Cover Page The handle http://hdl.handle.net/26502 holds

Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/26502 holds various files of this Leiden University
dissertation.
Author: Willems, Lianne Irene
Title: Direct and two-step activity-based profiling of proteases and glycosidases
Issue Date: 2014-06-24
Samenvatting
Chemisch biologisch onderzoek richt zich op het toepassen van chemische benaderingen
voor het bestuderen en controleren van biologische processen. Principes en kennis uit de
organische chemie worden gebruikt om bepaalde biomoleculen te manipuleren in een
biologisch systeem. Op die manier kan inzicht worden verkregen in de processen waarbij de
betreffende moleculen betrokken zijn. Dit proefschrift beschrijft de ontwikkeling van nieuwe
chemische verbindingen en methodes voor ´activity-based protein profiling´ (ABPP), een
vakgebied binnen de chemische biologie met als doel de activiteit van enzymen zichtbaar te
maken en te kwantificeren in de context van een complex biologisch systeem. Om dit doel te
bereiken wordt er gebruik gemaakt van verbindingen die covalent en irreversibel binden aan
het actieve centrum van een specifiek enzym of een klasse van enzymen, op een dusdanige
manier dat alleen de actieve enzympopulatie wordt gelabeld. Deze zogenoemde ´activitybased probes´ (ABPs) worden onderverdeeld in twee typen afhankelijk van de identiteit van
de detecteerbare groep waarmee ze zijn uitgerust. Directe ABPs bevatten een label, zoals
een fluorescent label of biotine, waarmee de target enzymen direct gevisualiseerd,
geïsoleerd, gekwantificeerd en/of geïdentificeerd kunnen worden. Tweestaps ABPs zijn
uitgerust met een kleine reactieve groep die kan worden gebruikt om het label in een later
stadium te introduceren, nadat de ABP aan zijn target enzym is gebonden. Om de labeling te
realiseren wordt er gebruik gemaakt van bioorthogonale ligatiereacties. Bioorthogonale
chemie kenmerkt zich door een hoge mate van selectiviteit, een hoge efficiëntie en vooral
ook door de afwezigheid van enige interacties met het biologische systeem waarin de
reactie wordt uitgevoerd. Hoofdstuk 1 beschrijft de principes van ABPP en het ontwerp van
ABPs.
In Hoofdstuk 2 wordt een overzicht gegeven van de verscheidene bioorthogonale
ligatiereacties die tot nu toe in de literatuur zijn beschreven, met de nadruk op het gebruik
van deze methodes voor de tweestaps labeling van enzymactiviteit. Voorafgaand aan het
werk beschreven in dit proefschrift berustten alle gerapporteerde tweestaps ABPP
methodes op het gebruik van een azide of een alkyn als reactieve groep in een ABP. Labeling
157
Samenvatting
van enzymactiviteit werd gerealiseerd via Staudinger-Bertozzi ligatie, de reactie tussen een
azide en een phosphine, of via azide-alkyn cycloadditie (‘click’ reactie), die ofwel
gekatalyseerd wordt door koper(I) of wordt gedreven door de ring-spanning in een
cyclooctyn.
In Hoofdstuk 3 wordt een nieuwe tweestaps ABPP methode beschreven die is gebaseerd
op de Diels-Alder cycloadditie. De Diels-Alder strategie maakt gebruik van ABPs die zijn
uitgerust met een geconjugeerd dieen en een maleimide reagens als de dienofiel waaraan
een fluorescent Bodipy label is gekoppeld. Deze strategie werd succesvol toegepast voor de
labeling van de endogene activiteit van het 20S proteasoom en van cathepsines, een klasse
van cysteine proteases, in celextracten. Daarnaast werd aangetoond dat de ontwikkelde
ligatiemethode gecombineerd kan worden met de Staudinger-Bertozzi ligatie voor de
labeling van twee verschillende enzymactiviteiten in hetzelfde experiment. De Diels-Alder
ABPP strategie vormt een bruikbaar alternatief voor bestaande methodes die gebaseerd zijn
op Staudinger-Bertozzi ligatie en click chemie. Desondanks wordt de bredere
toepasbaarheid ervan gelimiteerd door de noodzaak om cysteine residuen te beschermen
vóór toevoeging van de dienofiel, waardoor in situ en in vivo toepassingen niet mogelijk zijn.
Een ander nadeel van deze methode is de aanzienlijke hoeveelheid achtergrond labeling,
waardoor de detectie van eiwitten met lage endogene activiteit wordt bemoeilijkt.
Hoofdstuk 4 beschrijft de ontwikkeling van een alternatieve ABPP strategie die is
gebaseerd op de ‘inverse-electron-demand’ Diels-Alder reactie. Het gebruik van tetrazine als
een dieen en norborneen als een dienofiel, welke beide niet met cysteine residuen
reageren, resulteert in een ligatiereactie met sterk verbeterde selectiviteit en verhoogde
snelheid. Een norborneen-gemodificeerde proteasoom ABP werd gebruikt om endogene
proteasoom activiteit efficiënt en selectief te labelen in celextracten en in levende cellen via
reactie met Bodipy- en biotine-gelabelde tetrazines. Bovendien werd er een drievoudige
bioorthogonale ligatiestrategie ontwikkeld waarbij de tetrazine ligatie werd gecombineerd
met de Staudinger-Bertozzi ligatie en de koper(I)-gekatalyseerde click reactie voor de
simultane labeling van drie verschillende enzymactiviteiten met verschillende labels in een
enkel experiment. Ondanks het feit dat tetrazines niet stabiel zijn onder de condities voor
koper(I)-gekatalyseerde click chemie, maakt een simpele wasstap tussen de twee
ligatiereacties het mogelijk beide ligaties opeenvolgend uit te voeren in hetzelfde
experiment. Dit onderzoek creëert de mogelijkheid drie verschillende biomoleculen
tegelijkertijd te bestuderen via bioorthogonale labeling in een complex biologisch systeem.
158
Samenvatting
Het tweede deel van dit proefschrift beschrijft de synthese en biologische evaluatie van
nieuwe glycosidase ABPs. Glycosidases zijn enzymen die verantwoordelijk zijn voor de
hydrolyse van glycosidische bindingen in (oligo)sacchariden en glycoconjugaten en zijn
cruciaal voor de afbraak van glyco(sphingo)lipiden in lysosomen. Een deficiëntie in één van
de lysosomale glycosidases kan ophoping van de corresponderende substraten in lysosomen
veroorzaken, wat op zijn beurt kan leiden tot een lysosomale stapelingsziekte. Ondanks de
vergelijkbare defecten die ten grondslag liggen aan de verschillende lysosomale
stapelingsziekten, zijn deze opvallend heterogeen wat betreft loop van de ziekte,
phenotypes en klinische manifestatie. ABPP kan een nuttige techniek zijn om de
verschillende glycosidases en hun rol in de verscheidene ziektes te bestuderen. Tot op
heden is er slechts een beperkt aantal glycosidase ABPs ontwikkeld, waarschijnlijk vanwege
de nauwe substraatspecificiteit en de afwezigheid van covalente interacties met het
substraat in het katalytische mechanisme van vele van deze enzymen. Niettemin vormen de
meeste glycosidases met een ‘retaining’ mechanisme wel een covalent enzym-substraat
intermediair en zijn daarom geschikte kandidaten voor ABPP studies, waarbij ABPs
ontworpen kunnen worden die covalent reageren met het katalytisch actieve nucleofiel van
één (of meerdere) van deze enzymen.
Hoofdstuk 5 beschrijft het ontwerp en de synthese van irreversibele remmers en ABPs
voor twee klassen van glycosidases, de retaining α- en β-galactosidases. De galactopyranosegeconfigureerde probes bevatten een electrofiele epoxide of aziridine groep die op een
dusdanige manier is gepositioneerd (in een α- of β-configuratie) dat deze aangevallen kan
worden door de katalytisch actieve nucleofiel van respectievelijk α- en β-galactosidases.
Voor beide enzymen werden vier epoxide probes gesynthetiseerd, waaronder één nietgelabelde remmer en drie ABPs waarin de hydroxyl group op C6 (koolhydraat nummering) is
gesubstitueerd met een Bodipy label, biotine of een azide voor tweestaps labeling.
Daarnaast werden er twee α-galactosidase aziridine probes gesynthetiseerd waarin een
azide of Bodipy label werd geïntroduceerd via acylering van de aziridine amine. Pogingen om
ook β-galactosidase aziridine probes te isoleren waren tot dusver niet succesvol, aangezien
zelfs het gebruik van volledig zuurvrije procedures voor zuivering en vriesdrogen van deze
verbindingen resulteerde in opening van de geacyleerde aziridine.
In Hoofdstuk 6 wordt de remming en labeling van humane retaining α-galactosidases
door de α-galactopyranose-geconfigureerde probes beschreven. De aziridine ABPs bleken
zeer potente remmers te zijn van α-galactosidase A (αGal A), het humane lysosomale enzym
dat deficiënt is in patiënten met de ziekte van Fabry, een lysosomale stapelingsziekte.
Verder werd aangetoond dat deze probes geen reactiviteit vertonen tegen een retaining β159
Samenvatting
galactosidase, galactocerebrosidase, en een retaining β-glucosidase, glucocerebrosidase. De
niet-gelabelde epoxide remmer was een factor 10.000 minder potent op αGal A dan de
aziridine probes. Daarentegen vertoonde geen van de C6-gelabelde epoxide ABPs enige
remming van dit enzym, wat aantoont dat de primaire hydroxyl groep op C6 essentieel is
voor binding van de probes. De fluorescent gelabelde aziridine kan gebruikt worden om de
endogene activiteit van αGal A te labelen in celextracten van wild-type fibroblasten. Naast
αGal A labelt de ABP ook de activiteit van N-acetyl-galactosaminidase (αGal B), het tweede
humane enzym in de familie van retaining α-galactosidases. In fibroblast celextracten die
afkomstig zijn van klassieke Fabry patiënten is overeenkomstig het gebrek aan αGal A
activiteit uitsluitend labeling van αGal B zichtbaar. Een mogelijk zeer waardevolle toepassing
van de Bodipy-gelabelde probe is het labelen en vergelijken van de retaining α-galactosidase
activiteit in celextracten van Fabry patiënten met verschillende mutaties in αGal A en/of
phenotypische varianten van de ziekte.
In Hoofdstuk 7 worden de β-galactopyranose-geconfigureerde epoxide probes
geëvalueerd met betrekking tot remming en labeling van het humane enzym
galactocerebrosidase. Deficiëntie van deze lysosomale β-galactosidase leidt eveneens tot
een lysosomale stapelingsziekte, de ziekte van Krabbe. De meest potente remmer van
galactocerebrosidase was de niet-gelabelde epoxide, terwijl substitutie van de hydroxyl
groep op C6 met een azide resulteerde in een factor 2.000 lagere potentie. Daarentegen
bleek de introductie van een Bodipy label, en in mindere mate biotine, op dezelfde positie
de potentie weer gedeeltelijk te herstellen. Zowel de Bodipy- als de biotine-gelabelde
probes werden toegepast om katalytisch actief galactocerebrosidase te visualiseren op gel.
Verder werd aangetoond dat de probes selectief zijn voor dit enzym ten opzichte van
retaining α-galactosidases en β-glucosidases. Eerdere publicaties hebben laten zien dat deze
laatste klasse van enzymen selectief kan worden gelabeld met ABPs die slechts verschillen
van de β-galactosidase probes in de configuratie van een enkele hydroxyl substituent. Het
onderzoek beschreven in hoofdstukken 6 en 7 laat zien dat het mogelijk moet zijn
verschillende klassen van retaining glycosidases te labelen door ABPs te ontwikkelen die
dusdanig gemodificeerd zijn dat de configuratie overeenkomt met het natuurlijke substraat
van de target enzymen. Bovendien vormen de beschreven α- en β-galactosidase remmers en
ABPs nuttige middelen voor het bestuderen van de betreffende enzymen en hun
betrokkenheid bij de corresponderende lysosomale stapelingsziekten.
160
Samenvatting
In Hoofdstuk 8 wordt een overzicht gegeven van het onderzoek dat in dit proefschrift is
beschreven. Daarnaast worden verdere toepassingen van de ontwikkelde probes en
methodes besproken en worden voorstellen gedaan voor nieuwe glycosidase ABPs die
andere eigenschappen hebben (stabiliteit, reactiviteit) en/of gericht zijn tegen andere
enzymklassen. Ook worden twee lopende projecten geïntroduceerd, waarvan de eerste
betrekking heeft op tweestaps labeling van enzymactiviteit met behulp van de tetrazine
ligatie. Een biotine-gelabeld tetrazine reagens waarin een splitsbare linker is opgenomen
kan gebruikt worden om gelabelde eiwitten te isoleren met behulp van geïmmobiliseerd
streptavidine en vervolgens selectief af te splitsen onder milde condities om zo een zuiver
preparaat te verkrijgen. Het tweede project beschrijft het ontwerp en de (gedeeltelijke)
synthese van probes voor 2-oxoglutaraat-afhankelijke oxygenases. Omdat deze klasse van
enzymen geen covalent enzym-substraat intermediair vormt, is er gekozen voor het gebruik
van ‘affiniteit-gebaseerde probes’ in plaats van ABPs. De probes zijn gebaseerd op de
structuur van 2-oxoglutaraat en bevatten een norborneen groep voor labeling via tetrazine
ligatie en een ‘fotoreactieve’ groep, waarmee door middel van fotochemie irreversibele
binding aan target enzymen gerealiseerd kan worden.
De focus binnen het vakgebied van ABPP verschuift in steeds hogere mate richting het
labelen van enzymklassen met andere en soms slechts deels opgehelderde katalytische
mechanismes, nauwe substraatspecificiteit en/of lage expressie niveaus. Daarom worden
voortdurend inspanningen gewijd aan het ontwikkelen van nieuwe benaderingen die het
mogelijk maken de activiteit van deze enzymen zichtbaar te maken en/of te kwantificeren.
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift biedt een aantal nieuwe strategieën die aanzet
geven tot verdere onderzoekslijnen, zowel voor het labelen van de activiteit van nieuwe
enzymklassen als ook voor de bioorthogonale labeling van enzymactiviteit en andere
biomoleculen.
161