LABINFO6_NED_COR 31_05.indd

Praktische invoering van PCR
voor microbiologische bepalingen in het
Federaal Laboratorium voor de Veiligheid
van de Voedselketen in Melle (FLVVM)
Inleiding
In dit artikel wordt de invoering van real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) voor de detectie van Salmonella
spp. in het Federaal Voedingslaboratorium Melle (FLVVM) beschreven.
De detectie van Salmonella spp. in voedingsmiddelen en dierenvoeders werd voorheen uitgevoerd met de ISO
methode 6579:2002 “Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp.” Deze methode is arbeidsintensief en vergt meer tijd. Met de invoering van PCR werd opnieuw een
stap gezet in de richting van automatisering in het FLVVM.
Er werd gekozen voor het implementeren van de iQ-CheckTM Salmonella II kit van Biorad. Deze kit is AFNOR gevalideerd volgens ISO 16140: 2003 (BRD 07/06-07/04; 01/07/2004 – 01/07/2012). Op deze manier was enkel een
verificatie nodig in het laboratorium.
In de loop van 2008 werd de PCR methode gevalideerd in het FLVVM. Vanaf 1 januari 2009 werden bijna alle
monsters door DG Controle genomen voor de detectie van Salmonella spp. geanalyseerd volgens de ingevoerde
PCR methode.
PCR techniek
PCR staat voor Polymerase Ketting Reactie (Polymerase Chain Reaction). Deze techniek wordt onder andere gebruikt om micro-organismen te detecteren.
De eerste stap in de detectie is het laten vermenigvuldigen van het micro-organisme in een aanrijkingsmedium.
Vervolgens wordt met een lyse-reagens het DNA (= deoxyribonucleïnezuur) uit de cellen geëxtraheerd.
Aan het geëxtraheerde DNA wordt een PCR-mix toegevoegd. Deze mix bevat alle nodige bestanddelen voor
DNA vermenigvuldiging: dNTP’s (= nucleotiden of bouwstenen van het DNA), primers (= kleine stukjes chemisch
gesynthetiseerd enkelstrengig (es) DNA, complementair aan het bacterie DNA; ze vormen de startplaats van de
vermenigvuldigingsreactie), DNA polymerase (= enzym), fluorescente probes, reagentia en buffers.
Met behulp van het polymerase wordt via een kettingreactie een specifiek gedeelte van het micro-organisme
DNA vermenigvuldigd (= doelwit-DNA). Deze reactie vindt plaats in een microtiterplaat (96-well plaat) (figuur 1) in
een thermocycler (figuur 2).
7
Figuur 1 : Vullen van een microtiterplaat
Figuur 2 : Thermocycler: Chromo4TM real-time thermocycler
8
De nieuw gevormde stukjes DNA worden amplicons of amplificatieproducten genoemd. Deze worden aan de
hand van een fluorescentiesignaal zichtbaar gemaakt zodat de resultaten continu en snel (in ‘real-time’) kunnen
worden afgelezen.
Positieve resultaten volgens PCR worden steeds bevestigd met de traditionele (ISO) methode.
Om contaminatie te vermijden worden de verschillende stappen van de methode in verschillende zones uitgevoerd. Ook worden bij elke reeks negatieve en positieve controles geanalyseerd.
Validatietesten
Om de PCR methode te valideren in het labo werden:
• proefmonsters parallel geanalyseerd met PCR en volgens ISO 6579 (tabel 1);
• aangekochte producten (verschillende matrices) besmet op het niveau van de detectielimiet en geanalyseerd met PCR. De vooropgestelde detectielimiet van de fabrikant werd behaald, namelijk < 10 cfu;
• verschillende ringanalyses werden correct uitgevoerd;
• verschillende stammen van Salmonella getest.
Tabel 1 : Overzicht validatieparameters proefmonsters
Parameter
Omschrijving
Formule
Resultaat
a+d
a+b+c+d
98%
Effectiviteit
fractie juist bevonden resultaten
Gevoeligheid
fractie bevestigde positief bevonden resultaten
a
a+b
94%
Specificiteit
fractie bevestigde negatief bevonden resultaten
d
c+d
98%
% vals positieve
fractie onjuist positief bevonden resultaten
c
a+c
11%
% vals negatieve
fractie onjuist negatief bevonden resultaten
b
b+d
1%
Met:
a = aantal resultaten die in het laboratorium positief zijn bevonden en ook werkelijk positief zijn
(= vergelijking met de referentiemethode, ISO 6579);
b = aantal resultaten die in het laboratorium negatief zijn bevonden, maar in werkelijkheid positief zijn
(vals negatieve);
c = aantal resultaten die in het laboratorium positief zijn bevonden, maar in werkelijkheid negatief zijn
(vals positieve);
d = aantal resultaten die in het laboratorium negatief zijn bevonden en ook werkelijk negatief zijn.
9
Bevindingen tijdens de validatietesten
Een microtiterplaat kan afgesloten worden met caps, maar ook met klevende doorzichtige folie. Folie is goedkoper en gemakkelijker in gebruik zodat dit in de eerste testen werd gebruikt. De testen wezen echter uit dat de
folie de plaat niet voldoende afsloot.
Met een PCR techniek worden ook dode Salmonella spp. teruggevonden. Bij de analyse van ‘eierproducten NHC
(not for human consumption)’ werden positieve resultaten teruggevonden met PCR terwijl deze niet bevestigd
werden met de ISO methode.
Waarschijnlijk zijn deze producten hoog besmet met dode Salmonella. Er werd besloten om dit type product in
het vervolg altijd te analyseren met de ISO methode die gesteund is op het detecteren van enkel levende microorganismen.
Voor de bemonstering van karkassen van varkens en runderen worden steriele bevochtigde schuursponsjes
gebruikt. Na onderzoek bleek dat de buffer waarin de schuursponsjes zich bevonden zorgde voor inhibitie bij
het uitvoeren van PCR (= geen vermenigvuldiging van DNA). Na deze bevindingen werd overgeschakeld op een
ander type schuursponsjes.
Conclusie
Algemeen kan gesteld worden dat de iQ-CheckTM Salmonella II kit van Biorad voor de detectie van Salmonella
spp. met PCR voor het merendeel van de te analyseren matrices in het FLVVM een goed bevonden techniek is. Er
is een tijdswinst van 2 dagen voor negatieve proefmonsters en er kunnen grotere reeksen tegelijkertijd worden
ingezet door eenzelfde analist.
Op 8 mei 2009 werd de accreditatie van de PCR methode behaald tijdens de BELAC audit.
Elly Harnie, FLVVM
[email protected]
10