Tools voor genetische analyse in polyploïde gewassen

Tools voor genetische analyse in polyploïde
gewassen: een brug tussen aardappels,
bloemen en groenten
12 mei 2014, Netwerkdag TKI Uitgangsmaterialen
Chris Maliepaard, Wageningen UR Plant Breeding
Polyploïde gewassen
Tetraploïd (4N),
bijv. aardappel,
prei, roos
Hexaploïd (6N),
bijv. chrysant
Achtergrond project
 Diploïden: genetische kartering met DNA-merkers
inmiddels standaard
 (Auto-)polyploïde kruisings-populatie (F1 van kruising)
● Veel complexere genetica
● Groot aantal merkers nodig
● Methoden en software nodig
 Nú beter mogelijk dan voorheen
 Niet gewasafhankelijk: generiek voor veel polyploïde
gewassen
Complexere genetica


Meer dan twee allelen mogelijk
Alleldosis kan variëren van 0 tot 4 (tetraploid)
● nulliplex, simplex, duplex, triplex, quadruplex
● aaaa, aaab, aabb, abbb, bbbb
● Twee homozygoten, drie verschillende heterozygoten
● Bij kruising: alle paarsgewijze mogelijkheden
● Uitsplitsingen: 1:1 1:2:1 1:4:1 1:5:5:1 1:8:18:8:1
● Paring chromosomen tijdens meiose
● Bivalenten of quadrivalenten in tetraploid
● Willekeurige of preferentiële paring
● Meer merkers nodig – voor elk homoloog chromosoom
bivalenten
quadrivalent
Doelen van het project
 Methoden voor genetische analyse in polyploïden
 Software voor toepassing
 Betere kennis over de genetica van polyploïden
 Kennisuitwisseling en overdracht –bijv. gebruik
methoden en software (workshops) naar bedrijfspartners
Voorgeschiedenis
 Ideeën ± 2003: Plantum, preiveredelaars
 Daarna snelle ontwikkelingen in genetica/genomica:
 Next-Generation sequencing, genotyperingsplatforms
● Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
● Veel grotere aantallen merkers
● Goedkopere genotypering populaties
● SNP arrays
 Betere software: fitTetra dosis-bepaling SNPs
● Voorrips et al. 2011
Totstandkoming TKI-project
 TTI-Groene Genetica project polyploïden 2010-2012
● Core project: geen financiering bedrijven
● Bedrijven wel betrokken: klankbord
● Succesvolle demonstratie mogelijkheden (aardappel, roos)
● Tetraploïde kaart individuele homologe
chromosomen
● Validatie aan aardappel-sequentie
● Software-scripts – goed begin voor TKI-polyploïdenproject
 Toenemende belangstelling sierteelt-sector
● Studiekring Plantenveredeling – polyploïden, Nov. 2011
● Presentatie resultaten TTI-GG aan bedrijven, Juni 2012
● 100 jaar Plantenveredeling - Sessie polyploïden, Nov. 2012
Totstandkoming TKI-project
 Andere lopende/geplande onderzoeksprojecten:
●
●
●
●
Ui/prei-TTI-project met Olga Scholten, Roeland Voorrips
Roos: karteringsstudies snijroos/tuinroos met AIOs
Aardappel associatie-studies
Chrysant-AIO-project Geert v Geest met PBR (Paul Arens)
WU Tuinbouwketens (Uulke v Meeteren)
 Aardappel, prei, siergewassen
● vergelijkbare vragen mbt toepassing merkers, genetische
kartering, QTL-analyse
Structuur van het project
Partners polyploïden-project
 2 Aardappel-veredelingsbedrijven
 2 Groenten-veredelingsbedrijven
 5 Siergewassen-veredelingsbedrijven
 1 Amerikaanse bedrijfspartner, akkerbouwgewas
 Plant Res. Intl. – Plant Breeding, Biometris
 Wageningen Universiteit - Plant Breeding, Biometris
 TKI-Uitgangsmaterialen
Meerwaarde kruisbestuiving typen bedrijven
 Kennisuitwisseling merkers, genetica polyploïden
 Wat voor 1 gewas is ontwikkeld, bruikbaar voor andere
 Meer aspecten aan bod:
● Tri-, tetra- en hexaploïde F1-populaties
● Disome/tetrasome overerving
● Fysieke sequentie al dan niet beschikbaar
● Kwalitatieve/kwantitatieve eigenschappen
● Typen merkers, arrays, populaties
● Vergelijkingen tussen gewassen
● Bijv. chromosoomparing, quadrivalenten etc.
Toevoegen partners
 Mogelijk en wenselijk, wel afspraken
● Veredelingsbedrijven die later instappen: toegang
tot zelfde kennis, methoden, software – ook zelfde
verplichtingen
● Geen toegang tot vertrouwelijke kennis concurrent
● Instemming huidige partners vereist
● als werkt op zelfde gewas
 Sinds start: nieuwe partner toegevoegd
 Ook: nieuw TKI-project toegevoegd
● Uitbreiding rol een van de huidige partners
● vrijwel rond
Aanpak

Stap 1: Sequencen, SNP detectie, SNP-array-ontwikkeling
genotypering populatie met SNPs

Stap 2: Dosisbepaling met fitTetra, toewijzing
uitsplitsings-type, selectie bruikbare merkers

Stap 3: Merkers indelen naar chromosoom en
homoloog; kaart-constructie, validatie
(fysieke kaart, verwante soorten,
grootouders, etc.)


Stap 4: Kaart-integratie over alle uitsplitsings-types
Stap 5: Model, methode, software voor polyploïde QTLanalyse
Stap 1: Sequencen, SNPs, genotypering
 Sequencen kruisingsouders
 Identificatie geschikte SNPs
 Grote aantallen:
● Aardappel: 20K SNP-array (Infinium)
● Roos: 68K array (Affymetrix Axiom) x 2 probes
Stap 2:
Bepaling alleldosis en uitsplitsings-type, selectie bruikbare
merkers
Bepaling allel-dosis in tetraploïden
 Vier kopieën van elk gen of merker-allel
● Vijf mogelijke genotypen per locus
voor SNPs:
Genotype
Allelverhouding
Fractie b
aaaa = nulliplex (voor b)
4:0
0.00
aaab = simplex
3:1
0.25
aabb = duplex
2:2
0.50
abbb = triplex
1:3
0.75
bbbb = quadruplex
0:4
1.00
Signaal a-allel vs. signaal b-allel
nulliplex
simplex
duplex
triplex
quadruplex
Software: fitTetra (vrij beschikbaar; R pakket)
Dosis toegekend als p > 0.99
0
1
2
3
4
Kansen v elke klasse
P0
P1
0.00
0.00
P2
P3
P4
1.00 0.00
0.00
0.00
0.00
0.77 0.00
0.23
Signaalverhouding b/(a+b)
Voorrips et al. (2011)
Goed te scoren SNPs (aardappel)
Type
#SNPs
%
remark
Op array
17987
100.0
fitTetra scores
15266
84.9
1 of 2 ouders goed te scoren
15227
84.7
F1-uitsplitsing ok
13842
80.0
F1-geen uitsplitsing (monomorf)
6588
0x0 of 4x4
6573
0x4
F1 goed te scoren en
uitsplitsend
Rest: niet splitsend of onduidelijk, signaal te laag
Rest: geen goede fit, null-allelen, >3% niet te scoren
15
7254
40.3
Dosis ouders
Simplex x nulliplex
Simplex x quadruplex
Triplex x nulliplex
Triplex x quadruplex
Duplex x nulliplex
Duplex x quadruplex
Simplex x simplex
Simplex x triplex
Triplex x triplex
Duplex x simplex
Duplex x triplex
Duplex x duplex
Totaal
Uitsplitsing #SNPs
1:1
3280
P1
1547
P2
1733
424
1:4:1
895
471
1:2:1
1403
Beide
Beide
1:5:5:1
1368
Beide
Beide
1:8:18:8:1
308
7254
Beide
Beide
Stap 3
 Toekennen merkers aan chromosomen en homologen
per chromosoom; maken merkerkaart
 Eerst de 1:1 uitsplitsende merkers: simplex x nulliplex
Simplex x nulliplex toekennen
Chromosoom volgens fysieke sequentie
Locus
Group Position
solcap_snp_c2_49911
1
0 chr01
PotVar0124464
1
0.25 chr01
PotVar0124515
1
0.425 chr01
solcap_snp_c2_49917
1
0.425 chr01
PotVar0127038
1
2.58 chr01
PotVar0126769
1
3.004 chr01
PotVar0126587
1
3.855 chr01
PotVar0036149
1
3.855 chr01
PotVar0035378
1
7.35 chr01
PotVar0060667
1
12.221 chr01
PotVar0060753
1
12.221 chr01
PotVar0060678
1
12.221 chr01
solcap_snp_c2_13650
1
58.009 chr01
PotVar0032887
1
61.065 chr01
PotVar0049692
1
69.612 chr01
PotVar0018832
1
76.119 chr01
PotVar0122550
1
78.717 chr01
PotVar0122547
1
78.717 chr01
PotVar0014240
1
78.717 chr10
PotVar0100729
1
79.141 chr01
solcap_snp_c1_14649
1
80.858 chr01

Locus
solcap_snp_c2_12526
PotVar0044087
PotVar0044411
solcap_snp_c1_12597
PotVar0044278
solcap_snp_c2_28186
solcap_snp_c2_28176
solcap_snp_c2_28167
PotVar0048012
solcap_snp_c1_8713
solcap_snp_c1_8709
solcap_snp_c2_28309
solcap_snp_c1_9918
PotVar0047829
PotVar0047976
solcap_snp_c2_50620
PotVar0047616
solcap_snp_c2_26040
PotVar0104502
solcap_snp_c2_4530
solcap_snp_c2_52104
solcap_snp_c1_8601
PotVar0132077
Group
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
Position
0
3.076
3.933
3.933
3.933
9.272
9.272
9.272
9.272
9.272
9.272
9.272
9.695
11.851
11.851
12.702
13.984
13.984
23.737
44.315
47.494
47.946
53.73
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr07
chr08
chr07
Toekennen aan chromosomen vrij eenvoudig:
● JoinMap: 12 Koppelingsgroepen =12 chromosomen
● Af en toe verschil genetische kartering /fysieke kaart (14x)
1
Vier homologen ouder 1, chrom 1
0.0
2.2
4.4
5.7
7.0
12.9
21.1
22.8
23.3
25.9
32.3
40.9
43.9
63.3
64.2
81.7
82.6
87.5
91.0
91.8
92.2
94.8
95.0
95.3
98.8
100.0
100.5
PotVar0072076
solcap_snp_c2_6683
solcap_snp_c2_6713
PotVar0044823
PotVar0045000
PotVar0045662 PotVar0045260
PotVar0102229 solcap_snp_c1_14649
PotVar0114353 PotVar0100717
PotVar0100762 PotVar0100729
PotVar0122547 PotVar0122550
PotVar0014240
PotVar0018832
PotVar0049692
PotVar0032887 PotVar0032906
solcap_snp_c2_13650
PotVar0006246
PotVar0006356
PotVar0061043
PotVar0060678 PotVar0060667
PotVar0060753
PotVar0035378
PotVar0126587 PotVar0036149
PotVar0126769
PotVar0127038
solcap_snp_c2_49911
PotVar0124464
PotVar0124515 solcap_snp_c2_49917
PotVar0099756 PotVar0099782
PotVar0122388 solcap_snp_c2_31041
PotVar0122353 PotVar0122386
PotVar0122414
PotVar0122423
homoloog 1
0.0
0.4
0.9
PotVar0120088
PotVar0119912
PotVar0119975
0.0
solcap_snp_c2_51800
0.0
0.4
9.8
solcap_snp_c2_49732
2.6
6.5
11.4
12.7
15.3
16.2
36.7
37.6
37.8
38.0
41.6
43.3
43.7
44.1
44.6
46.3
47.1
50.2
50.6
52.3
53.2
59.5
59.9
60.7
61.6
62.8
64.2
64.6
solcap_snp_c2_43970
PotVar0118576
solcap_snp_c1_14648 PotVar0028605
PotVar0122549 PotVar0037326
PotVar0071533
solcap_snp_c2_45621
PotVar0071575 PotVar0018968
PotVar0018985 PotVar0071624
PotVar0018687 solcap_snp_c2_35503
solcap_snp_c2_35537 solcap_snp_c2_35536
PotVar0049754 PotVar0049777
PotVar0049542 PotVar0049593
solcap_snp_c2_38404
solcap_snp_c2_32367
PotVar0049005
PotVar0126052
solcap_snp_c1_13686 solcap_snp_c2_40954
PotVar0126035
PotVar0032926
PotVar0032928 PotVar0032910
solcap_snp_c2_13751
homoloog 2
38.7
41.7
42.2
43.0
45.2
54.7
56.6
59.2
60.0
66.8
67.7
68.1
68.5
PotVar0098709
PotVar0098422 PotVar0098430
PotVar0098530
solcap_snp_c2_20521
PotVar0072139
PotVar0043665
PotVar0006198
solcap_snp_c1_3853 solcap_snp_c1_3854
solcap_snp_c2_12215
PotVar0006384
PotVar0041770 PotVar0041748
PotVar0041852 PotVar0041837
PotVar0042153
PotVar0049792
PotVar0049974 PotVar0050056
PotVar0050116 PotVar0050140
PotVar0050484 PotVar0050638
homoloog 3
43.3
44.6
45.5
46.3
47.2
47.6
48.0
48.4
48.9
53.7
55.0
55.9
56.7
57.2
63.9
64.8
65.6
67.3
68.2
70.8
76.6
84.3
89.7
93.2
1
PotVar0120126
PotVar0119973 PotVar0119913
PotVar0120075
PotVar0071852
PotVar0072072 solcap_snp_c2_6906
PotVar0044815
solcap_snp_c2_21099
solcap_snp_c1_6674
solcap_snp_c2_21234
solcap_snp_c2_686 PotVar0102233
PotVar0100708 solcap_snp_c2_2873
solcap_snp_c2_55618
PotVar0014900
solcap_snp_c2_54303 PotVar0071270
solcap_snp_c2_45395 PotVar0088430
solcap_snp_c2_53763 solcap_snp_c2_54306
solcap_snp_c1_5477
solcap_snp_c2_2653
solcap_snp_c2_35518
PotVar0124795
PotVar0006104
solcap_snp_c2_38406 PotVar0049628
PotVar0049426 PotVar0049273
PotVar0049427 PotVar0049351
PotVar0049291
PotVar0049174 solcap_snp_c1_12131
solcap_snp_c2_41339
solcap_snp_c1_4744
solcap_snp_c2_14580
solcap_snp_c2_14589
PotVar0129827
solcap_snp_c1_4763
PotVar0098497
solcap_snp_c2_20530
PotVar0098389
PotVar0072133
PotVar0072157
PotVar0043650
solcap_snp_c1_5653
PotVar0041677
PotVar0028699 PotVar0028811
solcap_snp_c2_7007
homoloog 4
Validatie met fysieke sequentie
P1 Chr 1 Homoloog 1
P1 Chr 1 Homoloog 2
100
80
Gen. positie (cM)
Gen. positie (cM)
100
60
40
20
0
0,00E+00 2,00E+07 4,00E+07 6,00E+07 8,00E+07 1,00E+08
80
60
40
20
0
0,E+00
2,E+07
Fysieke Kaartpositie
8,E+07
P1 Chr 1 Homoloog 4
100
100
80
Gen. positie (cM)
Gen. positie (cM)
6,E+07
Fysieke Kaartpositie
P1 Chr 1 Homoloog 3
60
40
20
0
0,E+00
4,E+07
2,E+07
4,E+07
6,E+07
Fysieke Kaartpositie
8,E+07
1,E+08
80
Lange arm
60
Centromeer
40
20
0
0,E+00
Korte arm
2,E+07
4,E+07
6,E+07
Fysieke kaartpositie
8,E+07
1,E+08
Stap 4: integratie alle merkertypen
 Nog in ontwikkeling, wel al eerste resultaten
Op weg naar kaart-integratie (snijroos)
H1
Hier:
Simplex x nulliplex
Simplex x simplex
Duplex x nulliplex
H1_SxN
0.0
0.4
0.5
1.1
1.3
1.5
3.9
4.1
4.6
5.0
8.2
8.8
9.0
10.0
RhK5_3227_966R42
RhMC_10886_879R42
RhMC_7560_1265R42
RhK5_3734_1149R42
RhMC_17265_281R42
RhMC_5378_1008R42
K5_21865_126R33
RhK5_17663_793R42
K5_1100_2297R11
12GR_46627_260R11
RhK5_11182_1896R42
RhK5_2667_1364R42
RhK5_9135_266R42
RhMC_218_1049R42
25.4
25.9
26.2
26.6
26.7
27.0
28.3
29.0
30.3
30.9
Rh12_21601_1089R01
RhK5_1097_1427R43
K5_4439_976R33
K5_6720_562R33
RhK5_7593_828R01
RhK5_4334_1326R01
RhK5_7142_692R01
RhK5_2768_330R43
RhK5_632_306R43
Rh12_2505_1835R01
35.3
35.4
36.1
37.3
38.0
38.8
12GR_22536_456R33
K5_3974_589R33
K5_204_3377R11
RhK5_2359_1357R43
RhK5_4174_524R43
RhK5_3493_1545R01
43.6
RhK5_1586_435R43
49.6
51.1
51.2
51.3
51.5
52.4
52.8
53.2
54.0
54.7
54.8
54.9
55.1
55.3
55.5
57.0
57.6
58.6
59.0
59.3
59.6
60.5
61.8
62.6
64.3
66.3
68.2
69.2
71.7
K5_701_1858R33
K5_3028_1539R11
K5_9138_1486R33
MCRND_21021_1777R33
K5_17159_89R11
K5_2560_1635R33
RhK5_9919_1180R01
RhK5_7286_637R43
Rh12_18534_102R01
K5_8088_195R11
12GR_16710_1568R33
K5_13720_1505R11
K5_6079_747R11
K5_15594_833R33
Rh12_12405_153R43
RhK5_3568_558R01
RhK5_4018_818R43
RhK5_4690_1027R43
Rh12_91221_504R43
RhMC_511_2491R01
RhMC_24936_108R43
RhK5_16900_140R43
RhK5_5952_759R43
MCRND_16962_563R11
RhMC_3676_1294R43
RhK5_2131_946R01
RhK5_15967_513R01
RhK5_15967_884R02
RhK5_1345_877R43
0.0
0.5
0.8
1.3
1.5
2.7
3.4
3.5
4.1
4.7
5.4
Rh12_21601_1089R01
RhK5_2149_799R43
RhK5_1097_1427R43
RhK5_2198_544R43
RhK5_4334_1326R01
RhK5_7142_692R01
RhK5_13288_1030R01
RhK5_2768_330R43
Rh12_57182_457R43
RhK5_632_306R43
Rh12_2505_1835R01
12.0
12.7
13.4
RhK5_2359_1357R43
RhK5_4174_524R43
RhK5_3493_1545R01
18.4
RhK5_1586_435R43
29.2
30.7
32.0
32.1
32.7
34.1
34.2
34.3
34.7
35.6
36.9
39.4
41.4
41.5
RhK5_8088_287R43
Rh12_12405_153R43
Rh12_46438_208R01
RhK5_3568_558R01
RhK5_4018_1062R43
Rh12_91221_504R43
RhK5_8086_271R43
RhK5_4690_1027R43
RhMC_511_2491R01
Rh12_55740_342R01
RhK5_5952_759R43
RhMC_3676_1294R43
RhK5_2131_946R01
RhK5_7590_160R01
46.9
RhMC_4498_1181R43
Homologie roos met diploïde bosaardbei
(Fragaria vesca) - gesequenced
Chrom
Fv1
Fv2
Fv3
Fv4
Fv5
Fv6
Fv7
Total

LG1
1
1
0
0
1
5
143
151
LG2
122
2
6
4
1
180
0
315
LG3
73
3
2
2
0
137
1
218
LG4
0
2
4
88
20
0
0
114
LG5
0
19
172
1
1
2
6
201
LG6
0
203
3
1
5
4
0
216
LG7
7
1
0
16
134
1
0
159
Total
203
231
187
112
162
329
150
1374
Roos vs. bosaardbei duidelijke sequentie-overeenkomsten
● Bijvoorbeeld:
● 143 merkers roos koppelingsgroep 1 hebben homologie met
bosaardbei chromosoom 7
● Soms één rozengroep met twee aardbeigroepen (en andersom)
Nog te doen
 Stap 4: Efficiënte integratie alle merker-typen over alle
homologe chromosomen van beide ouders samen
8 homologen tetraploïd, 12 hexaploïd
 Stap 5: QTL-analyse-modellen ontwikkelen, testen, toepassen
● Nu nog: analyse per-merker
● toepassing complexere QTL-modellen
 Verdere integratie software-modules
 Visualisatie resultaten
Met dank aan:
 TKI-Uitgangsmaterialen
 Projectteam ‘Polyploids United’
● Bedrijfspartners
● Promovendi en postdoc bij bedrijven
Geert van Geest, Arwa Shahin, Mirjana Vukosavljev
● WUR Plant Breeding
Paul Arens, Carole Koning-Boucoiran, Danny Esselink,
Tiago Santos-Leonardo (Master-student), René
Smulders, Roeland Voorrips
● WUR Biometris
Gerrit Gort, Hans Jansen
Dank u
Vragen ?