University of Groningen Artificial cofactors Jin, Jianfeng

University of Groningen
Artificial cofactors
Jin, Jianfeng
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2010
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Jin, J. (2010). Artificial cofactors: a marriage of homogeneous catalysis with enzymology Groningen: s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Samenvatting
Samenvatting
148
Samenvatting
Enzymen zijn katalysatoren die opgebouwd zijn uit eiwit. Naar schatting bevatten meer dan
de helft van alle enzymen ook nog een cofactor. Een cofactor stelt een enzym in staat om
reacties te katalyseren die niet alleen op basis van eiwit gekatalyseerd kunnen worden.
Verschillende metaal ionen komen als cofactor voor en daarnaast bestaan er ook verschillende
organische cofactoren die in sommige gevallen ook metaal bevatten.
Hoewel enzymen vaak zeer chemo-, regio- en/of enantioselectief zijn, zijn er nog
relatief weinig industriële enzymtoepassingen. Redenen hiervoor zijn dat enzymen vaak
beperkt zijn in substraatbereik en stabiliteit. Daarnaast kan, in het geval van cofactorafhankelijke enzymen, de regeneratie van cofactoren belemmerend zijn. Aan de andere kant
hebben studies aan overgangsmetalen aangetoond dat deze uitermate geschikt zijn als basis
voor katalysatoren voor een breed scala aan reacties. Het inbouwen van
overgangsmetaalcomplexen in enzymen of eiwitten kan het katalytisch potentieel van
enzymen verder vergroten. In dergelijke artificiële enzymen, waarbij een chemische
katalysator is ingebracht in een eiwit, kan de directe eiwitomgeving rondom de kunstmatige
metaal cofactor zorgen voor een gewenste reactiviteit en selectiviteit.
Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van bekende natuurlijke cofactoren en artificiële
cofactoren. De meest voorkomende natuurlijke cofactoren en de gerelateerde enzymen
worden hierin behandeld. Daarnaast worden verschillende artificiële cofactoren beschreven en
manieren waarmee deze in eiwitten of DNA zijn ingebouwd. Recent onderzoek heeft
aangetoond dat het combineren van eiwit/DNA met een katalytische artificiële cofactor tot
interessante artificiële enzymen kan leiden.
Hoofdstuk 2 beschrijft het werk dat verricht is in samenwerking met L. Panella dat
geleid heeft tot het creëren van een rhodium-bevattend artificieel enzym. De biochemische
karakterisatie van het ontworpen cysteïne protease, papaïne, met daarin een monodentaat
fosfiet ligand is beschreven. De proteolytische activiteit van papaïne bleek na modificatie met
het synthetische monodentaat fosfiet ligand verdwenen. De alkylering van cysteïne 25 kon
bevestigd worden met massaspectrometrische metingen. Na complexering met rhodium werd
het artificiële enzym getest op activiteit. De hybride katalysator bleek in staat de
hydrogenering van methyl 2-acetamidoacrylate te katalyseren. Hoewel een volledige
conversie uitgevoerd kon worden, bleek het artificiële enzym niet enantioselectief.
In hoofdstuk 3 is een serine hydrolase, penicilline G acylase (PA), gemodificeerd met
als doel om hiervan een artificieel enzym te maken. Het actieve centrum van het enzym is
verborgen in een holte van het eiwit. Door het inbouwen van de katalysator/cofactor die ook
in hoofdstuk 1 is gebruikt, werd verwacht dat de eiwitomgeving rondom de cofactor voor
enantioselectiviteit zou zorgen. Verschillende condities voor het modificeren van het eiwit
zijn getest om een actief hydrogenerend semisynthetisch enzym te creëren. Met het artificiële
enzym was het mogelijk om volledige hydrogenering uit te voeren, helaas zonder
enantioselectiviteit.
Hoofdstuk 4 beschrijft de ontdekking van karakterisatie van een flavine-bevattend
oxidase, eugenol oxidase (EUGO), van Rhodococcus sp. strain RHA1. Het betreffende gen
werd geïdentificeerd in het genoom en vervolgens gekloneerd. Het bacteriële oxidase is in
staat om eugenol om te zetten tot coniferyl alcohol (KM = 1.0 ȝM, kcat = 3.1 s-1). Vanillyl
alcohol en 5-indanol blijken ook goede substraten te zijn terwijl sommige andere fenolen
(vanillylamine, 4-ethylguaiacol) slechte substraten zijn.
Gelpermeatie experimenten en massaspectrometrie hebben onthuld dat EUGO als
dimeer voorkomt. EUGO bevat een covalent gebonden FAD cofactor. Met in vitro
experimenten aan apo EUGO kon aangetoond worden dat het enzym in staat is om de FAD
cofactor autokatalytisch en covalent in te bouwen. Covalente inbouw van FAD gaat gepaard
met vorming van waterstofperoxide. Dit suggereert dat tijdens de inbouw van FAD de flavine
cofactor gereduceerd wordt en uiteindelijk de electronen kwijtraakt aan moleculair zuurstof.
149
Samenvatting
Een modelstructuur van EUGO geeft aan dat de FAD cofactor aan histidine 390 gekoppeld
wordt. Het model geeft ook een verklaring voor het feit dat EUGO dimeren vormt terwijl het
zeer homologe vanillyl alcohol oxidase (VAO) octameren vormt. EUGO mist namelijk een
oligomerisatie-loop.
In Hoofdstuk 5 is de covalente inbouw van de FAD cofactor in VAO bestudeerd. Om
de flavinylering te bestuderen is een riboflavine-auxotrofe Escherichia coli stam gebruikt.
Incubatie van het verkregen apo VAO met FAD resulteerde in een activiteitstoename in de
tijd. De toename in activiteit ging gepaard met vorming van covalent eiwit-FAD. De vorming
van stoichiometrische hoeveelheden waterstofperoxide bevestigde het voorgestelde
mechanisme waarin de covalente koppeling ontstaat door een autokatalytisch proces waarin
de cofactor tijdelijk wordt gereduceerd. Nano-electrospray massaspectrometrische
experimenten bevestigden dat de covalente inbouw van FAD autokatalytisch is en dat FAD
binding oligomerisatie stimuleert. De ontwikkelde protocollen om apo flavoproteïnen te
produceren en om deze te reconstitueren, biedt interessante mogelijkheden om artificiële
flavoproteïnen te maken met flavine derivaten als synthetische cofactoren.
150