Samenvatting Activiteits-gebaseerd profileren van glycoconjugaat

Samenvatting
Activiteits-gebaseerd profileren van
glycoconjugaat afbrekende enzymen
Het onderzoek naar biologische processen richt zich steeds meer op het analyseren van de
betrokken moleculen en de bijbehorende reacties. In dit onderzoeksveld, ook wel chemische
biologie genoemd, ontwikkelt men moleculair gereedschap (activiteitsgebaseerde probes)
om een specifiek enzym te labelen en zo de rol van het enzym te bestuderen. Op activiteit
gebaseerde probes bestaan uit drie delen: een reactieve groep, een “linker” en een label. De
reactieve groep, ook wel “warhead” genoemd, reageert met een nucleofiel in het actieve
centrum van een enzym, waarbij een covalente binding ontstaat. Om goede binding van de
reactieve groep aan het enzym te bewerkstelligen wordt een “linker” ingebouwd. Deze
beperkt mogelijke sterische hindering tussen het label en het actieve centrum van het
enzym. Tevens kan de “linker” gebruikt worden om specificiteit te generen voor een
bepaald enzym. Het label, vaak een fluorofoor, maakt de visualisatie/analyse van het
covalente adduct mogelijk. In sommige gevallen kan de linker en/of label binding aan het
enzym verhinderen. Een alternatieve methode om deze enzymen toch te kunnen labelen, is
de zogenaamde twee-staps labeling. In plaats van een linker/label wordt een bioorthogonaal
ligatie functionaliteit, zoals een azide, ingebouwd in de activiteitsgebaseerde probe. Binding
aan het enzym wordt niet verstoord door de relatief kleine azido-groep en na binding kan
het ligatie-handvat worden gebruikt om alsnog een label aan te brengen.
136 Samenvatting
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gericht op het ontwikkelen van moleculair
gereedschap dat gebruikt kan worden om enzymen die betrokken zijn bij de afbraak van
glycoconjugaten te bestuderen. Er is een grote varieteit aan glycoconjugaten, maar over het
algemeen bestaan ze uit een suikerstructuur welke via een N- of een O-glycosidische band is
gebonden aan een eiwit, lipide of een ander suiker. Deze conjugaten spelen een rol in
belangrijke biologische processen, zoals voedselopslag en cel-cel herkenning. De synthese
en afbraak ervan is daarom goed gereguleerd en een verstoring van de balans veroorzaakt
vaak ziektes. In Hoofdstuk 1 wordt allereerst het principe van activiteitsgebaseerde probes
behandeld. Vervolgens worden de enzymen die betrokken zijn bij de opbouw en afbraak
van glycoconjugaten beschreven en wordt een overzicht van de covalente remmers en
activiteitsgebaseerde probes van deze enzymen gegeven.
Het enzym peptide N-glycanase (PNGase) is verantwoordelijk voor het loskoppelen van
N-glycanen van glycoproteinen. De synthese en karakterisatie van een fluorescente probe
voor dit enzym wordt beschreven in Hoofdstuk 2. Een in de literatuur beschreven
covalente remmer van PNGase, Z-VAD-Fmk, werd voorzien van BODIPY-TMR. Deze
fluorofoor maakte in-gel detectie van gelabeld eiwit mogelijk met behulp van een
fluorescentie scanner. Labeling van PNGase met de ontstane probe was afhankelijk van
concentratie van de probe en de activiteit van het enzym. De fluorescente probe werd
gebruikt in competitie-experimenten om de activiteit van mogelijke nieuwe covalente
remmers te onderzoeken.
In Hoofdstuk 3 wordt met behulp van een aantal gefunctionaliseerde chitobioses het
belang van de reactieve groep op de potentie van PNGase-remmers beschreven. Aangezien
het actieve centrum van PNGase overeenkomsten heeft met het actieve centrum van
cysteine proteases werd chitobiose gefunctionaliseerd met verschillende reactieve groepen
die voorkomen bij cysteine protease remmers. Het bleek dat de reactieve groep zeer
belangrijk is voor de activiteit van de remmer. Chitobiose-derivaten voorzien met een goede
vertrekkende groep (Cl, OMs) als “warhead” bleken potenter dan remmers met een
slechtere vertrekkende groep (F, DMBA). Tevens bleek de stereochemie een grote rol te
spelen in epoxide/aziridine bevattende inhibitoren, waarbij de S,S configuratie het meest
potent was.
GlcNAcylering van eiwitten is een veel voorkomende post-translationele modificatie in
het cytosol. Eiwitten in het cytosol worden afgebroken door het proteasoom maar het is niet
duidelijk of dit voor geglycosyleerde eiwitten ook opgaat. De mogelijke afbraak van
geglycosyleerde eiwitten wordt in Hoofdstuk 4 met behulp van geGlcNAcyleerde
proteasoom probes bestudeerd. Twee verschillende soorten probes werden gesynthetiseerd.
Bij de eerste set probes werd de N-terminus van het peptide voorzien van een azidoacetyl.
In de tweede set werd de azide aangebracht op de suiker, door de acetyl van het
glucosamine-residue te vervangen voor een azidoacetyl. Uit competitie-experimenten bleek
dat het proteasoom geremd werd door beide geglycosyleerde probes. Om aan te tonen dat
het glucosamine-residue niet was gehydrolyseerd door glycosidases, werd de azide in de
probes na labeling gemodificeerd met biotine. Aangezien beide soorten probes hetzelfde
Samenvatting
137
labelingspatroon vertoonden, is deglycosylering van de probe geen vereiste voor binding
aan het proteasome. Er mag daarom geconcludeerd worden dat het proteasome
geGlcNAcyleerde eiwitten kan afbreken. De relevantie van de gevormde glycopeptides dient
echter verder te worden onderzocht.
De natuurstof cyclophellitol was de basis voor het ontwerpen van zowel een twee-staps
probe (KY170) als een directe probe (MDW933) voor exo β-glucosidases (Hoofdstuk 5).
Door het primaire alcohol van cyclophellitol te vervangen voor een azide-groep werd
KY170 verkregen. Uit een assay met een fluorogeen substraat bleek dat de twee-staps probe
een goede inhibitor is van β-glucosidase uit amandelen (de potentie voor dit enzym is
ongeveer 10 keer verminderd door de introductie van de azide) alsmede recombinant
glucocerebrosidase (IC50 100 nM) was. Vervolgens werd de twee-staps probe getoetst in
labelingsexperimenten. Met gezuiverde enzymen kon het gevormde covalente probe-enzym
adduct worden aangetoond door ligatie van de azide met een fluorofoor. Echter, een
significante hoeveelheid niet-specifieke labeling werd waargenomen tijdens de ligatie van de
fluorofoor in complexe monsters, zoals cellysaten of levende cellen. Om de problematische
tweede stap te voorkomen werd de directe probe MDW933 gesynthetiseerd. De BODIPY
fluorofoor werd geconjugeerd aan de azide van KY170 door middel van de kopergekatalyseerde “click”-reactie. De directe probe bleek niet alleen een potentere remmer van
glucocerebrosidae (IC50 2 nM), maar labelde bovendien GBA-1 selectief in cel-lysaten en
levende cellen.
Glucocerebrosidase hydrolyseert de glycosidische band tussen glucose en ceramide.
Mutaties die leiden tot vouwingsproblemen van glucocerebrosidases zorgen voor een
deficiëntie ervan, wat uiteindelijk leidt tot ophoping van het substraat glucosyl-ceramide.
Het gevolg is een stappelingsziekte die de ziekte van Gaucher wordt genoemd. Drie
therapieën zijn bekend voor de ziekte van Gaucher, enzym-replacement therapie, substraatreductie therapie en de chaperone therapie. Bij de enzym-therapie wordt recombinant
enzym intraveneus bij een patient ingebracht. Een tweede methode is het herstellen van de
balans tussen afbraak en synthese van glucosylceramide door het enzym dat de synthese
katalyseert te remmen. Bij de laatste methode wordt de vouwing van het gemuteerde enzym
hersteld door een chaperone, meestal een non-covalente remmer, toe te voegen. Hoofdstuk
6 beschrijft hoe MDW933 gebruikt werd om Gauchers’ ziekte te onderzoeken en in het
bijzonder om de chaperone therapie te valideren. Uit de resultaten met MDW933 bleek dat
chaperones zorgen voor een toename aan hoeveelheid eiwit in cellen met de mutatie
Asn370Ser. De toename van activiteit was hiermee niet evenredig, wat er op kan duiden dat
een deel van het enzym geremd wordt door de chaperones.