit aan zijde (verschillende uitgestrekte vouwbladen op elkaar gestapeld) - -draai: richting van polypeptide draait plots 180° waarna er een stukje anti-parallelle -structuur ontstaat (dikwijls door prolineresidu) Collageenhelix = triple helix - uniek voor collageen (bindweefseleiwit) - zeer hoog gehalte aan glycine, proline en post-translationeel gewijzigd hydroxyproline (motief Gly-ProX met X vaak hydroxyproline) - linksdraaiende helix met precies 3 residu’s per winding - 3 polypeptideketens kunnen zeer dicht bij elkaar komen doordat de glycines met hun zeer kleine zijketen naar de gemeenschappelijke lengte-as uitsteken en de (hydroxy)prolines radiaal uitsteken Supersecundaire structuur = typische motieven van ruimtelijke conformaties in iets uitgebreidere gebieden (vb bundels van -helix of raamwerken van parallele of anti-parallele -vouwbladen) vormen soms domein in het eiwit Volledige ruimtelijke structuur van de polypeptideketen = tertiaire structuur Gebieden in de polypeptideketen met minder regelmatige conformatie = random coil Aminozuurresidu’s in onregelmatige bochten aan de oppervlakte van het eiwit zijn evolutionair minder geconserveerd Binnen een bepaalde eiwitfamilie is de homologie in tertiaire structuur doorgaans groter dan de homologie in de primaire structuur De ruimtelijke structuur van eiwitten met verschillende subeenheden = quaternaire structuur Elk afzonderlijk polypeptide wordt subeenheid genoemd Hemoglobine: - eiwit dat zuurstof transporteert in de rode bloedcellen - heterotetrameer: structuur met 4 subeenheden waaronder tenminste 2 verschillende soorten subeenheid - de 2 soorten subeenheden behoren tot de globinefamilie (zoals myoglobine zuurstofdragend eiwit in spierweefsel) Fibreuze eiwitten - grote supramoleculaire netwerken - vezelachtige structuren - belangrijke mechanische rol o o o collageen bindweefsel elastine wand bloedvaten keratine huid en haar Fibroïne - eiwit dat de zijderups gebruikt om zijde te spinnen voor een cocon - rijk aan glycine (45%), alanine (29%) en serine (12%) uitgestrekte regio’s van anti-parallele vouwbladen (alternerend gly-X) verschillende bladen mooi dicht opeen stapelen (heel wat nietcovalente interacties op korte afstand Keratines - -keratines structurele rol in haar - velee polypeptideketens liggen evenwijdig gerangschikt in een vezel - elke afzonderlijke polypeptideketen vormt een langgerekte -helix - 3 -helixen draaien om elkaar heen = protofibril - bundels protofibrillen interageren parallel tot een microfibril en vele microfibrillen vormen macrofibrillen - talrijke stabiliserende H-bruggen - afzonderlijke polypeptideketens covalent aan elkaar gebonden via een netwerk van S-S-bruggen = cross-links Collageen: - meest voorkomende eiwit in het lichaam van hogere dieren - vormt wateronoplosbare eiwitkabels die weerstand bieden aan mechanische trekkrachten mechanische stevigheid - extracellulair bindweefseleiwit, in praktisch alle weefsels - meer dan 10 verschillende collageensoorten beschreven met een weefselspecifiek distributiepatroon, elk type collageen bezit een gelijkwaardige ruimtelijke structuur - primaire structuur: repetitieve sequentie met glycine en proline secundaire structuur: collageenhelix - 3 collageenhelixen vormen samen de triple helix procollageen (voorlopereiwit van collageen) door weefselvormende cellen zoals fibroblasten aangemaakt en buiten de cellen gebracht via secretie - in extracellulaire ruimte zullen de ‘losse staartjes’ aan de carboxy- en aminoterminale uiteinden van procollageen worden afgeknipt tropocollageen - vele H-bruggen tussen de ketens van de triple helix en de dichte toenadering van de ketens waardoor er van der Waals interacties zijn, veroorzaken een vrij stijve, staafvormige molecuul (totale lengte 300 nm) - vele tropocollageen moleculen liggen parallel gerangschikt in een collageenvezel, waarbij koppen en staarten van naburige moleculen ongeveer 67 nm tov elkaar verschoven zijn - de gaten tussen de tropocollageen bouwstenen (40 nm) zijn waarschijnlijk nucleatieplaatsen voor de afzetting van calciumzouten (hydroxyapatiet) in bot-collageen - cross-links: tussen lysines en hydroxylysines o lysines worden eerst door het enzym lysyl-oxydase omgezet tot lysine-aldehyde (allysine) o 2 allysineresidu’s of een lysine- en een allysineresidu condenseren tot een cross-link o verschillende lysine- en allysineresidu’s aan de carboxy- en aminoterminale uiteinden van tropocollagen condenseren tot een complexe cross-link die een brug vormt tussen 2 afzonderlijke tropocollageen moleculen collageenvezel verstevigd o vb: in collageen type I van menselijke achillespees veel meer cross-linking dan in huid - enzymatische afbraak door collagenasen die peptidebindingen in het tropocollageen openknippen o pathologische collagenase: bacterie clostridium histolyticum (verwekker van gangreen, een zeer invasieve weefselinfectie) in onderzoekslabo’s gebruikt om weefselstukken te verteren tot losse cellen of celklompjes o fysiologisch type collagenase: door fibroblasten gebruikt tijdens perioden van weefselmodellering (embryogenese of wondheling) knipt tropocollageen slechts op enkele specifieke plaatsen door Globulaire eiwitten - compacte, wateroplosbare bolvormige eiwitten - diverse functies: katalyse, transport, signaaloverdracht, genexpressie, verdediging - de meeste polaire aminozuurzijketens steken naar de buitenkanten van het eiwit uit terwijl de apolaire residu’s in de diepte van het eiwit liggen begraven en via van der Waals-interacties kunnen interageren - ook regelmatige secundaire structuren (-helix, -vouwblad) vooral in de diepte omdat de polaire backbone-groepen verbonden zijn door H-bruggen en dus geen interactie meer kunnen aangaan met water - hydrofobe effect is een van de grootste drijfveren voor het spontaan oprollen van globulaire eiwitten in een waterige omgeving - andere stabiliserende krachten: ionbindingen, S-S bruggen, H-bruggen Cytochroom c: - hydrofobe effect: hydrofobe en hydrofiele aminozuurresidu’s liggen door elkaar heen in de primaire eiwitstructuur, in de tertiaire structuur liggen de hydrofobe aminozuurresidu’s echter in de diepte van het eiwit begraven en de hydrofiele aminozuurresidu’s aan de oppervlakte van het eiwit - bevat relatief veel stukjes -helix zowel aan oppervlak als in de diepte - centraal in het eiwit ligt een hydrofobe niet-eiwitstructuur: haemgroep haem = platte ringvormige structuur, waarmee cytochroom c zijn functie uitoefent, centraal in de ringstructuur zit een ijzeratoom (geïoniseerd en covalent verbonden met 2 aminozuurzijketens van de polypeptideketen (his-18 en met80) - tertiaire structuur is evolutionair zeer goed geconserveerd - het ijzerion wordt gereduceerd en geoxideerd tijdens een redoxreactie die als doel heeft om elektronen door e geven in de mitochondriale ademhalingsketen. Door deze elektronenstroom is de mens in staat om biochemische brandstoffen aëroob te verbranden Immunoglobulinen - antilichamen herkennen en opruimen van lichaamsvreemde structuren (herkenningsmechanisme: dichte wederzijdse toenadering) - basisstructuur: Y-vormig molecuul dat is opgebouwd uit 2 paren polypeptideketens die aaneenhangen dankzij S-S-bruggen en niet-covalente interacties o zware ketens en lichte ketens met moleculair gewicht van 50 en 25 kDa o centrale as: carboxyterminale helft van de beide zware ketens o lichte keten gaat interacties aan met telkens de aminoterminale helft van 1 zware keten - er bestaan 5 verschillende immunoglobuline klassen (IgA, IgG, IgD, IgE en IgM) met telkens 1 bepaald type zware keten (, , , of ) - er bestaan 2 soorten lichte ketens ( of ) - IgM: o circulerend antilichaam o vroege fase van immuunrespons o herkennen van antigenen met een zich herhalende structuur - IgG o grootste fractie van de circulerende immunoglobulines o veel grotere specificiteit van de antigeen herkenning o kan door complexvorming gevaarlijke stoffen neutraliseren (vb neutralisatie van het tetanostoxine van de bacil Clostridium tetani en neutralisatie van het poliovirus) o het constant gedeelte van IgG kan verschillende effectormechanismen in gang zetten opsonisatie: het door IgG gebonden virus of bacterie wordt gemakkelijker gefagocyteerd door macrofagen of monocyten activatie van het complementsysteem: cascade van proteolytische eiwitreacties die leiden tot het vrijkomen van ontstekingsbevorderende factoren en tot het doorboren van de met IgG beklede celmembraan - - - - - - - IgA o antilichaam van de secretievloeistoffen o relatief resistent tegen proteasen o dimeer, naast zware en lichte ketens een aparte secretory component o verdediging tegen infectieziekten thv de slijmvliezen o via de moedermelk aan de zuigeling gegeven IgD: integraal eiwit in de membraan van lymfocyten IgE o in zeer lage concentraties in het serum o gehalte is gestegen bij allergische patiënten o bindt om mastocyten en veroorzaakt secretie van vasoactieve stoffen zoals histamine (wanneer in sterk overdreven mate in bloed anafylactische shock) mbv proteolytische enzymen zoals papaïne kan een immunoglobuline gesplitst worden in een constant gedeelte (Fc) dat bestaat uit een doormidden gebroken zware-ketenpaar en 2 variabele fragmenten (Fab) die bestaan uit de andere helft van 1 zware keten samen met 1 lichte keten antigeen bindt in groeve (antigeen-bindende sites) aan het uiteinde van de Fab fragmenten variaties aan de carboxyterminale helft van de lichte en zware ketens komen veel minder voor, maar de aminoterminale gedeelten van zowel lichte als zware ketens vertonen kleine regio’s van enorme variabiliteit o in primaire structuur = hypervariabele regio’s o ruimtelijke eiwitstructuur = complementariteit-determinerende regio’s (CDR’s) antigeen-bindende sites: o afgegrensd door de aminozuurzijketens die zich bevinden in de bochten van 6 CDR’s (3 van lichte en 3 van zware keten) o vooral apolair verhindert het binnendringen van water o plaatsspecifieke groepen die via de niet-covalente interacties bijdragen tot bindingsstrekte met het antigeen globale ruimtelijke structuur: elk van de 4 ketens is opgerold in een klein aantal compacte domeinen = immunoglobuline vouw 2 anti-parallelle -vouwbladen die interacties met elkaar aangaan door talrijke hydrofobe interacties en S-S-bruggen geconserveerde domeinstructuur wordt bepaald door regelmatige secundaire structuur, terwijl variatie ontstaat door veranderde aminozuurzijketens in onregelmatige lussen Het bewijs dat de primaire structuur van een polypeptideketen alle informatie bevat voor de vorming van de correcte 3D eiwitstructuur en eiwitfunctie: Anfinsen die het enzym Rnase bestudeerde - denaturatie van ribonuclease mbv hoge concentraties ureum dat de niet-covalente interacties binnen de peptideketen verbreekt - verdere denaturatie door toevoegen van -mercaptoethanol dat de covalente S-S-bruggen verbreekt door reductie van de zwavelgroepen polypeptideketen in radom coil conformatie (geen 3D organisatie meer, maar zeer flexibele en variabele conformatie - gedenatureerd Rnase geen enkele biologische activiteit - denaturatie is reversibel en enzymatische activiteit van het gedenatureerde preparaat kan herwonnen worden door de denaturerende agentia via dialyse te verwijderen en her-oxidatie van de cysteïnes - oprollen tot de juiste rumtelijke structuur = renaturatie De sequentie van zijketens op een eiwit of nucleïnezuur bevat informatie voor de 3D structuur en dus voor de functie. Basisprincipes: - hydrofobe en hydrofiele aminozuurresidu’s door elkaar in primaire eiwitstructuur, maar in tertiaire structuur liggen de hydrofobe aminozuren vooral in de diepte van het eiwit begraven en de hydrofiele aminozuren aan de oppervlakte - polaire of geladen aminozuurzijketens kunnen paarsgewijs of in netwerkverband sterkere bindingen in de diepte van het eiwit maken - S-S-brugen stabiliseren deze interacties (gevormd nadat het eiwit zich ruimtelijk goed heeft opgerold) Het oprollen van kleine eiwitten gebeurt spontaan, wordt op vele plaatsen tegelijk geïnitieerd waarbij het systeem trapsgewijs van een hoge energietoestand naar een lage toestand vervalt ontstaan van lokale secundaire structuren Ribonuclease T1 - klein eiwit met enkele S-S-bruggen in de primaire structuur - Stabiliserende krachten: 4 S-S-bruggen, 90 intramoleculaire H-bruggen en ongeveer 85% van de hydrofobe aminozuurzijketens begraven in het binnenste van het eiwit - -helix aan het ene oppervlak van het eiwit en een anti-parallel -vouwblad aan de andere zijde - val in vrije energie tijdens het oprollen van het eiwit in waterig midden is vrij laag (verbreken van 1 covalente C-C-binding vraagt 16x meer energie) - invloed van pH op conformationele stabiliteit is klein rol van elektrostatische krachten tussen geladen aminozuurzijketens als verwaarloosbaar - grootste stabiliteit bij iso-elektrisch punt Grotere eiwitten hebben hulp nodig van begeleidermoleculen op te kunnen opvouwen: moleculaire chaperons: - evolutionair sterk geconserveerde eiwitten - hsp70 familie: herkennen in een juist aangemaakt eiwit de lokale hydrofobe raakvlakken in secundaire structuren, door op deze structuren te binden, verhinderen deze chaperones dat het eiwit zich voortijdig slecht opvouwt - hsp60 familie: helpt het eiwit ten koste van ATP-hydrolyse verder opvouwen - hsp heat shock proteïn: komen veel voor in door verhitting beschadigde cellen Proteïnen functioneren meestal dankzij hun binding aan 1 of meerdere voor hen specifieke moleculen. De gebonden stof noemt men ligand. Na binding van het ligand kunnen er kleine lokale verplaatsingen van eiwitgroepen optreden die secundair tot gevolg hebben dat de algehele eiwitstructuur verandert. Wanneer deze structuurverandering een extra goede ruimtelijke complementariteit tussen eiwit en ligand tot gevolg heeft, spreekt men van induced fit De werking van het eiwit vergt soms een belangrijke ruimtelijke structuurverandering die optreedt nadat het ligand is gebonden: vb: receptoren voor peptidehormonen in de plasmamembraan wanneer ligand specifiek op de receptor gebonden is, ondergaat de receptor een structuurverandering die zich uitbreidt tot de zijde van de receptor die in contact is met het cytoplasma Veel eiwitten bevatten ook speciale bindingsplaatsen voor regelende liganden die een conformatieverandering en dus een gewijzigde functie veroorzaken De alternatieve ruimtelijke toestanden van het eiwit = allosterie Myoglobine en hemoglobine: - zuurstof opslag en transport in spieren en zuurstoftransport in rode bloedcellen - zuurstof bindt aan haem (platte ringvormige apolaire niet-eiwitstructuur) = prosthetische groep - in centrum van ring: Fe2+-ion dat een zuurstofmolecuul kan binden - haemgroep is covalent gebonden met het eiwitgedeelte via his-F8, een tweede histidine bepaalt de hoek waarmee zuurstof aan haem kan binden - ijzer in vrije haemgroep wordt onmiddellijk door O2 geoxideerd tot Fe3+ kan niet langer zuurstof binden polypeptideketen belet oxidatie - geometrie (his-E7) zorgt voor een sterische belemmering voor het binden van CO op de haemgroep Myoglobine: - eerste eiwit waarvan de ruimtelijke structuur met Angstrom resolutie werd bepaald - zuurstof opslaan in spieren - 75% uit -helix die in het eiwit loopt als 8 korte staafjes - in 4 gevallen wordt een stuk helix onderbroken door een proline knik - erg compact eiwit, in diepte vooral hydrofobe aminozuren (Leu, Val, Met, Phe) binden van apolaire haemgroep - 2 uitzonderlijke polaire residu’s in de diepte: his E7 en F8 binding van haem en vorming van de bindingsholte voor zuurstof - zuurstof bindt in hydrofobe spleet van myoglobine op het centrale ijzerion van de haemgroep Hemoglobine - fysiologische zuurstofdrager van de rode bloedcellen - quaternaire eiwitstructuur: 4 globineketens met elk een zeer gelijkwaardige 3D structuur als myoglobine - elk van de ketens bezit de compacte ruimtelijke vorm met vooral -helix en een haemring die gebonden is tussen his E7 en F8 in een centrale apolaire ruimte - hemoglobine A (HbA): structuur ()2 interacties tussen de 4 ketens in hemoglobine zorgen voor allosterie o oxygenatietoestand van myoglobine is op hyperbole wijze afhankelijk van de partiële zuurstofdruk, partiële zuurstofdruk waarbij 50% van de myoglobine verzadigd is met zuustof is ongeveer 1 mm Hg (lager dan zuurstofspanning in bloedvaten van spieren) o hemoglobine in de rode bloedcellen vertoont een sigmoïdale verzadigingskromme met een veel lagere affiniteit van Hb voor zuurstof (p50 HbA is ongeveer 30 mm Hg hoger dan partiële zuurstofspanning in capillairen in spieren zuurstof laat Hb los minder dan 50% van Hb verzadigd) o vrijgekomen O2 zal naar spiercellen diffunderen en daar binden op Mb - 2 belangrijke kenmerken van allosterie in de hemoglobine-zuurstof interactie: coöperativiteit en regelbaarheid van de binding o in totaal kunnen 4 moleculen O2 binden op 1 molecuul Hb binding van eerste molecuul O2 op Hb is het moeilijkst coöperativiteit: interactie tussen de 4 subeenheden vooral thv de raakvlakken tussen 12 en 21 subeenheden: H-bruggen verbroken en nieuwe H-bruggen gevormd binding O2 op haemring F8-his-zijketen naar haemring getrokken F-helix wijzigt in structuur via raakvlakken wordt conformatie doorgegeven aan andere subeenheden F-helixen in andere 3 ketens ook verplaatsen = homo-allosterie o regelbaar door fysiologische moleculen: heteroallosterie kleine organische zuur 2,3difosfoglyceraat (DPG) dat in rode bloedcellen wordt geproduceerd DPG is sterk negatief geladen bindt krachtig in nis die gevormd wordt door de 2 -subeenheden van Hb (elektrostatische bindingen met pos. geladen aminotermini van ketens en zijketens Lys82 en His-143 stabiliseert de deoxy-Hb conformatie binding zuurstof op haem allosterische vormverandering in Hb spleet tussen ketens nauwer DPG moet bindingsplaats verlaten, verdringen kost energie ( affiniteit van HbA voor zuurstof is laag) Foetaal hemoglobine (HbF): - bevat 2 -ketens - heeft minder krachtige bindingsplaats voor DPG his-143 is vervangen door serine - zuurstofaffiniteit van HbF is groter dan die van HbA zuurstof kan door de placenta heen worden overgedragen van moederlijk naar foetaal bloed Hemoglobine bindt zuurstof liever in arterieel bloed dan in veneus bloed veneus bloed bevat relatief hoge CO2 en H+ concentraties en dit zijn allosterische liganden die de desoxy-conformatie van Hb bevorderen ten koste van de oxy-conformatie = Bohr-effect HbO2 laat zuurstof los in capillairen waar CO2 en H+ vrijkomen, omgekeerd in longen (Haldane effect) Elastine - elasticiteit van de bloedvatwanden - ontstaan als fibreuze (wateronoplosbare) structuren doordat afzonderlijke elastinemonomeren (proelastine) intensief zijn verbonden via cross-links - typische brug in elastine: desmosine o condensatie van 4 lysineresidu’s o secundaire structuur tussen desmosinebruggen: vooral -spiraal, maar ook random coil - bij uitrekken van elastine worden de polypeptideketens vooral thv de -spiraal meer lineair - afgebroken via elastasen (vb uit witte bloedcellen die circuleren in capillairen) = enzymen die de peptidebindingen in de elastineketen doorknippen - grootste deel van elastase wordt onmiddellijk geremd door een eiwit-inhibitor of 1-antitrypsine - rokers: grotere hoeveelheden witte bloedcellen in longweefsel meer elastase wanneer aanmaak van nieuwe elastase de afbraaksnelheid niet kan volgen, daalt de elasticiteit van de long en kan een pathologische toestand (emfyseem) ontstaan Koolstofmonoxidevergiftiging - CO is een kleurloos, reukloos en niet-irriterend gas dat vrijkomt door de onvolledige verbranding van kolen, hout of andere brandstoffen - CO is een van nature in de mens voorkomende stof, die in zeer kleine hoeveelheden ontstaat bij de afbraak van haem tot bilirubine (vermoeden: bij zeer lage concentraties in hersenen een natuurlijke functie als neurotransmitter) - toxische eigenschappen CO: zeer sterke binding van het gas aan Hb en in mindere mate door binding op het myoglobine in spieren (carboxyhemoglobine) defect in het zuurstoftransport met weefsel hypoxie als gevolg - CO remt afgifte van zuurstof door oxyhemoglobine - affiniteit van CO voor Hb is ongeveer 200 maal groter dan die voor O2 - symptomen: o bij lucht waarin 0,01 – 0,03% CO: geleidelijk opkomende kloppende hoofdpijn, misselijkheid en braken o meer dan 0,1% CO: slachtoffer volkomen verrast, ‘slaapt’ inmiddelijk in o kersrode kleur van de huid en slijmvliezen keur van carboxyHb - behandeling: onmiddelijke beluchting met verse lucht, patiënt moet stil blijven liggen, eventueel inademen van zuivere zuurstof - bij ernstige gevallen zullen neurologische stoornissen blijven bestaan (sequelen) Sikkelcel bloedarmoede - puntmutatie in het -globine gen op chromosoon 11: glutamaatresidu vervangen door apolaire valine - sickle cell trait: heterozygoot, niet of nauwelijks ziek omdat ongeveer 50% HbA in rode bloedcellen - sikkelcel bloedarmoede verkorte levensduur van rode bloedcellen, chronische bloedarmoede en acute aanvallen met infarcten in diverse organen (milt, bot) - praktisch al het hemoglobine in de rode bloedcellen is opgebouwd uit 2 normale -ketens en 2 abnormale -ketens (HbS), daarnaast is er een variabele hoeveelheid HbF - - - - aminozuursubstitutie van de -keten manifesteerd zich aan het oppervlak van het eiwit waarbij de polaire glutamaat-zijketen vervangen is door het apolaire valine in desoxyHb bestaat er voor dit apolaire uitsteeksel een complementaire apolaire bindingsgroeve polymeren HbS-polymeren groeien aan tot dikke kabels met mechanische stijfheid rode bloedcellen vervormen tot kenmerkende sikkelvormige toestand gaan sneller stuk in bochtige en nauwe capillairen chronische bloedarmoede in een acute crisis ontstaan er in een korte tijd grote aantallen sikkelcellen die de haarvaten verstoppen vicieuze cirkel met stijgend zuurstoftekort in de weefsels en verdere sikkelcelvorming infarct van het weefsel met sterte van de stikkende cellen diagnose: door de aminozuursubstitutie is de nettolading van het eiwit afgenomen met 2 negatieve eenheden iso-elektrisch punt van het eiwit toegenomen van ong 6,8 naar 7 (vaststellen via isoelektrische focussing of kolomchromatografie) (nu via vruchtwaterpunctie of chorionvlokkenbiopt genotype onderzoeken) Behandeling: vooral symptomatisch: acute aanvallen worden bestreden met pijnstillers en transfusies Immuno-assay: de specifieke binding van immunoglobulines aan welbepaalde antigenen wort gebruikt in een aantal technieken om 1 bepaald eiwit op te sporen en de concentratie ervan te meten vaak zeer specifiek en zeer gevoelig - afhankelijk van de beschikbaarheid van een specifiek antilichaam - antigeen: o biochemisch gezuiverd of moleculair biologisch verkregen eiwit o oligopeptide-onderdeel van het eiwit synthetiseren en dit koppelen aan een immunogeen standaardeiwit na paar weken in bloed van geïmmuniseerde proefdier een mengsel van verschillende antilichamen die onderdelen van het eiwit herkennen = polyklonaal antilichaam - specifieke antilichamen kunnen uit het serum gezuiverd worden door een immunoaffiniteitschromatografie met geïmmobiliseerd antigeen in de kolom - Milstein en Köhler: in vitro via celculturen van tumorale immunoglobuline-secreterende cellen een kloon cellen selecteren die het gewenste antilichaam produceert = monoklonaal antilichaam - scheiden van antiserum en eiwit: antilichaam-antigen complexen precipiteren of adsorberen aan een oppervlak - antilichaam-antigen complexen detecteren en kwantificeren: o western blot en radio-immuno)assay radio-isotopen o enzyme-linked-immuno-sorbent-assay enzym dat een kleurreactie katalyseerd Western blot: scheidingsvermogen van gelelektroforese + specifieke herkenningsvermogen van antilichamen - na de SDS-PAGE worden de op molecuulmassa gescheiden eiwitten vanuit de gel kwantitatief overgebracht (via capillaire vloeistofstroom of door elektrisch veld) op de oppervlakte van een nylon of nitrocellulose membraan (op oppervlakte talrijke polaire en apolaire groepen die niet-covalente bindingen toelaten met eiwit) - membraan met geblotte eiwitten wordt behandeld, zodat niet specifieke adsorptie van het antiserum wordt vermeden overmaat standaardeiwit - de antilichamen zullen in principe slechts specifiek binden op plaatsen waar antigeen geconcentreerd is - incubatie van sterk verdunde antiserum met de membranen: in waterige oplossing bij fysiologische pH - na incubatie worden niet gebonden antilichamen grondig weggewassen - gebonden antilichaam op de membraan detecteren: 2de antilichaam (gemerkt) dat gericht is tegen het eerste o radioactieve methoden autoradiografie: fotografische film zwarting evenredig met de hoeveelheid vrijgekomen radioactiviteit en dus met de hoeveelheid gebonden antigeen o Niet-radioactieve detectie: 2de antilichaam koppelen aan een enzym dat een bepaalde reactie katalyseert, vb: peroxydase dat een chemoluminiserend reactieproduct produceert nagaan of een bepaald eiwit aanwezig is in een biologisch monster en ruwe kwantificatie door meting van de intensiteit van het fotografische of autoradiografische signaal en als kwaliteitscriterium om na te gaan of men over een specifiek antilichaam tegen een bepaald eiwit-antigeen beschikt Radio-immuno-assay - ontwikkeld door Yalow en Berson meting van zeer lage concentraties insuline in menselijk bloedplasma - principe: competitie tussen radioactief gemerkt en ongemerkt antigeen voor binding op hetzelfde antilichaam (gemerkte antigeen bindt evengoed op antilichaam) - men dient te beschikken over een antilichaam dat een beperkte en specifieke bindingscapaciteit bezit voor het antigeen dat mens wenst te doseren: vb hormoon insuline in bloed van patiënten meten via RIA-dosering: o componenten die nodig zijn: specifiek anti-hormoon antilichaam = Ab radioactief gemerkt hormoon (meestal 125I) = *H verdunningsreeks van bekende hoeveelheden ongemerkt hormoon = H scheidingsmethode voor (niet)gebonden hormoon en detectiestap o na mengen *H en H ontstaat na verloop van tijd een evenwicht o wanneer constante hoeveelheden antilichaam en radioactief hormoon beschikbaar zijn, dan ziet men dat de hoeveelheid *H.Ab bij evenwicht afhankelijk is van de bijgevoegde hoeveelheid koud hormoon onderlinge competitie voor de binding op dezelfde voorraad bindingsplaatsen op de antilichamen o competitie kwantificeren: op antilichaam gebonden radioactiviteit scheiden van vrije radioactiviteit (vb door precipitatie van de antilichamen door polyethyleenglycol) o men verkrijgt de standaardcurve door bij een reeks bekende standaardconcentraties van koud hormoon te meten hoeveel radioactiviteit op het antilichaam gebonden blijft - in RIA meet men altijd eerst een reeks bekende standaards zodat men de standaardcurve kan tekenen of berekenen, de hoeveelheid hormoon in onbekende monsters wordt daarna via de standaardcurve berekend uit de gemeten radioactiviteit - RIA is een veel gebruikte techniek voor het meten van lage concentraties van hormonen in bloedplasma en voor de dosering van andere biomoleculen - combineert hoge gevoeligheid met grote specificiteit (hoge specifieke activiteit van 125I) en het scherpe moleculaire herkenningsvermogen van antilichamen ENZYMEN Onder fysiologische omstandigheden verlopen de meeste biochemische reacties tussen zuivere stoffen bijzonder traag Splitsing van een peptidebinding door een molecuul water = hydrolyse Beginstoffen = substraten, gevormde stoffen = reactieproducten Peptidebindingen zijn in waterige oplossing onder fysiologische omstandigheden vrij stabiel eiwitten van huid en haar zullen niet zomaar in aminozuren splitsen door contact met water Pancreatische spijsverteringsenzymen trypsine en chymotrypsine knippen peptidebindingen in een tijdsbestek van milliseconden versnelling = katalyse Een katalysator wordt niet stoichiometrisch tijdens een reactie verbruikt en blijft dus beschikbaar om nieuwe reacties te katalyseren Elke chemische reactie verloopt energetisch over een soort barrière: toestand waarbij de bestaande elektronenconfiguratie van het substraat reeds gedeeltelijk verdwenen is ten koste van het begin van de nieuwe elektronenconfiguratie van het reactieproduct Thermodynamisch: - hoogst energetische toestand van het energiediagram van de reactie = transition state - energieverschil tussen begintoestand en transition state = activeringsenergie hoe groter, hoe trager de reactie Het katalytisch vermogen van enzymen activeringsenergie verlagen: chemische omgeving creëren die optimaal is aangepast aan de structuur van de transition state (= enzymen stabiliseren de chemische toestand van de transition state) door stabilisatie is het ook gemakkelijker om van de eindtoestand via de transition state naar de begintoestand te gaan (veel biochemische reacties zijn reversibel) enzymen hebben geen invloed op de ligging van het reactie-evenwicht Actieve site - waar substraten en reactieproducten tijdelijk gebonden worden en chemische reactie versneld door stabilisatie van de transition state - paar procent van de totale enzymstructuur - meestal kleine holte binnen in het eiwit die wordt afgegrensd door specifieke aminozuurzijketens en door niet specifieke groepen van de peptidebackbone Enzymen - substraatspecifiteit - hoge mate van regelbaarheid werkelijke snelheid van de chemische reactie is niet afhankelijk van de massawet, maar van de activiteitstoestand van het enzym De enzymatische katalyse van een biochemische reactie begint met de binding van substraat op de actieve site waarbij een enzymsubstraatcomplex (ES) gevormd wordt. Algemene kenmerken van enzymsubstraat interacties: - de actieve site bestrijkt slechts klein deel van het totale enzym (meestal een in de diepte van het eiwit gelegen kleine ruimte met wanden die worden gegenereerd door de zijketens van enkele residu’s van de peptideketen). Soms actieve site op grensvlak tussen de subeenheden van het enzym met quaternaire structuur vaak goed afgegrensd waardoor de enzymatische reactie in een optimale fysisch-chemische omgeving kan optreden - specificiteit van de enzymatische reactie berust grotendeels op een nauwkeurig aan het substraat aangepaste vorm van de ruimte van de actieve site verschillende atomen van substraat en enzym dicht naderen om talrijke niet-covalente interacties met elkaar aan te gaan Chymotrypsine en trypsine - serine proteasen: hydrolyseren peptidebindingen dankzij de katalytische werking van een belangrijk serineresidu dicht bij de actieve site - overwegend -vouwblad als secundaire structuur, 2 domeinen - door de exocriene pancreas aangemaakt als inactieve pro-enzymen (zymogenen) die in de darmholte proteolytisch moeten worden geactiveerd voorkomt ongewenste proteolytische activiteit van nieuw aangemaakte pro-enzymen in pancreascellen - actieve site: raakvlak beide domeinen, in centrum eiwit - substraatspecificiteit: holte die ontstaat tussen de polypeptidelussen die -vouwblad3-4 en 5-6 verbinden - chymotrypsine: serine, glycine en glycine vrij grote holte voor aromatische zijketen van substraat (tryptofaan, fenylalanine, tyrosine) knipt peptidebindingen naast deze aromatische zijketens - trypsine: negatief geladen aspartaat op de bodem van de substraatbindende site positief geladen arginine- of lysineresidu’s hydrolyseert naast lysine of arginine Elastase: - serine protease - ondiepe actieve site met een apolaire bodem bekleed met valine zijketen - knipt naast de kleine glycine of alanineresidu’s De meeste enzymen vertonen tijdens hun katalyse enige vorm van induced fit, vb: hexokinase - zet glucose om tot glucose-6-fosfaat - na binding substraten (glucose en ATP) beweegt er een heel eiwitdomein over grote afstand tov het andere eiwitdomein - de actieve site wordt ahw van de buitenwereld afgesloten Kunstmatig zeer discrete veranderingen aanbrengen in 1 bepaalde aminozuurketen rond de actieve site = site-directed mutagenesis Elk enzym heeft zijn eigen specifiek mechanisme voor katalyse, maar toch overeenkomsten: - katalyse wordt voorafgegaan door de binding van het substraat in de actieve site, doorgaans induced fit, indien meerdere substraten dicht genoeg bij elkaar brengen in een geschikte ruimtelijke oriëntatie tov elkaar - vrijgekomen energie van de enzym-substraat binding ruimtelijke conformatie gedwongen tot transition state - kritische aminozuurzijketens of hulpfactoren leveren elektronen of protonen die nodig zijn voor de chemische reactie, soms tijdelijk covalente binding met het substraat - na reactie meestal 2de transition state alvorens reactieproduct - reactieproduct laat los van enzym dat door 2de vormverandering zijn oorspronkelijke toestand weer bereikt enzymen maken een bepaald proces mogelijk door de meest ongunstige toestand in de reactie thermodynamisch een stuk waarschijnlijker te maken Co-factor: - hulpstof voor katalytische werking - in de buurt van de actieve site, of maken er deel van uit - co-enzymen: vaak afgeleid van stoffen uit de vitamine B groep, vormen samen met het eiwitgedeelte (apo-enzym) het functioneel intact enzym (holo-enzym), binden vaak alleen via niet-covalente bindingen aan de peptideketen van het enzym - metaalionen: meestal covalent gebonden - prosthetische groep: indien het co-enzym zeer vast zit aan het enzym Serine proteasen: het substraat bindt eerst aan het enzym - serine doet een nucleofiele aanval op de carbonyl-C van de te splitsen peptidebinding, geholpen door histidine dat een proton overneemt - positief geladen histidine wordt gestabiliseerd door negatief geladen aspartaat transition state, waarbij carbonylgroep van de te klieven peptidebinding in een tetraëdische configuratie, carbonyl-O heeft 1 elektronenpaar extra voor zichzelf neg. gestabiliseerd door binding in speciale site van het enzym (oxanion-gat) verlaagt activeringsenergie - peptidebinding breekt doordat histidine proton afstaat aan nieuwe aminoterminus, carboxyterminaal gedeelte van polypeptide verlaat actieve site ontstaan van acyl-enzym complex - water neemt plaats in van verdwenen reactieproduct, histidine maakt van water een zeer nucleofiele hydroxylgroep door een proton op te nemen extra proton wordt gestabiliseerd door histidine/aspartaat, het hydroxyl-anion valt de carbonyl-C van het acyl-enzym complex aan - er ontstaat een tetraëdische transition state, toestand wordt gestabiliseerd door binding van O—groep in oxanoin-gat - aminoterminaal gedeelte van geknipte peptidebinding komt vrij wanneer serine proton van histidine overneemt, actieve site weer in begintoestand Dehydrogenasen: - katalyseren redoxreacties waarbij een elektronenpaar wordt overgedragen van het ene substraat naar het andere - in elk type is 1 van de 2 substraten enzymspecifiek, terwijl de andere vrijwel onveranderlijk is en als coenzym meespeelt in de actieve site 2 soorten co-enzymen: o nicotinamide adenine dinucleotide NAD+ of zijn fosfaat NADP+ o flavine adenine dinucleotide FAD elektronenpaar dat overgedragen wordt tijdens redoxreactie wordt gebonden op reactieve nicotinamide ring of isoalloxazine ring (moeten als vitaminen uit het voedsel worden opgenomen) Lactaat dehydrogenase: - NAD-gekoppeld dehydrogenase - NADH wordt gebruikt als substraat om reducerende elektronen te leveren en als co-enzym om transition state te stabiliseren - binding van pyruvaat (sterke elektrostatische kracht tussen carboxylgroep en positief geladen zijketen van arginine) in een kloof van de actieve site van het enzym beweging van een lus van LDH actieve site volledig van de buitenwereld afgesloten (induced fit) - uitsluitend L-lactaat als substraat - tijdens transition-state wordt C=O-binding van pyruvaat maximaal gepolariseerd waardoor een positief geladen koolstofatoom en een negatief geladen zuurstofatoom ontstaat gestabiliseerd door arginine en histidine (stabiliseren negatief geladen O) en aspartaat (stabiliseert positief geladen histidine) - tijdens reactie levert histidine een H+-ion aan de O-groep van pyruvaat terwijl NADH een hydride-ion levert aan het centrale C-atoom - nicotinamidering van NADH ligt op correcte wijze georiënteerd dankzij hydrofobe interacties met onder andere isoleucine - na H+/H- overdracht, ontstaan de producten L-lactaat en NAD+ - stoffen verlaten actieve site en nieuw proton zal op histidine binden Fundamentele concepten van de enzymatische werking: - slechts enkele aminozuren in het enzym zijn kritisch voor de katalyse - substraatspecificiteit wordt veroorzaakt door bindingssites in de actieve site - de reactie wordt versneld doordat het enzym de transition state stabiliseert Veel enzymatische reacties vertonen een hyperbolisch verband tussen de initiële reactiesnelheid en de substraatconcentratie Steady state: geen wijziging in de hoeveelheid enzymsubstraat complex als functie van de tijd snelheid waarmee ES gevormd wordt = snelheid waarmee ES verdwijnt Michaelis-Menten vergelijking: V Vmax - S S K M bij zeer lage substraatconcentraties is de reactiesnelheid recht evenredig met [S] bij zeer hoge substraatconcentraties is de reactiesnelheid niet langer afhankelijk van [S], maar heeft ze haar maximale waarde bereikt Lineweaver-Burk grafiek: dubbel reciproke variant van Michaelis-Menten vergelijking: K 1 1 1 bepaling van KM en Vmax: de meetpunten komen op rechte lijn te liggen M V Vmax Vmax S Eadie-Hofstee vergelijking: V wodt uitgezet teven V/[S] KM stelt de substraatconcentratie voor waar de helft van het totale aantal enzymmoleculen bestaat als EScomplexen, zodat de reactiesnelheid op 50% van de maximale waarde verloopt affiniteit van het substraat tov het enzym Turnover getal k3= maat voor de snelheid waarmee het enzym reactieproducten vormt uit het ES-complex Irreversibele enzyminhibitoren: moleculen die meestal een covalente binding met het doelwitenzym aangaan, waardoor de katalytische eigenschappen van het enzym definitief uitgeschakeld worden (vb acetylcholinesteraseremmers insecticiden) Reversibele inhibitoren - competitieve inhibitoren: lijken sterk op substraat , bezetten in onderlinge competitie met het substraat de actieve sites op het enzym minder actieve sites beschikbaar (stijging van helling en verschuiving van –1/KM naar het nulpunt op de x-as op de Lineweaver-Bork grafiek) - niet-competitieve inhibitoren: inhibitor bindt op ander gedeelte van het enzym katalytische efficiëntie van het enzym wordt verminderd (wijziging van intercept met y-as, Vmax daalt) Enzymclassificatie: - EC1: oxidoreductasen: katalyseert oxidatie- en reductiereacties, afhankelijk van elektronenacceptor: o dehydrogenasen (NAD+, NADP+, FAD of cytochromen als elektronenacceptor) o oxygenasen geven elektronen af aan zuurstof (mono- en di-oxygenasen) - EC2: transferasen: overdracht van een bepaalde groep van het ene molecuul naar het andere, donor treedt vaak als co-factor van het enzym op - EC3: hydrolasen: ook transferasen, dragen bepaalde groepen over aan een watermolecuul, splitsen ester-, glycoside-, peptide- of andere covalente bindingen waarbij de –OH en –H groepen van water aan beide uiteinden van het gesplitste molecuul komen te liggen afbraak van grotere macromoleculen tot hun bouwstenen o peptidasen of proteasen: hydrolyseren peptidebindingen (serine proteasen, metalloproteasen metaalion als co-factor) o lipasen: hydrolyse van esterbindingen in vetten o sacharidasen: verbreken glycosidebindingen tusen suikerpolymeren o ribonucleasen en desoxyribonucleasen: splitsing van RNA en DNA tot vrije nucleotiden fosfaatesters verbroken - EC4: lyasen: klieven of veranderen C-C, C-N en C-O-bindingen via: o eliminatie van groepen waardoor er dubbele bindingen ontstaan o toevoegen van groepen waardoor dubbele bindingen verdwijnen - EC5: isomerasen: sterische veranderingen binnen het substraatmolecuul (racemasen, epimerasen, cistrans-isomerasen, mutasen) - EC6: ligasen (= synthetasen): plakken uiteinden van 2 moleculen aan elkaar waarbij water vrijkomt Iso-enzymen van LDN: heterotetrameer eiwit met 2 mogelijke soorten subeenheden: - M-type subeenheid - H-type subeenheid verschillen in affiniteit voor substraat en in regelbaarheid door externe factoren Myocard infarct: - creatine fosfokinase: hoge piek, daalt snel - LDN: komt trager tot stand, maar kan tot 10 dagen na het infarct aanwezig blijven Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) - detecteren van biomoleculen, virussen of geneesmiddelen - specifiek antilichaam tegen het op te sporen antigeen - met een tweede antilichaam wordt de aanwezigheid van gebonden eerste antilichaam gedetecteerd detectie: enzymatische kleurreactie (biotine uiterst hoge bindingsaffiniteit voor streptavidine dat covalent gekoppeld is aan een ezym zoals peroxidase) - vb: aanwezigheid van HIV via de virale antigenen in menselijk bloed opsporen REGELING ENZYMATISCHE ACTIVITEIT Enzymregulatie: de enzymatische activiteit kan worden geregeld naargelang de behoeft van de cel - 1ste niveau: substraatniveau regulatie: sommige enzymen worden competitief geremd door hun reactieproduct - snelheid van meeste metabole wegen wordt bepaald door bottleneck, het snelheidsbeperkend enzym (mate van opstopping thv het moeilijkste punt in het traject) op kritische snelheidsbeperkende enzymen zitten regelknoppen die de enzymatische activiteit drastisch kunnen veranderen: o liganden gaan op bindingssites van het enzym binden en zullen een ruimtelijke structuurverandering in het enzym veroorzaken = allosterie - covalente verandering van de enzymstructuur: bij enzym-fosforylatie worden er covalente fosfaatesters gevormd met OH-groepen van serine, threonine of tyrosine sterk verandernde enzymatische activiteit - irreversibele vorm van enzymregulatie: covalente verandering van de primaire enzymstructuur bij proteasen die alleen op welbepaalde plaats en tijd actief mogen zijn (vb trypsine en chymotrypsine enkel in dunnen darmholte) - thv productie of afbraak van het enzym bepaalt aantal enzymmoleculen, thv genexpressie Reacties verlopen spontaan in 1 bepaalde richting indien de vrije energie van Gibbs een negatief getal is = exergonisch (verlaging potentiële energie of verhoging van de wanorde in de richting van de reactie) Reacties met positieve vrije energie van Gibbs of een waarde gelijk aan nul kunnen dus niet spontaan verlopen = endergonisch Een thermodynamisch ongunstige reactie kan dus verlopen door ze te koppelen aan een thermodynamisch gunstige reactie (als exergonische stap vaak hydrolyse) Bij allosterie zullen regelstoffen via niet-covalente krachten op het enzym binden en daardoor de katalytische eigenschappen van het enzym wijzigen. Ze doen dit door na de binding een ruimtelijke structuurverandering in het enzym te induceren die zich uitbreidt tot in de actieve site substraat bindt met gewijzigde affiniteit op de actieve site of de transition state wordt moeilijker of gemakkelijker bereikt De overgang van de ene in de andere toestand = allosterische transitie - allosterische toestand waarin het enzym hoge katalytische activiteit vertoont: R - inactieve vorm: T Principe: positieve coöperativiteit tav de binding van substraat en regelbaarheid van de allosterische toestand door activatoren en inhibitoren - positieve coöperativiteit: bij alle allosterische enzymen is de V-[S]-kromme sigmoïdaal, bij lage substraatconcentraties is er een kleinere toename van V, bij verdere toename van [S] gaat V ineens sterk stijgen - zonder substraat bevindt het enzym zich in T configuratie alle actieve sites hebben lage affiniteit voor substraat, dus binding van eerste substraatmolecuul met vorming van een ES-complex is het moeilijkst Naast katalytische subeenheden bezitten sommige allosterische enzymen ook regulatorische subeenheden die via vele niet-covalente interacties deel uitmaken van het holo-enzym bevatten doorgaans heteroallosterische regelknoppen Aspartaat transcarbamoylase (ATCase) - katalyseert de snelheidsbeperkende stap in de pyrimidinebiosynthese die nodig is voor de aanmaak van DNA en RNA - fusie tussen 2 substraten (aspartaat en carbamoylfosfaat) tot carbamoylaspartaat - kinetiek is sigmoïdaal coöperativiteit - allosterisch geremd door CTP, een eindproducti van de pyrimidinesynthese = feedback inhibitie - het snelheidsbeperkend enzym voor de keten wordt uitgeschakeld wanneer er zich genoeg eindproduct opstapeld, de allosterisch rem wordt tegengewerkt door de activator ATP - homo-allosterisch gedrag en regelbaarheid van het enzym door CTP en ATP uit te schakelen door te behandelen met kwikzuiten ATCase valt uiteen in verschillende subeenheden (katalytische subeenheden en regulator subeenheden bindingsplaatsen voor de allosterische liganden ATP en CTP) - quaternaire structuur: o 6 katalytische subeenheden georganiseerd als 2 trimeren o 6 regulator subeenheden in 3 dimeren o ruimtelijke structuur van T-configuratie is compacter omdat paren van katalytische subeenheden elkaar loslaten tijdens de allosterischte TR-transitie o binnen een katalytische subeenheid wordt de tertiaire structuur juist compacter en wordt de actieve site scherper afgegrensd beide substraten kunnen met hoge affiniteit binden Fosfofructokinase - in glucolyse: zet fructose-6-fosfaat om tot fructose-1,6-bifosfaat - tetrameer van identieke subeenheden waarbij de 4 katalytische sites aan 1 zijde afgegrensd worden door de raakvlakken tussen 2 subeenheden - binding van allosterische liganden veroorzaakt rotatie van 2 dimeren tov elkaar thv actieve site: uitwisseling van arginine voor glutamaat, het arginine bindt elektrostatisch met de fosfaatgroep van fructose-6-fosfaat, terwijl Glutamaat dit juist verhindert - geremd door ATP en citroenzuur, allosterisch geactiveerd door AMP en fructose-2,6-bisfosfaat Fosfaatesters worden gevormd door proteïne kinasen, enzymen die de fosfaat overdragen van ATP op welbepaalde aminozuurzijketens die door herkenningspunten in de primaire eiwitstructuur afgebakend worden. Fosfaatesters worden gesplitst door hydrolyse via proteïne fosfatasen. Zowel de activiteit van proteïne kinasen als die van proteïne fosfatasen wordt geregeld door chemische stimuli, die de cel van buiten bereieken en die in de cel worden omgezet tot intracellulaire chemische signalen. Glycogeen fosforylase - katalyseert de snelheidsbeperkende stap van de afbraak van glycogeen in lever en spieren - homodimeer: in elke subeenheid is de actieve site in een diepe groeve van het enzym gelegen water moet uit de actieve site geweerd worden (hydrolyse) - door hetero-allosterie geregeld glycogeen fosforylase wordt actief als er energietekort ontstaat in de cel o ATP: sterke inhibitor o AMP: allosterische activator - een tweede regelknop is gevoelig voor allosterisch inhibitor glucose-6-fosfaat vermeden dat de brandstofvoorraad wordt aangesproken als er een alternatieve energiebron in de spiercel aanwezig is - de niet-gefosforyleerde vorm = fosforylase b - fosforylatie van serine vorming fosforylase a veranderng in tertiaire structuur: het aminoterminaal domein van de gefosforyleerde subeenheid krijgt een stijve structuur die overeenkomt met deze van de R-conformatie hogere affiniteit voor substraat en niet meer gevoelig voor de allosterische inhibitie van ATP en glucose-6-fosfaat - proteïne fosfatase 1 splitst fosfaat af van serine fosforylase b De enzymen die de voedingseiwitten verteren, worden door de pancreas als zymogenen aangemaakt - enzym enteropeptidase knipt de 6 aminoterminale aminozuren van trypsinogeen weg trypsine - zal zelf vele ander tripsinogeen moleculen omzetten in trypsine - katalyseert omzetting van chymotrypsinogeen in -chymotrypsine, pro-elastase in elastase en procarboxypeptidase A in carboxypeptidase A - bij gebrek aan substraat zullen de spijsverteringsenzymen zichzelf uitschakelen - in pancreas: pancreatische trypsine inhibitor Pancreatitis - gemeenschappelijk afvoerkanaal van pancreas en galafvoerkanaal verstopt door galsteenvorming - afvloei van pancreassap belemmeren en zelfs galsap retrograad in de ductus pancreaticus doen vloeien - activatie van trypsine in pancreas sneeuwbaleffect van autokatalyse massale vertering van het weefsel en lek van geactiveerde enzymen in omringende weefsel, bloedingen en vochtopstapeling in het orgaan - kan ook door overmatig alcoholgebruik, bepaalde virale infecties en inname van bepaalde geneesmiddelen Bloedstolling - bij defect in vaatwand bloed van hoge naar lage hydrostatische druk bloedverlies - cascade van zymogeen-activaties wateroplosbaar fibrinogeen wordt omgezet tot wateronoplosbaar fibrinenetwerk (klonter of thrombus) waarin bloedcellen vastgehouden worden - 2 verschillende initiatiewegen convergeren naar 1 gemeenschappelijke amplificatie- en effectorweg stollingsfactor thrombine knipt enkele oligopeptiden uit fibrinogeen - na proteolytische werking thrombine (knipt 4 peptidebindingen van fibrinogeen) splitsen fibrinopeptiden A en B af en ontstaat de ()2-structuur van fibrine bezit complementaire hydrofobe holten en knobbels aan de oppervlakte spontane polymerisatie in water - fibrinopeptiden A en b netto negatief bijdrage tot wateroplosbaarheid van fibrinogeen en elektrostatisch afstoten van individuele moleculen fibrinogeen - fibrinepolymeer wordt door crosslinks (covalente glutaminebruggen tussen 2 fibrinemoleculen, aangebracht door enzym trans-glutaminase) verder verstevigd - Activatie van thrombine: 2 initiatiewegen o intrinsieke weg: herkent contactoppervlak dat veranderd is o extrinsieke weg: weefselfactor die vrijkomt uit door trauma beschadigde cellen - thrombine wordt proteolytisch gevormd uit pro-thrombine - hemofilie A en B: o X-gebonden recessief overgeërfd o veroorzaakt door deleties of puntmutaties van het reusachtige factor VIII-gen waardeoor er te weinig of een defect factor VIII wordt aangemaakt o therapie: frequente bloedtransfusies of toediening van donor-plasmaconcentraten - Fibrinolyse o fibrinedraden via proteolyse afbreken tot fibrine degradatieproducten o enzym: plasmine o plasmine dat vrij circuleert in menselijk plasma wordt vrijwel onmiddellijk uitgeschakeld door een fysiologische inhibitor 2-antiplasmine voorkomt algemene intravasculaire afbraak van fibrinogeen o 2 enzymen die plasminogeen kunnen activeren tot plasmine: tissue-type Plasminogen Activator: bindt via aminoterminaal gedeelte met hoge affiniteit aan fibrine verhoogt katalytische werking enzym efficiënter geactiveerd aan het oppervlak van een fibrineklonter (werking tegengegaan door inhibitoreiwit) urokinase hoge activiteit in menselijke urine - kunstmatige antistolling en thrombolyse o bloedafname: verlagen van vrije calciumionen door toevoeging van calciumchelators of toevoegen van overmaat heparine dat via antithrombine III de actieve stollingsfactoren onmiddellijk neutraliseert o chronische antistollingstherapie: remmers van de werking van vitamine K vermindering van de -carboxylering van glutamaat in stollingseiwitten Serineprotease-inhibitors = serpins Het complementsysteem - doden van micro-organismen die in het lichaam zijn doorgedrongen + produceren van alarmsignalen die immuunsysteem aantrekken of fagocytose vergemakkelijke - klassieke weg: herkenning van een antigeen-antilichaam complex door het complement eiwit C1q - alternatieve weg: lichaamsvreemde moleculaire oppervlak herkend door complement eiwit C3 en bijkomende hulpeiwitten - mannaan-herkenningsweg: specifieke receptor voor bacteriële suiker mannaan - amplificatie: activatie van C3 convertase (splitst pro-enzym C3 in C3a en C3b) C3b activeert proenzym C5 convertase splitst C5 in C5a en C5b C5b complexeert reeks andere complementfactoren - effectorfase: ontstaan ringvormige poriecomplex dat de plasmamembraan van de indringer doorboort NUCLEINZUREN Het betrouwbaar kopiëren van DNA voor de volgende generatie = replicatie Retrovirussen gebruiken de omgekeerde transcriptie waarin RNA wordt afgeschreven tot cDNA Bewijs voor de rol van DNA: - Grifith - Avery - studies van de bacteriofaag T2 (klein virus dat parasiteert op de colibacil) o hecht zich met zijn staart op de gastheercel en injecteert het zijn genetisch materiaal door de bacteriewand, DNA gaat zich vermenigvuldigen, gastheercel barst open en nieuwe virussen komen vrij in de buitenwereld o Hershey en Chase: T2-DNA werd gemerkt met 32P terwijl de virale eiwitten werden gemerkt met 35S na korte incubatie van radioactief gemerkt virus met de colibacillen werd het mengsel onderworpen aan een mechanische agitatie, waardoor de vastgehechte virussen van hun gastheercellen werden afgebroken mengsel werd gecentrifugeerd zodat de bacteriën pellet en vrije virussen in vloeistof daarboven (supernatans) pellet en supernatans werden geanalyseerd op hoeveelheden 32P en 35S radioactiviteit virus injecteert zijn DNA en niet zijn eiwitten in de gastheercel aanzienlijke fractie van 32P in dochtervirussen, 35S niet Bouwstenen van DNA: - purines: adenine en guanine - pyrimidines: cytosine en thymine - desoxyribose - fosfaat - 3’-5’-fosfodiësterbindingen - oriëntatie: nucleotide met vrije 5’-fosfaatgroep laagste nummer en links DNA ketens worden gemaakt van 5’ 3’ Chemische analyse van de bouwstenen van DNA: Chargaff in alle soorten DNA evenveel adenine als thymine en evenveel guanine als cytosine Franklin en Wilkins - DNA gezuiverd uit cellen en laten polymeriseren als vezels, röntgendiffractie geen kristal met een perfecte ruimtelijke herhaling van structuur - werk overgenomen door Watson en Crick: dubbele helix: gemiddelde structuur van de DNA-vezels Essentiële karakteristieken van Watson en Crick dubbele helix: - 2 DNA-ketens spiraalsgewijs rond een gemeenschappelijke as gewonden, 1 complete winding = 10 nucleotiden per keten, lengte 34 Å, diameter 20 Å, oriëntatie: antiparallel - suikerfosfaat ruggengraten liggen aan buitenzijde, basen naar binnen waar zij hydrofobe interacties met elkaar aangaan, basen staan ongeveer loodrecht op lengteas en liggen als schoteltjes opgestapeld (basepair stacking). Tussen beide backbones bevinden zicht 2 spleten (brede en smalle groeve) waar de basenparen contact hebben met de omgeving - basenparen interageren door middel van H-bruggen: A-T en G-C - basensequentie in DNA = drager van de genetische informatie, dubbelstrenging DNA bestaat uit 2 ketens met complementaire sequenties Replicatie van DNA is semi-conservatief bewijs door Meselson en Stahl: - merkten nieuw aangemaakt en oud DNA tegelijkertijd door zware (15N) of lichte (14N) stikstofatomen in de basen in te bouwen - het zware DNA kon gescheiden worden van het lichte via dichtheidsgradiënt-evenwichts-sedimentatie (concentratie-gradiënt van een cesiumchloride-oplossing) - eerst werden bacteriën gekweekt op een voedingsbodem met uitsluitend 15N alle nieuw aangemaakte DNA een hoger soortelijk gewicht dan het DNA dat verkregen zou worden met 14Nvoedingsbodem - door plotseling over te schekelen op licht stikstof in de voedingsbron, bleken alle dochtercellen van de eerste generatie DNA te bevatten met ‘intermediaire’ dichtheid Lengte van DNA-moleculen: - chromosoom van E. coli: 4600 kb (kilobasen) of 4,6 mb (megabasen) - totale lengte van het DNA in 1 menselijke zaadcel: 1 meter dubbele helix (~3000 mb) DNA-moleculen vertonen superwindingen (supercoils). Supercoiled DNA is compacter dan lineair DNA en draagt bij tot het gemakkelijker ontrollen van de complementaire ketens Bouwstenen van RNA: - ribose - uracil in plaats van thymine - meestal enkelvoudige strengen, maar kunnen stam-lus structuren vormen waarbij de stammen als korte stukjes dubbele helix voorkomen Ribosomaal RNA (rRNA) - grootste aandeel van het totaal RNA in de cel (80%) - 2/3 van het gewicht van de ribosomen - 4 soorten rRNA met sedimentatiecoëfficiënten van 5S, 5,8S, 18S en 28S in 1 ribosoom telkens een molecuul van elk van deze 4 - rol in de translatie - bij bacteriën: 3 soorten rRNA (23S, 16S en 5S) Transport RNA (tRNA) - 10-15% van het totale RNA - fysische drager van geactiveerde aminozuren naar de ribosomen - tijdens de eiwitsynthese als adaptormolecuul om de juiste aminozuren aaneen te koppelen - voor elk van de 20 aminozuren bestaat er minstens 1 specifiek tRNA - klein: 75 nucleotiden - karakteristieke secundaire (klaverblad) en tertiaire (L-vorm) structuur Messenger RNA (mRNA) - minder dan 5% van het totale cellulair RNA - zeer heterogeen, ontstaat door transcriptie - bij bacteriën heeft mRNA een kort leven en zijn transcriptie en translatie gekoppeld in tijd en ruimte - bij eukaryoten is mRNA veel stabieler en ontstaat het pas na een reeks modificaties (splicing, capping, poly-A staart) Bij eukaryoten bestaat er ook nog een verzamelijk kleine RNA’s die vaak geassocieerd voorkomen met eiwitten - in de kern zijn er de small nuclear ribonucleoproteïns (snRNP) enzymatische bewerking (splicing) van juist afgeschreven RNA’s - in het cytoplasma bestaan er small cytoplasmic ribonucleoproteins (scRNP) transport van bepaalde eiwitten door de membraan van het endoplasmatisch reticulum RNA dient ook als primer voor de DNA-replicatie KOOLHYDRATEN vereenvoudigde kenmerkende stoichiometrie (CH2O)n Belangrijke functies van koolhydraten: - metabolisme: tussenproducten in de stofwiseling van de meeste organismen (prototype: glucose) - structureel: skelet van planten, insecten en schaaldieren, structuurelementen van RNA, DNA en nucleotiden - Cel-cel interacties: vertakte koolhydraten met relatief ingewikkelde structuur vertonen covalente bruggen met eiwitten of vetten die zich aan de oppervlakte van dierlijke cellen bevinden (glycoproteïnen en glycolipiden) - diverse functies: bepalen van de levensduur van een in het bloed circulerend eiwit, eiwitadressering en moleculair smeren van gewrichten Grote koolhydraten bestaan door covalente brugvorming tussen kleine bouwstenen (monosachariden) Monosachariden: - ketosen of aldosen - 3-8 C-atomen (vb: triosen, pentosen, hexosen) Triose D-glyceraldehyde - kleinste aldose - als fosfaatester door cellen gebruikt als metaboliet - thv de 3 C-atomen geoxideerd: C1 is aldehyde, C2 en C3 dragen alcoholgroepen - zeer polair en goed wateroplosbaar gemeenschappelijk kenmerk voor alle suikers - middelste C-atoom chiraal centrum 2 enantiomeren: D- en L-glyceraldehyden alleen Dglyceraldehyde in cellen gebruikt als metaboliet (bijna alle monosachariden D-configuratie) (per Catoom komt er 1 nieuw chiraal centrum bij) ketotriose dihydroxyaceton: C2-ketogroep tautomeer van glyceraldehyde - als fosfaatester belangrijk stofwisselingsproduct - symmetrisch molecuul geen stereo-isomeren (grotere ketosen wel chirale centra) ketotriosefosfaat en aldotriosefosfaat worden tijdens de stofwisseling in elkaar omgezet dankzij het enzym triosefosfaat isomerase Koolstofketens van pentosen en hexosen zijn in waterige oplossing zeer flexibel (rotaties rond de C-C bindingen). Door herschikking van elektronen rond de aldehydegroep en het voorlaatste C-atoom ringvormige structuren: pyranosen (6-ring) of furanosen (5-ring) die in een waterige oplossing veel stabieler zijn Tijdens de ringsluiting van D-glucose tot een D-glycopyranose interageert de aldehydegroep van C1 met de OH-groep van C5, door herschikking van elektronenparen ontstaat een hemi-acetaalbinding (door ringsluiten ontstaat 1 extra asymmetrisch C-atoom -anomeer waarbij de anomerische OH-groep onder het vlak van de ring ligt en de -anomeer waarbij de OH-groep boven de ring ligt Openen en sluiten van ring is reversibel, in water evenwicht naar ringen 2 x meer -D-glucose strandstoelconformatie (zijgroepen telkens equatoriale positie want minder sterische hinder) en alle volumineuze zijgroepen van de ring equatoriaal Fructose 4 mogelijke ringstructuren: -D en -D-fructopyranose en -D en -D-fructofuranose Glucose en fructose: zoet smakende suikers, belangrijk als brandstoffen, via enzymen afgebroken tot kleinere suikers zoals triosefosfaten (glycolyse) Stereo-isomeren die niet elkaars ruimtelijk spiegelbeeld zijn = diastereomeren 2 diastereomeren die slechts verschillen op 1 assymetrisch C-atoom = epimeren Galactose eveneens een brandstof voor bepaalde cellen die de suiker kunnen opnemen Er bestaan een hele reeks chemisch gewijzigde monosachariden die een rol spelen als metabolieten of bouwstenen van complexe suikerpolymeren - fosfaatesters van hexosen en triosen in glycolyse (glucose-6-fosfaat, glyceraldehyde-3-fosfaat) - C6-OH-groep van glucose kan verder geoxideerd worden tot –COOH ontstaan van zure suiker glucuronzuur (afbraak en eliminatie van sommige geneesmiddelen door de menselijke lever) - C2-OH-groepen van hexosen worden soms vervangen door een aminogroep (glucosamine, galactosamine) verder veranderd door N-acetylering tot bv N-acetylglucosamine (samen met Nacetylmuraminezuur een belangrijke bouwsteen van peptidoglycaan, structurele polysacharide van de bacteriële celwand) De glycosidebinding ontstaat wanneer de anomerische OH-groep condenseert met een andere suiker-OHgroep (O-glycosidebinding polymerisatie van monosachariden tot polymeren) of met een purine- of pyrimidinebase (N-glycosidebinding in ribonucleotide of desoxyribonucleotide, positie base altijd boven de ring) In cellobiose (disacharide, afbraakproduct van cellulose) is de -anomerische OH-groep van een glucoseresidu verbonden met de C4-OH-groep van een tweede glucoseresidu Adenosine is een adenine bevattend ribonucleoside - komt voor als metabole tussenstap in de afbraak van ribonucleotiden ATP, ADP en AMP - door sommige cellen gebruikt als extracellulair signaal in de intercellulaire communicatie Bij disachariden worden 2 monosachariden verbonden tot een dimeer via 1 O-glycosidebinding - sucrose: tafelsuiker, anomerisch C-atoom van glucose is via een -1,2-glycosidebinding gehecht aan het anomerisch C2-atoom van fructose - maltose: bestaat uit D-glucose via -1,4-glycosidebinding aan elkaar gebonden, ontstaat bij mens in dunne darm door spijsvertering van polysachariden zoals zetmeel - lactose: galactose dat via een -1,4-binding vastzit aan glucose, in zoogdierenmelk, door een speciaal enzym aangemaakt in de borstklier tijdens de periode van lactatie door specifieke enzymen (sucrase, maltase en lactase, die zich als integrale membraaneiwitten in de microvilli van de mucosacellen bevinden) verteerd in dunne darm Bij een groot aantal volwassen mensen bestaat er lactose-intolerantie waarbij de lactase-activiteit in de dunne darm zo sterk daalt, dat lactose niet langer verteerd wordt en er na het drinken van melk diarree optreedt De meeste polysachariden zijn vertakte ketens, de bouwstenen en onderlinge bindingen zijn meer variabel en de synthese van polysachariden is niet matrijsafhankelijk De belangrijke polysachariden - structurele rol: o peptidoglycaan celwanden bacteriën o chitine exoskelet schaaldieren en insecten o cellulose hout van planten o proteoglycanen bij zoogdieren grondstof van intercellulaire ruimten (vooral bindweefsel) - metabole rol: glucose energiereserve o dextraan eencelligen o zetmeel planten o glycogeen zoogdieren, in lever en spieren - oligosachariden: onderdeel van glycoproteïnen en glycolipiden in de extracellulair gerichte laag van celmembraan Cellulose: - lange lineaire ketens van cellulose worden stijf door zeer regelmatige H-bruggen tussen de C3-OH en de ring-O-groep in 2 naburige glucoseresidu’s - ook veel H-bruggen tussen afzonderlijke, parallel verlopende ketens - meest voorkomende biomolecuul op aarde met een biomassa van vele triljoenen tonnen en een jaarlijkse productie/afbraak van meer dan 1015 kg - celwand van plantaardige cellen - vezels van het polysacharide worden stevig bijeengehouden door hemi-cellulose (mengsel van andere structuurpolysachariden - papier is een vrij zuivere vorm van cellulose Chitine - bouwstof van exoskelet van insecten en schaaldieren - op bepaalde posities sterk gemineraliseerd - talrijke H-bruggen tussen C3-OH en ring-O van naburige residu’s Levende wezens gebruiken homo-polymeren van D-glucose als opslagplaats voor energie - bacteriën dextranen, planten zetmeel, dieren glycogeen - dextranen bestanddeel van tandplaque, mineralisatie van plak tandsteen tandvlees trekt terug en metabolisme van bacteriën levert lokaal organische zuren die de mineralen van het tandglazuur oplossen cariës (gaatjes) - - zetmeel: o grote korrels in cytoplasma van plantaardige cellen o bevat moleculair 2 componenten: vertakte amylopectine: -1,4-glycosidebindingen met hierop vertakkingen dankzij 1,6-glycosidebindingen, helicale structuur bolvormige structuur onvertakte amylose: lineair polymeer met uitsluitend -1,4-bindingen tussen glucoseresidu’s, ruimtelijk amylose-helix o mens: spijsverteringsenzymen (vb pancreatisch amylase) om -1,4-glycosidebindingen van zetmeel te hydrolyseren ontstaan van oa maltose dat verder afgebroken wordt tot Dglucose o mens bezit geen enzymen om de -1,4-bindingen van cellulose te hydrolyseren een voldoende hoeveelheid onverteerbare vezels in het voedsel vergemakkelijkt de passage van de inhoud van de dikke darm dierlijke glycogeen o lijkt sterk op amylopectine o treedt op als opslagpolymeer van D-glucose in de lever en in de skeletspieren rol in menselijk metabolisme Proteoglycanen - rol als grondstof voor intercellulaire ruimtes vooral in bindweefsel - 95% suikers en 5% eiwit, sterk negatief geladen binden veel water en kationen, basis van extracellulaire matrix - suikergedeelte = glycosaminoglycaan: o polysachariden die bestaan uit repeterende eenheden van telkens 2 hexosen waaronder doorgaans een aminosuiker o negatief geladen door een carboxylgroep of door sulfatie van amino- of alcoholgroep binding van watermantels en interactie met positieve ladingen van andere macromoleculen o vb: hyaluronzuur (polymeer van glucuronzuur en N-acetylglucosamine, als vrij polysacharide in synoviale vloeistof en in glasachtig lichaam van oog verhoogt viscositeit en smeert gewrichten), heparine, heparaansulfaat, chondroïtinesulfaat en kerataansulfaat o bindt via niet covalente krachten aan ongeveer 140 moleculen core protein, aan elk core protein zitten op regelmatige afstand de polysacharidenchondroïtinesulfaat en kerataansulfaat covalent gebonden op serinezijketens Heparine - bindt sterk aan anti-thrombine III in bloedbaan voorkomt bloedstolling - in geneeskunde vaakt gebruikt als anti-stollingsmiddel - komt normaal niet voor in de bloedbaan - mutaties in het gen dat codeert voor sulfaterend enzym voor heparinesynthese in muizen heparine regelt intracellulair de werking van mastocyten op het niveau van eiwitglycosylering Vertakte oligosachariden die covalent verbonden zijn met eiwitten (glycoproteïnen) en vetten (glycolipiden) spelen rol in herkenningsmechanismen: de speciefieke structuur van de suikers wordt door specifieke eiwitten herkend, deze lectines bevinden zich in de membraan van een andere cel ontstaan nietcovalente bindingen tussen cellen rol in celadhesie (beweeglijke cel hecht zich vast aan een andere) O-gebonden oligosachariden: - vast aan serine- of threonineresidu’s van het eiwit - vrijwel identiek aan suikers op glycolipiden - glycoforine A: eiwit in rode bloedcelmembraan met veel O-gebonden oligosachariden N-gebonden oligosachariden - vast op asparagineresidu - vertakte structuren van ongeveer 10 suikerresidu’s: in hun centrum een kern of core oligosacharide dat opgebouwd is uit 2 moleculen N-acetylglucosamine en 3 moleculen mannose waarrond een aantal extra suikers Het aantal oligosachariden is enorm omdat een groot aantal verschillende bouwstenen op een vrij groot aantal mogelijke manieren aan elkaar kunnen vastzitten De bacteriële celwanden zijn voor deel verantwoordelijk voor klinische uiting van bacteriële infecties en suikers in deze celwanden leveren vaak de antigenen die zullen leiden tot een immunologische afweer vanwege de gastheer Penicilline verhindert dat bacteriën hun celwand vormen en lysozyme breekt de polysacharideketen af Bacteriën hebben hun celwand nodig om te kunnen overleven versterkende laag, bescherming tegen mechanische en osmotische agressie - grampositieve bacteriën: celwand bestaat uit peptidoglycaan en teichoïnezuur - gramnegatieve bacteriën: nog extra laag die bestaat uit complex mengsel van eiwitten, lipiden en koolhydraten Polysacharideketens - basis van wandstructuur - bestaan uit herhalende disacharide: N-acetylglucosamine in -1,4-glycosidebinding met Nacetylmuraminezuur die onderling verbonden zijn via -1,4-glycosidebinding Peptidebruggen: - aan elk molecuul NAM zit covalent aan lactaatgroep een tetrapeptide vast (keten met van amino- naar carboxyterminaal: L-alanine, D-glutamaat, L-lysine en D-alanine) - de 2 D-aminozuren worden door racemasen gevormd uit hun natuurlijke voorlopers - glutamaat vormt een isopeptidebinding via -carboxylgroep - pentaglycine zit met carboxyterminus vast aan de -aminogroep van L-lysine in het tetrapeptide De laatste stap in de biosynthese van nieuw peptidoglycaan vindt plaats buiten de cel, op de basis van reeds aanwezige celwand - vorming van covalente bruggen tussen de afzonderlijke suiker-peptide ketens - enzym glycopeptide transpeptidase afsplitsing 2de D-alanine deze stap wordt geremd door penicilline (bezit zelf een reactieve peptidebinding in de -lactaamring die een covalent complex vormt met het glycopeptide transpeptidase irreversibel uitgeschakeld) Een aantal van de pathogene bacteriën bij de mens zijn resistent geworden egen het natuurlijk voorkomende penicilline dankzij resistentie-enzym penicillinase dat de reactieve peptidebinding van de lactaamring openknipt waarbij inactief penicillaanzuur gevormd wordt maar derivaten van penicilline LIPIDEN EN BIOLOGISCCH MEMBRAAN overheersende hydrofobe eigenschappen door de koolwaterstofstructuur die overheerst, toch is in een aantal belangrijke lipiden een beperkt deel polair of zelfs geladen (amfifatisch) geschit om apolaire fase af te schermen van waterige fase (vormen van micellen (spijsvertering van vetten) of moleculaire dubbellagen (lipidenmembranen, compartimentalisatie van weefsels in cellen grote snelheid van biochemische reacties laat een beperkte diffusieafstand van substraten en producten toe, juiste moleculen binnen het beperkte volume van een cel concentreren) De beperkte diameter van cellen door afbakening door een lipidenmembraan minimaliseert de diffusieafstanden en zorgt ervoor dat eiwitten en andere grote moleculen in de cel ‘geconcentreerd’ blijven Maar probleem van splendid isolation: niet alle voor de cel belangrijke moleculen diffunderen even goed als zuurstof door een lipidenmembraan, vooral polaire of geladen stoffen diffunderen niet of nauwelijks biologische membraan is dus semi-permeabel speciale transportkanalen (doorlaatbaarheid geregeld in functie van de fysiologische omstandigheden) Rollen van lipiden: - structurele rol in membranen - belangrijke brandstof voor het metabolisme - isoleert veel warmbloedige dieren tegen koudere buitenwereld - beperken soms verlies van of contact met water Basisstructuur: - 1 of enkele vetzuren via esterbinding covalent gebonden aan een alcohol - vetzuren = organische zuren met een ioniseerbare carboxylgroep en een koolwaterstofstaart - carboxylgroep reageert in water als zwak zuur, is sterk polair, de koolwaterstofstaart is sterk hydrofoob - echte vetzuren lengte van koolwaterstofstaart minstens 10 C-atomen, in biologische structuren 10 tot 26 C-atomen, aantal C-atomen bijna altijd even getal, keten doorgaans niet vertakt Stearaat: 18 C-atomen (17 in vetzuurstaart, 1 van carboxylgroep), bestanddeel van kaarsvet Palmitaat: 16 C-atomen, zeer talrijk in allerlei lipiden, als vetzuur grote rol in het metabolisme Belangrijke onverzadigde vetzuren voor de mens: oleaat, linoleaat en linolenaat (3 vetzuur, beschermt tegen hart- en vaatziekten) (C18) cisconfiguratie knik invloed op 3D-structuur van vetzuur Micellen: de enigszinds kegelvormige ruimtelijke structuur van een geïoniseerd vetzuur leidt tot bolvormige aggregaten van vetzuren met een polair oppervlak en een apolaire kern in kernen kunnen andere apolaire lipiden opgelost worden soortgelijke functie vervullen de amfifatische galzouten in de spijsvertering van vetten in de dunne darm Vetzuren kunnen via een esterbinding met hun carboxylgroep covalent gebonden worden met een alcoholgroep. Wanneer 3 vetzuren veresterd zijn met glycerol triacyglycerol (= triglyceride, niet amfifatisch, vormen geen micellen) belangrijk bestanddeel van vetcellen (adipocyten) Gemiddelde gezonde volwassen mens draagt ongeveer 10 kg triglyceriden mee, vooral in laag onderhuids vet brandstof voor vele weefsels en waterstofisolator Lipiden van biologische membranen ontstaan doordat 1 of meerdere vetzuren via esterbindingen covalent gebonden worden aan glycerol (glycerolipiden) of sfingosine (sfingolipiden), daarnaast bevatten dierlijke membranen het neutraal lipide cholesterol (groot, apolair alcohol) Schematische structuren van glycerolipide en sfingolipide: - aan de ene zijde 2 apolaire koolwaterstofstaarten - aan de andere zijde ene polaire of zelfs geladen kop uitgesproken amfifatisch fosforylcholine: - 3de alcoholgroep van glycerol is veresterd met fosfaat dat op zijn beurt covalent gebonden is aan choline = fosfatidylcholine - kan als kop dienen in een sfingolipide = sfingomyeline Behalve choline kan fosfaat van glycerolipiden nog 3 andere polaire stoffen dragen: - serine fosfatidylserine - ethanolamine fosfatidylethanolamine - inositol fosfatidylinositol o kan nog verder veresterd worden met 2 bijkomende fosfaatgroepen op de inositolring voorloper van de intracellulaire signaalmoleculen diacyglycerol en inositol-1,4,5-trifosfaat o kan door een fosfo-inositide-3-OH kinase thv de 3-OH groep worden veresterd cruciale stap van de signaaltransductie van een aantal hormonen en groeifactoren Glycolipiden: - sommige sfingolipiden dragen een suikergroep als polaire kop - komen uitsluitend in de buitenste laag van de celmembran voor, waarbij de suikers in de extracellulaire ruimte steken - rol in weefselherkenning en cel-cel interacties - cerebrosiden: bevatten glucose of galactose als monosacharide - gangliosiden: dragen op sfingosine vertakte oligosachariden die bestaan uit tot 7 suikers van diverse soorten zoals N-acetylgalactosamine, galactose, siaalzuur en fucose, worden samen met andere componenten van verouderde stukken celmembraan in de cel opgenomen en verteerd tot vrije suikers, vetzuren en sfingosine (lysosomen) gangliosidosen: stapelingsziekten waarbij in lysosomen 1 specifiek enzym ontbreekt dat de gangliosiden in de lysosomen moet afbreken - ABO-bloedgroepen systeem op rode bloedcellen o 3 verschillende suikerstructuren: A-, B- en O-antigeen o elk van deze oligosachariden zit onveranderlijk covalent vast op een ceramide (sfingosine + vetzuur) o O-antigeen: sfingosine-gebonden oligosacharide bestaande uit N-acetyl galactosamine, galactose, siaalzuur en fucose o A-antigeen: extra N-acetylgalatosamine op galactose gebonden o B-antigeen: extra suiker galactose Cholesterol - compact molecuul met 4 stijve ringen die alle in stoelconfiguratie verkeren = sterolkern o meest linkse ring draagt een OH-groep o de vijfring rechts draagt een vertakte koolwaterstofketen - alleen in dierenrijk, in grote hoeveelheden in de plasmamembranen ingebouwd - wanneer de vrije alcoholgroep covalent gebonden wordt aan een vetzuur = cholesterolesters in lipidendruppels binnen of buiten de cellen - biochemische voorloper van steroïdhormonen (vb cortisol, aldosteron, oestrogenen, progesteron en testosteron) rol in regulatie van genexpressie - komt niet voor in de membranen van prokaryoten en planten, bij dieren minder aanwezig in de membranen van celorganellen dan in de plasmamembraan Sfingo- en glycerolipiden: - amfifatisch en bijna perfect cilindervormig - in waterige omgeving spontaan lipidendubbellagen vormen, elke halflaag ong 3 nm dik - bij planten en bacteriën wordt de membraan omgeven door een celwand van polysachariden - in dierlijke cellen wordt de membraan verstevigd door een proteïneskelet in de cel en een proteoglycaanmatrix tussen de cellen die door integrines in de membraan gebonden worden Asymmetrische verdeling van lipiden over de buitenste en binnenste halflaag, vb: rode bloedcellen: buitenste halflaag: 80% van het totale fosfatidylcholine, 15% van het membraan fosfatidylethanolamine, 5% van het fosfatidylserine en 90% van het sfingomyeline - verschillende verdeling van lading aan de binnen- en buitenzijde van de cel - verschillende fysische beweeglijkheid van lipiden in een halflaag = fluïditeit (bijna uitsluitend een laterale diffusie van de lipiden ten opzichte van elkaar) o bij afkoeling onder een bepaalde kritische temperatuur (transitietemperatuur) zal de trillingsenergie van de vetzuurstaarten lager zijn dan de bindingsenergie tussen de parallele staarten geen laterale diffusie meer mogelijk o aanwezigheid van onverzadigde vetzuren verlaagt de van der Waals krachten (grote verschil in smeltpunten tussen verzadigde en onverzadigde vetzuren met gelijke ketenlengte) o cholesterol (stijve ringen met regelmatige kristalstructuur) minder sterk effect van de temperatuur op de membraanfluïditeit Membraanfuncties die fluïditeit vereisen: - exocytose: versmelten van de plasmamembraan met de membraan van een secretiegranule - endocytose: een deel van de plasmamembraan stulpt zich in en knijpt zich af van het cytoplasma - celbeweging waarbij een cel membraanuitstulpsels doet vormen die zich aan een zijde aan de bodem vastgrijpen - celvervorming: extreem bij rode bloedcellen bij elke passage door het lichaam 2 x door zeer nauwe capillairen worden geperst - communicatie tussen cellen waarbij een extracellulair signaal door de membraan wordt opgevangen en wordt doorgegeven aan enzymen in de plasmamembraan Membraaneiwitten: - selectieve transport van polaire moleculen (kanalen) - specifieke binding van hormonen of neurotransmitters (receptoren) - katalyse van bepaalde biochemische reacties (enzymen) - 20-75% van de massa van een biologische membraan Myelineschede van zenuwvezels erg arm aan eiwit zo weinig mogelijk ionen doorlaten (elektrische isolatie), binnenste mitochondriale membraan erg eiwitrijk (oa cytochromen oxidatieve fosforylatie) Integrale membraaneiwitten: - zitten stevig in de lipidenlaag verankerd doordat een hydrofoob gedeelte van het eiwit direct in contact is met de vetzuurstaarten - bevatten meestal een transmembranair gedeelte dat bestaat uit minstens 1 transmembranaire -helix o uitgesproken overwicht van apolaire aminozuren (Val, Leu, Phe) interageren via hun zijketens met de hydrofobe vetzuurstaarten o 20 aminozuurresidu’s lang, dus ongeveer 6 helicale windingen o vb: G-proteïnen: sterk geconserveerde ruimtelijke structuur met telkens 7 transmembranaire -helixen (serpentinereceptoren) (vb: adrenerge-receptoren, glucagonreceptor, geurstofreceptoren, fotoreceptoren) - kunnen ook via covalente vasthechting aan een apolaire stof verankerd zijn, vb: proto-oncogenen regulatie van de celproliferatie (overdreven expressie = kanker) o p21ras: covalent gebonden aan een farnesylgroep (C1 isopropeen structuur) o p60src: via aminoterminaal glycine verbonden aan C14 vetzuur myristaat Perifere membraaneiwitten: zijn losser aan de membraan gebonden, meestal door niet-covalente interacties met een integraal eiwit Laterale diffusie goed mogelijk, voor sommige membraaneiwitten zelfs noodzakelijk signaaltransductie van een hormonale prikkel buiten de cel naar een tweede prikken binnen de cel Transversale beweging (flip-flop) zeer moeilijk tot onmogelijk omdat polaire of geladen eiwitgedeelten hiervoor door het apolaire centrum van de dubbellaag heen moeten dompelen (thermodynamisch onwaarschijnlijk) Samenstelling van de buitenste en binnenste zijde van de celmembraan verschillen van elkaar - qua lipidensamenstelling - wat betreft oriëntatie van de integrale membraaneiwitten - aard van de perifere eiwitten membranen bestaan uit 2 asymmetrische dubbellagen oorsprong: op asymmetrische wijze gesynthetiseerd (vb suikergroepen van glycolipiden en van membraanglycoproteïnen altijd gebonden aan het extracellulair eiwitgedeelte) Glycoforine A: - talrijke suikergroepen zijn covalent gebonden op de peptideketen van glycoforine (vooral op serines en threonines) thv het extracellulair domein - suikergroepen alleen gebonden aan serines/threonines die zich bevinden in het extracellulaire domein van het eiwit - 1 transmembranaire -helix van 20 overwegend apolaire residu’s - carboxyterminale cytoplasmatische domein bevat een aantal geladen aminozuurzijketens Flippasen = enzymen die de flip-flop-beweging van bepaalde membraanbestanddelen kunnen versnellen dankzij ATP-hydrolyse asymmetrische inplanting/verdeling van een membraanmolecuul over de 2 lipidenhalflagen onderhouden of induceren Vb: P-glycoproteïne resistentie van kenkercellen tegen een serie cytostatica: flip-flopt vetoplosbare cytostatica van de binnenste naar de buitenste lipidenhalflaag Anionenkanaal in de rode bloedcel en de glucosetransporters: - verankerd in membraan dankzij een aantal transmembranaire helixen met hydrofobe zijketens - vaak amfifatisch met polaire zijketens die afgewisseld zijn met apolaire zijketens - vormen samen een watergevuld kanaaltje waarbij polaire of geladen zijketens in de holte van het kanaal wijzen, terwijl de hydrofobe zijketens verantwoordelijk zijn voor de helix-helix contacten en de interactie met de lipiden - anionenkanaal o homodimeer: elke subeenheid boort zesmaal door de lipidenmembraan o uitwisseling van HCO3-/Cl- ionen door de celmembraan heen rol in transport van CO2 en O2 (ademhaling) o werkt samen met koolzuuranhydrase (enzym dat CO2 en water omzet in HCO3- en H+ en omgekeerd) o draagt ook bij tot stevigheid van de rode bloedcel aminoterminaal domein bevindt zich in het cytoplasma en interageert daar met het cytoskelet (spectrine, actine en ankyrine) van de rode bloedcel - glucosetransporters: o opname van glucose door cellen stofwisseling van die cel o bij zoogdieren: minstens 5 verschillende leden die structureel en functioneel op elkaar lijken met elk een weefselspecifiek patroon van expressie GLUT2: leverspecifieke glucosetransporter GLUT4: spierspecifieke isovorm regelbaar door het hormoon insuline dat glucoseopname in deze weefsels bevordert o doorkruisen de lipidenmembraan 12 x, telkens via een transmembranaire -helix van 20 residu’s vormen samen een watergevulde porie waardoor het polaire glucose kan diffunderen Een van de meest intense moleculaire contacten tussen mens en bacterie: oppervlaktestructuren van gramnegatieve bacillen en het immuunsysteem van de gast Het meest primitieve immuunsysteem mucosabarrière met lipopolysacharide (LPS) - complex vertakte suiker die covalent gebonden is met een lipide van de buitenste celmembraan - buitenste deel: repeat oligosacharide (herhaling van een lineair of vertakt oligosacharide) - binnenste deel: bijna onderveranderlijk, omvat een core-oligosacharide dat covalent vast zit aan lipide A (gefosforyleerd glucosamine-disacharide waaraan 5 vetzuurstaarten verankerd zitten, negatief geladen) - ook endotoxine genoemd: lipide A gedeelte is na intraveneuze inspuiting extreem toxisch bij alle zoogdieren - komt in het bloed vrij tijdens de septische shock levensgevaarlijke bloeddrukdaling en uitvallen van verschillende orgaanfuncties ten gevolge van de aanwezigheid van bacteriën in de bloedbaan (sepsis) Toxische effecten niet rechtstreeks door LPS zelf veroorzaakt: - bij lysis van enkele gramnegatieve bacteriën door macrofagen kleine hoeveelheden LPS vrij die worden gekliefd in het suikergedeelte en het lipide A - lipide A stimuleert de macrofagen tot de aanmaak en secretie van een reeks polypeptiden (cytokines) waaronder tumor necrosis facter-alfa - TNF, zeer actief cytokine dat de werking van het immuunsysteem op vele manieren tegelijk activeer o werking op thermoregulatoir systeem met ontwikkeling van koorts o induceert het verschijnen van acute-fase eiwitten in bloedbaan o verhoogt werking van B- en T-lymfocyten o doet via immuunactivatie afweer tegen sommige tumoren toenemen met eventueel tumorregressie als gevolg - het cytokine activeert de adhesie van granulocyten aan de wanden van de capillairen en de productie van toxische zuurstofradialen door granulocyten
