Samenvatting Chemisch gereedschap voor het bestuderen van het

Samenvatting
Chemisch gereedschap voor het
bestuderen van het proteasoom
Hoewel afgelopen decennia uitgebreide studies zijn verricht valt er nog veel te
ontdekken in het veld van het proteasoom onderzoek. De interdisciplinaire inspanningen
op het grensvlak van de chemie en de biologie hebben het begrip over de rol van het
proteasoom in een breed scala van processen in een stroomverselling gebracht. Een
beknopt overzicht van de recente ontwikkelingen in het veld van chemische biologie
gedreven proteasoom onderzoek is uiteengezet in Hoofdstuk 1. Het onderzoek beschreven
in dit proefschrift richt zich op de ontwikkeling van nieuw chemisch biologisch gereedschap
waarmee proteasomen nauwgezetter bestudeerd kunnen worden.
De synthese en karakterisatie van de fluorescente, cell-permeabele en activiteits
gebaseerde proteasoom probe BODIPY TMR-Ahx3L3VS (MV151) is beschreven in
Hoofdstuk 2. Deze probe bewerkstelligt de snelle en gevoelige in-gel detectie van
proteasoom activiteit in een gegeven monster gebruik makende van een fluorescentie
scanner. De probe is gebruikt voor het labelen van de actieve proteasoom populatie in cel
lysaten en in levende cellen. MV151 heeft een aantal voordelen vergeleken met eerder
ontwikkelde probes in de zin dat Western blotten, radioactiviteit en gel drogen overbodig
zijn. De distributie van MV151 was eenvoudig te detecteren in UbG76V-GFP transgene
muizen en correleerde met de inhibitie van het proteasoom in het getroffen weefsel,
gebaseerd op de accumulatie van de GFP-reporter. Het labellen van het proteasoom door
middel van MV151 in combinatie met UbG76V-GFP transgene muizen is een bruikbare
strategie voor het aantonen van de biodistributie van proteasoom inhibitoren. Ten slotte is
een competitie experiment gebruik makende van MV151 een snelle en gevoelige methode
153
Samenvatting
gebleken voor het vaststellen van het inhibitie profiel (in de zin van potentie en subunit
preferentie) van een gegeven proteasoom inhibitor.
De ontwikkeling van drie makkelijk toegankelijke alkyn gefunctionaliseerde BODIPY
fluoroforen wordt besproken in Hoofdstuk 3. Deze fluoroforen kunnen chemoselectief
worden gekoppeld aan elke willekeurig azide bevattende activiteits gebaseerde
karakterisatie probe en azide gemodificeerde metaboliet. De toepasbaarheid van de alkyn
bevattende BODIPYs is gedemonstreerd aan de hand van de synthese van drie epoxomicin
afgeleide fluorescente proteasoom probes.
In Hoofdstuk 4 wordt de synthese van het bifunctionele azido-BODIPY zuur
beschreven. In een activiteits gebaseerde eiwitprofilerings setting biedt deze nieuwe
fluorofoor een keur aan flexibiliteit vergeleken met de conventionele
monogefunctionaliseerde fluoroforen. Evenals de laatstgenoemde, maken azido-BODIPY
uitgeruste activiteits gebaseerde probes snelle fluorescente detectie mogelijk en zijn deze
probes compatibel met “live cell imaging” technieken. Gebruik makende van twee sets aan
een- en twee-staps labeling proteasoom probes gebaseerd op azido-BODIPY werd
vastgesteld dat de Staudinger-Bertozzi ligatie zo goed als quantitatief verloopt onder de
toegepaste condities. Dit resultaat houdt in dat de efficiëntie van de eiwit labeling afhangt
van de reactiviteit van de activiteits gebaseerde probe ten opzichte van het doel
eiwit(familie) en niet van de chemoselectieve ligatie die gebruikt wordt in de tweede stap.
Dit betekent in essentie dat twee-staps activiteits gebaseerde eiwit profilering met
dezelfde efficiëntie kan verlopen als het labelen van eiwitten in een gebruikelijke een-staps
strategie.
Op peptiden gebaseerde proteasoom inhibitoren bestaan uit drie structurele
entiteiten, namelijk 1) het “warhead”, de electrofiele val die reageert met het nucleofiele
residu van het actieve centrum, 2) het peptidische herkenningselement dat fungeert als een
sturingssequentie en 3) de N-terminale extentie. In Hoofdstuk 5 wordt uitgelegd dat deze
structurele elementen van vijf veel gebruikte proteasoom inhibitoren kunnen worden
gecombineerd wat resulteerde in een bibliotheek van 15 hybride proteasoom inhibitoren.
Met behulp van MV151 werd het inhibitie profiel van de bibliotheek bepaald. Het
combineren van structurele elementen van bekende proteasoom remmers bleek een
legitieme strategie voor de ontwikkeling van nieuwe potente proteasoom inhibitoren, daar
een van epoxomicin afgeleide boor ester naar voren kwam als een van de meest potente
peptide-gebaseerde proteasoom inhibitoren die zijn beschreven.
154
Samenvatting
Een soortgelijke strategie wordt behandeld in Hoofdstuk 6. In dit geval werden
warheads en peptide herkennings elementen van beschreven subunit specifieke
proteasoom inhibitoren gecombineerd. Onverwachts bleken alle vinyl ethyl ester
gebaseerde verbindingen, inclusief de door Marastoni et al. beschreven β2 specifieke
inhibitor niet actief in competitie experimenten tegen MV151. Een potentere op
epoxyketon gebaseerde β1 specifieke proteasoom inhibitor werd ontwikkeld, naast de β5
specifieke vinyl sulfon en een op β2 en β5 gerichte epoxyketon. Deze hits werden
ongevormd tot subunit specifieke twee-staps labelings probes door de introductie van een
azide. Door het vervangen van de naphthylacetamide voor een azido-BODIPY werden een
β5 specifieke en een op β2 en β5 gerichte fluorescente twee-staps labelings probe
verkregen. Daarnaast leverde de conjugatie van een alkyn gefunctionaliseerde BODIPY met
de β1 specifieke twee-staps probe een groen fluorescente probe op met een voorkeur voor
β1, welke bij hogere concentraties β5 begint te labelen.
In Hoofdstuk 7 beschijft de synthese van vier epoxomicin analoga welke zijn
uitgerust met een dieen. Deze probes bleken het proteasoom te inhiberen met een
potentie in dezelfde orde van grootte als de moeder verbinding epoxomicin. Initiële DielsAlder twee-staps proteasoom labeling experimenten, uitgevoerd op gezuiverd 20S
proteasomen en gebruik makende van een dieen bevattende inhibitor en een fluorescent
dienofiel, lieten zien dat de Diels-Alder een veel belovende alternatieve ligatie methode in
activiteits gebaseerde eiwit profilering is. Om concurerend te worden met bestaande ligatie
methoden is het nodig dat deze reactie wordt geoptimaliseerd.
155