Effect van processing op enzymstabiliteit in veevoeding
advertisement
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015 Effect van processing op enzymstabiliteit in veevoeding Joyce Vermeersch Promotor: Prof. dr. ir. Mia Eeckhout Tutor: Geert Bruggeman Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015 Effect van processing op enzymstabiliteit in veevoeding Joyce Vermeersch Promotor: Prof. dr. ir. Mia Eeckhout Tutor : Geert Bruggeman Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie Auteursrechtelijke bescherming “De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.” “The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.” Woord vooraf Ten eerste wil ik Geert Bruggeman bedanken om mij de kans te geven om in het bedrijf Nuscience mijn masterproef uit te voeren en de begeleiding gedurende mijn traject. Daarnaast wil ik alle andere mensen van Nuscience bedanken voor hun hulp tijdens het uitvoeren van de praktische taken. Met in het bijzonder Hannes Carmans voor de begeleiding van de uitvoering van de testen en David Hermans voor de begeleiding van de interpretatie van de resultaten. Tevens wil ik mijn promotor Mevrouw Eeckhout bedanken voor de hulp tijdens het schrijven en de begeleiding van mijn masterproef. Daarnaast wil ik mevrouw Deleyn bedanken voor het aanleren van de viscositeitsmetingen. Tenslotte wil ik mijn ouders bedanken voor hun steun. Met in het bijzonder mijn moeder, voor de hulp tijdens het schrijven van mijn masterproef. Tijdens het uitvoeren van mijn masterproef heb ik mogen ervaren hoe het is om in een R&D team te werken. Abstract Het gebruik van de exogene enzymen fytasen, xylanasen, glucanasen en mannanasen is veelvoorkomend in veevoeding. In dit werk wordt de specifieke enzymactiviteit(en) van NSP enzymen en fytasen bepaald bij een standaard pH (volgens het protocol). De fytase-activiteit wordt bepaald volgens de ISO norm 30024:2009 en de xylanase-, glucanase- en mannanase-activiteit van de NSP enzymen volgens de gestandaardiseerde methode van het bedrijf Nuscience. Door de specifieke activiteit in U/g uit te drukken, kunnen de enzymen onderling vergeleken worden op basis van enzymactiviteit. Om te bepalen voor welke diersoort (kip of big) het enzym het meest geschikt is, wordt de activiteit van enkele NSP enzymen en fytasen bepaald bij een zure en neutrale pH-waarde. Daarnaast wordt het effect van processing op enzymstabiliteit van vijf fytasen en vijf NSP enzymen bepaald. Dit door een soja-maïs gebaseerd voeder met toegevoegd enzym te pelletiseren onder laboratoriumomstandigheden bij drie procestemperaturen, respectievelijk 75, 85 en 95°C. Van de aangemaakte pellets en meel met toegevoegd enzym, wordt de specifieke enzymactiviteit bepaald. Hieruit blijkt dat de meeste fytasen activiteit verliezen in pellets ten opzichte van meel en dat de meeste NSP enzymen een goede hittestabiliteit vertonen tot procestemperaturen van 75°C. In een laatste fase worden viscositeitsmetingen uitgevoerd op meel en aangemaakte pellets met toegevoegd NSP enzym, om na te gaan hoe de viscositeit verloopt in functie van de tijd. Hieruit blijkt dat alle NSP enzymen een viscositeitsverlagend effect vertonen, zowel op meelbasis als op pellets. Kernwoorden: fytasen, NSP enzymen, ranking, pelletiseren, enzymstabiliteit, viscositeit The use of the exogenous enzymes phytases, xylanases, glucanases and mannanases is common in feed. In this work the specific enzyme activitity is determined for phytases and NSP enzymes at a standard pH (according to the protocol). The phytase activity is determined according to the ISO norm 30024 :2009 and the xylanase-, glucanase and mannanase-activity of the NSP enzymes is determined according to the standardized method of the company Nuscience. By expressing the specific enzyme activity in U/g, the enzymes can be compared on the basis of the enzyme activity. To determine to which species (chicken or piglet) the enzyme is the most appropriate, the activity of some NSP enzymes and phytases is determined at acidic and neutral pH-value. In addition, the effect of processing on enzyme stability is determined of five phytases and five NSP enzymes. For this a soy-corn based feed with added enzyme is pelletizing under laboratory conditions at three temperatures, respectively 75, 85 and 95°C. The specific enzyme activity is determined of the created pellets and flour with added enzyme. This shows that most phytases lose activity in pellets in relation to flour and that the most NSP enzymes exhibit a good heat stability to process temperatures of 75°C. In a last phase viscosity measurements are determined on flour and created pellets with added NSP enzyme, to see how viscosity is a function of time. This shows that all NSP enzymes exhibit a reducing of the viscosity, both on flour basis as on pellets. Key words : phytases, NSP enzymes, ranking, pelletizing, enzyme stability, viscosity Inhoudsopgave Lijst met figuren ..................................................................................................................... 4 Lijst met tabellen ................................................................................................................... 6 1 Inleiding.......................................................................................................................... 7 2 Gebruik van enzymen in veevoeding .............................................................................. 9 2.1 Belang van enzymen in veevoeding ........................................................................ 9 2.2 Niet-zetmeelpolysacharide enzymen ....................................................................... 9 2.2.1 β-glucanase ....................................................................................................10 2.2.2 Xylanase .........................................................................................................12 2.2.3 β-mannanase ..................................................................................................14 2.3 2.3.1 Substraat en werking van het enzym ...............................................................15 2.3.2 Productie van het enzym fytase ......................................................................16 2.3.3 Effect van toevoegen van fytase op dierniveau ...............................................17 2.4 3 Wetgeving omtrent voederenzymen .......................................................................17 Pelletiseren ...................................................................................................................19 3.1 Inleiding..................................................................................................................19 3.2 Verschillende stappen van het pelletiseerproces ....................................................19 3.2.1 Vermalen.........................................................................................................19 3.2.2 Conditioneren ..................................................................................................19 3.2.3 Persen ............................................................................................................20 3.2.4 Koel- en droogstap ..........................................................................................21 3.2.5 Nabehandeling ................................................................................................21 3.3 Chemische en fysische veranderingen ten gevolge van het pelletiseerproces .......21 3.3.1 Invloed op zetmeel ..........................................................................................21 3.3.2 Invloed op proteïnen .......................................................................................22 3.3.3 Invloed op viscositeit van het voeder in het verteringsstelsel ...........................22 3.3.4 Invloed op enzymen ........................................................................................22 3.4 4 Fytase ....................................................................................................................15 Verbeteren van de enzymstabiliteit in pellets ..........................................................24 3.4.1 Overdosage ....................................................................................................25 3.4.2 Vloeibare enzymen na pelletiseren..................................................................25 3.4.3 Verbeteren van de thermostabiliteit van enzymen ...........................................25 Materiaal en methoden ..................................................................................................28 4.1 Proefopzet..............................................................................................................28 1 4.2 4.2.1 Bepalen van de xylanase-ijklijn .......................................................................29 4.2.2 Bepalen van de xylanase-activiteit van NSP enzymen ....................................29 4.3 Bepalen van de glucanase-activiteit .......................................................................31 4.3.1 Bepalen van de glucanase-ijklijn .....................................................................32 4.3.2 Bepalen van de glucanase-activiteit van NSP enzymen ..................................32 4.4 Bepalen van de mannanase-activiteit .....................................................................33 4.4.1 Bepalen van de mannanase-ijklijn ...................................................................33 4.4.2 Bepalen van de mannanase-activiteit van NSP enzymen ................................34 4.5 Bepalen van de fytase-activiteit ..............................................................................35 4.5.1 Bepalen van de fytase-ijklijn ............................................................................35 4.5.2 Bepalen van de fytase-activiteit van fytasen (volgens ISO norm 30024:2009) .36 4.6 Pelletiseren van het voeder ....................................................................................38 4.6.1 Samenstelling van het voeder .........................................................................38 4.6.2 Het pelletiseren onder laboratoriumomstandigheden ......................................39 4.7 Bepalen van de enzymactiviteit in voeder...............................................................40 4.7.1 Voorbereidingen ..............................................................................................40 4.7.2 Bepaling fytase-activiteit in voeder ..................................................................40 4.7.3 Bepaling xylanase-activiteit in voeder ..............................................................40 4.8 5 Bepaling van de xylanase-activiteit.........................................................................28 Viscositeitsmetingen...............................................................................................41 4.8.1 Benodigdheden en voorbereidingen ................................................................41 4.8.2 Uitvoering ........................................................................................................41 Resultaten .....................................................................................................................43 5.1 Ranking volgens specifieke enzymactiviteit bij standaard pH .................................43 5.1.1 Probleemstelling..............................................................................................43 5.1.2 Ranking volgens xylanase-activiteit bij standaard pH ......................................44 5.1.3 Ranking volgens glucanase-activiteit bij standaard pH ....................................45 5.1.4 Ranking volgens mannanase-activiteit bij standaard pH..................................46 5.1.5 Ranking volgens fytase-activiteit bij standaard pH ...........................................47 5.2 Specifieke enzymactiviteit bij verschillende pH-waarden ........................................48 5.2.1 Xylanase-activiteit bij verschillende pH-waarden .............................................48 5.2.2 Glucanase-activiteit bij verschillende pH-waarden ...........................................49 5.2.3 Mannanase-activiteit bij verschillende pH-waarden .........................................50 5.2.4 Fytase-activiteit bij verschillende pH-waarden .................................................51 5.3 Effect van processing op de enzymactiviteit ...........................................................52 5.3.1 Samenstelling van het voedermengsel ............................................................52 2 5.3.2 Parameters tijdens het pelletiseren .................................................................52 5.3.3 Hittestabiliteit van fytasen ................................................................................53 5.3.4 Hittestabiliteit van NSP enzymen ....................................................................58 5.4 6 Viscositeitsmetingen...............................................................................................63 5.4.1 Viscositeitsverloop van meel ...........................................................................63 5.4.2 Viscositeitsverloop van pellets.........................................................................65 Discussie .......................................................................................................................68 6.1 Bepalen van de specifieke enzymactiviteit .............................................................68 6.2 Effect van processing op enzymstabiliteit ...............................................................68 6.3 Viscositeitsmetingen...............................................................................................69 6.4 Besluit ....................................................................................................................71 7 Algemeen besluit ...........................................................................................................72 8 Literatuurlijst ..................................................................................................................73 9 Bijlagen .........................................................................................................................76 Bijlage 1: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 2 ......................................76 Bijlage 2: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 4 ......................................77 Bijlage 3: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 5 ......................................78 Bijlage 4: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 10 ....................................79 3 Lijst met figuren Figuur 1: schematische voorstelling van de inwerking van (1-3,1-4)-β-glucanase op (1-3,1-4)β-glucaan. De horizontaal geordende zeshoeken stellen de 1,4-β- verbonden ᴅglucopyranosyl eenheden voor en de schuine lijn stelt de 1,3-β-verbinding voor (Du Jardin et al., 2011) ..............................................................................................................................11 Figuur 2: structurele elementen in arabinoxylaan: links: ongesubstitueerd xylanopyranosylresidu, midden: gesubstitueerd xylanopyranosylresidu op positie O-2 en O-3, rechts: gesubstitueerd xylanopyranosylresidu op positie O-2 (Dexter & Izydorczyl, 2008) ....12 Figuur 3: schematische voorstelling van de enzymatische hydrolyse van arabinoxylaan (Du Jardin et al., 2011)................................................................................................................13 Figuur 4:hydrolyse van fytaat door fytase in inositol, fosfaat en tweewaardige kationen (Lei & Porres, 2003) .......................................................................................................................16 Figuur 5: schematische voorstelling van het principe van persen (Eeckhout, 2015) .............20 Figuur 6: schematische voorstelling van twee types van coaten van enzymen (Cooney, 2010) .............................................................................................................................................26 Figuur 7: schematische voorstelling van het principe van vacuüm coaten (Lamichhane et al., 2015) ....................................................................................................................................27 Figuur 8: schematische voorstelling voor de bepaling van de specifieke enzymactiviteit van een NSP enzym ...................................................................................................................31 Figuur 9: schematische voorstelling voor bepaling van de eigenlijke waarden ......................37 Figuur 10: schematische voorstelling voor de bepaling van de blanco waarden ...................37 Figuur 11: pelletiseertoetel in het labo graan- en diervoedertechnologie aan de Universiteit Gent .....................................................................................................................................39 Figuur 12: Fritsch variable speed rotor mill pulverisette 14 ...................................................40 Figuur 13: Haake viscosimeter VT 550 .................................................................................41 Figuur 14: probe FL 100 .......................................................................................................41 Figuur 15: rotormolen Retsch GmbH, type SK1 ....................................................................41 Figuur 16: ranking volgens xylanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen bij standaard pH 4,8 ..................................................................................................................44 Figuur 17: vergelijking tussen de bepaalde xylanase-activiteit in U/g en de xylanase-activiteit volgens de leverancier van enkele NSP enzymen ................................................................45 Figuur 18: ranking volgens glucanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymenbij standaard pH 5 .....................................................................................................................46 Figuur 19: ranking volgens mannanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen bij pH 7,5 ........................................................................................................................................47 Figuur 20: ranking volgens fytase-activiteit van de beschikbare fytasen bij standaard pH 5,5 .............................................................................................................................................48 Figuur 21: verloop van xylanase-activiteit bij verschillende pH-waarden van enkele NSP enzymen ..............................................................................................................................49 Figuur 22: verloop glucanase-activiteit bij verschillende pH-waarden van enkele NSP enzymen ..............................................................................................................................50 Figuur 23: verloop mannanase-activiteit bij verschillende pH-waarden van enkele NSP enzymen ..............................................................................................................................51 Figuur 24: verloop fytase-activiteit bij verschillende pH-waarden van alle beschikbare fytasen .............................................................................................................................................52 4 Figuur 25: fytase-activiteit van fytase 1 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................54 Figuur 26: fytase-activiteit van fytase 2 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................54 Figuur 27: fytase-activiteit van fytase 3 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................55 Figuur 28: fytase-activiteit van fytase 4 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................56 Figuur 29: fytase-activiteit van fytase 5 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................56 Figuur 30: fytase-activiteit van de fytasen in meel en blanco meel .......................................57 Figuur 31: fytase-activiteit van de fytasen in pellets aangemaakt bij 75°C ............................57 Figuur 32: fytase-activiteit van de fytasen in pellets aangemaakt bij 85°C ............................57 Figuur 33: fytase-activiteit van de fytasen in pellets aangemaakt bij 95°C ............................57 Figuur 34: xylanase-activiteit van NSP 2 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................59 Figuur 35: xylanase-activiteit van NSP 4 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................59 Figuur 36: xylanase-activiteit van NSP 5 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................60 Figuur 37: xylanase-activiteit van NSP 10 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................61 Figuur 38: xylanase-activiteit van NSP 12 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen ........................................................................................................................61 Figuur 39: xylanase-activiteit van NSP enzymen in meel en blanco meel .............................62 Figuur 40: xylanase-activiteit van NSP enzymen in pellets aangemaakt bij 75°C .................62 Figuur 41:xylanase-activiteit van NSP enzymen in pellets aangemaakt bij 85°C ..................62 Figuur 42: xylanase-activiteit van NSP enzymen in pellets aangemaakt bij 95°C .................62 Figuur 43: viscositeitscurve van blanco meel en meel met toegevoegd NSP enzym ............64 Figuur 44: theoretische mannanse-, glucanase- en xylanase-activiteit van NSP enzymen, bepaald bij standaard pH......................................................................................................64 Figuur 45: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 12 ......................................66 Figuur 46: viscositeitsverloop van pellets aangemaakt bij 75°C met toegevoegd NSP enzym .............................................................................................................................................67 Figuur 47: viscositeitsverloop van pellets aangemaakt bij 85°C met toegevoegd NSP enzym .............................................................................................................................................67 Figuur 48: viscositeitsverloop van pellets aangemaakt bij 95°C met toegevoegd NSP enzym .............................................................................................................................................67 5 Lijst met tabellen Tabel 1: hoeveelheden totaal NZP, β-glucaan, arabinoxylaan en β-mannaan in verschillende granen en graanafgeleiden (Bedford et al., 2010; Choct, 2011; Choct et al., 2010; Cowieson, 2005; Dexter & Izydorczyl, 2008; Knudsen, 2001; Meng & Slominski, 2005) ........................10 Tabel 2: bepaalde xylanase-activiteit in starter en finisher voeder bij verschillende pelletiseertemperaturen met telkens het behoud aan activiteit (Cowieson et al., 2005) ........23 Tabel 3: endogene fytasen-activiteit (U/g) voor (meel) en na pelletiseren (pellet) in twee verschillende productie-eenheden (Davie et al., 2007). ........................................................24 Tabel 4: het effect van de conditioneertemperatuur op fytase-activiteit (U/g) voor twee commerciële fytasen (Davie et al., 2007) ..............................................................................24 Tabel 5: hoeveelheden xylose-oplossing en citroenzuurbuffer voor aanmaken van de standaardreeks ....................................................................................................................29 Tabel 6: hoeveelheden glucose-oplossing en natriumacetaatbuffer voor het aanmaken van de standaardreeks................................................................................................................32 Tabel 7: hoeveelheden mannose-oplossing en trisbuffer voor het aanmaken van de standaardreeks ....................................................................................................................33 Tabel 8: hoeveelheid fosfaatstock standaardoplossing en hoeveelheid acetaatbuffer met polysorbaat voor het aanmaken van de standaardoplossing ................................................35 Tabel 9: samenstelling van het voeder met de functie van de grondstof in het dier ..............38 Tabel 10: enkele NSP enzymen met hun xylanase-activiteit en een code voor eenheid volgens de leverancier..........................................................................................................43 Tabel 11: conditioneertemperatuur en gemiddeld vochtgehalte van het geconditioneerd meel voor de 10 batchen...............................................................................................................53 Tabel 12: dosering van fytase in meel met de theoretische fytase-activiteit en de gemeten exogene fytase-activiteit in meel van vijf fytasen ..................................................................53 Tabel 13: dosering van NSP enzym in meel met de theoretische xylanase-activiteit en de gemeten exogene xylanase-activiteit in meel van vijf NSP enzymen ....................................58 6 1 Inleiding “Effect van processing op enzymstabiliteit in veevoeding” geeft weer wat de invloed is van het processen van pellets op de activiteit van enzymen. Enzymen worden in veevoeding aangewend om de vertering bij dieren mee te ondersteunen daar waar het inwendige enzymsysteem nog niet voldoende ontwikkeld is en om vezelrijke substraten beter toegankelijk te maken voor het dier. De enzymen die behandeld worden in dit werk zijn de glucanasen, xylanasen, mannanasen en fytasen toegepast voor pluimveevoeder en varkensvoeder. Met deze enzymen wil men een enzymcocktail maken die functioneel is en een goede activiteit vertoont in het dier, zodat voedingsstoffen makkelijker opneembaar worden. Daarnaast wil men dat diezelfde enzymcocktail stabiel is bij de productie van pellets. Er is een grote verscheidenheid in eenheden die gebruikt wordt tussen leveranciers onderling om enzymactiviteit uit te drukken. De verscheidenheid in eenheden wijst erop dat er verschillende methoden worden gebruikt om enzymactiviteit te bepalen, waardoor het moeilijk is de verschillende enzymen te vergelijken op basis van activiteit. Hiertoe wordt per enzymsoort een ranking opgesteld volgens enzymactiviteit, dit bij een standaard pH en volgens de gestandaardiseerde procedure van Nuscience voor de niet-zetmeelpolysacharide enzymen en volgens de ISO norm 30024:2009 voor de fytasen. Vervolgens wordt nagegaan wat de enzymactiviteit is in functie van de pH. Dit om te bepalen op welke plaats in het verteringsstelsel het enzym de grootste activiteit vertoont en voor welke diersoort het enzym het meest geschikt is. Het processen van pellets kan invloed hebben op de enzymactiviteit. Om dit na te gaan worden vijf NSP enzymen en vijf fytasen toegevoegd aan een testvoeder. Het voeder met toegevoegd enzym wordt gepelletiseerd onder laboratoriumomstandigheden bij drie temperaturen, respectievelijk 75, 85 en 95°C. Vervolgens wordt de enzymactiviteit bepaald vóór en na het pelletiseren. Het effect van processing op de enzymstabiliteit wordt bepaald door de enzymactiviteit in de pellets te vergelijken met de enzymactiviteit in het meel. Tevens wordt bepaald welk enzym het meest geschikt is in pellets bij een bepaalde procestemperatuur of in meel. Dit wordt bepaald op basis van de grootste enzymactiviteit. Door de aanwezigheid van oplosbare vezels in het voeder, stijgt de viscositeit in het verteringsstelsel van het dier. Door de stijging van de viscositeit worden nutriënten minder beschikbaar. Door toevoeging van NSP enzymen in voeder daalt de viscositeit in het verteringsstelsel, waardoor de nutriënten beter beschikbaar worden voor het dier. Om dit na te gaan worden viscositeitsmetingen uitgevoerd met behulp van de Haake viscosimeter VT 550 om na te gaan hoe de viscositeit verloopt in functie van de tijd na toevoeging van een NSP enzym aan het voeder. 7 In de literatuurstudie wordt het gebruik van enzymen in veevoeding beschreven. Hierbij wordt van ieder enzym het werkingsprincipe, productie en effect van toevoeging aan het voeder op dierniveau besproken. Daarnaast wordt ook nagegaan wat de wetgeving zegt omtrent enzymtoevoeging in veevoeding. Vervolgens wordt het productieproces van mengvoeder besproken, met in het bijzonder het pelletiseren. Hierbij wordt verduidelijkt wat de invloed is van dit proces op het voeder en op de enzymactiviteit. Tenslotte wordt nagegaan hoe de thermostabiliteit van enzymen verbeterd kan worden. In het tweede deel, materiaal en methoden, wordt van elk experiment beschreven hoe deze wordt uitgevoerd. Dit zowel voor de bepaling van de specifieke enzymactiviteit, het pelletiseren onder laboratoriumomstandigheden en het uitvoeren van viscositeitsmetingen. Het derde deel bevat de resultaten. In een eerste onderdeel wordt een ranking opgesteld van de beschikbare enzymen volgens specifieke enzymactiviteit, bepaald met eenzelfde methode bij een standaard pH. In een tweede onderdeel wordt de enzymstabiliteit van vijf fytasen en vijf NSP enzymen besproken. Ten slotte wordt de viscositeit in functie van de tijd besproken na toevoeging van NSP enzymen in meel en pellets. Het vierde deel omvat de discussie waarin conclusies en mogelijke verklaringen worden beschreven van de bekomen resultaten. Het laatste deel omvat het algemeen besluit waarin de belangrijkste bevindingen worden geformuleerd. 8 2 Gebruik van enzymen in veevoeding In dit hoofdstuk wordt besproken wat het belang is van enzymen in veevoeding. Daarnaast worden de niet-zetmeelpolysacharide (NZP) enzymen (glucanasen, xylanasen en mannanasen) en de fytasen besproken naargelang de inwerking op het substraat, de productie ervan en het effect van toevoeging aan voeder op dierniveau. Tenslotte wordt de wetgeving omtrent enzymen besproken. 2.1 Belang van enzymen in veevoeding Veevoeding bevat zetmeel, proteïnen, vetten en daarnaast antinutritionele factoren, zoals fytinezuur en NZP die de nutriëntenopname voor het dier limiteren. Fytinezuur bevindt zich binnenin de cel, bevat fosfor en heeft de capaciteit om te binden met andere nutriënten, wat de opname van die nutriënten reduceert. NZP bevinden zich in de celwand. De nutriëntenopname vermindert doordat oplosbare NZP voor een verhoging van de viscositeit in het verteringsstelsel van het dier zorgen. Bovendien vormen de onoplosbare NZP in de celwand een barrière voor de vrijstelling van nutriënten (Adeola & Cowieson, 2011; Barletta, 2010; Bedford et al., 2010; Nyachoti & Woyengo, 2010). Zetmeel, proteïnen en vetten kunnen door pluimvee en varkens worden afgebroken met hun eigen spijsverteringsstelsel, meer bepaald de enzymen amylasen, proteasen en lipasen. Dit in tegenstelling tot NZP en fytaat die intact blijven door een tekort aan bruikbare enzymen in het eigen verteringsstelsel (Adeola & Cowieson, 2011; Paloheimo et al., 2010). Door toevoeging van extra enzymen aan het dieet, worden de antinutritionele effecten gereduceerd en de beschikbaarheid van nutriënten bevorderd. Toevoeging van deze enzymen (fytasen en NZP enzymen) leidt dus tot een betere groei van het dier, hogere efficiëntie van nutriëntengebruik en minder excretie van voedingsstoffen. Tevens is de laatste jaren de kost van energie voor het voeder gestegen en is er een verhoogde vraag naar graanafgeleiden vanuit de biobrandstofindustrie. De vraag om de efficiëntie van de nutriënten te verhogen, leidt tot het gebruik van exogene enzymen (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford et al., 2014; Paloheimo et al., 2010; Ravindran & Selle, 2007). De veevoederenzymmarkt bestaat uit 50% fytase en 50% NZP enzymen (Paloheimo et al., 2010). 2.2 Niet-zetmeelpolysacharide enzymen De plantencelwand bestaat uit niet-zetmeelpolysachariden (NZP), lignine, proteïnen, vetzuren en wassen. De NZP zijn voor 70-90% aanwezig in de plantencelwand en zijn een diverse groep van moleculen die variëren in mate van wateroplosbaarheid, grootte en structuur (Knudsen, 2001). De NZP zijn de bouwstenen van de plantencelwand, waarvan de belangrijkste cellulose, arabinoxylanen en vertakte β-glucanen zijn. Lignine zorgt voor de binding en verankering van 9 deze bouwstenen. Hoofdzakelijk bestaat de celwand uit onoplosbare NZP en lignine, terwijl het endosperm meer oplosbare polysachariden bevat, zoals arabinoxylanen en onvertakte βglucanen (Knudsen, 2001). De plantencel werkt als een barrière voor de vrijstelling van nutriënten en verhoogt bovendien de viscositeit van de vloeibare fase wat absorptie van de nutriënten beperkt. Het merendeel van de NZP vertoont, wanneer ze opgelost zijn in water, een verhoging van de viscositeit. De viscositeit is afhankelijk van het moleculair gewicht en concentratie van het polymeer (Knudsen, 2001). In Tabel 1 staan de hoeveelheden weergegeven van de zetmeelpolysachariden voor verschillende granen en graanafgeleiden. belangrijkste niet- Tabel 1: hoeveelheden totaal NZP, β-glucaan, arabinoxylaan en β-mannaan in verschillende granen en graanafgeleiden (Bedford et al., 2010; Choct, 2011; Choct et al., 2010; Cowieson, 2005; Dexter & Izydorczyl, 2008; Knudsen, 2001; Meng & Slominski, 2005) graansoort totaal NZP ( %) β-glucaan (%) arabinoxylaan β-mannaan (%) (%) maïs gerst haver rijst tarwe rogge sorghum sojaboonmeel 7,6-9,7 18,7 23,2 4,6-8,6 11,9 15,2 0,2-4,6 17-27 0,1 2,5-11,3 2,2-7,8 1,2-2 0,4-1,4 0,9-1,1 0,1 0 0,1 5,8 2,7-3,5 2,6 5,8 3,4-5,5 1,8 2,6 0,2 0,49 0,30 0,10-0,30 0,10 0,69 0,09 1,61 2.2.1 β-glucanase 2.2.1.1 Substraat en werking van het enzym Het substraat β-glucaan is een oplosbaar, gemengd (1-3,1-4)-β-glucaan en komt voor in viskeuze granen, zoals gerst en haver. Vertakt β-glucaan is opgebouwd uit lineaire homopolymeren van β-ᴅ-glucopyranosylresiduen die meestal verbonden zijn via twee of drie achtereenvolgende β-(1,4)-verbindingen en gescheiden door een enkele β-(1,3)-verbinding. Onvertakt β-glucaan is wanneer de β-(1,3)-verbindingen losgerukt zijn uit de vertakte keten (Du Jardin et al., 2011; Paloheimo et al., 2010). β-glucanen vertonen in verschillende granen eenzelfde algemene moleculaire structuur. Ze vertonen variatie in de ratio β-(1,4)-verbindingen/ β-(1,3)-verbindingen van 3,2:1 tot 6,6:1 en in moleculaire grootte. β-glucaan van gerst bestaat uit lineaire ketens van 30% β-(1,3)verbindingen en 70% β-(1,4) verbindingen. Gerst en haver bevat een grote hoeveelheid βglucaan in vergelijking met andere graansoorten (Tabel 1). De lagere wateroplosbaarheid van β-glucaan is geassocieerd met een hoger moleculair gewicht en een grotere hoeveelheid β-(1,4)-verbindingen (Dexter & Izydorczyl, 2008; Du Jardin et al., 2011; Paloheimo et al., 10 2010). Het voorkomen van losgerukte β-(1,3)-verbindingen in β-glucaan maakt het meer oplosbaar in water (Knudsen, 2001). Degradatie van (1-3,1-4)-β-glucaan (Figuur 1) gebeurt door (1-3,1-4)-β-glucanase, βglucosidasen en β-glucaan exohydrolasen. Het (1-3,1-4)-β-glucanase knipt specifiek de (1-4)-verbindingen die zich bevinden aan het reducerende uiteinde van een (1-3)-β-glucosylresidu. Dit zorgt voor de vorming van oligosachariden die een variabel aantal (1-4)-β-glucosylresiduen hebben aan het nietreducerend uiteinde en één (1,3)-β-glucosylresidu aan het reducerende uiteinde. De (1-3,1-4)-β-glucanase zorgt voor de vrijstelling van meestal tri- en tetrasachariden, maar ook oligosachariden van 10 en meer eenheden kunnen voorkomen (Du Jardin et al., 2011). Figuur 1: schematische voorstelling van de inwerking van (1-3,1-4)-β-glucanase op (1-3,1-4)-β-glucaan. De horizontaal geordende zeshoeken stellen de 1,4-β- verbonden ᴅ-glucopyranosyl eenheden voor en de schuine lijn stelt de 1,3-βverbinding voor (Du Jardin et al., 2011) De (1-3,1-4)-β-ᴅ-oligosachariden kunnen verder worden gehydrolyseerd door de enzymen βglucosidasen en β-glucaan exohydrolasen, die glucose vrijstellen aan de niet-reducerende uiteinden van hun substraten (Du Jardin et al., 2011). β-glucanase wordt typisch gebruikt bij gerst en havergebaseerde diëten (Adeola & Cowieson, 2011; Aydin et al., 2008; Paloheimo et al., 2010). 2.2.1.2 Productie van het enzym β-glucanase β-glucanasen zijn hoofdzakelijk van fungale oorsprong. De belangrijkste hierbij is Trichoderma reesei. Dit β-glucanase heeft bij β-glucaan van gerst een optimum bij pH 5-7 en een optimale activiteit bij 65°C. Daarnaast zijn ook Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae en Humicola insolens bronnen voor het aanmaken van het enzym. β-glucanasen kunnen ook van bacteriële oorsprong zijn, bijvoorbeeld van de Bacillus species (Paloheimo et al., 2010). 2.2.1.3 Effect van toevoegen van β-glucanase op dierniveau Wateroplosbaar β-glucaan verhoogt de viscositeit in de darm, wat leidt tot een verminderde opname van nutriënten en dus een verminderde groeiprestatie. Tevens verhoogt de kans op “sticky droppings”. Sticky droppings doet zich voor bij gevogelte, voornamelijk bij de jonge 11 dieren en wordt omschreven als een ongewenste gummi-achtige consistentie van mest en wordt geassocieerd met gezondheidsproblemen (Aydin et al., 2008; Johnson & Miles, 2009). Door β-glucanasetoevoeging worden deze negatieve effecten geminimaliseerd daar βglucanase het β-glucaan hydrolyseert in kleinere fragmenten en dus de viscositeit in de darm verlaagt. Hierdoor verbetert de groei van het dier, de voederconversie ratio en wordt de opname van nutriënten bevorderd (Aydin et al., 2008). 2.2.2 Xylanase 2.2.2.1 Substraat en werking van het enzym Het substraat xylaan is een polymeer waarvan de hoofdketen bestaat uit ᴅ-xylose eenheden. Xylanen zijn voor 30-35% aanwezig in het celwandmateriaal van éénjarige planten, voornamelijk in tarwe en rogge (Tabel 1). Op de hoofdketen kunnen verschillende zijketens zijn aangebracht. Het xylaan in de celwanden van granen en grassen (éénjarige planten) is typisch arabinoxylaan (ook wel pentosaan genoemd) zowel in oplosbare als onoplosbare vorm (Adeola & Cowieson, 2011; Paloheimo et al., 2010). De hoofdketen van arabinoxylaan (Figuur 2) bestaat uit ᴅ-xylanopyranosyleenheden verbonden via 1,4-glycosidische bindingen. Op deze hoofdketen zijn α-Larabinofuranosylresiduen verbonden op positie O-3 of O-4 van een xylanopyranosylresidu. Bovendien kunnen ze gebonden zijn op positie O-2 en O-3 van een xylanopyranosylresidu (Dexter & Izydorczyl, 2008; Du Jardin et al., 2011). Figuur 2: structurele elementen in arabinoxylaan: links: ongesubstitueerd xylanopyranosylresidu, midden: gesubstitueerd xylanopyranosylresidu op positie O-2 en O-3, rechts: gesubstitueerd xylanopyranosylresidu op positie O-2 (Dexter & Izydorczyl, 2008) Arabinoxylanen kunnen wateroplosbaar of wateronoplosbaar zijn. De oplosbaarheid is afhankelijk van de graad van de ratio ᴅ-xylanopyranosyleenheden ten opzichte van Larabinofuranosylresiduen, vertakkingspatroon en verschil in moleculair gewicht. Een lange opeenvolging van onvertakte xyloseresiduen verlaagt de oplosbaarheid (Du Jardin et al., 2011). De degradatie (Figuur 3) gebeurt door het enzym endo β-(1-4)-xylanase dat de xylaanhoofdketen knipt op de 1-4-glycosidische bindingen wat resulteert in kleinere, vertakte xylo-oligosachariden. Voor volledige hydrolyse zijn er nog andere enzymen (hemicellulasen) nodig. De 1,4-β-ᴅ-xylosidase knipt xylobiose en xylo-oligosachariden in xylosemonomeren. 12 α-L-arabinofuranosidase knipt de vertakte arabinofuranosylresiduen af met het vrijkomen van L-arabinose (Du Jardin et al., 2011; Gao et al., 2008; Paloheimo et al., 2010). Figuur 3: schematische voorstelling van de enzymatische hydrolyse van arabinoxylaan (Du Jardin et al., 2011) Xylanase wordt aanbevolen bij tarwegebaseerde diëten (Gao et al., 2008; Paloheimo et al., 2010). 2.2.2.2 Productie van het enzym xylanase Xylanasen in commerciële voederpreparaties zijn afgeleid van bacteriën en schimmels. De bacterie Bacillus en de schimmels Aspergillus, Humicola, Penicillium en Trichoderma worden gebruikt. De meeste microbiële xylanasen werken bij mesofiel temperatuursbereik (40–60°C) en bij een lichtzure of normale pH (4-6). In het algemeen zijn de fungale xylanasen beter bestand tegen zure condities in vergelijking met de bacteriële xylanasen. Sommige xylanasen afgeleid van thermofiele Bacillus species zijn stabiel bij hoge temperaturen (Paloheimo et al., 2010). 2.2.2.3 Effect van toevoegen van xylanase op dierniveau Viskeuze granen worden geassocieerd met een verhoogde viscositeit in de darm door de aanwezigheid van oplosbare arabinoxylanen die grote hoeveelheden water vasthouden. Door deze verhoogde viscositeit wordt de interactie tussen substraat en verteerbare enzymen belemmerd. Bovendien wordt ook de absorptie van nutriënten verhinderd. Hierdoor wordt de efficiëntie van de voederconversie en de groei van het dier gereduceerd en verhoogt bovendien de kans van opstopping in de darm. De hoge viscositeit in de darm vertraagt de passage van de verteerbare massa wat de microbiële balans in de darm verandert. Dit doordat de zuurstofspanning in de dunne darm daalt en hierdoor een relatief stabiele omgeving ontstaat. Hier kunnen zich fermentatieve microflora vestigen met de productie van vluchtige vetzuren en melkzuur, gepaard gaande met een verlaging van de pH (Gao et al., 2008; Paloheimo et al., 2010). Xylanasetoevoeging verlaagt de viscositeit van de verteerbare massa waardoor de nutriëntverteerbaarheid verhoogt en resulteert in een betere groeiprestatie van het dier, voederconversie ratio en gewichtstoename. Xylanase knipt de lange keten in kleinere fragmenten. De geknipte fragmenten hebben een laag moleculair gewicht wat resulteert in 13 een lagere viscositeit. Dit in tegenstelling tot hoog moleculair gewicht oplosbare arabinoxylanen die verantwoordelijk zijn voor een verhoging van de viscositeit. Daarnaast beïnvloedt de xylanasetoevoeging de microbiële populatie in de darm door de fermentatie in de dunne darm te inhiberen, met als gevolg een hogere pH-waarde in de darm. Tevens hebben xylanasen een positieve invloed op het prebiotisch effect. Door de degradatie van de celwand van de plant worden oligosachariden vrijgesteld. Deze worden niet gedegradeerd in het spijsverteringsstelsel en komen in het darmkanaal terecht waar ze werken als prebiotica (Gao et al., 2008; Paloheimo et al., 2010). Een combinatie van xylanase en β-glucanase is veelvoorkomend in voeder. De ratio arabinoxylaan tot β-glucaan varieert van 1:3 voor gerst tot 10:1 voor tarwe en triticale (Paloheimo et al., 2010). 2.2.3 β-mannanase 2.2.3.1 Substraat en werking van het enzym Het substraat mannaan is een polymeer waarvan de hoofdketen bestaat uit ᴅ-mannose eenheden. De hoofdketen kan verschillende zijketens bevatten. Ten eerste met enkel ᴅglucose, glucomannaan; ten tweede met enkel ᴅ-galactose, galactomannaan en ten derde met ᴅ-galactose en ᴅ-glucose, galactoglucomannaan (Chauhan et al., 2012; Jackson, 2010; Paloheimo et al., 2010). β-mannanen zijn viskeuze polysachariden en komen voor in soja, palmpitmeel, kokosnootmeel en sesammeel (Tabel 1) (Cao et al., 2010; Jackson, 2010). β-mannanase (1,4-β-ᴅ-mannohydrolase) is een endo-enzym dat de interne glycosidische bindingen willekeurig knipt in de hoofdketen, waardoor korte β-1,4-manno-oligosachariden ontstaan. Het enzym β-mannosidase knipt aan de uiteinden van de oligosachariden en stelt hierbij mannose vrij. Daarnaast knipt het enzym het mannobiose in twee waarbij mannose wordt vrijgesteld. Het wegknippen van de zijgroepen glucose en/of galactose vereist bijkomende enzymen. β-glucosidase knipt de 1,4-glucopyranose eenheden weg van glucomannaan en galactoglucomannaan. Het enzym α-galactosidase knipt de α-(1,6) gebonden ᴅ-galactopyranosyl eenheden weg van de hoofdketen, terwijl acetylmannanesterase de acetylgroepen verwijdert van galactoglucomannaan (Chauhan et al., 2012). 2.2.3.2 Productie van het enzym β-mannanase β-mannanase kan geproduceerd worden door schimmels en grampositieve bacteriën, zoals Bacillus species. De meest gebruikte groep zijn de schimmels, zoals Aspergillus, Penicillium en Trichoderma. De optimum pH voor activiteit voor de meeste bacteriële mannanasen bevindt zich in een neutraal bereik, voor de fungale mannanasen is dit een zuur bereik. Microbiële mannanasen werken bij verschillende temperaturen, van 37°C tot 70°C. In het 14 algemeen zijn bacteriële mannanasen meer thermostabiel dan fungale mannanasen (Chauhan et al., 2012). 2.2.3.3 Effect van toevoegen van β-mannanase op dierniveau β-mannaan is een viskeus polysacharide, wat de opname van nutriënten in het darmkanaal verhindert. Dit heeft tot gevolg een verminderde groei van het dier en een groter voedergewicht ratio. Daarnaast weerhoudt β-galactomannaan de insulinesecretie in het varken en suggereert een schadelijk effect op het energiemetabolisme, door een verminderde opname van glucose en water (Cao et al., 2010; Jackson, 2010). Toevoeging van β-mannanase heeft een gunstig effect op het energiemetabolisme, dit door een verhoogde stimulatie van de insulinesecretie en een betere glucoseabsorptie. Doordat het enzym willekeurig knipt in de hoofdketen, worden meer oplosbare en kleinere polysachariden gevormd. Deze doen de viscositeit dalen, wat zorgt voor een betere opname van de nutriënten (Chauhan et al., 2012; Jackson, 2010). 2.3 Fytase 2.3.1 Substraat en werking van het enzym Het substraat fytaat wordt zowel omschreven als een antinutritionele factor en als een onverteerbaar nutriënt voor niet-herkauwers. Dit doordat het enerzijds complexen aangaat met metalen en anderzijds fytaatgebonden fosfor niet beschikbaar is voor het dier waardoor onverteerbaar fosfor terecht komt in de omgeving. Om fosfor beschikbaar te maken voor het dier, wordt enerzijds gebruik gemaakt van microbiële fytasen die fytaatgebonden fosfor vrijstellen en tevens de fosforexcretie reduceren of anderzijds door anorganische fosforbronnen toe te voegen aan het dieet, zoals dicalciumfosfaat (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford et al., 2010; Ravindran & Selle, 2007). Fytaat bevindt zich in planten, daar het als fosforreservoir dient voor de zaadkieming, zoals maïs, tarwe, gerst, sorghum, sojaboon, rijstzemelen, raapzaad, koolzaad en katoenzaad. Fytaat (myo-inositolhexafosfaat, IP6) bestaat uit een myo-inositolring van zes koolstofatomen waarop zes fosfaatgroepen gebonden staan (Figuur 4). Het is een polyanionische molecule waardoor het complexen kan vormen met positief geladen nutriënten, meer bepaald met tweewaardige kationen zoals magnesium, ijzer, zink, koper en calcium. Deze binding van een tweewaardig kation kan plaatsvinden binnen 1 fytaatmolecule of tussen twee fytaatmoleculen. Deze complexvorming zorgt voor een slechte absorptie van de gebonden metalen in de dunne darm (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford et al., 2010; Lei & Porres, 2003; Ravindran & Selle, 2007). 15 Figuur 4:hydrolyse van fytaat door fytase in inositol, fosfaat en tweewaardige kationen (Lei & Porres, 2003) Voedergerelateerde fytasen worden ingedeeld in 2 subklassen, dit afhankelijk van de plaats waar de hydrolyse start op de koolstofring van inositol. Het enzym 3-fytase start de splitsing van de fosfaatgroep op C3, terwijl het enzym 6-fytase de splitsing van de fosfaatgroep start op C6. De enzymatische hydrolyse (Figuur 4) zet zich daarna voort en produceert telkens een lager myo-inositolfosfaatester en stelt hierbij één fosfaatgroep vrij. De hydrolyse van fytaat door fytase kan vijf anorganische fosfaatgroepen vrijstellen en myoinositolmonofosfaat (IP1). De fosfaatgroep gebonden aan het C2-atoom in de myoinositolring is axiaal georiënteerd en weerspannig aan de hydrolyse, waardoor het niet te degraderen is door het microbieel fytase. Bijgevolg zal de hydrolyse van fytaat door fytase resulteren in myo-inositol monofosfaat (IP1) en vijf anorganische fosfaatgroepen. De hydrolyse van fytaat door fytase zal niet altijd leiden tot deze grootte van afbraak (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford et al., 2010; Lei & Porres, 2003; Ravindran & Selle, 2007). Daarnaast kan fytaatdegradatie beïnvloed worden door plantfytase in gerst, rijst, triticale en tarwe. De activiteit van plantfytase is echter minder effectief dan microbieel fytase. Dit is te wijten aan hun nauwer pH optimum gebied (5-6) en hun grotere gevoeligheid aan proteolytische vertering. Het plantfytase, dat een 6-fytase is, is ook meer hittelabiel waardoor de activiteit zal gereduceerd of geëlimineerd worden tijdens het pelletiseren (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford et al., 2010; Nyachoti & Woyengo, 2010 ; Ravindran & Selle, 2007). 2.3.2 Productie van het enzym fytase De 3-fytasen zijn afgeleid van Aspergillus Niger. De 6-fytasen zijn afgeleid van E. coli en Peniophora lycii (Bedford et al., 2010; Ravindran & Selle, 2007). De meeste fytasen hebben hun pH optimum binnen het gebied 4,5-6. De temperatuur optimum van de meeste plant en microbiële fytasen is binnen het gebied van 45-60°C (Lei & Porres, 2003). 16 2.3.3 Effect van toevoegen van fytase op dierniveau Fytaat is een polyanionische molecule waardoor het een onoplosbare neerslag kan vormen in de dunne darm met tweewaardige kationen, zoals Ca2+, Zn2+, Fe2+ en Cu2+. Door deze complexvorming is de beschikbaarheid van deze mineralen en van het fosfor gereduceerd (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford et al., 2010). Toevoeging van fytase vergroot de beschikbaarheid voor opname van deze nutriënten en fosfor daar het fytaat wordt gedefosforyliseerd in het verteringsstelsel. Doordat standaard slechts een beperkte hoeveelheid fytase wordt toegevoegd aan het voeder en de inwerktijd vrij kort is, zal het toegevoegd fytase niet alles kunnen omzetten naar myo-inositol monofosfaat. Er zal dus ook steeds ophoping zijn van IP5, IP4, IP3 en IP2, die nog steeds met mineralen een complex kunnen vormen (Adeola & Cowieson, 2011; Ravindran, 2007). 2.4 Wetgeving omtrent voederenzymen Volgens de Europese wetgeving behoren enzymen tot toevoegingsmiddelen. Toevoegingsmiddelen zijn stoffen, micro-organismen of preparaten die vanwege een specifieke functie opzettelijk aan diervoeder of water worden toegevoegd. Het kan gaan om het gunstig beïnvloeden van het milieueffect, de opbrengst van dierlijke productie of van dierenwelzijn (Veevoederadditieven en -contaminanten, 2015). In de Europese Unie dienen voederenzymen goedgekeurd te zijn onder richtlijn EC 1831/2003. Het doel van deze richtlijn is verzekeren dat voederenzymen veilig zijn voor het dier, veilig voor degene die betrokken is bij manipulatie en voor de consument (Barletta, 2010). Alle toegelaten enzymen staan in het Europees register van toegelaten additieven in de lijst “European Union-Register of feed additives”. Hierin kan men onder andere terugvinden dat het enzym xylanase mag gebruikt worden afkomstig van Aspergillus oryzae, Aspergillus Niger, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma koningii, Trichoderma viride, Penicillium funiculosum, Bacillus subtilis. Daarbij staat telkens weergegeven voor welke diergroep deze geschikt is (Richtlijn, 12 mei 2014). Volgens de Europese wetgeving zijn de specifieke etiketteringsvoorschriften voor enzymen de volgende: De specifieke benaming van het actieve bestanddeel volgens zijn enzymatische werking is overeenkomstig de verleende vergunning. Daarnaast dient het International Union of Biochemistry (IUB) identificatienummer vermeld te staan. Voor activiteiten die nog niet zijn opgenomen, moet een systematische naam worden gebruikt overeenkomstig de nomenclatuurregels van de IUB. Triviale namen kunnen worden aanvaard voor zover zij ondubbelzinnig zijn, in het hele dossier op consistente wijze worden gebruikt en bij de eerste vermelding duidelijk in verband kunnen worden gebracht met de systematische naam en het IUB-nummer. 17 Men dient ook het aantal activiteitseenheden weer te geven. Tevens moeten relevante nevenactiviteiten worden vermeld. De activiteitseenheden moeten worden gedefinieerd, bij voorkeur als μmol product dat per minuut uit het substraat vrijkomt, met vermelding van pH en temperatuur. Tenslotte moet van elke enzymactiviteit de biologische herkomst worden vermeld (E.G., 22 september 2003, bijlage 3; E.G., 25 april 2008, § 2.1.3, §2.2.1.1). 18 3 Pelletiseren In dit hoofdstuk wordt kort het proces van pelletiseren beschreven en de invloed ervan op voedercomponenten, met in het bijzonder de enzymen. Daarnaast wordt besproken hoe de enzymstabiliteit in pellets verbeterd kan worden. 3.1 Inleiding Tijdens het pelletiseren gaan kleine voederpartikels samenklonteren tot grotere voederpartikels onder de vorm van pellets. Dit gebeurt met behulp van mechanische druk, vocht en warmte (Abdollahi et al., 2013). Door het gebruik van pellets vergroot de voederopname van het dier wat resulteert in een betere groeiprestatie en voederefficiëntie. Dit wordt onder andere toegeschreven aan een verbeterde zetmeelverteerbaarheid, verhoogde nutriënteninname en een verminderd voederverlies (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011). 3.2 Verschillende stappen van het pelletiseerproces 3.2.1 Vermalen Voordat de grondstoffen tot pellets worden gemaakt, dienen ze eerst vermalen te worden. Het verkleinen van de partikels gebeurt hoofdzakelijk met een hamermolen maar kan ook door middel van walsen. Tijdens het vermalen wordt de zaadhuid en de celwand van de graankorrel gescheurd, waardoor de partikelgrootte verkleint en nutriënten beter beschikbaar worden in het spijsverteringsstelsel van het dier. Daarnaast verbetert het vermalen het mengvermogen, de homogeniteit en wordt het persen vergemakkelijkt (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011). Na het vermalen van de grondstoffen wordt een meel bekomen, met een vochtgehalte van ongeveer 12%. Dit meel wordt naar de conditioner geleid (Abdollahi et al., 2013). 3.2.2 Conditioneren Conditioneren is de meest kritische stap in de fabricage van pellets. Tijdens deze stap worden warmte en vocht toegediend aan het meel. Het is van belang dat een juiste balans wordt verkregen tussen warmte en vocht. Dit kan bereikt worden door het toepassen van stoom onder druk. De stoom zorgt ervoor dat vocht en warmte-energie aan het meel worden toegediend. Het vocht dat zich verdeelt tijdens het conditioneren, zorgt voor de binding tussen de partikels onderling via capillaire sorptie. Deze binding is als “lijm” die zorgt voor de agglomeratie tijdens het persen. Bovendien zorgt het vocht voor een gemakkelijke doorvoer in de matrijs (Abdollahi et al., 2013; Cooney & Gilbert, 2011; Froetschner, 2006). Er worden procestemperaturen gebruikt van 80-90°C die tevens eventueel Salmonella en Campylobacter onderdrukken. Daarnaast is de warmte-energie van belang voor een uniform 19 transport van het vocht naar het centrum van de meelpartikels (Brinch-Pedersen et al., 2007; Cooney & Gilbert, 2011). Het is belangrijk dat de gebruikte stoom zuiver en vrij van overmaat aan condensaat is. Condensaat is vocht in stoom dat gecondenseerd is vanuit de dampfase. Het gecondenseerd vocht dat wordt blootgesteld aan het meel, zal niet zo effectief worden geabsorbeerd als vocht dat zich in de dampfase bevindt. Het is dus belangrijk om zoveel mogelijk condensaat te vermijden uit stoom (Froetschner, 2006). Retentietijden van het meel in de conditioner variëren van 10 tot 90 seconden en de stoomdruk varieert tussen 1 tot 5 bar, dit afhankelijk van het type conditioner en de temperaturen die men wil bereiken. Langere retentietijden zorgen voor een uniformere vochtpenetratie en warmteoverdracht. Er wordt gestreefd naar een maximaal vochtgehalte van 16,5 tot 17% in het geconditioneerd meel (Abdollahi et al., 2013; Cooney & Gilbert, 2011; Froetschner, 2006). 3.2.3 Persen Tijdens het persen wordt het meel vanuit de conditioner, met een vochtgehalte van 16,5-17% en temperatuur 80-90°C, door een matrijs gestuurd waaruit pellets verkregen worden. De praktijk leert dat men vaker bij lagere temperaturen werkt (Abdollahi et al., 2013; Cooney & Gilbert, 2011; Froetschner, 2006). Het geconditioneerde meel wordt aangevoerd naar de pers via een vijzel. Het meel valt vervolgens tussen de rol en de matrijs (Figuur 5). De matrijs is voorzien van boringen met een zekere diameter en lengte, die perskanalen genoemd worden. Doordat de rol met een hoge snelheid over de matrijs rolt, wordt het meel door de perskanalen geduwd. De uit de matrijs geperste meelprop breekt af onder invloed van zijn eigen gewicht of wordt afgesneden aan de buitenkant van de matrijs door één of meerdere regelbare messen (Amerah et al., 2011; Eeckhout, 2015). I: niet-gepelletiseerd materiaal II: pellets geëxtrudeerd door de matrijs III: pelletmessen Figuur 5: schematische voorstelling van het principe van persen (Eeckhout, 2015) 20 In de matrijs wordt wrijving (frictiekracht) gegenereerd en zorgt voor een temperatuursstijging. De temperatuur stijgt met 3-6°C ten opzichte van de doeltemperatuur. Wanneer de matrijs slijtage kent of verouderd is, kan de temperatuursstijging 2 tot 3 keer zo hoog oplopen (Cooney, 2010; Cooney & Gilbert, 2011). 3.2.4 Koel- en droogstap Nadat de pellets gevormd zijn, volgt er een koel- en droogstap. Dit heeft tot doel het vochtgehalte van de korrel te doen dalen naar 14%. Daarnaast zal de temperatuur van de pellets dalen tot omgevingstemperatuur en zullen ze harden (Eeckhout, 2015). De koel- en droogstap kan door middel van een koude luchtstroom. Een te hoge luchtsnelheid leidt vaak tot een uitdroging van het pelletoppervlak, waardoor de vochtmigratie uit de kern afneemt en een te hoog vochtgehalte overblijft binnenin de korrel. Deze verschillen creëren spanningen in de pellet en veroorzaken breuk in de buitenste laag en dus een verminderde kwaliteit (Abdollahi et al., 2013; Eeckhout, 2015). 3.2.5 Nabehandeling Eventueel kan er nog een nabehandeling volgen zoals nazeven of verkruimelen. Het nazeven verwijdert het meel uit de pellets waardoor een homogeen product wordt verkregen (Eeckhout, 2015). De gevormde pellets kunnen verkruimeld worden om een gewenste grootte te verkrijgen. Dit kan door middel van brekerswalsen (Eeckhout, 2015). 3.3 Chemische en fysische veranderingen ten gevolge van het pelletiseerproces Chemische en fysische veranderingen treden op als gevolg van hitte, vocht en mechanische druk tijdens het conditioneren en persen. De veranderingen kunnen zowel voordelig als nadelig zijn voor de voedercomponenten. Deze zullen effect hebben op de nutriëntenbeschikbaarheid en verteerbaarheid (Abdollahi et al., 2013). 3.3.1 Invloed op zetmeel Zetmeel is een belangrijke energiebron en komt voor als wateronoplosbare korrels in granen. Zetmeelkorrels zwellen in waterig milieu en is een reversibel proces. Wanneer de zwelling zich voordoet bij een verhoogde temperatuur wordt het proces irreversibel. Dit proces wordt gelatinisatie genoemd en treedt op bij een temperatuur van 45-90°C, afhankelijk van de zetmeelbron en het vochtgehalte. Zowel warmte en vocht zijn vereisten voor de gelatinisatie. Een gedeelte van deze gelatinisatie vindt plaats tijdens het stoomconditioneren, maar het merendeel tijdens het persen. Tijdens het persen zorgt de frictiewarmte, die geproduceerd wordt in de matrijs, voor een aanzienlijk deel van de gelatinisatie (Abdollahi et al., 2013; Eeckhout, 2015). 21 Indien tijdens de processing langere perskanalen in de matrijs worden gebruikt, wordt de frictiewarmte groter. Daar een grotere frictiewarmte voor meer zetmeelgelatinisatie zorgt, is er een grotere binding tussen de voederpartikels (Abdollahi et al., 2013). De zetmeelgelatinisatie staat in voor de bindingseigenschappen binnen de pellet en zorgt voor een betere beschikbaarheid en verteerbaarheid. Bovendien wordt de granulaire structuur tijdens de gelatinisatie geopend en kan deze worden aangetast door enzymen (Abdollahi et al., 2013; Eeckhout, 2015). 3.3.2 Invloed op proteïnen Hitte tijdens het pelletiseerproces zal proteïnen denatureren, daar dit hittegevoelige structuren zijn. Denaturatie is het verbreken en ontvouwen van de driedimensionale structuur, wat de functionaliteit van het proteïne kan aantasten. Bovendien zullen proteïnegerelateerde enzyminhibitoren (zoals trypsine en α-amylase) worden geïnactiveerd, wat de verteerbaarheid van de proteïnen verbeterd (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011). 3.3.3 Invloed op viscositeit van het voeder in het verteringsstelsel Door het pelletiseren neemt de viscositeit van het voeder in het verteringsstelsel toe (Abdollahi et al., 2013; Cowieson et al., 2005). Er wordt een hogere viscositeit waargenomen wanneer gevoederd wordt met pellets in tegenstelling tot meel. Wanneer de conditioneertemperatuur toeneemt van 70 tot 95°C in zowel een dieet met als zonder enzymtoevoeging, wordt een verhoging van de viscositeit waargenomen met stijgende temperatuur. De toename in viscositeit is groter voor het voeder zonder enzymtoevoeging dan het voeder met enzymtoevoeging (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011). De verhoging van de viscositeit bij pellets is te verklaren daar de concentratie oplosbare NZP toeneemt en/of door veranderingen in moleculair gewicht van de NZP, zetmeelgelatinisatie en eventueel degradatie van enzymen. De oplosbaarheid van NZP verhoogt, doordat NZP worden vrijgesteld die eerder ingesloten zaten in de cel waardoor meer oplosbare vezels ontstaan. Daar een deel van de NZP een hoog moleculair gewicht hebben, lossen deze op in het verteringsstelsel en zorgen voor een verhoging van de viscositeit (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011; Cowieson et al., 2005). 3.3.4 Invloed op enzymen De werkzaamheid van exogene en endogene enzymen kan beïnvloed worden tijdens de productie van pellets (Amerah et al., 2011). Voeders bevatten vaak endogene en microbiële enzymen. De endogene en exogene enzymen zijn vaak onvoldoende stabiel voor de procesomstandigheden tijdens het pelletiseren. Aangezien enzymen proteïnen zijn, zijn deze vatbaar voor denaturatie. De grootte van deze inactivatie is afhankelijk van de pelletiseercondities. De processtappen 22 conditioneren, persen en koelen hebben een invloed op de enzymstabiliteit (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011; Cowieson et al., 2005). De meeste inactivatie vindt plaats tijdens het stoomconditioneren en in mindere mate tijdens het persen. Tijdens het conditioneren wordt stoom toegevoegd aan het meel, waarbij enzymen water opnemen. Hoe hoger het opgenomen vochtgehalte, hoe makkelijker de warmteconductiviteit. Hierdoor zal de thermostabiliteit van het enzym dalen. Hogere temperaturen en langere retentietijden tijdens het stoomconditioneren resulteren in een grotere inactivatie van enzymen (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011; Davie et al., 2007). 3.3.4.1 Invloed op NZP enzymen Volgens Cowieson et al. (2005) is de stabiliteit van de exogene xylanase-activiteit bij verschillende conditioneertemperaturen goed. Het exogeen xylanase wordt in twee voeders toegevoegd voor vleeskuikens met een dosis van 2000 U/g, een starter voeder en een finisher voeder. Elk voeder wordt verdeeld in drie batches en elke batch wordt geconditioneerd bij respectievelijk 80, 85 en 90°C en geperst. In Tabel 2 staat de hoeveelheid enzymactiviteit (in U/g) weergegeven van het gepelletiseerd voeder voor de drie temperaturen met telkens het behoud van activiteit. Tabel 2: bepaalde xylanase-activiteit in starter en finisher voeder bij verschillende pelletiseertemperaturen met telkens het behoud aan activiteit (Cowieson et al., 2005) Procestemperatuur Xylanase-activiteit (U/g) in starter voeder Xylanase-activiteit (U/g) in finisher voeder Behoud van activiteit t.o.v. 2000 U/g (%) 80°C + xylanase 85°C + xylanase 90°C + xylanase 2020 2124 1499 2031 1438 1432 101 89 73 Wanneer deze waarden worden vergeleken met de werkelijk toegevoegde dosis van 2000 U/g, wordt een behoud van activiteit bekomen van 101, 89 en 73% bij conditioneertemperaturen van respectievelijk 80, 85 en 90°C (Cowieson et al., 2005). Wanneer procestemperaturen van 80°C worden overschreden, verliezen NZP enzymen aan activiteit (Amerah et al., 2011; Cooney & Gilbert, 2011). 3.3.4.2 Invloed op fytasen In Tabel 3 worden twee productie-eenheden weergegeven met elk een verschillende conditioneertemperatuur, productie-eenheid A bij 67°C en productie-eenheid B bij 70°C. Hierbij wordt nagegaan wat de invloed is van het pelletiseerproces op endogene fytaseactiviteit (Davie et al., 2007). 23 Tabel 3: endogene fytasen-activiteit (U/g) voor (meel) en na pelletiseren (pellet) in twee verschillende productieeenheden (Davie et al., 2007). Productie-eenheid meel pellet Verlies van activiteit (%) A (67°C) B (70°C) 450,8 287 186,6 164,5 58,5 42,5 Verlies aan endogene fytase-activiteit wordt waargenomen bij beide productie-eenheden (Davie et al., 2007). Er worden aanzienlijke hoeveelheden endogene fytase-activiteit verloren wanneer procestemperaturen van 60°C en meer worden bereikt. De optimum temperatuur voor plantfytase is 50-55°C (Nyachoti & Woyengo, 2010). In Tabel 4 wordt de activiteit van twee commerciële fytasen zonder hittebehandeling en bij een hittebehandeling bij 60 en 70°C weergegeven met telkens het behoud van activiteit (Davie et al., 2007). Tabel 4: het effect van de conditioneertemperatuur op fytase-activiteit (U/g) voor twee commerciële fytasen (Davie et al., 2007) enzym Activiteit zonder hittebehandeling in (U/g) Activiteit bij 60°C in (U/g) Behoud activiteit bij 60°C (%) Activiteit bij 70°C in (U/g) Behoud activiteit bij 70°C (%) Fytase A Fytase B 2478± 43,1 3603± 12,7 1793± 28,4 3225± 61,3 72,4 89,5 481± 14,2 1659± 51,2 19,4 46,0 Beide commerciële fytasen vertonen het laagste behoud van activiteit bij 70°C (Davie et al., 2007). Fytasen vertonen van nature minder thermotolerantie dan de meeste vezeldegraderende enzymen. De meeste plantfytasen en microbiële fytasen beginnen hun activiteit te verliezen rond 55-60°C (Brinch-Pedersen et al., 2007; Cooney & Gilbert, 2011). Wanneer procestemperaturen van 70°C worden overschreden, verliezen exogene fytasen significante hoeveelheden aan activiteit (Amerah et al., 2011; Cooney & Gilbert, 2011). 3.4 Verbeteren van de enzymstabiliteit in pellets De lage hittestabiliteit van commerciële enzymen vormt een probleem tijdens het pelletiseren. Er zijn verschillende toepassingen om dit te verbeteren (Davie et al., 2007): overdosage van het enzym in voeder (Lamichhane et al., 2015) gebruik van vloeibare enzymen na pelletiseren (Amerah et al., 2011) thermostabiliteit van het enzym verbeteren door coaten, genetisch manipuleren of ontdekken van thermostabiele enzymen (Amerah et al., 2011) Het coaten en genetisch manipuleren van enzymen zijn de meest gebruikte technieken (Abdollahi et al., 2013; Amerah et al., 2011). 24 3.4.1 Overdosage Enzymen worden overgedoseerd in het voeder om verlies tijdens processing, distributie en opslag te compenseren. Overdosage is een eenvoudige, maar wel dure aangelegenheid (Lamichhane et al., 2015). 3.4.2 Vloeibare enzymen na pelletiseren Vloeibare enzymen worden over de pellets gesproeid direct na pelletiseren. Deze toepassing verzekert dat het toegevoegde enzym niet meer wordt blootgesteld aan hoge procestemperaturen (Amerah et al., 2011; Cooney & Gilbert, 2011). De toepassing moet verzekeren dat iedere pellet voldoende besproeid is met enzym. Een kritische factor is dan ook de monitoring en controle van de enzymvloeistof en flowsnelheid van het voeder. Enzymproducten dienen vaak in kleine dosages te worden toegediend. Om ervoor te zorgen dat alle pellets gecoat worden met enzym, wordt water toegevoegd aan de vloeibare enzymen en dit ter hoogte van de sproeikop. Op die manier kan er meer vloeistof gesproeid worden over de pellets zodat de coatingefficiëntie verhoogt en alle pellets gecoat zijn met enzym (Cooney, 2010; Cooney & Gilbert, 2011). Het gebruik van vloeibare enzymen is een complexe en dure procedure, daar deze toepassing speciale apparatuur vereist. Bovendien geeft deze toepassing geen garantie dat het de gewenste enzymactiviteit zal opleveren. Dit doordat het enzym zich op het oppervlak van de pellet bevindt en dus kwetsbaarder is dan de endogene en/of microbiële enzymen die toegevoegd zijn voor het pelletiseren en zich binnenin de korrel bevinden (Amerah et al., 2011; Davie et al., 2007). 3.4.3 Verbeteren van de thermostabiliteit van enzymen De thermostabiliteit van een enzym kan verbeterd worden door coaten, genetisch manipuleren of het ontdekken van thermostabiele enzymen (Amerah et al., 2011). Een nadeel van thermostabiele enzymen is dat ze meestal een lage activiteit hebben bij omgevingstemperatuur, wat geassocieerd is met een grote rigiditeit en dus een verminderde flexibiliteit van het enzym. Om de thermostabiliteit van exogene enzymen te verbeteren, dient een ideaal voederenzym aan een aantal karakteristieken te voldoen (Amerah et al., 2011; Brinch-Pedersen et al., 2007; Cooney & Gilbert, 2011): Een hoge specifieke activiteit per unit Een goede thermostabiliteit tijdens processing Een hoge activiteit in de pH range van de maag van het dier Resistent tegen maagproteasen Goede stabiliteit onder omgevingstemperatuur 25 3.4.3.1 Coaten 3.4.3.1.1 Coaten van het droge enzym (gegranuleerd enzym) Het gebruik van droge enzymen is een geprefereerde optie. Een belangrijk voordeel is het gemak waarmee het droge enzym aan het voeder wordt toegevoegd dit via een premix, handmatig of via automatisering (Cooney, 2010; Cooney & Gilbert, 2011). Coaten verbetert de thermotolerantie van een enzym. Een ideale coating dient het enzym te beschermen tijdens processing, maar dient het enzym ook snel vrij te stellen wanneer het in het verteringsstelsel van het dier terechtkomt (Amerah et al., 2011). Door het coaten van het droge enzym is het beschermt tegen hitte en vocht die gegenereerd worden tijdens het proces. Bovendien mag de efficiëntie in het dier niet tegengegaan worden door een ondoordringbare coating. De coating moet tevens de inhoud vrijlaten in de darm bij een verlaagde temperatuur en een verhoogd vochtgehalte. Een gecoat enzym zorgt voor een vertraagde vrijstelling van het enzym in het verteringsstelsel in vergelijking met een ongecoat enzym (Amerah et al., 2011; Bedford, 2008; Cooney, 2010). De meest evidente methode is door gebruik te maken van een omhulling, namelijk een hydrofobe coat, zoals polyolen, carbohydraten en lipiden. Hierdoor wordt het enzym minder blootgesteld aan vocht en zal het beter hogere temperaturen verdragen dan een enzym zonder coating (Adeola & Cowieson, 2011; Bedford, 2008). In Figuur 6 wordt een schematische voorstelling weergegeven van het coaten van een enzym. Figuur 6: schematische voorstelling van twee types van coaten van enzymen (Cooney, 2010) 3.4.3.1.2 Vacuüm coaten van pellets Vacuüm coaten is een vorm van post pelleting additie. Het gebeurt op pellets en vervangt de lucht binnenin de pellet door een vloeistof. Om deze methode toe te passen, is het belangrijk dat de pellet voldoende porositeit bevat om zo voldoende plaats te voorzien voor de insluiting van enzymvloeistof (Lamichhane et al., 2015). De pellets bekomen uit de matrijs met een temperatuur van ongeveer 70°C worden in de vacuümkamer geplaatst (Figuur 7). Daar wordt de lucht uit de poriën verwijderd door een vacuüm te creëren. De enzymvloeistof wordt dan via sproeikoppen over de pellets gesproeid en de vacuümdruk wordt losgelaten waardoor de enzymvloeistof in de poriën wordt 26 aangetrokken. Vervolgens worden de pellets met de enzymvloeistof naar de koeler gestuurd (Lamichhane et al., 2015). Figuur 7: schematische voorstelling van het principe van vacuüm coaten (Lamichhane et al., 2015) 3.4.3.2 Genetisch manipuleren van enzymen Door het genetisch manipuleren van een enzym wordt een thermostabiel enzym bekomen. Dit gebeurt meestal door veranderingen aan te brengen in de aminozuurstructuur. Het dient zorgvuldig te gebeuren zodat de actieve plaats van het enzym niet beschadigd wordt, anders kan dit de werkzaamheid van het enzym verminderen (Amerah et al., 2011; Cooney & Gilbert, 2011). Genetische manipulatie heeft reeds de thermostabiliteit van enzymen verhoogd. Wijzigingen aan een wildtype enzym leidt tot een verbeterde thermostabiliteit voor NZP degraderende enzymen bij procestemperaturen van 90-95°C (Amerah et al., 2011). 3.4.3.3 Ontdekken van thermostabiele enzymen Er werden reeds thermostabiele xylanasen en β-glucanen ontdekt, zoals deze van het metagenoom van de Avachinsky krater in Kamchatka (Rusland) (Angelov et al., 2013). 27 4 Materiaal en methoden 4.1 Proefopzet Er is een grote verscheidenheid in eenheden tussen de verschillende leveranciers om enzymactiviteit uit te drukken. De verscheidenheid in eenheden wijst erop dat er verschillende methoden worden gebruikt om enzymactiviteit te bepalen, waardoor het moeilijk is de verschillende enzymen te vergelijken op basis van activiteit. Daarom wordt in een eerste fase de specifieke enzymactiviteit (U/g) bepaald met eenzelfde methode bij standaard pH. Op die manier wordt een ranking opgesteld van de beschikbare enzymen volgens enzymactiviteit. De specifieke enzymactiviteit van de NSP enzymen wordt bepaald met de gestandaardiseerde methode van het bedrijf Nuscience, zowel voor de glucanase-activiteit (bij standaard pH 5), de mannanase-activiteit (bij standaard pH 7,5) als de xylanase-activiteit (bij standaard pH 4,8). De specifieke enzymactiviteit van de fytasen wordt bepaald volgens de ISO norm 30024:2009 bij een standaard pH van 5,5. Vervolgens wordt de enzymactiviteit van enkele NSP enzymen en fytasen bepaald bij meerdere pH-waarden. Dit om na te gaan hoe de enzymactiviteit verloopt in functie van de pH. De enzymactiviteit wordt bepaald bij een zure en een neutrale pH. De zure pH bootst de condities van de maag van het dier na terwijl de neutrale pH de condities van het darmkanaal van het dier nabootst. In een tweede fase wordt nagegaan welk effect het pelletiseren heeft op de enzymactiviteit. Dit door vijf fytasen en vijf NSP enzymen toe te voegen aan een voeder. Het voeder wordt gepelletiseerd onder laboratoriumomstandigheden bij temperaturen van respectievelijk 75, 85 en 95°C. Vervolgens wordt de enzymactiviteit (bij standaard pH) van de NSP enzymen en de fytasen bepaald vóór en na het pelletiseren. De enzymstabiliteit wordt dan nagegaan door de enzymactiviteit in de pellets te vergelijken met de enzymactiviteit in het meel. In een derde fase worden viscositeitsmetingen uitgevoerd om na te gaan in welke mate NSP enzymen de viscositeit van een voeder beïnvloeden in functie van de tijd. De viscositeit in functie van de tijd wordt zowel bepaald op het blanco meel (zonder enzymtoevoeging), meel met enzymtoevoeging en pellets van het voeder met enzymtoevoeging aangemaakt bij respectievelijk 75, 85 en 95°C. 4.2 Bepaling van de xylanase-activiteit De bepaling van de xylanase-activiteit wordt uitgevoerd volgens de gestandaardiseerde methode van het bedrijf Nuscience. Eerst wordt er een ijklijn opgesteld. Aan de hand van deze ijklijn kan de xylanase-activiteit bepaald worden. 28 4.2.1 Bepalen van de xylanase-ijklijn 4.2.1.1 Benodigdheden en voorbereidingen Er wordt een citroenzuurbuffer (50 mM) aangemaakt door 21 g citroenzuur op te lossen in 2 l gedemineraliseerd water en op pH 4,8 te brengen. Er wordt een standaard xylose-oplossing aangemaakt van 1 g/l, door 1 g xylose op te lossen in 1 l gedemineraliseerd water. Er worden 10 proefbuizen gevuld met 1,5 ml dinitrosalicylzuur (DNS). 4.2.1.2 Bepaling van de ijklijn In Tabel 5 staan de hoeveelheden weergegeven van de xylose-oplossing en citroenzuurbuffer die nodig zijn voor de aanmaak van de standaardreeks. Deze wordt aangemaakt in 10 proefbuizen. Tabel 5: hoeveelheden xylose-oplossing en citroenzuurbuffer voor aanmaken van de standaardreeks proefbuis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 xylose-oplossing (ml) citroenzuurbuffer (ml) 0 2 0,1 1,9 0,2 1,8 0,3 1,7 0,4 1,6 0,5 1,5 0,6 1,4 0,7 1,3 0,8 1,2 0,9 1,1 Van de aangemaakte standaardreeks wordt van elke proefbuis met een micropipet 600 µl overgebracht in een proefbuis met 1,5 ml DNS en gehomogeniseerd. Vervolgens worden die 10 proefbuizen 5 minuten in een kokend waterbad geplaatst en nadien 5 minuten in een koud waterbad. De optische densiteit (OD) wordt gemeten door de koude vloeistof in een cuvet te gieten. Deze cuvetten worden in de spectrofotometer geplaatst die de absorptie meet bij 540 nm. Uit de grafiek wordt dan de ijklijn bepaald. 4.2.2 Bepalen van de xylanase-activiteit van NSP enzymen 4.2.2.1 Voorbereidingen Voor de bereiding van het staal wordt van het desbetreffende NSP enzym 3 g afgewogen in een erlenmeyer. Daarnaast wordt 1 g soja; 0,1 g natriumdodecylsulfaat (SDS) en 100 ml gedemineraliseerd water toegevoegd. De erlenmeyer wordt 45 minuten geschud. Na het schudden wordt 2 ml overgebracht in een Eppendorf buisje en gecentrifugeerd gedurende 10 minuten aan 12.000 g. Indien nodig wordt deze oplossing verdund met gedemineraliseerd water. De verdunning is afhankelijk van de bekomen OD-waarde en wordt proefondervindelijk bepaald. Xylaansubstraat wordt aangemaakt door 2,5 g xylaan op te lossen in 250 ml koude citroenzuurbuffer met pH 4,8 en deze zachtjes te laten opkoken. Vervolgens wordt 3 g xylaansubstraat afgewogen in een proefbuis. Per enzymbepaling zijn hiervan twee proefbuizen nodig. Per enzymbepaling zijn ook vier proefbuizen met 1,5 ml DNS nodig, namelijk twee proefbuizen voor het nulpunt te bepalen en twee proefbuizen voor de eigenlijke waarde. De 29 proefbuizen met DNS blijven op kamertemperatuur staan. Bij het DNS dient een mespunt natriumsulfiet te worden toegevoegd om oxidatie te voorkomen. De xylanase-activiteit van enkele NSP enzymen wordt ook bepaald bij pH 3 en pH 6. Hiervoor dient er nieuw xylaansubstraat te worden aangemaakt. Daarvoor wordt eerst citroenzuurbuffer aangemaakt met pH 3 en pH 6. 4.2.2.2 De bepaling (Figuur 8) De twee proefbuizen met 3 g xylaansubstraat worden in een warmwaterbad geplaatst van 40°C. Uit het staal wordt 600 µl genomen met een micropipet en toegevoegd aan proefbuis A met xylaansubstraat en gehomogeniseerd. Nadien wordt deze terug in het warmwaterbad geplaatst. 30 seconden erna gebeurt dezelfde handeling bij proefbuis B. Na 6 minuten incuberen van de proefbuizen in het warmwaterbad, wordt proefbuis A gehomogeniseerd en hieruit 600 µl genomen en terug in het warmwaterbad geplaatst. De 600 µl wordt toegevoegd aan een proefbuis met 1,5 ml DNS en gehomogeniseerd. 30 seconden erna gebeurt dezelfde handeling met proefbuis B. Deze zijn om het nulpunt te bepalen. Na 11 minuten incuberen van de proefbuizen in het warmwaterbad, wordt proefbuis A gehomogeniseerd en hieruit 600 µl genomen en terug in het warmwaterbad geplaatst. De 600 µl wordt toegevoegd aan een proefbuis met 1,5 ml DNS en gehomogeniseerd. 30 seconden erna gebeurt dezelfde handeling met proefbuis B. Deze zijn om de eigenlijke waarde te bepalen. De vier bekomen proefbuizen worden 5 minuten in een kokend waterbad geplaatst en vervolgens in een koud waterbad. De OD wordt gemeten door de koude vloeistof in een cuvet te gieten. De cuvetten worden in de spectrofotometer geplaatst die de absorptie meet bij 540 nm. De OD wordt zowel van het nulpunt als de eigenlijke waarde bepaald. Indien de OD-waarde van het nulpunt en/of de eigenlijke waarde meer dan 1,900 bedraagt, dient het staal meer te worden verdund en wordt de ganse procedure opnieuw gevolgd. Indien de OD-waarde van het nulpunt en de eigenlijke waarde nauwelijks van elkaar verschillen (minder dan 0,050 verschil), is het staal te veel verdund en dient er een kleinere verdunning te worden aangemaakt en de volledige procedure opnieuw te doorlopen. 30 staal 600 µl 600 µl 3 g substraat A B 1,5 ml DNS Na incuberen warmwaterbad Na incuberen in warmwaterbad 600 µl NULPUNT 600 µl 600 µl in 600 µl EIGENLIJKE WAARDE Figuur 8: schematische voorstelling voor de bepaling van de specifieke enzymactiviteit van een NSP enzym De gemiddelde OD-waarde van de nulpunten wordt afgetrokken van de gemiddelde ODwaarde van de eigenlijke waarden. Dit resultaat wordt in de ijklijn gestoken en daaruit wordt de xylanase-activiteit (U/g) bekomen. 4.3 Bepalen van de glucanase-activiteit De bepaling van de glucanase-activiteit wordt uitgevoerd volgens de gestandaardiseerde methode van het bedrijf Nuscience. Eerst wordt er een ijklijn opgesteld. Aan de hand van deze ijklijn kan de glucanase-activiteit bepaald worden. 31 4.3.1 Bepalen van de glucanase-ijklijn 4.3.1.1 Benodigdheden en voorbereidingen Er wordt een natriumacetaatbuffer (0,1 M) aangemaakt door 11,44 ml azijnzuur op te lossen in 2 l gedemineraliseerd water en op pH 5 te brengen. Er wordt een standaard glucose-oplossing aangemaakt van 1 g/l, door 1 g glucose op te lossen in 1 l gedemineraliseerd water. Er worden 10 proefbuizen gevuld met 1,5 ml DNS. 4.3.1.2 Bepaling van de ijklijn In Tabel 6 staan de hoeveelheden weergegeven van de glucose-oplossing en natriumacetaatbuffer die nodig is voor de aanmaak van de standaardreeks. Deze wordt aangemaakt in 10 proefbuizen. Tabel 6: hoeveelheden glucose-oplossing en natriumacetaatbuffer voor het aanmaken van de standaardreeks proefbuis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 glucose-oplossing (ml) natriumacetaatbuffer (ml) 0 2 0,1 1,9 0,3 1,7 0,4 1,6 0,6 1,4 0,7 1,3 0,9 1,1 1 1 1,1 0,9 1,3 0,7 Van de aangemaakte standaardreeks wordt van elke proefbuis 600 µl met een micropipet overgebracht in een proefbuis met 1,5 ml DNS en gehomogeniseerd. Vervolgens worden die 10 proefbuizen 5 minuten in een kokend waterbad geplaatst en nadien 5 minuten in een koud waterbad. De OD wordt gemeten door de koude vloeistof in een cuvet te gieten. Deze cuvetten worden in de spectrofotometer geplaatst die de absorptie meet bij 540 nm. Uit de grafiek wordt de ijklijn bepaald. 4.3.2 Bepalen van de glucanase-activiteit van NSP enzymen 4.3.2.1 Benodigdheden en voorbereidingen Voor de bereiding van het staal wordt van het desbetreffende NSP enzym 3 g afgewogen in een erlenmeyer. Daarnaast wordt 1 g soja; 0,1 g SDS en 100 ml gedemineraliseerd water toegevoegd. De erlenmeyer wordt 45 minuten geschud. Na het schudden wordt 2 ml overgebracht in een Eppendorf buisje en gecentrifugeerd gedurende 10 minuten aan 12.000 g. Indien nodig wordt deze oplossing verdund met gedemineraliseerd water. De verdunning is afhankelijk van de bekomen OD-waarde en wordt proefondervindelijk bepaald. β-glucaansubstraat wordt aangemaakt door 1,25 g β-glucaan op te lossen in 250 ml koude natriumacetaatbuffer met pH 5 en zachtjes te laten opkoken. Vervolgens wordt 3 g β-glucaansubstraat afgewogen in een proefbuis. Per enzymbepaling zijn twee proefbuizen nodig. Per enzymbepaling zijn er ook vier proefbuizen nodig met 1,5 ml DNS, namelijk twee proefbuizen voor het nulpunt te bepalen en twee proefbuizen voor de eigenlijke waarde. De 32 proefbuizen met DNS blijven op kamertemperatuur staan. Bij het DNS dient een mespunt natriumsulfiet te worden toegevoegd, om oxidatie te voorkomen. De glucanase-activiteit van enkele NSP enzymen wordt ook bepaald bij pH 3 en pH 6. Hiervoor dient er nieuw β-glucaansubstraat te worden aangemaakt. Daarvoor wordt eerst natriumacetaatbuffer aangemaakt met pH 3 en pH 6. 4.3.2.2 De bepaling (Figuur 8) De bepaling van de glucanase-activiteit verloopt op dezelfde manier als de bepaling van de xylanase-activiteit. Verschillend hierbij zijn de incubatietijden. Het nulpunt wordt bepaald na 10 minuten incuberen in een warmwaterbad bij 40°C. De eigenlijke waarde wordt bepaald na 25 minuten incuberen in een warmwaterbad van 40°C. De OD wordt gemeten in een spectrofotometer bij 540 nm. De gemiddelde OD-waarde van de nulpunten wordt afgetrokken van de gemiddelde OD-waarde van de eigenlijke waarden. Dit resultaat wordt in de ijklijn gestoken en daaruit wordt de glucanase-activiteit (U/g) bekomen. 4.4 Bepalen van de mannanase-activiteit De bepaling van de mannanase-activiteit wordt uitgevoerd volgens de gestandaardiseerde methode van het bedrijf Nuscience. Eerst wordt er een ijklijn opgesteld. Aan de hand van deze ijklijn kan de mannanase-activiteit bepaald worden. 4.4.1 Bepalen van de mannanase-ijklijn 4.4.1.1 Benodigdheden en voorbereidingen Er wordt een trisbuffer (0,1 M) aangemaakt door 6,05 g tris (hydroxymethyl) aminomethaan op te lossen in 1 l gedemineraliseerd water en op pH 7,5 te brengen. Er wordt een standaard mannose-oplossing aangemaakt van 1 g/l, door 1 g mannose op te lossen in 1 l gedemineraliseerd water. Er worden 10 proefbuizen gevuld met 1,5 ml DNS. 4.4.1.2 Bepaling van de ijklijn In Tabel 7 staan de hoeveelheden weergegeven van de mannose-oplossing en trisbuffer die nodig is voor de aanmaak van de standaardreeks. Deze wordt aangemaakt in 10 proefbuizen. Tabel 7: hoeveelheden mannose-oplossing en trisbuffer voor het aanmaken van de standaardreeks proefbuis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mannose-oplossing (ml) trisbuffer (ml) 0 2 0,2 1,8 0,4 1,6 0,6 1,4 0,8 1,2 1 1 1,2 0,8 1,4 0,6 1,6 0,4 1,8 0,2 Van de aangemaakte standaardreeks wordt van elke proefbuis 600 µl met een micropipet overgebracht in een proefbuis met 1,5 ml DNS en gehomogeniseerd. Vervolgens worden die 33 10 proefbuizen 5 minuten in een kokend waterbad geplaatst en nadien 5 minuten in een koud waterbad. De OD wordt gemeten door de koude vloeistof in een cuvet te gieten. Deze cuvetten worden in de spectrofotometer geplaatst die de absorptie meet bij 550 nm. Uit de grafiek wordt de ijklijn bepaald. 4.4.2 Bepalen van de mannanase-activiteit van NSP enzymen 4.4.2.1 Benodigdheden en voorbereidingen Voor de bereiding van het staal wordt van het desbetreffende NSP enzym 3 g afgewogen in een erlenmeyer. Daarnaast wordt 1 g soja; 0,1 g SDS en 100 ml gedemineraliseerd water toegevoegd. De erlenmeyer wordt 45 minuten geschud. Na het schudden wordt 2 ml overgebracht in een Eppendorf buisje en gecentrifugeerd gedurende 10 minuten aan 12.000 g. Indien nodig wordt deze oplossing verdund met gedemineraliseerd water. De verdunning is afhankelijk van de bekomen OD-waarde en wordt proefondervindelijk bepaald. Mannaansubstraat wordt aangemaakt door 2,5 g LBG (Locust Bean Gum, johannesbroodpitmeel) op te lossen in 500 ml koude trisbuffer met pH 7,5 en zachtjes te laten opkoken. Vervolgens wordt 3 g mannaansubstraat afgewogen in een proefbuis. Per enzymbepaling zijn twee proefbuizen nodig. Per enzymbepaling zijn er ook vier proefbuizen nodig met 1,5 ml DNS, namelijk twee proefbuizen voor het nulpunt te bepalen en twee proefbuizen voor de eigenlijke waarde. De proefbuizen met DNS blijven op kamertemperatuur staan. Bij het DNS dient een mespunt natriumsulfiet te worden toegevoegd, om oxidatie te voorkomen. De mannanase-activiteit van enkele NSP enzymen wordt ook bepaald bij pH 3 en pH 4,8. Hiervoor dient er nieuw mannaansubstraat te worden aangemaakt. Daarvoor wordt eerst citroenzuurbuffer aangemaakt met pH 3 en pH 4,8. Er wordt citroenzuurbuffer gebruikt, omdat de trisbuffer bij de lage pH-waarden kapot zou gaan. 4.4.2.2 De bepaling (Figuur 8) De bepaling van de mannanase-activiteit verloopt op dezelfde manier als de bepaling van de xylanase-activiteit. Verschillend hierbij zijn de incubatietijden. Het nulpunt wordt bepaald na 5 minuten incuberen in een warmwaterbad bij 40°C. De eigenlijke waarde wordt bepaald na 50 minuten incuberen in een warmwaterbad van 40°C. De OD wordt gemeten in een spectrofotometer bij 550 nm. De gemiddelde OD-waarde van de nulpunten wordt afgetrokken van de gemiddelde OD-waarde van de eigenlijke waarden. Dit resultaat wordt in de ijklijn gestoken en daaruit wordt de mannanase-activiteit (U/g) bekomen. 34 4.5 Bepalen van de fytase-activiteit De bepaling van de fytase-activiteit wordt uitgevoerd volgens de ISO norm 30024:2009. Eerst wordt er een ijklijn opgesteld. Aan de hand van deze ijklijn kan de fytase-activiteit bepaald worden. 4.5.1 Bepalen van de fytase-ijklijn 4.5.1.1 Benodigdheden en voorbereidingen Er wordt een fosfaatstock standaardoplossing (50 mmol/l) aangemaakt door 682 mg kaliumfosfaat op te lossen in 100 ml acetaatbuffer met polysorbaat. De acetaatbuffer met polysorbaat wordt gemaakt door 0,5 ml polysorbaatoplossing op te lossen in 500 ml acetaatbuffer. De acetaatbuffer wordt aangemaakt door 34 g natriumacetaattrihydraat op te lossen in 1 l gedemineraliseerd water en op pH 5,5 te brengen. De polysorbaatoplossing wordt aangemaakt door 10 g polysorbaat op te lossen in 100 ml gedemineraliseerd water. Fytaatsubstraat wordt aangemaakt door 2 g dodecasodium fytaat op te lossen in 250 ml acetaatbuffer met pH 5,5 en wordt bewaard bij koelkasttemperatuur. Het stopreagens bestaat uit 1 volume ammonium vanadaat reagens, 1 volume ammonium heptamolybdaat reagens en 2 volumes verdund salpeterzuur. 4.5.1.2 Bepaling van de ijklijn In Tabel 8 staan de hoeveelheden weergegeven voor de fosfaatstock standaardoplossing en acetaatbuffer met polysorbaat voor de aanmaak van de standaardoplossing. Deze wordt aangemaakt in vier proefbuizen. Tabel 8: hoeveelheid fosfaatstock standaardoplossing en hoeveelheid acetaatbuffer met polysorbaat voor het aanmaken van de standaardoplossing standaardoplossing fosfaatstock standaardoplossing (ml) acetaatbuffer met polysorbaat (ml) A B C D 1 3 7 15 1 1 1 1 Voor iedere aangemaakte standaardoplossing wordt de eigenlijke bepaling in drievoud uitgevoerd. In ieder Eppendorf buisje van 2 ml wordt 360 µl acetaatbuffer met polysorbaat gebracht. Vervolgens wordt 40 µl van de aangemaakte standaardoplossing toegevoegd aan ieder Eppendorf buisje. Daarna wordt 800 µl fytaatsubstraat en 800 µl stopreagens toegevoegd aan ieder Eppendorf buisje. Nadien wordt het Eppendorf buisje gehomogeniseerd en 10 minuten laten rusten. Daarna worden de Eppendorf buisjes 3 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 g. 35 De blanco bepaling wordt in tweevoud uitgevoerd. Beide Eppendorf buisjes worden gevuld met 400 µl acetaatbuffer met polysorbaat. Vervolgens wordt aan ieder Eppendorf buisje 800 µl fytaatsubstraat en 800 µl stopreagens toegevoegd. Nadien wordt het Eppendorf buisje gehomogeniseerd en 10 minuten laten rusten. Daarna worden de Eppendorf buisjes 3 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 g. Na het centrifugeren van de Eppendorf buisjes, wordt de OD gemeten door de vloeistof in een cuvet te gieten. Deze cuvetten worden in de spectrofotometer geplaatst die de absorptie meet bij 415 nm. Uit de grafiek wordt de ijklijn bepaald. 4.5.2 Bepalen van de fytase-activiteit van fytasen (volgens ISO norm 30024:2009) 4.5.2.1 Benodigdheden en voorbereidingen Voor de bereiding van het staal wordt 2 g van het betreffende fytase afgewogen in een erlenmeyer. Daarnaast wordt 100 ml gedemineraliseerd water toegevoegd en 0,5 ml polysorbaatoplossing. De erlenmeyer wordt 45 minuten geschud. Na het schudden wordt 2 ml overgebracht in een Eppendorf buisje en gecentrifugeerd gedurende 3 minuten aan 12.000 g. Indien nodig wordt deze oplossing verdund met gedemineraliseerd water. De verdunning is afhankelijk van de bekomen OD-waarde en wordt proefondervindelijk bepaald. De polysorbaatoplossing wordt aangemaakt door 10 g polysorbaat op te lossen in 100 ml gedemineraliseerd water. Fytaatsubstraat wordt aangemaakt door 2 g dodecasodium fytaat op te lossen in 250 ml acetaatbuffer met pH 5,5 en wordt bewaard bij koelkasttemperatuur. De acetaatbuffer met polysorbaat wordt gemaakt door 0,5 ml polysorbaatoplossing op te lossen in 500 ml acetaatbuffer, die reeds op de gewenste pH is gebracht. De acetaatbuffer wordt aangemaakt door 34 g natriumacetaat trihydraat op te lossen in 1 l gedemineraliseerd water en op pH 5,5 te brengen. Het stopreagens bestaat uit 1 volume ammonium vanadaat reagens, 1 volume ammonium heptamolybdaat reagens en 2 volumes verdund salpeterzuur. De fytase-activiteit van enkele fytasen wordt ook bepaald bij pH 3; pH 4,5 en pH 6. Hiervoor dient er nieuw fytaatsubstraat en acetaatbuffer met polysorbaat te worden aangemaakt. Daarvoor wordt eerst acetaatbuffer aangemaakt met pH 3; pH 4,5 en pH 6. 4.5.2.2 De bepaling Er worden vijf Eppendorf buisjes geplaatst in een warmwaterbad van 37°C. Drie Eppendorf buisjes zijn om de eigenlijke waarde te bepalen, de twee andere Eppendorf buisjes voor de blanco waarde. 4.5.2.2.1 De bepaling van de eigenlijke waarden (Figuur 9) Alle Eppendorf buisjes worden gevuld met 300 µl acetaatbuffer met polysorbaat en in het warmwaterbad geplaatst. 36 Aan ieder Eppendorf buisje wordt 100 µl staal toegevoegd, gehomogeniseerd en terug in het warmwaterbad geplaatst, telkens met een tussentijd van 30 seconden. Na 5 minuten incuberen van de Eppendorf buisjes in het warmwaterbad, wordt aan ieder Eppendorf buisje 800 µl voorverwarmd substraat toegevoegd, met telkens een tussentijd van 30 seconden. Na 30 minuten incuberen van de Eppendorf buisjes in het warmwaterbad, wordt aan ieder Eppendorf buisje 800 µl stopreagens toegevoegd en gehomogeniseerd, met telkens een tussentijd van 30 seconden. De Eppendorf buisjes uit het warmwaterbad halen en 10 minuten laten rusten. Na het rusten worden de Eppendorf buisjes gecentrifugeerd gedurende 3 minuten bij 12.000 g. Figuur 9: schematische voorstelling voor bepaling van de eigenlijke waarden 4.5.2.2.2 De bepaling van de blanco waarden (Figuur 10) Alle Eppendorf buisjes worden gevuld met 300 µl acetaatbuffer met polysorbaat en in het warmwaterbad geplaatst. Aan ieder Eppendorf buisje wordt 100 µl staal toegevoegd, gehomogeniseerd en terug in het warmwaterbad geplaatst, telkens met een tussentijd van 30 seconden. Na 5 minuten incuberen van de Eppendorf buisjes in het warmwaterbad wordt aan ieder Eppendorf buisje 800 µl stopreagens toegevoegd en gehomogeniseerd, met telkens een tussentijd van 30 seconden. Vervolgens wordt aan ieder Eppendorf buisje 800 µl voorverwarmd substraat toegevoegd. De Eppendorf buisjes uit het warmwaterbad halen en 10 minuten laten rusten. Na het rusten worden de Eppendorf buisjes gecentrifugeerd gedurende 3 minuten bij 12.000 g. Figuur 10: schematische voorstelling voor de bepaling van de blanco waarden 37 4.5.2.2.3 De bepaling van de fytase-activiteit Nadat de Eppendorf buisjes van de eigenlijke waarden en de blanco waarden zijn gecentrifugeerd, wordt de OD gemeten door de vloeistof in een cuvet te gieten. Deze cuvetten worden in de spectrofotometer geplaatst die de absorptie meet bij 415 nm. Indien de OD-waarde van de blanco waarde en/of de eigenlijke waarde meer dan 1,900 bedraagt, dient het staal te worden verdund en wordt de ganse procedure opnieuw doorlopen. Indien de OD-waarde van de blanco waarde en de eigenlijke waarde nauwelijks van elkaar verschillen (minder dan 0,050 verschil), is het staal te veel verdund en dient er een kleinere verdunning te worden aangemaakt en de volledige procedure opnieuw te doorlopen. De gemiddelde OD-waarde van de blanco waarden wordt afgetrokken van de gemiddelde OD-waarde van de eigenlijke waarden. Dit resultaat wordt in de ijklijn gestoken en daaruit wordt de fytase-activiteit (U/g) bekomen. 4.6 Pelletiseren van het voeder 4.6.1 Samenstelling van het voeder Het pelletiseren onder laboratoriumomstandigheden wordt uitgevoerd op een voeder bestemd voor mestkuikens. De samenstelling van het voeder met de functie van de grondstof in het dier staat weergegeven in Tabel 9. Tabel 9: samenstelling van het voeder met de functie van de grondstof in het dier grondstof maïs sojaschroot sojaboon olie krijt monocalciumfosfaat natriumbicarbonaat zout vitaminen mineralen hoeveelheid (%) 52,8 34,5 5 4 1,7 1 0,5 functie in het dier koolstofbron stikstofbron stikstofbron energiebron calciumbron fosforbron natriumbron natrium- en chloorbron 0,5 De NZP fractie van de grondstof maïs bestaat hoofdzakelijk uit xylanen en in mindere mate uit mannanen en β-glucanen. De NZP fractie van de grondstof soja daarentegen bestaat hoofdzakelijk uit mannanen (onder andere galactomannanen) en in mindere mate uit xylanen. Het totaal NZP gehalte van soja (13,7%) ligt een stuk hoger dan dat van maïs (7,6%). Waarvan de oplosbare NZP fractie van soja (13,4%) hoger ligt dan de oplosbare NZP fractie van maïs (6,4%) (Meng & Slominski, 2005). 38 4.6.2 Het pelletiseren onder laboratoriumomstandigheden Van het voeder wordt eerst een staal van 200 g genomen voor de xylanase- en fytaseactiviteit en een staal van 400 g voor de viscositeitsmetingen. Het voeder wordt verdeeld in 10 batchen van elk 100 kg. Aan iedere batch wordt een ander enzym toegevoegd. Het betreft hier vijf fytasen en vijf NSP enzymen. Deze worden toegediend volgens aanbevolen dosering door de leverancier. Het aanmaken van de pellets wordt uitgevoerd in het labo graan- en diervoedertechnologie aan de Universiteit Gent (Figuur 11). Iedere batch met toegevoegd enzym wordt geconditioneerd respectievelijk bij 75, 85 en 95°C en geperst, wat resulteert in drie experimenten per batch. Figuur 11: pelletiseertoetel in het labo graan- en diervoedertechnologie aan de Universiteit Gent Per batch wordt het enzym eerst gemengd met een kleine hoeveelheid voeder (ongeveer 2 kg), een voormengsel, om dan aan de rest van het voeder toe te voegen in de verticale menger. Dit wordt gedurende 15 minuten gemengd om een homogeen staal te bekomen. Bij iedere batch wordt er steeds een staal genomen. Bij het meel met toegevoegd fytase is dit een staal van 200 g voor de fytase-activiteit. Bij het meel met toegevoegd NSP enzym wordt een staal van 200 g genomen voor de xylanase-activiteit en een staal van 400 g voor de viscositeitsmetingen . Vervolgens wordt het meel naar de conditioner geleid, wat een sneldraaiende schuin opgestelde paddlemixer is, waarin stoom wordt toegevoegd. Het meel verblijft hierin 45-50 seconden. De conditioneertemperatuur wordt gemeten op het einde van de conditioner. Vochtgehalte van het meel in de conditioner wordt bepaald door een staal te nemen en dit gedurende een nacht in de droogoven te steken. Vanuit de conditioner komt het meel in de pers terecht. Er wordt gebruik gemaakt van een 4x50 mm matrijs, respectievelijk diameter en 39 lengte van de perskanaaltjes. Na de pers worden de pellets gekoeld tot omgevingstemperatuur. Bij iedere batch wordt er steeds een staal van de pellets genomen na koelen. Bij de pellets met toegevoegd fytase, is dit een staal van 200 g voor de fytase-activiteit. Bij de pellets met toegevoegd NSP enzym is dit een staal van 200 g voor de xylanase-activiteit en een staal van 400 g voor de viscositeitsmetingen. Nadat een batch is uitgevoerd, wordt de verticale menger steeds gereinigd voordat een nieuwe batch wordt opgestart. Dit om contaminatie te vermijden. 4.7 Bepalen van de enzymactiviteit in voeder 4.7.1 Voorbereidingen Om de enzymactiviteit in pellets te bepalen, wordt 200 g van de pellets vermalen tot een meel. Het malen gebeurt met een Fritsch variable speed rotor mill pulverisette 14 (Figuur 12) waarbij een zeefopening gebruikt wordt van 1 mm. De meelstalen worden niet gemalen. Figuur 12: Fritsch variable speed rotor mill pulverisette 14 4.7.2 Bepaling fytase-activiteit in voeder De bepaling van de fytase-activiteit in voeder verloopt op dezelfde manier als de bepaling van de fytase-activiteit op fytasen (4.5.2). Enkel de bereiding van het staal is verschillend. Bij de bereiding van het staal wordt 20 g van de vermalen pellets of van het meel overgebracht in een erlenmeyer van 250 ml. Hieraan wordt 100 ml gedemineraliseerd water toegevoegd en 1 ml polysorbaat. 4.7.3 Bepaling xylanase-activiteit in voeder De bepaling van de xylanase-activiteit in voeder verloopt op dezelfde manier als de bepaling van de xylanase-activiteit op NSP enzymen (4.2.2). Enkel de bereiding van het staal is verschillend. 40 Bij de bereiding van het staal wordt 20 g van de vermalen pellets of van het meel overgebracht in een erlenmeyer van 250 ml. Daarnaast wordt 1 g soja; 0,1 g SDS en 100 ml gedemineraliseerd water toegevoegd. 4.8 Viscositeitsmetingen 4.8.1 Benodigdheden en voorbereidingen De viscositeitsmetingen worden uitgevoerd met de Haake-viscosimeter VT 550 (Figuur 13) met de probe FL 100 (Figuur 14). De probe is schoepvormig en het meest geschikt voor deze soort meting. De schoepen zorgen voor een constant contact met het staal en zorgt voor minder snelle waterafscheiding rond de probe in vergelijking met andere probes (Rosier, 1999). Het toestel wordt ingesteld op een meettijd van 60 seconden, waarbinnen 100 registraties worden verricht. Er wordt een rotatiesnelheid gehanteerd van 4 per seconde. Bij de staalvoorbereiding wordt zowel van het meel als van de pellets 400 g vermalen. Dit gebeurt met een rotormolen Retsch GmbH, type SK1 (Figuur 15) waarbij een zeefopening van 1 mm wordt gebruikt. Figuur 15: rotormolen Retsch GmbH, type SK1 Figuur 14: probe FL 100 Figuur 13: Haake viscosimeter VT 550 4.8.2 Uitvoering De metingen worden steeds uitgevoerd bij kamertemperatuur. In een plastiek beker wordt 200 g staal (gemalen meel of gemalen pellets) afgewogen op een bovenweger. Daarnaast wordt in een andere plastiek beker 400 g gedestilleerd water afgewogen op een bovenweger. Het water wordt aan het meel toegevoegd en gemengd met behulp van een 41 vork, zodat er geen klonters overblijven. Onmiddellijk hierna worden de eerste vijf metingen uitgevoerd. Daarna worden steeds vijf metingen uitgevoerd 20, 40, 60, 120 en 180 minuten nadat het meel met het water vermengd is. Voordat de meting aanvat, wordt het mengsel eerst geroerd met een vork. Op elk tijdstip worden die vijf metingen uitgevoerd binnen een tijdspanne van 60 seconden. Het is hierbij van belang dat de probe niet te dicht tegen de rand van de plastiek beker zit, de probe juist niet onder het mengsel zit en dat de vijf metingen op verschillende plaatsen in het mengsel worden bepaald. Om die metingen te registreren, wordt de plastiek beker met behulp van een Supportboy naar de probe gebracht. Zodra de probe in aanraking komt met het mengsel wordt een afschuifkracht geregistreerd. Wanneer een piek wordt waargenomen in de grafiek afschuifkracht in functie van de afschuifsnelheid, wordt de probe uit het mengsel gehaald. De probe wordt vervolgens op een andere plaats in dezelfde beker gebracht om terug een meting uit te voeren. Nadat de metingen zijn uitgevoerd, wordt de probe afgespoeld met gedestilleerd water. Uit de vijf bekomen piekwaarden wordt de viscositeit bepaald in Pa.s met het programma Agrimex. Van deze vijf waarden wordt het gemiddelde genomen. De gemiddelde viscositeit bij ieder tijdstip wordt uitgezet in de grafiek viscositeit in functie van de tijd. 42 5 Resultaten 5.1 Ranking volgens standaard pH specifieke enzymactiviteit bij Bij de ranking van de beschikbare NSP enzymen en fytasen wordt de specifieke enzymactiviteit bepaald met eenzelfde methode bij standaard pH. Bij de fytasen is dat de fytase-activiteit. Bij de NSP enzymen is dat de xylanase-, glucanase- en mannanaseactiviteit. 5.1.1 Probleemstelling Er is grote verscheidenheid in eenheden voor het uitdrukken van enzymactiviteit tussen de verschillende leveranciers. De verscheidenheid in eenheden wijst erop dat er verschillende methoden worden gebruikt om enzymactiviteit te bepalen, waardoor het moeilijk is om de enzymen onderling te vergelijken op basis van enzymactiviteit. Hiertoe wordt een ranking opgesteld van de beschikbare enzymen met eenzelfde methode die de specifieke enzymactiviteit bepaald in U/g bij standaard pH. De probleemstelling wordt geïllustreerd aan de hand van de xylanase-activiteit van enkele NSP enzymen. Dit wordt tevens waargenomen bij glucanase- en mannanase-activiteit van NSP enzymen en bij fytasen. In Tabel 10 staan enkele NSP enzymen weergegeven met hun xylanase-activiteit en een code voor eenheid volgens de leverancier. Van elk NSP enzym wordt de xylanase-activiteit vermeld volgens de technische fiche van de leverancier. De xylanase-activiteit van elk NSP enzym wordt uitgedrukt in een andere eenheid. In Tabel 10 wordt dit weergegeven door telkens een andere index te gebruiken als code voor eenheid volgens de leverancier. Tabel 10: enkele NSP enzymen met hun xylanase-activiteit en een code voor eenheid volgens de leverancier NSP enzym NSP 1 NSP 2 NSP 3 NSP 4 NSP 7 NSP 8 NSP 10 NSP 12 xylanaseactiviteit 15000 5600 100 3200 160000 12200 1000 40000 code voor eenheid volgens de leverancier Ua/g Ub/g Uc/g Ud/g Ue/g Uf/g Ug/g Uh/g 43 5.1.2 Ranking volgens xylanase-activiteit bij standaard pH De xylanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen wordt bepaald volgens de gestandaardiseerde methode van Nuscience, bij een standaard pH van 4,8. Uit Figuur 16 wordt afgeleid dat NSP 10 en NSP 7 de grootste xylanase-activiteit vertonen bij pH 4,8; maar niet significant verschillend zijn van elkaar. NSP 9 vertoont de laagste xylanase-activiteit. Van de enzymen NSP 5, NSP 6, NSP 9 en NSP 11 wordt geen xylanaseactiviteit vermeld door de leverancier. 16000 14000 xylanase-activiteit (U/g) 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 NSP 1 1254,33 NSP 2 3988,95 NSP 3 204,80 NSP 4 7079,46 NSP 5 1467,20 NSP 6 20,47 NSP 7 9683,08 NSP 8 2809,95 NSP 9 12,67 NSP 10 12352,21 NSP 11 1462,83 NSP 12 4429,99 Figuur 16: ranking volgens xylanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen bij standaard pH 4,8 44 In Figuur 17 wordt de bepaalde xylanase-activiteit in U/g van enkele NSP enzymen vergeleken met de xylanase-activiteit volgens de leverancier (Tabel 10). Er wordt duidelijk verschil in xylanase-activiteit van een NSP enzym waargenomen tussen de bepaalde activiteit in U/g en de activiteit volgens de leverancier. Bij de vergelijking van de xylanaseactiviteiten volgens de leverancier vertoont NSP 7 duidelijk de grootste xylanase-activiteit. Terwijl NSP 10 de grootste xylanase-activiteit vertoont bij vergelijking van de bepaalde activiteiten in U/g. Daarnaast kan besloten worden dat de meeste leveranciers een grotere xylanase-activiteit geven dan de xylanase-activiteit bepaald in U/g, uitgezonderd deze van NSP 3, NSP 4 en NSP 10. De vergelijking van de xylanase-activiteiten volgens de leverancier geeft dus een vertekend beeld. 160000 140000 xylanase-activiteit 120000 100000 80000 bepaalde xylanase-activiteit in U/g 60000 xylanase-activiteit volgens leverancier 40000 20000 0 Figuur 17: vergelijking tussen de bepaalde xylanase-activiteit in U/g en de xylanase-activiteit volgens de leverancier van enkele NSP enzymen 5.1.3 Ranking volgens glucanase-activiteit bij standaard pH De glucanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen wordt bepaald volgens de gestandaardiseerde methode van Nuscience, bij een standaard pH van 5. Uit Figuur 18 wordt afgeleid dat NSP 5 de grootste glucanase-activiteit vertoont en significant verschillend is van de andere NSP enzymen. NSP 4 vertoont de tweede grootste glucanaseactiviteit en de andere NSP enzymen vertonen een opmerkelijk lagere activiteit. 45 25000 glucanase-activiteit (U/g) 20000 15000 10000 5000 0 NSP 1 29,11 NSP 2 1391,48 NSP 3 62,22 NSP 4 16133,98 NSP 5 22539,80 NSP 6 50,97 NSP 7 975,93 NSP 8 2482,39 NSP 9 785,68 NSP 10 5,14 NSP 11 1938,10 NSP 12 6601,15 Figuur 18: ranking volgens glucanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymenbij standaard pH 5 5.1.4 Ranking volgens mannanase-activiteit bij standaard pH De mannanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen wordt bepaald volgens de gestandaardiseerde methode van Nuscience, bij een standaard pH van 7,5. Uit Figuur 19 wordt afgeleid dat NSP 6 de grootste mannanase-activiteit vertoont en significant verschillend is van de andere NSP enzymen, daar deze duidelijk een lagere mannanase-activiteit vertonen. 46 1000000 900000 mannanase-activiteit (U/g) 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 NSP 4 1827,14 NSP 5 156136,85 NSP 6 923828,70 NSP 9 13276,50 NSP 11 534,65 Figuur 19: ranking volgens mannanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen bij pH 7,5 5.1.5 Ranking volgens fytase-activiteit bij standaard pH De fytase-activiteit van de beschikbare fytasen wordt bepaald volgens de ISO norm 30024:2009 bij een standaard pH van 5,5. Uit Figuur 20 wordt afgeleid dat fytase 1 en fytase 2 de grootste fytase-activiteit vertonen, maar niet significant verschillend zijn van elkaar. Fytase 4 vertoont de laagste fytase-activiteit van alle geteste fytasen. 47 18000 16000 fytase-activiteit (U/g) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 Fytase 1 15367,16 Fytase 2 15802,52 Fytase 3 11901,05 Fytase 4 7469,18 Fytase 5 10200,84 Figuur 20: ranking volgens fytase-activiteit van de beschikbare fytasen bij standaard pH 5,5 5.2 Specifieke enzymactiviteit bij verschillende pH-waarden De specifieke enzymactiviteit van enkele NSP enzymen en enkele fytasen wordt bepaald bij verschillende pH-waarden. Op die manier worden de verschillende condities in het verteringsstelsel van het dier nagebootst. Een neutrale pH bootst de darm na, daar de pH in de darm van zowel kip als big 6 à 7 is. Een zure pH bootst de maag na, daar de pH in de maag van de kip 2 à 3 is en van een big 4. Op basis van deze gegevens wordt besloten welk enzym het meest geschikt is voor welke diersoort. 5.2.1 Xylanase-activiteit bij verschillende pH-waarden Op basis van de grootste xylanase-activiteit bij standaard pH, wordt van vier NSP enzymen de xylanase-activiteit bepaald volgens de gestandaardiseerde methode van Nuscience bij drie verschillende pH-waarden, respectievelijk 3; 4,8 en 6. Uit Figuur 21 wordt afgeleid dat NSP 2 en NSP 10 een gelijkaardig verloop vertonen. Bij standaard pH 4,8 vertonen beiden de grootste activiteit en bij de zure pH de laagste activiteit. NSP 4 vertoont de hoogste activiteit bij de laagste pH en de laagste activiteit bij de hoogste pH. NSP 12 vertoont de laagste activiteit bij een lage pH en de hoogste activiteit bij de hoogste pH. 48 16000 xylanase-activiteit (U/g) 14000 12000 10000 NSP 2 8000 NSP 4 NSP 10 6000 NSP 12 4000 2000 0 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 pH Figuur 21: verloop van xylanase-activiteit bij verschillende pH-waarden van enkele NSP enzymen 5.2.2 Glucanase-activiteit bij verschillende pH-waarden Op basis van een gelijkaardige glucanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen, wordt van vier NSP enzymen de glucanase-activiteit bepaald volgens de gestandaardiseerde methode van Nuscience bij drie verschillende pH-waarden, respectievelijk 3, 5 en 6. Uit Figuur 22 wordt afgeleid dat alle vier de NSP enzymen een gelijkaardig gedrag vertonen. Ze bezitten alle vier de grootste activiteit bij standaard pH 5 en de laagste activiteit bij pH 6. NSP 2 en NSP 11 vertonen geen significant verschil in activiteit bij pH 3 en 5. 49 18000 16000 glucanase-activitit (U/g) 14000 12000 10000 NSP 2 8000 NSP 4 NSP 11 6000 NSP 12 4000 2000 0 2 3 4 5 6 7 pH Figuur 22: verloop glucanase-activiteit bij verschillende pH-waarden van enkele NSP enzymen NSP 12 is het meest geschikt voor het gebruik in biggenvoeder, daar de xylanase- en de glucanase-activiteit de grootste activiteit vertonen bij een zure pH. NSP 2 is zowel geschikt voor het gebruik in een kippen- als biggenvoeder, daar de xylanase- en de glucanaseactiviteit een gelijke activiteit vertonen bij sterk zure en zure pH. 5.2.3 Mannanase-activiteit bij verschillende pH-waarden Op basis van een gelijkaardige mannanase-activiteit van de beschikbare NSP enzymen, wordt van twee NSP enzymen de mannanase-activiteit bepaald volgens de gestandaardiseerde methode van Nuscience bij drie verschillende pH-waarden, respectievelijk 3; 4,8 en 7,5. Uit Figuur 23 wordt afgeleid dat NSP 9 een dalende mannanase-activiteit vertoont bij een stijgende pH. NSP 4 vertoont geen significant verschil in mannanase-activiteit bij pH 3 en 4,8 en vertoont een dalende activiteit bij neutrale pH. 50 250000 mannanase-activiteit (U/g) 200000 150000 NSP 4 100000 NSP 9 50000 0 2 3 4 5 6 7 8 pH Figuur 23: verloop mannanase-activiteit bij verschillende pH-waarden van enkele NSP enzymen 5.2.4 Fytase-activiteit bij verschillende pH-waarden Van alle vijf de beschikbare fytasen wordt de fytase-activiteit bepaald volgens de ISO norm 30024:2009 bij vier verschillende pH-waarden, respectievelijk 3; 4,5; 5,5 en 6. Uit Figuur 24 wordt afgeleid dat fytase 1 de grootste activiteit vertoont bij pH 4,5. Fytase 2, fytase 3, fytase 4 en fytase 5 vertonen de grootste activiteit bij pH 4,5 en 5,5 daar de beide waarden niet significant verschillend zijn van elkaar. Fytase 2, fytase 4 en fytase 5 vertonen geen significant verschil tussen pH 3 en 6. Terwijl fytase 3 de laagste activiteit vertoont bij pH 3 en fytase 1 de laagste activiteit bij pH 6. 51 24000 22000 fytase-activiteit (U/g) 20000 18000 16000 Fytase 1 14000 12000 Fytase 2 10000 Fytase 3 8000 Fytase 4 6000 Fytase 5 4000 2000 0 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 pH Figuur 24: verloop fytase-activiteit bij verschillende pH-waarden van alle beschikbare fytasen 5.3 Effect van processing op de enzymactiviteit De hittestabiliteit wordt bepaald van vijf NSP enzymen en vijf fytasen. Dit gebeurt door het voedermengsel te pelletiseren onder laboratoriumomstandigheden bij drie verschillende temperaturen, respectievelijk 75, 85 en 95°C. De enzymactiviteit wordt bepaald in het meel en de gekoelde pellets. De hittestabiliteit van het enzym wordt beoordeeld door deze activiteiten onderling te vergelijken. Bij de bepaling van de enzymactiviteit in pellets en meel, wordt geen onderscheid gemaakt in wat endogene en wat exogene activiteit is. Daarna wordt nagegaan welk enzym de grootste activiteit oplevert in meel en gepelletiseerd voeder van respectievelijk 75, 85 en 95°C. 5.3.1 Samenstelling van het voedermengsel Het pelletiseren werd uitgevoerd op een voeder bestemd voor mestkuikens. Aan iedere batch wordt een ander enzym toegevoegd, dit volgens een dosering aanbevolen door de leverancier. Het betreft hier vijf fytasen (fytase 1, fytase 2, fytase 3, fytase 4 en fytase 5) en vijf NSP enzymen (NSP 2, NSP 4, NSP 5, NSP 10 en NSP 12). De NSP enzymen worden zo gekozen dat een brede waaier wordt bekomen naar xylanaseactiviteit (Figuur 16). Aangezien slechts van vijf fytasen de fytase-activiteit bepaald werd bij standaard pH, worden deze alle vijf getest (Figuur 20). 5.3.2 Parameters tijdens het pelletiseren Tijdens het pelletiseren wordt het vochtgehalte na conditioneren en de conditioneertemperatuur bepaald. Voor het pelletiseren heeft het meel een vochtgehalte van 52 11,48%. In Tabel 11 staat het gemiddelde vochtgehalte bij de drie conditioneertemperaturen weergegeven voor de 10 verschillende batchen. Naarmate de conditioneertemperatuur toeneemt, stijgt het vochtgehalte in het meel. Tabel 11: conditioneertemperatuur en gemiddeld vochtgehalte van het geconditioneerd meel voor de 10 batchen Conditioneertemperatuur (°C) 75 85 95 Gemiddeld vochtgehalte (%) 16,24 ± 0,63 17,06 ± 0,47 17,94 ± 0,82 5.3.3 Hittestabiliteit van fytasen Bij de bepaling van de hittestabiliteit per fytase wordt de fytase-activiteit bepaald in meel en pellets aangemaakt bij respectievelijk 75, 85 en 95°C na toevoeging van het fytase. Bij de fytase-activiteit wordt geen onderscheid gemaakt in wat endogene en exogene fytaseactiviteit is in pellets, aangezien er geen blanco meel (meel zonder enzymtoevoeging) gepelletiseerd werd. 5.3.3.1 Vergelijking theoretische activiteit en gemeten exogene activiteit in meel In Tabel 12 staat de dosering van fytase in meel. Daarnaast staat de theoretische fytaseactiviteit in meel, berekend op basis van de bepaalde fytase-activiteit bij standaard pH (Figuur 20). Daarnaast staat ook de gemeten exogene fytase-activiteit in meel met toegevoegd fytase (het verschil tussen de gemeten fytase-activiteit in meel met toegevoegd fytase en de gemeten fytase-activiteit in blanco meel). Tabel 12: dosering van fytase in meel met de theoretische fytase-activiteit en de gemeten exogene fytase-activiteit in meel van vijf fytasen Fytase Dosering in meel (g/ton) Fytase 1 Fytase 2 Fytase 3 Fytase 4 Fytase 5 20 50 50 100 100 theoretische fytaseactiviteit in meel (U/g) 0,307 0,790 0,595 0,747 1,020 Gemeten exogene fytase-activiteit in meel (U/g) 0,617 ± 0,053 0,153 ± 0,016 1,000 ± 0,146 1,789 ± 0,004 0,891 ± 0,057 Uit Tabel 12 blijkt dat de theoretische activiteit van fytase 5 het grootst is in meel. Dit in tegenstelling tot de gemeten exogene activiteit in het meel waar fytase 4 de grootste is. Er wordt een duidelijk verschil waargenomen in theoretische en gemeten activiteit. 5.3.3.2 Hittestabiliteit van fytase 1 In Figuur 25 staat de fytase-activiteit van fytase 1 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 53 0,3 fytase-activiteit (U/g) 0,25 0,2 0,15 0,1 meel pellets bij 75°C pellets bij 85°C pellets bij 95°C 0,05 0 Figuur 25: fytase-activiteit van fytase 1 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen Fytase 1 is een hittestabiel enzym bij alle toegepaste procestemperaturen. Daar er geen significant verlies aan activiteit tussen de pellets onderling en tussen de pellets en het meel wordt waargenomen. In de technische fiche van fytase 1 staat niets vermeld over hittestabiliteit. 5.3.3.3 Hittestabiliteit van fytase 2 In Figuur 26 staat de fytase-activiteit van fytase 2 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 1,2 fytase-activiteit (U/g) 1 0,8 0,6 0,4 meel pellets bij 75°C pellets bij 85°C pellets bij 95°C 0,2 0 Figuur 26: fytase-activiteit van fytase 2 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen Fytase 2 vertoont een daling in fytase-activiteit bij pellets ten opzichte van het meel. Daar de activiteit in pellets bij de drie procestemperaturen significant verschil vertonen met de activiteit in meel. In de technische fiche van fytase 2 staat vermeld dat het aanbevolen wordt om procestemperaturen van 95°C niet te overschrijden. In Figuur 26 wordt een significante daling in activiteit bij pellets aangemaakt bij 95°C waargenomen ten opzichte van de pellets aangemaakt bij de andere procestemperaturen. Maar er wordt ook een daling in fytase- 54 activiteit bij pellets aangemaakt bij 75 en 85°C ten opzichte van de fytase-activiteit in meel waargenomen. 5.3.3.4 Hittestabiliteit van fytase 3 In Figuur 27 staat de fytase-activiteit van fytase 3 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 0,8 fytase-activiteit (U/g) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 meel pellets bij 75°C pellets bij 85°C pellets bij 95°C 0,2 0,1 0 Figuur 27: fytase-activiteit van fytase 3 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen Fytase 3 is een hittestabiel enzym tot procestemperaturen van 85°C. Bij procestemperaturen van 95°C daalt de activiteit significant ten opzichte van de andere procestemperaturen. In de technische fiche van fytase 3 staat vermeld dat het fytase aanbevolen wordt voor gepelletiseerd voeder, specifiek beneden de 85°C. Uit Figuur 27 blijkt dat procestemperaturen van 85°C ook nog een goede fytase-activiteit vertonen in vergelijking met de activiteit in het meel. 5.3.3.5 Hittestabiliteit van fytase 4 In Figuur 28 staat de fytase-activiteit van fytase 4 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 55 1,4 fytase-activiteit (U/g) 1,2 1 meel 0,8 pellets bij 75°C 0,6 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 0,4 0,2 0 Figuur 28: fytase-activiteit van fytase 4 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen Fytase 4 vertoont een daling in fytase-activiteit bij pellets ten opzichte van het meel. Het verliest significante hoeveelheden aan fytase-activiteit wanneer pellets worden aangemaakt bij de drie procestemperaturen ten opzichte van de fytase-activiteit in het meel. In de technische fiche van fytase 4 staat vermeld dat het fytase hittestabiel is onder een pelletiseertemperatuur van 75°C. In Figuur 28 wordt bij pellets aangemaakt bij 75°C tevens een daling in activiteit waargenomen ten opzichte van de activiteit in meel. 5.3.3.6 Hittestabiliteit van fytase 5 In Figuur 29 staat de fytase-activiteit van fytase 5 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 2 1,8 fytase-activiteit (U/g) 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 meel pellets bij 75°C pellets bij 85°C pellets bij 95°C 0,4 0,2 0 Figuur 29: fytase-activiteit van fytase 5 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen Fytase 5 vertoont trapsgewijs een daling in activiteit bij toenemende procestemperatuur. Het verliest significante hoeveelheden aan fytase-activiteit wanneer pellets worden aangemaakt bij de drie procestemperaturen ten opzichte van de activiteit in meel. In de technische fiche van fytase 5 wordt vermeld dat het fytase aanbevolen wordt om procestemperaturen van 80°C niet te overschrijden. Dit in tegenstelling tot Figuur 29 waar 56 reeds een significante daling in activiteit wordt waargenomen bij procestemperaturen van 75°C ten opzichte van de activiteit in meel. 5.3.3.7 Vergelijking van de fytase-activiteit van fytasen in meel en gepelletiseerd voeder In Figuur 30 staat de fytase-activiteit van alle vijf de fytasen in meel en blanco meel weergegeven. In Figuur 31, Figuur 32 en Figuur 33 staat de fytase-activiteit van alle vijf de fytasen voor gepelletiseerd voeder bij respectievelijk 75, 85 en 95°C weergegeven. 2 0,7 1,8 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,6 fytase 1 fytase 2 fytase 3 fytase 4 fytase 5 blanco fytase-activiteit (U/g) fytase-activiteit (U/g) 1,6 0,4 fytase 1 fytase 2 fytase 3 0,3 0,2 fytase 4 fytase 5 0,1 0,2 0 0 Figuur 30: fytase-activiteit van de fytasen in meel en blanco meel Figuur 31: fytase-activiteit van de fytasen in pellets aangemaakt bij 75°C 1 0,5 0,9 0,5 0,8 0,4 0,7 fytase 1 0,6 fytase 2 0,5 fytase 3 0,4 fytase 4 0,3 fytase 5 fytase-activiteit (U/g) fytase-activiteit (U/g) 0,5 0,4 fytase 1 0,3 fytase 2 0,3 fytase 3 0,2 fytase 4 0,2 fytase 5 0,2 0,1 0,1 0,1 0 0,0 Figuur 32: fytase-activiteit van de fytasen in pellets aangemaakt bij 85°C Figuur 33: fytase-activiteit van de fytasen in pellets aangemaakt bij 95°C Uit Figuur 30 blijkt dat het blanco meel (meel zonder enzymtoevoeging) reeds een fytaseactiviteit bezit. Wanneer fytasen aan het meel worden toegevoegd, wordt een duidelijke toename in activiteit waargenomen. Toevoeging van fytase aan het voeder zorgt dus voor een significante verhoging in de fytase-activiteit. Fytase 5 is op basis van activiteit het meest geschikt voor toevoeging op meelbasis. 57 Uit Figuur 31 blijkt dat fytase 2 en fytase 3 de grootste activiteit vertonen in pellets aangemaakt bij 75°C. Dit wijst erop dat beide fytasen op basis van activiteit het meest geschikt zijn voor deze toepassing. In Figuur 32 wordt waargenomen dat fytase 2 de grootste activiteit vertoont bij de pellets aangemaakt bij 85°C. In Figuur 33 wordt waargenomen dat fytase 2 opnieuw de grootste activiteit vertoont bij pellets aangemaakt bij 95°C. Uit Figuur 31, Figuur 32 en Figuur 33 blijkt dat fytase 2 het meest geschikte fytase is voor het gebruik in pellets, daar het de grootste fytase-activiteit oplevert. 5.3.4 Hittestabiliteit van NSP enzymen Bij de bepaling van de hittestabiliteit per NSP enzym wordt enkel de xylanase-activiteit bepaald in meel en pellets aangemaakt bij respectievelijk 75, 85 en 95°C na toevoeging van het NSP enzym. Hierbij kan geen onderscheid worden gemaakt in wat endogene en exogene xylanase-activiteit is in pellets, aangezien er gaan blanco meel (meel zonder enzymtoevoeging) gepelletiseerd werd. 5.3.4.1 Vergelijking theoretische activiteit en gemeten exogene activiteit in het meel In Tabel 13 staat de dosering van het NSP enzym in meel. Daarnaast staat de theoretische xylanase-activiteit in meel, berekend op basis van de bepaalde xylanase-activiteit bij standaard pH (Figuur 16). Daarnaast staat de gemeten exogene xylanase-activiteit in meel met toegevoegd NSP enzym (verschil tussen xylanase-activiteit in meel met toegevoegd NSP enzym en xylanase-activiteit in blanco meel). Tabel 13: dosering van NSP enzym in meel met de theoretische xylanase-activiteit en de gemeten exogene xylanaseactiviteit in meel van vijf NSP enzymen NSP enzym Dosering in meel (g/ton) theoretische xylanaseactiviteit in meel (U/g) NSP 2 NSP 4 NSP 5 NSP 10 NSP 12 100 50 50 100 100 0,399 0,354 0,073 1,235 0,443 Gemeten exogene xylanase- activiteit in meel (U/g) 0,655 ± 0,092 0,770 ± 0,028 0,378 ± 0,232 1,152 ± 0,079 0,565 ± 0,068 De theoretische activiteit is het grootst bij NSP 10 en dit blijkt ook het grootst te zijn bij de gemeten exogene activiteit. De kleinste theoretische activiteit is bij NSP 5 en dit blijkt ook de kleinste te zijn bij de gemeten exogene activiteit. Er wordt een verschil waargenomen in theoretische activiteit en gemeten activiteit. 5.3.4.2 Hittestabiliteit van NSP 2 In Figuur 34 staat de xylanase-activiteit van NSP 2 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 58 3,5 xylanase-activiteit (U/g) 3 2,5 meel 2 pellets bij 75°C 1,5 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 1 0,5 0 Figuur 34: xylanase-activiteit van NSP 2 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen NSP 2 is een hittestabiel enzym tot procestemperaturen van 85°C. Daar er geen significant verschil in activiteit wordt waargenomen in pellets aangemaakt bij 75°C, 85°C en meel. Bij procestemperaturen van 95°C vertoont het enzym wel significant verlies in activiteit. In de technische fiche van NSP 2 wordt vermeld dat het enzym wordt aanbevolen in gepelletiseerd voeder tot een temperatuur van 85°C, wat overeenstemt met de resultaten in Figuur 34. 5.3.4.3 Hittestabiliteit van NSP 4 In Figuur 35 staat de xylanase-activiteit van NSP 4 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 3,5 xylanase-activiteit (U/g) 3 2,5 meel 2 pellets bij 75°C 1,5 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 1 0,5 0 Figuur 35: xylanase-activiteit van NSP 4 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen NSP 4 is een hittestabiel enzym tot procestemperaturen van 75°C. Daar het enzym geen significant verschil in activiteit vertoont bij procestemperaturen van 75°C ten opzichte van het meel. Er wordt een verlies in activiteit waargenomen bij procestemperaturen hoger dan 75°C, maar er zijn geen significante verschillen in activiteit tussen procestemperaturen van 85 en 95°C. 59 In de technische fiche van NSP 4 wordt vermeld dat het enzym geschikt is voor gepelletiseerd voeder beneden de 85°C. Uit Figuur 35 blijkt dat het enzym inderdaad hittestabiel is tot procestemperaturen van 75°C. 5.3.4.4 Hittestabiliteit van NSP 5 In Figuur 36 staat de xylanase-activiteit van NSP 5 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 3,5 xylanase-activiteit (U/g) 3 2,5 meel 2 pellets bij 75°C 1,5 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 1 0,5 0 Figuur 36: xylanase-activiteit van NSP 5 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen NSP 5 is een hittestabiel enzym tot procestemperaturen van 75°C. Daar het enzym geen significant verlies aan activiteit vertoont bij pellets aangemaakt bij 75°C ten opzichte van het meel. Terwijl de activiteit trapsgewijs afneemt bij toenemende procestemperaturen hoger dan 75°C. In de technische fiche van NSP 5 wordt vermeld dat het aanbevolen is geen procestemperaturen van 90°C te overschrijden. Uit Figuur 36 blijkt echter dat het enzym hittestabiel is tot procestemperaturen van 75°C. 5.3.4.5 Hittestabiliteit van NSP 10 In Figuur 37 staat de xylanase-activiteit van NSP 10 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 60 4 xylanase-activiteit (U/g) 3,5 3 2,5 2 1,5 meel pellets bij 75°C pellets bij 85°C pellets bij 95°C 1 0,5 0 Figuur 37: xylanase-activiteit van NSP 10 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen Bij NSP 10 neemt de xylanase-activiteit af in pellets aangemaakt bij alle drie de procestemperaturen ten opzichte van het meel. Wel wordt in de pellets aangemaakt bij drie procestemperaturen onderling geen significant verschil in activiteit waargenomen. In de technische fiche staat vermeld dat NSP 10 een hittestabiel xylanase is. Uit Figuur 37 blijkt dat er geen significant verschil is tussen de pellets onderling, maar toch wordt een grote terugval waargenomen in activiteit ten opzichte van het meel. 5.3.4.6 Hittestabiliteit van NSP 12 In Figuur 38 staat de xylanase-activiteit van NSP 12 weergegeven in meel en gepelletiseerd voeder. 3,5 xylanase-activiteit (U/g) 3 2,5 meel 2 pellets bij 75°C 1,5 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 1 0,5 0 Figuur 38: xylanase-activiteit van NSP 12 in meel en voeder gepelletiseerd bij drie temperaturen NSP 12 vertoont trapsgewijs een daling in xylanase-activiteit procestemperaturen. In de technische fiche van NSP 12 staat niets vermeld over hittestabiliteit. bij toenemende 61 5.3.4.7 Vergelijking van de xylanase-activiteit van NSP enzymen in meel en gepelletiseerd voeder 4 3,5 3,5 3 3 2,5 2 1,5 1 NSP 2 NSP 4 NSP 5 NSP 10 NSP 12 blanco xylanase-activiteit (U/g) xylanase-activiteit (U/g) In Figuur 39 staat de xylanase-activiteit van alle vijf de NSP enzymen in meel en blanco meel weergegeven. In Figuur 40, Figuur 41 en Figuur 42 staat de xylanase-activiteit van alle vijf de NSP enzymen voor gepelletiseerd voeder bij respectievelijk 75, 85 en 95°C weergegeven. 2 1 0,5 0 0 NSP 5 NSP 10 NSP 12 0,5 0 Figuur 41:xylanase-activiteit van NSP enzymen in pellets aangemaakt bij 85°C xylanase-activiteit (U/g) NSP 2 NSP 4 1 NSP 10 NSP 12 2,5 2,5 1,5 NSP 4 Figuur 40: xylanase-activiteit van NSP enzymen in pellets aangemaakt bij 75°C 3 2 NSP 2 NSP 5 1,5 0,5 Figuur 39: xylanase-activiteit van NSP enzymen in meel en blanco meel xylanase-activiteit (U/g) 2,5 2 NSP 2 1,5 NSP 4 NSP 5 1 NSP 10 NSP 12 0,5 0 Figuur 42: xylanase-activiteit van NSP enzymen in pellets aangemaakt bij 95°C Uit Figuur 39 blijkt dat het blanco meel reeds een aanzienlijke hoeveelheid endogene xylanase-activiteit bevat. De toegevoegde NSP enzymen zorgen slechts voor een kleine verhoging van activiteit in vergelijking met toegevoegd fytase aan het meel (Figuur 30). Alle vijf de NSP enzymen zorgen voor een gelijkaardige xylanase-activiteit in meel. Blijkt dat NSP 2, NSP 4 en NSP 10 het meest aangewezen zijn voor de toepassing in meel op basis van activiteit. Bovendien levert NSP 5 geen significante verhoging aan de xylanase-activiteit van 62 het meel, daar er geen significant verschil in activiteit wordt waargenomen tussen het meel met NSP 5 en het blanco meel. Uit Figuur 40 blijkt dat NSP 4 de grootste xylanase-activiteit vertoont in pellets aangemaakt bij 75°C. Uit Figuur 41 blijkt dat NSP 2 de grootste xylanase-activiteit vertoont in pellets aangemaakt bij 85°C. Uit de Figuur 42 blijkt dat NSP 4 en NSP 10 de grootste xylanase-activiteit vertonen in pellets aangemaakt bij 95°C. NSP 12 is op basis van xylanase-activiteit geen geschikt enzym voor het gebruik in pellets bij procestemperaturen hoger dan 75°C. Daar de activiteit beduidend lager ligt in vergelijking met de andere NSP enzymen. 5.4 Viscositeitsmetingen De viscositeitsmetingen worden uitgevoerd op meel en pellets met toegevoegd NSP enzym en tevens op blanco meel. Het betreft hier dezelfde vijf NSP enzymen die getest worden op hittestabiliteit. Aan de hand van deze metingen wordt nagegaan hoe de viscositeit verloopt in functie van de tijd. Het voeder bevat maïs en soja die de viscositeit beïnvloeden. De NZP fractie van de grondstof maïs bestaat hoofdzakelijk uit xylanen en in mindere mate uit mannanen en βglucanen. De NZP fractie van de grondstof soja daarentegen bestaat hoofdzakelijk uit mannanen (onder andere galactomannanen) en in mindere mate uit xylanen. Het totaal NZP gehalte van soja (13,7%) ligt een stuk hoger dan dat van maïs (7,6%) (4.6.1). 5.4.1 Viscositeitsverloop van meel In Figuur 43 staat de viscositeit in functie van de tijd weergegeven van het blanco meel (zonder enzymtoevoeging) en meel met toegevoegd NSP enzym. In Figuur 44 staat de totale theoretische activiteit van het NSP enzym, bepaald bij standaard pH (Figuur 16, Figuur 18 en Figuur 19). 63 4 3,5 viscositeit (Pa.s) 3 meel met NSP 2 2,5 meel met NSP 4 2 meel met NSP 5 1,5 meel met NSP 10 1 meel met NSP 12 blanco meel 0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) Figuur 43: viscositeitscurve van blanco meel en meel met toegevoegd NSP enzym 180000 160000 enzymactiviteit (U/g) 140000 120000 mannanase-activiteit (U/g) 100000 glucanase-activiteit (U/g) 80000 xylanase-activiteit (U/g) 60000 40000 20000 0 NSP 2 NSP 4 NSP 5 NSP 10 NSP 12 Figuur 44: theoretische mannanse-, glucanase- en xylanase-activiteit van NSP enzymen, bepaald bij standaard pH Het blanco meel (zonder enzymtoevoeging) vertoont een initiële stijging en nadien een daling van de viscositeit in functie van de tijd. De stijging is te wijten aan het in oplossing gaan van de vezels. De daling wordt veroorzaakt door de graaneigen enzymen aanwezig in het meel die de vezels aantasten. De melen met toegevoegd NSP enzym vertonen allen een topviscositeit die hoger ligt dan de topviscositeit van het blanco meel, behalve NSP 4 en NSP 12. De melen met toegevoegd 64 NSP enzym vertonen allen een lagere eindviscositeit dan het blanco meel, behalve het voeder met NSP 12. Het meel met NSP 12 vertoont een viscositeitsverloop die hoger ligt dan het blanco meel. Het enzym NSP 2 bevat xylanase- en glucanase-activiteit en tevens de laagste totale enzymactiviteit van alle NSP enzymen (Figuur 44). Daar het enzym geen mannanaseactiviteit bevat, kan het enzym het aanwezige mannaan in het meel niet afbreken. Bij meel met NSP 2 wordt een daling en een daaropvolgende stijging in viscositeit waargenomen tussen de 60 en 120 minuten. Het meel met NSP 10 vertoont geen stijging in viscositeit na 60 minuten en bevat daarnaast geen mannanase-activiteit. Het enzym NSP 4 bevat xylanase-, glucanase- en mannanase-activiteit (Figuur 44). Hierdoor zullen aanwezige vezels in het meel worden aangetast door het enzym. De grafiek bereikt snel een plateau, wat erop kan wijzen dat NSP 4 een snelwerkend enzym is. Het enzym NSP 5 bevat xylanase-, glucanase- en mannanase-activiteit en tevens de grootste totale enzymactiviteit van alle NSP enzymen (Figuur 44). De grootste totale enzymactiviteit kan een verklaring zijn voor de laagste top in viscositeit die bereikt wordt na 20 minuten. Na 120 minuten wordt een duidelijke daling in de viscositeit waargenomen, wat erop kan wijzen dat het enzym langer doorwerkt. Op de technische fiche van het enzym NSP 4 staat vermeldt dat het enzym de viscositeit in het darmkanaal reduceert. Uit Figuur 43 kan worden waargenomen dat alle vijf de NSP enzymen viscositeitsverlagend werken. Dit maakt dat het geen uniek verkoopspunt is voor het enzym NSP 4. Uit Figuur 43 blijkt dat NSP 5 het meest geschikte NSP enzym lijkt dat viscositeitsverlagend werkt, aangezien deze tot de laagste eindviscositeit leidt in functie van de tijd. 5.4.2 Viscositeitsverloop van pellets 5.4.2.1 Viscositeitsverloop van pellets per toegevoegd NSP enzym Hierbij wordt slechts één NSP enzym besproken, namelijk NSP 12. Dit aangezien het viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP enzym, voor ieder NSP enzym hetzelfde beeld oplevert. De andere grafieken van het viscositeitsverloop van pellets per toegevoegd NSP enzym zijn terug te vinden in bijlage. In Figuur 45 staat de viscositeit in functie van de tijd weergegeven voor pellets met toegevoegd NSP 12. 65 40 35 viscositeit (Pa.s) 30 25 pellets bij 75°C 20 pellets bij 85°C 15 pellets bij 95°C 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) Figuur 45: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 12 Na het bereiken van de topviscositeit wordt bij alle drie de procestemperaturen een daling in viscositeit waargenomen in functie van de tijd. De topviscositeit die bereikt wordt bij pellets is minder scherp dan deze bij meel (Figuur 43). De begin-, top- en eindviscositeit van gepelletiseerd voeder is hoger dan dat van meel (Figuur 43). Naargelang de procestemperatuur van de pellets toeneemt, stijgt de begin-, topen eindviscositeit. Uit de Figuur 45 blijkt dat NSP 12 een goed viscositeitsverlagend effect vertoont in pellets, daar de curven niet ver uit elkaar liggen en de viscositeit blijft dalen in functie van de tijd na het bereiken van de topviscositeit. 5.4.2.2 Viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP enzym bij verschillende procestemperaturen In Figuur 46, Figuur 47 en Figuur 48 staat de viscositeit in functie van de tijd van pellets aangemaakt bij respectievelijk 75, 85 en 95°C met toegevoegd NSP enzym weergegeven. Er blijkt dat naarmate de procestemperatuur toeneemt de begin- en eindviscositeit verhoogt, alsook de topviscositeit. Aangezien er geen viscositeitsmetingen werden uitgevoerd op gepelletiseerd voeder zonder enzymtoevoeging, kan moeilijk besloten worden welk NSP enzym het best viscositeitsverlagend werkt. Er blijkt echter dat bij zowel alle NSP enzymen en dit bij alle drie de procestemperaturen een daling in viscositeit wordt waargenomen. 66 viscositeit (Pa.s) 25 20 NSP 2 15 NSP 4 10 NSP 5 5 NSP 10 NSP 12 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) Figuur 46: viscositeitsverloop van pellets aangemaakt bij 75°C met toegevoegd NSP enzym 30 viscositeit (Pa.s) 25 20 NSP 2 15 NSP 4 10 NSP 5 NSP 10 5 NSP 12 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) Figuur 47: viscositeitsverloop van pellets aangemaakt bij 85°C met toegevoegd NSP enzym 40 viscositeit (Pa.s) 35 30 25 NSP 2 20 NSP 4 15 NSP 5 10 NSP 10 5 NSP 12 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) Figuur 48: viscositeitsverloop van pellets aangemaakt bij 95°C met toegevoegd NSP enzym 67 6 Discussie Bij iedere bepaling van enzymactiviteit wordt rekening gehouden met meetfouten (standaarddeviatie). Deze meetfouten kunnen het gevolg zijn van omgevingsparameters zoals temperatuur, heterogeniteit van het staal of door de handelingen van de operator. 6.1 Bepalen van de specifieke enzymactiviteit Leveranciers gebruiken verschillende eenheden om enzymactiviteit uit te drukken. Dit wijst erop dat er verschillende methodes zijn om enzymactiviteit te bepalen. Hierdoor wordt een onjuist beeld verkregen (Figuur 17) bij de vergelijking van enzymen op basis van hun activiteit. Door de activiteit van enzymen in dezelfde eenheid uit te drukken met behulp van eenzelfde methode, wordt duidelijk welk enzym de grootste activiteit heeft. Tevens moet rekening gehouden worden met enzymsterkte, dosering en kostprijs van het enzym. Een enzym dat de grootste activiteit vertoont, is daarom economisch niet altijd het meest geschikt. Ideaal zou zijn dat de specifieke activiteit van een enzym bij verschillende pH-waarden hetzelfde niveau aanhoudt. Dit is echter niet het geval. Uit Figuur 21, Figuur 22, Figuur 23 en Figuur 24 blijkt dat de specifieke activiteit van een enzym bij verschillende pH-waarden verschillen vertoont. Daarnaast blijkt dat de standaard pH volgens het protocol voor de specifieke enzymactiviteit te bepalen, niet altijd de grootste activiteit vertoont. Ieder enzym heeft een verschillend pH-optimum. Van alle geteste fytasen is enkel fytase 4 van bacteriële oorsprong, de andere fytasen zijn van fungale oorsprong. Fytase 4 vertoont een fytase-activiteit die lager ligt dan de andere fytasen en dit bij alle pH-waarden. Dit kan erop wijzen dat mogelijks fungale fytasen een grotere fytase-activiteit vertonen dan fytasen van bacteriële oorsprong. 6.2 Effect van processing op enzymstabiliteit In Tabel 12 en Tabel 13 worden verschillen waargenomen in theoretische activiteit en gemeten exogene activiteit in meel. Deze verschillen kunnen te wijten zijn aan de heterogeniteit van het staal. Uit Figuur 30 blijkt dat het voeder zonder enzymtoevoeging een fytase-activiteit van 0,067 ± 0,011 U/g bevat. Het voeder bevat de grondstoffen soja en maïs, die van nature reeds een lage fytase-activiteit bezitten (Nyachoti & Woyengo, 2010). Bovendien bevat het voeder zonder enzymtoevoeging een xylanase-activiteit van 2,275 ± 0,160 U/g. Hieruit blijkt dus dat toevoeging van xylanase niet altijd een meerwaarde oplevert voor activiteit in het meel, daar meel zonder enzymtoevoeging reeds een aanzienlijke hoeveelheid endogene xylanaseactiviteit heeft. 68 Bij de hittestabiliteit van fytasen en NSP enzymen wordt de activiteit bepaald in meel en in pellets aangemaakt bij drie conditioneertemperaturen. Tijdens de bepaling van de fytase- en xylanase-activiteit in de pellets wordt geen onderscheid gemaakt in wat endogene en wat exogene activiteit is, aangezien er geen blanco meel (zonder enzymtoevoeging) gepelletiseerd is. Bij de bepaling van de hittestabiliteit van NSP enzymen wordt enkel de xylanase-activiteit bepaald. Dit kan een vertekend beeld geven naar hittestabiliteit, aangezien NSP enzymen eventueel ook een mannanase- en/of glucanase-activiteit hebben. Zo wordt in de technische fiche van NSP 5 vermeld dat het enzym wordt aanbevolen bij procestemperaturen lager dan 90°C. In Figuur 36 wordt waargenomen dat het enzym slechts hittestabiel is tot procestemperaturen van 75°C. NSP 5 bevat theoretisch een grote mannanase- en glucanase-activiteit (Figuur 44). Mogelijks vertoont één of beide van deze activiteiten een voldoende hoge hittestabiliteit waardoor het enzym wel geschikt kan zijn voor procestemperaturen lager dan 90°C. Dit wordt nog eens benadrukt bij NSP 10. Het enzym bevat theoretisch een grote xylanase-activiteit. In de technische fiche wordt vermeld dat NSP 10 een hittestabiel xylanase is. In Figuur 37 wordt waargenomen dat de activiteit tussen de pellets aangemaakt bij verschillende procestemperaturen onderling gelijk blijft, maar wel lager ten opzichte van het meel. In Figuur 26 en Figuur 28 wordt een hogere fytase-activiteit gemeten bij pellets aangemaakt bij 85°C in vergelijking met pellets aangemaakt bij 75°C. Tevens is in Figuur 25 de activiteit van pellets aangemaakt bij 95°C hoger dan de activiteit van de pellets aangemaakt bij 85°C. Verwacht wordt dat de activiteit daalt of gelijk blijft naarmate de procestemperatuur toeneemt. De verhoogde activiteit bij toenemende procestemperatuur kan te wijten zijn aan de heterogeniteit van het staal. 6.3 Viscositeitsmetingen Uit het viscositeitsverloop van meel met toegevoegd NSP enzym (Figuur 43) wordt in alle curven na het bereiken van een topviscositeit een daling waargenomen. Deze daling is mogelijks toe te schrijven aan de xylanase- en/of glucanase-activiteit van het NSP enzym. De topviscositeit van het meel met toegevoegd NSP enzym is bij ieder NSP enzym verschillend en bovendien liggen de meesten onder deze van het blanco meel. De topviscositeit wordt bereikt wanneer er een evenwicht is tussen de opgeloste vezels en enzymen die daarop inwerken. Mogelijks zijn NSP 4 en NSP 12 enzymen die trager beschikbaar worden, waardoor de opgeloste vezels langer aanwezig blijven en de viscositeit doen toenemen. Bij de viscositeitscurven van meel met toegevoegd NSP 2 en NSP 12 wordt na 60 minuten terug een stijging in viscositeit waargenomen. Daar NSP 2 en NSP 12 theoretisch geen mannanase-activiteit hebben (Figuur 44), kunnen zij het aanwezige mannaan in het voeder 69 niet aantasten. Mogelijks zorgt mannaan voor die stijging in viscositeit, wat erop kan wijzen dat mannaan een vezel is die trager in oplossing gaat. NSP 12 vertoont een hogere eindviscositeit dan het blanco meel. Dit is mogelijks, maar niet bewezen dat het enzym bepaalde structuren kapot maakt in het voeder. Dat kan leiden tot de vrijstelling van viscositeitsverhogende componenten. Ideaal zou zijn dat de eindviscositeit van gepelletiseerd voeder met enzymtoevoeging gelijk is aan de eindviscositeit van het meel met enzymtoevoeging. Dit is echter niet het geval. De begin- en eindviscositeit bij pellets is hoger dan deze bij meel. De viscositeitsverhoging tijdens het pelletiseren is het gevolg van zetmeelgelatinisatie, vrijstelling van NZP die eerder ingesloten zaten in de cel en degradatie van endogene en exogene enzymen (Amerah et al., 2011; Cowieson et al., 2005). Een bredere topviscositeit wordt waargenomen bij de pellets in vergelijking met de melen met toegevoegd NSP enzym. Mogelijks komen de enzymen in gepelletsieerd voeder minder makkelijk beschikbaar waardoor ze dus minder snel inwerken op de opgeloste vezels. Uit Figuur 46, Figuur 47 en Figuur 48 wordt een goed viscositeitsverlagend effect waargenomen bij alle drie de conditioneertemperaturen. Dit in tegenstelling tot de hittestabiliteit van de xylanase-activiteit van de NSP enzymen. NSP 4 en NSP 5 zijn slechts hittestabiel voor procestemperaturen tot 75°C en NSP 12 vertoont trapsgewijs een daling van activiteit bij toenemende procestemperaturen. Uit Figuur 44 blijkt dat die NSP enzymen theoretisch meerdere activiteiten hebben. Mogelijks zijn één of meerdere van deze activiteiten wel voldoende hittestabiel bij hogere procestemperaturen, waardoor deze dus viscositeitsverlagend kunnen werken. Mogelijks zijn het voornamelijk de β-glucanen en xylanen die viscositeitsverhogend werken in pellets. NSP 10 vertoont een lagere eindviscositeit bij hoge procestemperaturen in vergelijking met de andere NSP enzymen. Daar NSP 10 theoretisch een hoge xylanaseactiviteit bevat en bovendien de activiteit bij de pellets aangemaakt bij alle procestemperaturen gelijk blijft, zijn het de xylanen die viscositeitsverhogend werken. Daar NSP 12 trapsgewijs een daling vertoont voor zijn xylanase-activiteit bij toenemende procestemperaturen, vertoont het toch een goed viscositeitsverlagend effect bij de pellets. Mogelijks is hier de glucanase-activiteit verantwoordelijk voor het viscositeitsverlagend effect. De blijvende daling in viscositeit in zowel meel als pellets kan ook te wijten zijn aan zijactiviteiten van het enzym die niet gemeten werden en toch inwerken, zoals pectinase en cellulase-activiteit of door endogene enzymactiviteit. Aangezien er geen viscositeitsmetingen zijn uitgevoerd op pellets aangemaakt bij respectievelijk 75, 85 en 95°C zonder enzymtoevoeging, kunnen geen conclusies worden genomen welk enzym nu het best viscositeitsverlagend werkt bij pellets aangemaakt bij een bepaalde procestemperatuur. 70 6.4 Besluit Het gebruik van enzymen in veevoeding zal in de toekomst steeds belangrijker worden. Daar de bevolking toeneemt, is er meer voedsel nodig en is er minder plaats voor landbouwactiviteiten. Hierdoor zal de voederindustrie gedwongen worden om gebruik te maken van nevenstromen uit de voedingsindustrie en van graanafgeleiden uit de biobrandstofindustrie. Verhoogde vraag naar grondstoffen zoals maïs, tarwe, gerst en soja vanuit de voedings- en biobrandstofindustrie zorgt ervoor dat deze minder rijkelijk aanwezig zullen zijn en duurder worden. Sommige van deze grondstoffen bevatten een hoger vezelgehalte en daardoor minder verteerbaar. Hierdoor is men genoodzaakt om gebruik te maken van exogene vezeldegraderende enzymen. Deze zorgen ervoor dat grondstoffen met hoge gehaltes aan vezels gebruikt kunnen worden in veevoeding (Barletta, 2011; Bedford et al., 2014). Gebaseerd op de bekomen resultaten van deze studie kunnen dierproeven worden uitgevoerd met de enzymen die het best scoorden voor hittestabiliteit en viscositeitsverlagend effect. Op die manier wordt nagegaan of wat op laboratoriumschaal bepaald is, overeenkomt met wat in het verteringsstelsel van het dier plaatsvindt. In een volgende studie kan worden nagegaan wat de hittestabiliteit is van endogeen xylanase en fytase van het voeder. Op die manier kan beter bepaald worden wat de hittestabiliteit is van een toegevoegd fytase en NSP enzym. Tevens kan worden bepaald wat het gehalte endogeen xylanase en fytase is van de grondstoffen maïs en soja. Daarnaast kan op de grondstof maïs en soja viscositeitsmetingen worden uitgevoerd. Op die manier kan nagegaan worden welke grondstof de meeste invloed heeft op de viscositeit. Bij de bepaling van de hittestabiliteit van NSP enzymen werd enkel de xylanase-activiteit bij verschillende procestemperaturen bepaald. Om de hittestabiliteit van een NSP enzym in kaart te brengen, zou het beter zijn om alle activiteiten van dit enzym te testen bij de drie procestemperaturen. Tevens kunnen viscositeitsmetingen worden uitgevoerd op pellets aangemaakt bij de drie procestemperaturen zonder toegevoegd NSP enzym. Zo kan worden nagegaan of een NSP enzym inderdaad viscositeitsverlagend werkt in pellets. 71 7 Algemeen besluit Gebruik van exogene enzymen wordt meer en meer belangrijk in veevoeding. Veevoeding bevat namelijk antinutritionele factoren zoals fytinezuur en niet-zetmeelpolysachariden die de nutriëntenopname van het dier verhinderen. Toevoeging van exogene enzymen (fytasen, xylanasen, glucanasen en mannanasen) zorgt ervoor dat de nutriënten beter opneembaar worden, wat leidt tot een betere groei van het dier en minder excretie van voedingsstoffen. In een eerste fase van dit werk werd de vergelijking van de xylanase-activiteit volgens de leverancier en de bepaalde xylanase-activiteit in U/g weergegeven. Hieruit blijkt dat de vergelijking van de enzymactiviteit op basis van de leverancier een vertekend beeld heeft. Dit doordat de leveranciers verschillende methoden gebruiken om enzymactiviteit te bepalen. Hierdoor wordt de enzymactiviteit in verschillende eenheden uitgedrukt, waardoor het moeilijk is de enzymen te vergelijken op basis van activiteit. Daarnaast werd de specifieke enzymactiviteit bepaald bij verschillende pH-waarden, waaruit blijkt dat NSP 12 geschikt is voor het gebruik in biggenvoeder en dat NSP 2 geschikt is voor zowel het gebruik in kippenals biggenvoeder. Het gebruik van exogene enzymen in gepelletiseerd voeder kan resulteren in degradatie van enzymactiviteit, doordat enzymen vaak onvoldoende hittestabiel zijn. Uit de resultaten blijkt dat de meeste fytasen activiteit verliezen bij toenemende procestemperaturen. De xylanaseactiviteit van de meeste NSP enzymen vertoont een goede hittestabiliteit tot procestemperaturen van 75°C. Op basis van de grootte van enzymactiviteit werd beslist welk enzym het meest geschikt is voor welke toepassing. In een laatste fase werden viscositeitsmetingen uitgevoerd. Hieruit blijkt dat alle NSP enzymen een viscositeitsverlagend effect vertonen in functie van de tijd, dit zowel in meel als in gepelletiseerd voeder. In meel vertoont NSP 5 de laagste eindviscositeit. Meerdere metingen dienen uitgevoerd te worden om te besluiten welk NSP enzym het meest viscositeitsverlagend werkt in pellets. 72 8 Literatuurlijst Abdollahi, M.R., Ravindran, V. & Svihus B. (2013). Pelleting of broiler diets: An overview with emphasis on pellet quality and nutritional value. Animal Feed Science and Technology, 179, 1-23. Adeola, O. & Cowieson, A.J. (2011). Opportunities and challenges in using exogenous enzymes to improve nonruminant animal production. Journal of animal science, 89, 31893218. Amerah, A.M., Gilbert, C., Ravindran, V. & Simmins P.H. (2011). Influence of feed processing on the efficacy of exogenous enzymes in broiler diets. World’s Poultry Science Journal, 67, 29-46. Angelov, A., Brady, S., Mientus, M., Schuldes, J., Wemheuer, B. & Zimmerman, P. (2013). Thermostable xylanase and β-glucanase derived from the metagenome of the avachinsky crater in Kamchatka (Russia). Current Biotechnology, 2 (4), 284-293. Aydin, A., Cikim, G., Ekinci, S., Hayirli, A., Onderci, M., Ozercan, I., Ozkose, E., Sahin, K. & Sahin, N. (2008). β-glucanase-producing bacterial culture improves performance and nutrient utilization and alters gut morphology of broilers fed a barley-based diet. Animal Feed Science and Technology, 146, 87-97. Barletta, A. (2010). Introduction: current market and expected developments. In M.R. Bedford & G.G. Partridge (Eds.), Enzymes in farm animal nutrition, 2nd edition, pp. 1-11. Bodmin, UK : MPG books group. Bedford, M. (2008). Next generation thermo-tolerant enzymes for reducing feeding costs. Paper, UK, AB-Vista Feed ingredients, 8 blz. Bedford, M., Camacho, D., O’Neill, H.M., Rubio, J. & Santos, T. (2014). The interaction between cereal quality and enzyme use in animal feed. Paper, UK, AB Vista Feed Ingredients Ltd, 6 blz. Bedford, M.R., Cowieson, A.J., Ravindran, V. & Selle, P.H. (2010). Phytate and phytase. In M.R. Bedford & G.G. Partridge (Eds.), Enzymes in farm animal nutrition, 2nd edition, pp. 160205. Bodmin, UK : MPG books group. Brinch-Pedersen, H., Lei, X.G., Mullaney, E.J. & Porres, J.M. (2007). Phytase: source, structure and application. In A.P. MacCabe & J. Polaina (Eds.), Industrial enzymes. Structure, function and applications, pp. 505-529. Dordrecht, Nederland : Springer. Cao, Y., Chen, X., Chen, Y., Li, Y. & Li, Z. (2010). Effects of β- mannanase expressed by Pichia pastoris in corn-soybean meal diets on broiler performance, nutrient digestibility, energy utilization and immunoglobulin levels. Animal Feed Science and Technology, 159, 5967. Chauhan, P.S., Gupta, N., Puri, N. & Sharma, P. (2012). Mannanases : microbial sources, production, properties and potential biotechnological applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 93, 1817-1830. Choct, M. (2011). Feed polysaccharides: nutritional roles and effect of enzymes. Paper, England, University of New England, Poultry Cooperative Research Centre, 10 blz. 73 Choct, M., Dersjant-Li, Y., McLeish, J. & Peisker M. (2010). Soy oligosaccharides and soluble non-starch polysaccharides: a review of digestion, nutritive and anti-nutritive effects in pigs and poultry. Asian-Australasian Journal Animal Science, 23 (10), 1386-1398. Cooney, G. (2010). Turning up the heat with enzyme technology. Animal Feed Science and Technology, 13 (3), 21-23. Cooney, G. & Gilbert, C. (2011). Thermostability of feed enzymes and their practical application in the feed mill. In M.R. Bedford & G.G. Partridge (Eds.), Enzymes in farm animal nutrition, 2nd edition, pp. 249-258. Bodmin, UK : MPG books group. Cowieson, A.J. (2005). Factors that affect the nutritional value of maize for broilers. Animal Feed Science and Technology, 119, 293-305. Cowieson, A.J., Hruby, M. & Isaksen M.F. (2005). The effect of conditioning temperature and exogenous xylanase addition on the viscosity of wheat-based diets and the performance of broiler chickens. British Poultry Science, 46 (6), 717-724. Davie, T., Jones, O., Nyachoti, M.C. & Slominski, B.A. (2007). Heat stability of endogenous and microbial phytase during feed pelleting. Livestock science, 109, 244-246. Dexter, J.E. & Izydorczyk, M.S. (2008). Barley β-glucans and arabinoxylans : Molecular structure, physicochemical properties, and uses in food products - a review. Food Research International, 41, 850-868. Du Jardin, P., Fauconnier, M.L. & Jamar, C. (2011). Cell wall polysaccharides hydrolysis of malting barley (Hordeum vulgare L.) : a review. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 15 (2), 301-313. E.G. van 22 september 2003 betreffende toevoegingsmiddelen voor diervoeding, Publicatieblad van de Europese Unie, 18 oktober 2003, 29-43. E.G. van 25 april 2008 tot vaststelling van voorschriften ter uitvoering van Verordening (EG) nr. 1831/2003 van het Europees Parlement en de Raad wat betreft de opstelling en indiening van aanvragen en de beoordeling van en de verlening van vergunningen voor toevoegingsmiddelen voor diervoeding, Publicatieblad van de Europese Unie, 22 mei 2008, 1-65. Eeckhout, M. (2015). Veevoedertechnologie. Cursus, Gent, Universiteit Gent, Faculteit Bioingenieurswetenschappen, 188 blz. Froetschner, J. (2006). Conditioning controls pellet quality. Animal Feed Science and Technology, 10 (6), 13-15. Gao, F., Han, Z.K., Jiang, Y. & Zhou, G.H. (2008). The effects of xylanase supplementation on performance, characteristics of the gastrointestinal tract, blood parameters and gut microflora in broilers fed on wheat-based diets. Animal Feed Science and Technology, 142, 173-184. Jackson, M.E. (2010). Mannanase, alpha-galactosidase and pectinase. In M.R. Bedford & G.G. Partridge (Eds.), Enzymes in farm animal nutrition, 2nd edition, pp. 54-95. Bodmin, UK : MPG books group. Johnson, S. & Miles, C. (2009). Sticky droppings : A feed-related poultry problem. Rapport, Washington State University, Mount Vernon Northwest Washington Research and Extension Center, 3 blz. 74 Knudsen, K.E.B. (2001). The nutritional significance of ‘dietary fibre’ analysis. Animal Feed Science and Technology, 90, 3-20. Lamichhane, S., Sahtout, K., Scott, T.A. & Smillie J. (2015). Vacuum coating of pelleted feed for broilers : Opportunities and challenges. Animal Feed Science and Technology, 200, 1-7. Lei, X.G. & Porres, J.M. (2003). Phytase enzymology, applications, and biotechnology. Biotechnology letters, 25, 1787-1794. Meng, X. & Slominski, B.A. (2005). Nutritive values of corn, soybean meal, canola meal, and peas for broiler chickens as affected by a multicarbohydrase preparation of cell wall degrading enzymes. Poultry Science, 84, 1242-1251. Nyachoti, C.M. & Woyengo T.A. (2010). Review : supplementation of phytase and carbohydrases to diets for poultry. Canadian Journal of Animal Science, 91, 177-192. Paloheimo, M., Piironen, J. & Vehmaanperä, J. (2010). Xylanases and cellulases as feed additives. In M.R. Bedford & G.G. Partridge (Eds.), Enzymes in farm animal nutrition, 2nd edition, pp. 12-42. Bodmin, UK : MPG books group. Ravindran V. & Selle, P.H. (2007). Microbial phytase in poultry nutrition. Animal Feed Science and Technology, 135, 1-41. Richtlijn van nr.183/2003 van 12 mei 2014 betreffende European Union Register of Feed Additives, Europese commissie, editie 185. Rosier, S. (1999). Invloed van xylanasepreparaten op de viscositeit van tarwevariëteiten. Eindwerk, Gent, Hogeschool Gent, Departement BIOT, 80 blz. Veevoederadditieven en –contaminanten. Geraadpleegd op 21 april 2015 via http://www.rivm.nl/rvs/Stoffen_producten/Veevoederadditieven_en_contaminanten 75 9 Bijlagen Bijlage 1: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 2 40 35 viscositeit (Pa.s) 30 25 pellets bij 75°C 20 pellets bij 85°C 15 pellets bij 95°C 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) 76 Bijlage 2: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 4 35 30 viscositeit (Pa.s) 25 20 pellets bij 75°C 15 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) 77 Bijlage 3: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 5 35 30 viscositeit (Pa.s) 25 20 pellets bij 75°C 15 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) 78 Bijlage 4: viscositeitsverloop van pellets met toegevoegd NSP 10 35 30 viscositeit (Pa.s) 25 20 pellets bij 75°C 15 pellets bij 85°C pellets bij 95°C 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 tijd (min) 79
