respiratoir panel

ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN57
M02
RESPIRATOIR PANEL
INHOUD







Indicaties
Kostprijs en terugbetalingsmodaliteiten.
Uitvoerfrequentie.
Kwaliteitscontrole
Beproevingsmethode
Interpretatie resultaat
Referenties
INDICATIES
Bepaling van 29 respiratoire micro-organismes bij immuungecompromitteerde en/of kritisch zieke
patiënten met een ernstige lage luchtweginfectie.
Volgende virussen, bacteriën en een fungus worden gedetecteerd:
-
influenza A/B virus
-
respiratoir syncitiaal virus (RSV)
-
humaan metapneumovirus (hMPV)
-
parainfluenza virus 1/2/3/4
-
adenovirus
-
enterovirus
-
cytomegalovirus
-
parechovirus
-
coronavirus NL63 / 229E / OC43 / HKU-1
-
coronavirus SARS
-
coronavirus MERS
-
herpes simplex virus 1/2
-
rhinovirus
-
bocavirus
-
Mycoplasma pneumoniae
-
Pneumocystis jirovecii
-
Coxiella burnetti
-
Chlamydophila pneumoniae
-
Chlamydophila psittaci
-
Legionella pneumophila
-
Streptococcus pneumoniae
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
1/4
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN57
M02
KOSTPRIJS EN TERUGBETALINGSMODALITEITEN
Zie labogids:


Geen RIZIV Nomenclatuurnummer voor deze analyse
Aanrekening : 75 €
UITVOERINGSFREQUENTIE
Zie labogids: items ‘uitvoerfrequentie’ en ‘antwoordtijd’



stalen dienen uiterlijk, op de dag van uitvoering van de test, s’morgens om 8.00u in het
laboratorium beschikbaar te zijn
resultaten zijn op de dag van uitvoering van de test beschikbaar voor 17.00 uur.
om organisatorische redenen (volle 96-well plaat) worden stalen per batch van 7 uitgevoerd
samen met een negatieve controle.
KWALITEITSCONTROLE
Staalsoorten:
 Wisser bovenste luchtwegen (BLW)
 Broncho-alveolaire lavage (BAL)
 Aspiraat (Asp)
Bij elke uitvoering van het respiratoir panel worden 7 stalen samen getest met één negatieve controle.
Deze negatieve controle wordt ook tijdens de voorafgaande DNA/RNA-extractie tussen de 7 stalen mee
geëxtraheerd.
Voorafgaand aan de DNA/RNA-extractie wordt aan elk staal een ‘interne controle’ (IC) toegevoegd.
Deze IC bestaat uit 2 niet-humane virussen (één DNA-virus en één RNA-virus). Voor elk extract wordt in
het respiratoir panel ook deze 2 niet-humane virussen bepaald en geverifieerd. Indien deze IC niet
voldoet aan bepaalde criteria dan spreken we van ‘inhibitie’ van de analyse en dient de analyse voor het
betreffende staal herhaald.
2 eerstelijnscontroles die alle parameters van het panel omvatten worden afwisselend dagelijks bepaald
en als ingangsvalidatie van ieder nieuw - in-huis aangemaakt - lot van 96-well platen voor het respiratoir
panel.
Jaarlijks wordt deelgenomen aan een tweede- of derdelijnscontrole (externe kwaliteitscontrole). De
resultaten van deze controles kunnen worden opgevraagd.
BEPROEVINGSMETHODE
DNA/RNA-extractie van het staal gevolgd door in-huis real-time PCR Taqman op QuantStudio Dx

respiratoire stalen (BLW, BAL en Asp): DNA/RNA-extractie via NucliSens easyMAG
(BioMérieux) (semi-geautomatiseerde methode)
Lysis van het staal in een GUSCN-buffer gevolgd door binding van het vrijgestelde nucleïnezuur
aan silica gecoate magnetische beads. De beads worden vervolgens gewassen via 2
wasbuffers om onzuiverheden te verwijderen en in een laatste stap wordt het nucleïnezuur van
de beads geëlueerd in elutiebuffer.
In één extractierun kunnen 1-24 stalen geëxtraheerd worden in een tijdsduur van 1 uur. De extra
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
2/4
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN57
M02
hands-on tijd voor het uitvoeren van deze extractie bedraagt 30 tot 45 minuten.

In huis Real-time PCR Taqman (QuantStudio Dx – Life technologies)
Het via species-specifieke primers geamplificeerd DNA wordt tijdens de amplificatie
gedetecteerd via een species specifieke probe. Bij positieve stalen resulteert dit in een realtime
PCR amplificatiecurve met bijhorende Ct (Cycle treshold) – waarde. Deze Ct-waarde is
omgekeerd evenredig met de hoeveelheid species DNA aanwezig in de reactie.
Voor elk staal (nucleïnezuurextract) worden 12 multiplex reacties uitgevoerd voor de detectie
van alle microbiële parameters van het panel en de 2 niet-humane virussen van de IC.
In één PCR-run worden 7 stalen geamplificeerd samen met een negatieve controle in een
tijdsduur van 1 uur. De extra tijd voor de voorbereiding van de PCR-run en de analyse achteraf
bedraagt 45 minuten tot 1 uur.
INTERPRETATIE RESULTAAT
Na interpretatie van de PCR wordt een semi-kwantitatief resultaat gerapporteerd voor elke microbiële
parameter van het panel.
De gerapporteerde antwoorden zijn gebaseerd op de ‘Cycle treshold’ (Zie meetprincipe) Opgepast: dit is
enkel een indicatieve waarde en is afhankelijk van de staalsoort en de gebruikte standaard

Negatief: geen parameter DNA of RNA gedetecteerd.

Positief :
o sterk positief : Cycle treshold ≤ A
o positief : A < Cycle treshold ≤ B
o zwak positief : B < Cycle treshold ≤ 45
De waarde van A en B is parameter specifiek en werd bepaald tijdens de validatie van de
analyse op patiënten-stalen. Deze waarden kunnen aangepast worden in de toekomst
naarmate bijkomende info of resultaten beschikbaar zijn.
Voor Streptococcus pneumoniae komt bij een zwak positief resultaat volgend antwoord
“zwak positief, meest waarschijnlijk kolonisatie”
Voor Pneumocystis jiroveci op BAL komen volgende antwoorden:
 sterk positief: “Positief, compatibel met Pneumocystis jiroveci pneumonie”
 positief: “Zwak positief, mogelijks compatibel met Pneumocystis jiroveci
pneumonie”
 zwak positief: “Zeer zwak positief, zonder klinisch belang”

Bij inhibitie: (IC voldoet niet aan de kwaliteits-criteria):
‘Onbeslist door inhibitie van de reactie, indien opportuun graag nieuw staal’.
Een negatief resultaat voor Legionella pneumophila en Pneumocystis jirovecii op een bovenste
luchtwegwisser of aspiraat sluit de infectie niet uit.
REFERENTIES




Corman et al. “Detection of a novel human coronavirus by real-time reverse-transcription
polymerase chain reaction” Euro Surveill. 2012; 17 (39): pii=202085
Keyaerts et al. “Viral load quantification of SARS-coronavirus RNA using a one-step real-time
RT-PCR” Int. J. Infectious Diseases (2006) 10: 32-37.
Ménard et al. “Development of a real-time PCR for the detection of Chlamydia psittaci” JMM
(2006) p.471 - 473)
Neske et al. “ Real-time PCR for diagnosis of human bocavirus infections and phylogenetic
analysis” J. Clin. Microbiology (2007) 45: 22116-2122
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
3/4
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN57




M02
Nix et al. “Detection of all known parechoviruses by real-time PCR” J. Clin.Microbiology (2008)
46: 2519-2524
Panning et al. “High troughput detection of Coxiella burnetii by real-time PCR with internal
control system and automated DNA preparation”. BMC Microbiology 2008, 8:77
Steensels et al. “Clinical evaluation of a multi-parameter customized respiratory Taqman array
card compared to conventional methods in immunocompromised patients” J. Clin. Virology
(2015) 72: 36-41
Tiveljung et al. “Development and implementation of a molecular diagnostic platform for daily rapid
detection of 15 Respiratory viruses”. J. Med. Virology (2009) 81: 167-175.
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
4/4