Diagnostiek van acute myeloïde leukemie in een stroomversnelling

commentaren
Diagnostiek van acute myeloïde leukemie in een stroomversnelling
door toepassing van DNA-microarrays
B.Löwenberg, H.R.Delwel en P.J.M.Valk
Zie ook de artikelen op bl. 618, 626 en 638.
Recentelijk werden 2 studies gepubliceerd in The New England
Journal of Medicine waarin de toepassing van de zogenaamde
genchip voor de verbetering van de diagnostiek van leukemie wordt beschreven.1 2 In beide studies concluderen de
onderzoekers dat een completere prognostische classificatie van de ziekte acute myeloïde leukemie (AML) mogelijk
is door toepassing van deze nieuwe DNA-microarraytechnologie. Het gebruik van één enkele test zou in de toekomst
de gebruikelijke routinediagnostiek van AML, zoals morfologische, immunofenotypische, moleculair-genetische en
cytogenetische analyse, kunnen vervangen en daarmee een
efficiëntere diagnostiek van AML mogelijk maken.
dna-microarrays: de techniek
Een combinatie van nieuwe technologieën maakt het mogelijk om de expressie van duizenden genen in één diagnostisch weefselmonster te bepalen; eerder werd de techniek
in dit tijdschrift uitvoerig beschreven.3-5 Bij deze methode
wordt gebruikgemaakt van een genchip, ook aangeduid
als ‘microchip’, ‘biochip’ of ‘microarray’. Op deze genchip
zijn DNA-fragmenten, representatief voor duizenden genen,
in hoge dichtheid op een relatief klein oppervlak aangebracht. De basis voor deze methoden zijn de boodschapper(‘messenger’)-RNA(mRNA)-moleculen, die worden afgeschreven (transcriptie) van corresponderende genen in het
genoom en die coderen voor de verschillende eiwitten die in
een cel kunnen worden gemaakt. De mate van expressie van
een gen kan worden afgelezen aan de hoeveelheid mRNA
aanwezig in een cel. Het mRNA-expressiepatroon van een
groot aantal genen in een weefsel of celpopulatie wordt
genexpressieprofiel genoemd.
Door de transcriptie van weefselspecifieke genen zullen
de genexpressieprofielen tussen verschillende weefsels, bijvoorbeeld spier- en bloedweefsel, variëren. Deze profielen
kunnen ook verschillen weerspiegelen ten gevolge van veranderingen in de actuele toestand van cellen, bijvoorbeeld
wisselingen in delingsactiviteit. Echter, ook genetische defecten die aan de basis liggen van maligne transformatie
Erasmus Medisch Centrum, afd. Hematologie, Postbus 2040, 3000 CA
Rotterdam.
Hr.prof.dr.B.Löwenberg, internist-hematoloog; hr.dr.H.R.Delwel en hr.
dr.P.J.M.Valk, biologen.
Correspondentieadres: hr.prof.dr.B.Löwenberg
([email protected]).
kunnen resulteren in typische tumorgerelateerde genexpressieprofielen.
Een genexpressieprofiel kan worden bepaald met genchips, omdat op een chip duizenden DNA-vlekjes (‘spots’)
zijn gehecht, waarbij elke spot een gen representeert, complementair aan een bepaald mRNA. Van het mRNA dat uit
het weefsel wordt geëxtraheerd, worden kopieën vervaardigd met daaraan gekoppeld fluorescerende moleculen.
Vervolgens wordt het fluorescerende mRNA-mengsel op
de genchip gebracht, waarna specifieke koppeling kan ontstaan: wij spreken van hybridisatie. Door te kiezen voor de
juiste incubatiecondities en wasstappen zullen de verschillende gemerkte mRNA-moleculen na hybridisatie specifiek
binden op de spots waar de exacte complementaire DNAmoleculen zich bevinden.
De mate van fluorescentie op een spot is een maat voor
de hoogte van de expressie van het gen in het geanalyseerde weefsel. Er zijn verschillende methoden voor genchipexpressieanalyse ontwikkeld. Een bekend platform is de van
vlekken voorziene (‘spotted’) microchip waarbij een matrix
van DNA-moleculen in systematische ordening op een
objectglaasje is aangebracht met behulp van een robot (zogenaamde ‘spotter’). Het kan daarbij gaan om complementair DNA (ook wel ‘copy’-DNA (cDNA)) ofwel DNA in de
vorm van oligonucleotiden.
Bij het gebruik van deze genchip worden 2 RNA-monsters van verschillende weefsels omgezet in cDNA en vervolgens gelabeld met 2 verschillende fluorescerende moleculen, respectievelijk cyanine 5 (Cy5) met rode fluorescentie
en cyanine 3 (Cy3) met groene. Op deze wijze kan binnen
één experiment een genexpressieprofiel van een diagnostisch monster (bijvoorbeeld een tumor) worden vergeleken
met dat van een referentiemonster (bijvoorbeeld normaal
weefsel).
Bij een andere bekende methode wordt gebruikgemaakt
van een commercieel verkrijgbare genchip, de zogenaamde
Affymetrix GeneChip. Wederom zijn de DNA-moleculen
(in dit geval oligonucleotiden) in hoge dichtheid en op
geordende wijze op het oppervlak aangebracht. Het cRNA
wordt in dit geval gelabeld met een biotinemolecuul, dat
in een later stadium kan worden gedetecteerd met een fluorescerend molecuul dat gekoppeld is aan streptavidine. Bij
deze methode wordt geen gebruik gemaakt van een referentiemonster. Met de nieuwste GeneChip kan de expressie
van tenminste 20.000 genen worden geanalyseerd. Met een
Ned Tijdschr Geneeskd 2005 19 maart;149(12)
623
laserscanner wordt de expressie van de genen gemeten.
Door bio-informatische programma’s worden de gegevens
geordend en geanalyseerd en worden de expressieprofielen
bepaald.
toepassing van genchips bij acute myeloïde
leukemie en klinische consequenties
AML is een kwaadaardige aandoening waarbij onrijpe myeloïde cellen zich ophopen in het beenmerg en er een tekort
is aan functionele bloedcellen. De ziekte wordt veroorzaakt
door defecten in genen die een rol spelen bij de celvermeerdering en uitrijping van de bloedvormende cellen. Dergelijke genetische afwijkingen in beenmerg-voorlopercellen
liggen ten grondslag aan de maligne transformatie van de
hematopoëtische cel.
De diagnose ‘AML’ werd traditioneel gesteld op grond
van beenmergcytologisch onderzoek, op geleide van morfologische en cytochemische kenmerken. Immunologische
methoden blijken vooral zinvol om AML te onderscheiden
van lymfatische maligniteiten. Voor de verdere indeling van
AML in subgroepen is cytologisch onderzoek van beperkte
waarde gebleken.6 7 Het zijn met name de cytogenetische
veranderingen, vast te stellen via zogenaamd chromosoomonderzoek, die verschillen in prognose kunnen voorspellen.
Cytogenetisch onderzoek biedt de mogelijkheid om
entiteiten die onder de verzamelnaam AML schuilgaan, te
herkennen. Zo is het mogelijk om de acute promyelocytenleukemie, een ziekte die een specifieke therapie vraagt,
te herkennen aan de chromosoomtranslocatie t(15;17). De
chromosomale gegevens kunnen vanwege hun prognostische waarde ook de therapiekeuze dienen, bijvoorbeeld om
de vraag te beantwoorden of een patiënt al dan niet in aanmerking zou moeten komen voor een stamceltransplantatie.
Meer recent is gebleken dat bepaalde kleine moleculaire
afwijkingen zoals puntmutaties in genen die gemist worden
bij standaardchromosoomonderzoek, maar die opgepikt
worden in een polymerasekettingreactie, eveneens de prognose kunnen voorspellen.8-11 De opkomst van het cytogenetisch en moleculair-genetisch onderzoek markeert het begin
van een ontwikkelingsstroom die het mogelijk maakt de
exacte moleculaire basis van leukemieën te ontsluiten. Op
dit moment staan wij in feite nog pas aan het begin van deze
ontwikkeling. Immers, bij de meeste patiënten met AML
lukt het nog niet de onderliggende moleculaire of cytogenetische afwijking op te helderen. Het bepalen van het
genexpressieprofiel met de genchip betekent in dit verband
een belangrijke stap voorwaarts.
624
genexpressieprofielen bij acute myeloïde
leukemie
Wat is er tot nu toe gevonden met de genchiptechnologie bij
acute myeloïde leukemie? In belangrijke genexpressiestudies van 6 jaar geleden is in eerste instantie aangetoond dat
acute lymfatische leukemie (ALL) en AML kunnen worden
onderscheiden op basis van hun karakteristieke genexpressieprofiel.12 Inmiddels is via vervolgonderzoek de ontrafeling van de heterogene ziekte AML volop gaande. De 2 recent verschenen studies, waarin grotere groepen patiënten
met AML werden geanalyseerd, laten niet alleen zien dat
de reeds bekende cytogenetische subtypen van AML scherp
kunnen worden geïdentificeerd op grond van een typisch
genexpressiepatroon,1 2 maar ook dat door een kenmerkend
genexpressieprofiel tevoren onbekende subgroepen van
AML zichtbaar worden. De bevindingen in deze onderzoekingen leiden naar belangrijke gevolgtrekkingen:
– Het is mogelijk met één enkele techniek een grote variatie
aan soorten (subtypen of entiteiten) binnen een zo heterogene maligniteit als AML te herkennen. Waarschijnlijk zijn
bij deze leukemie-entiteiten verschillende genen of combinaties van genen actief betrokken die een kenmerkend
stempel op het expressiepatroon drukken. Daar kan in de
toekomst gebruik van worden gemaakt bij de moleculairdiagnostische herkenning van AML.1 2 13-16
– De diagnostische kracht van de microarraymethode is
opmerkelijk. De cytogenetische afwijkingen, die in bepaalde
gevallen waren gemist bij standaard-karyotypering, komen
alsnog aan het licht vanwege het karakteristieke expressieprofiel.1
– Niet alleen subtypen van leukemie met de typische cytogenetische afwijkingen, maar ook leukemieën met subtiele
mutaties, niet zichtbaar onder de microscoop, vallen op
door hun uitgesproken genexpressieprofiel.1
– Bepaalde genexpressieprofielen blijken te correleren met
overleving en respons op therapie. Zij kunnen dienen als
voorspellers van de uitkomst van de behandeling.1 2
toekomstperspectieven
Verwacht wordt dat de kenmerkende genexpressiepatronen
een sleutel zullen verschaffen tot de mechanismen van
transformatie als gevolg van de onderliggende genetische
afwijkingen. In feite gaat het om het ontdekken van de ontregeling van signaalpaden in de cel die het gevolg zijn van
de verworven genetische defecten. Omdat leukemie ontstaat
ten gevolge van de samenwerking tussen meer dan één
enkele genetische afwijking en er dus meer ontregelde
intracellulaire paden van signaalactivering in samenhang
tot leukemie leiden, zal in de komende jaren veel aandacht
uitgaan naar de ontrafeling van deze paden.
De verwachting is dat deze inzichten in cellulaire ont-
Ned Tijdschr Geneeskd 2005 19 maart;149(12)
regeling aangrijpingspunten zullen kunnen opleveren voor
de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Deze ontwikkeling
begint reeds voorzichtig haar stempel op de klinische praktijk te drukken. Denk maar aan de komst van een reeks
van kinaseremmers die de functie van de producten van
bepaalde oncogenen uitschakelen, zoals imatinib bij chronische myeloïde leukemie.
De ontwikkeling van de moleculaire diagnostiek zal in de
toekomst verdergaan door de komst van nieuwe genchips
die een groter aantal DNA-fragmenten bevatten en daardoor
een nog breder zicht bieden op het genexpressieprofiel.
Parallel aan de ontwikkeling van de genexpressiechip vinden ook belangrijke ontwikkelingen plaats op het gebied
van mutatieanalysen, eveneens op brede schaal. Daarbij gaat
het dus niet om de verhoogde of verlaagde expressie van
genen, maar om het rechtstreeks aantonen van mutaties en
polymorfismen van een groot aantal genen. Deze benadering, gekoppeld aan genexpressieonderzoek en het grootschalige peptideonderzoek (‘proteomics’) dat in opkomst
is, alsmede ontwikkelingen in de sector van de informatietechnologie (bio-informatica), zullen in de komende jaren
de klinische diagnostiek in nieuwe banen leiden.
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld.
15
Aanvaard op 17 januari 2005
16
Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK,
Vardiman J, et al. World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of
the Clinical Advisory Committee meeting – Airlie House, Virginia,
November 1997. J Clin Oncol 1999;17:3835-49.
Löwenberg B, Downing JR, Burnett A. Acute myeloid leukemia.
N Engl J Med 1999;341:1051-62.
Levis M, Small D. FLT3: ITDoes matter in leukemia. Leukemia
2003;17:1738-52.
Nakao M, Yokota S, Iwai T, Kaneko H, Horiike S, Kashima K, et al.
Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid
leukemia. Leukemia 1996;10:1911-8.
Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S, Erpelinck C,
Meijer J, Oosterhoud S van, Putten WL van, Valk PJ, et al. Biallelic
mutations in the CEBPA gene and low CEBPA expression levels
as prognostic markers in intermediate-risk AML. Hematol J 2003;4:
31-40.
Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S, Erpelinck C, Putten
WL van, Valk PJ, Poel-van de Luytgaarde S van der, Hack R, et al. High
EVI1 expression predicts poor survival in acute myeloid leukemia:
a study of 319 de novo AML patients. Blood 2003;101:837-45.
Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov
JP, et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class
prediction by gene expression monitoring. Science 1999;286:531-7.
Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB, Pieters R, Boer ML den,
Minden MD, et al. MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nat Genet 2002;
30:41-7.
Schoch C, Kohlmann A, Schnittger S, Brors B, Dugas M, Mergenthaler S, et al. Acute myeloid leukemias with reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene expression profiles. Proc
Natl Acad Sci USA 2002;99:10008-13.
Debernardi S, Lillington DM, Chaplin T, Tomlinson S, Amess J,
Rohatiner A, et al. Genome-wide analysis of acute myeloid leukemia
with normal karyotype reveals a unique pattern of homeobox gene
expression distinct from those with translocation-mediated fusion
events. Genes Chromosomes Cancer 2003;37:149-58.
Ross ME, Mahfouz R, Onciu M, Liu HC, Zhou X, Song G, et al. Gene
expression profiling of pediatric acute myelogenous leukemia. Blood
2004;104:3679-87.
Literatuur
1
2
3
4
5
Valk PJ, Verhaak RG, Beijen MA, Erpelinck CA, Barjesteh van Waalwijk van Doorn-Khosrovani S, Boer JM, et al. Prognostically useful
gene-expression profiles in acute myeloid leukemia. N Engl J Med
2004;350:1617-28.
Bullinger L, Dohner K, Bair E, Frohling S, Schlenk RF, Tibshivani R,
et al. Use of gene-expression profiling to identify prognostic
subclasses in adult acute myeloid leukemia. N Engl J Med 2004;350:
1605-16.
Braam GB, Bluyssen HAR, Voest EE, Koomans HA. Genexpressieanalyse met behulp van DNA-microarrays. Ned Tijdschr Geneeskd
2002;146:1867-73.
Linn SC, Rijn M van de, Giaccone G. Toekomstige verfijning van diagnostiek en therapie met DNA-microarrays. I. Technologie en dataanalyse. Ned Tijdschr Geneeskd 2003;147:795-9.
Linn SC, Rijn M van de, Giaccone G. Toekomstige verfijning van diagnostiek en therapie met DNA-microarrays. II. Toepassingen. Ned
Tijdschr Geneeskd 2003;147:800-4.
Abstract
The diagnosis of acute myeloid leukaemia enhanced by using DNA microarrays. – Recently, two studies have shown that the use of gene-expression
profiling using DNA microarrays or DNA chips may improve the classification of acute myeloid leukaemia (AML). In both studies, cluster analyses based on the molecular signatures defined known subgroups as well
as novel subgroups of AML. Chromosomal lesions, mutations, and abnormal gene expression with prognostic value determined the clustering.
In fact, gene-expression profiling recognized leukaemias with certain
chromosomal aberrations that had been missed by routine cytogenetics.
Thus, gene-expression profiling allows a comprehensive classification of
AML that includes previously-identified genetically-defined as well as
novel prognostically-relevant subgroups. One comprehensive DNA chip
may in the future replace a variety of cytogenetic, immunological and
molecular techniques that are currently used in combination.
Ned Tijdschr Geneeskd 2005;149:623-5
Ned Tijdschr Geneeskd 2005 19 maart;149(12)
625